Bioteknologi - 4 [PDF]

Citation preview

BIOTEKNOLOGI Minggu ke-4



Review 1. Apa itu rekombinan? Rekombinan itu merupakan suatu teknologi buatan yang direkayasa. DNA rekombinan/protein rekombinan, jadi suatu organisme disisipkan DNA yg kita inginkan. DNA disisipkan untuk memperoleh protein yang kita inginkan. Contoh, insulin mau diproduksi di e. coli. Caranya gen pengkode insulin harus disisipkan ke e. coli. Prinsipnya, sesuatu yang tidak ada di tempat aslinya. DNA yg berpindah tempat ke tempat lain itu disebut DNA rekombinan. Protein rekombinan, protein yang dibuat oleh e.coli (insulin). Protein : natif (punya manusia) dan rekombinan (yg diproduksi e. coli) 2. Apa tahap produksi protein terapeutik rekombinan? a. Pemilihan sel inang : pilih inang yg akan digunakan, vector harus sesuai dgn sel inang yg digunakan. b. Penyisipan DNA c. Ligase : DNA sisipan dan vector ditempelkan dulu d. Transformasi : plasmid dimasukkan ke sel inang e. Seleksi transforman f. Deteksi DNA sisipan diligasi dulu dengan vector kemudian ditransformasi agar masuk ke dalam sel inang. Kalau suksesnya sampai kita mendapatkan clone (inang yg membawa plasmid yg membawa DNA sisipan). Tetapi proses-proses yg dilakukan bisa mengalami gagal, seperti ligase bisa gagal atau sukses, ketika transformasi bisa sukses atau gagal. - ligasi sukses, transformasi sukses. - ligasi sukses, transformasi gagal (jadi dapetnya hanya inang, tidak kemasukkan plasmid). - ligasi gagal, transformasi gagal. - Ligasi gagal, transformasi berhasil. Artinya yg kita transformasi hanya plasmid, jd produk akhirnya adalah plasmid yg masuk sel inang tp tidak membawa sisipan. Karna keempat kemungkinan di atas, maka dilakukan seleksi. Menggunakan seleksi antibiotic (seleksi adanya plasmid). Di media diberi ampisilin, kalau yg tidak membawa plasmid akan mati. Untuk membedakan plasmid yg membawa DNA sisipan atau tidak itu dilakukan deteksi keberadaan DNA sisipan (sequencing, PCR, analisis migrasi, analisis pemotongan). 3. Jelaskan apa bedanya vector cloning dan vector ekspresi? - Vector cloning : tujuannya untuk mereplikasi DNA nya saja atau menyimpan DNA. Tersimpan di genomic library. Menyimpan di dalam vector dan dimasukkan ke dalam sel. - Vector ekspresi : tujuannya untuk menghasilkan protein yang diinginkan. Sehingga plasmid itu akan memiliki komponen yg ditujukan utk ekspresi. Artinya memiliki kaset ekspresi. 4. Perbedaan vector suicide dan vector shuttle? - Vector shuttle : memiliki sel inang lebih dari 1. Tidak suicide. Tepat berbentuk plasmid stlh masuk ke sel inang. - Vector suicide : terintegrasi ke kromosom. Plasmid itu episomal. Vector suicide akan bunuh diri dan terintegrasi ke kromosom stlh masuk ke dalam inang.



Kedua vector tsb berkaitan dengan ekspresi di eukariot. Untuk yg suicide akan terintegrasi ke kromosom, kl yg shuttle akan ttp berbentuk plasmid. Ketika di inang mau diekspresikan dalam plasmid maka ia harus memiliki ori (titik awal replikasi, tiap inang beda2). Kalau mau produksi protein di sel eukariot itu ada 2 tahap, yaitu dimasukkan dl ke e. coli baru nnt diisolasi lg dipindah ke eukariot. Artinya dia harus bisa bertahan sbg plasmid di inang pertama dan juga di inang kedua (vector shuttle). 5. Jelaskan teknik utk seleksi transforman? a. Marka seleksi ab : plasmid memiliki komponen gen pengkode resistensi antibiotic, nanti ditumbuhin di media yg ada antibiotic. Kalau vector salah maka tidak akan tumbuh di media tersebut. b. Seleksi biru putih : menggunakan lacZ. Bisa langsung terdeteksi apakah DNA sisipannya sudah masuk atau tidak. c. Auksotrof (JAUH LEBIH KOMPLEKS) : berdasarkan kemampuan untuk biosintesis sesuatu. Jadi inangnya special yaitu harus mutan suatu enzim yg berhubungan dgn biosintesis kebutuhan sel. Plasmid diberi gen pengkode enzim tersebut nanti DNA disisipan ke plasmid, sehingga kalau inangnya tumbuh tanpa produk maka tidak bisa hidup. Tp kalau kemasukkan plasmid, akan tumbuh krn enzimnya digantikan dgn yg ada di plasmid. Medianya harus khusus tidak mengandung produk biosintesis. media : kompleks (sumber asam amino dari bahan yg kompleks, missal ekstrak ragi) jadi gabisa pake media kompleks krn produknya disediain di media jadi nnt tetep aja bisa hidup. - Terdefinisi, bisa pilih media yg tidak memiliki asam amino tertentu. 6. Deteksi keberadaan DNA? a. Perbandingan ukuran : pake perbandingan ukuran. Krn ukuran dna sisipan + vector lebih besar dibandingkan dgn ukuran vector. Menggunakan elektroforesis, Analisis migrasi : menggunakan plasmid pembanding, tidak menggunakan marka. b. Analisis restriksi : gen dimasukkan menggunakan enzim restriksi. DNA rekombinan dapat dipotong dengan enzim yg dimasukkannya. Kl dipotong bisa menghasilkan 2 fragmen yg ukurannya berbeda. Nanti bisa pake marka. Enzim restriksi harus jelas. c. PCR : menggunakan primer yg spesifik utk DNA sisipannya nnt memberikan hasil positif atau negative. Menggunakan elektroforesis mendeteksinya. d. Sequencing : mau tau urutan persis. Dilanjutkan ke BLAST. Strategi Ekspresi Protein Rekombinan 1. Menggunakan promotor kuat, artinya RNA polymerase mengenali promotor mudah. Berlaku sama dengan terminator, terminator kuat. Tujuannya utk menghasilkan RNA yg banyak jadi protein yg dihasilkan juga banyak. 2. Copy plasmid (jumlah salinan plasmid). Kalau kromosom dalam sel hanya ada satu, tp kalau plasmid episomal di luar bisa banyak. Satu sel bisa membawa brp plasmid, itu setiap sel sifatnya beda-beda. Operon Laq : ada regulasi promotor kuat oleh protein LacI. LacI akan duduk dioperator shg menghalangi jalannya transkripsi. Lalu ada inducer (laktosa) yg mengubah konformasi dari represornya sehingga menghalangi repressor duduk di operator. Di setelah operator, RBS lalu ada start kodon, ORF, stop



kodon, dan terminator. ORF (gen LacA LacZ lacY), mengkode protein untuk memetabolisme laktosa. Lac Operon merupakan teknologi bakteri utk regulasi ekspresi. Pada saat stasioner : jumlah paling banyak, jadi baru buat protein jadi pengennya ada on/off. Jadi membajak punya bakteri, salah satunya Lac Operon. Protein Fusi, marker untuk mempermudah pemurnian (His tag), bisa sebagai protein pembantu (reporter), sinyal peptida. - Luciferase (Rluc8) : protein reporter (tingkat ekspresi), kalau protein diproduksi kita bisa melihat penanda tsb. - Sinyal peptide (PelB) : suatu urutan yang bisa digunakan utk menghantarkan protein itu ke tempat tertentu. Pada kondisi biasa, ketika protein tdk punya sinyal peptide ia akan diproduksi setelah beres dibuat di ribosom jadi posisinya di dalam sitoplasma. Tapi untuk protein yg nanti harus masuk ke nucleus lg atau harus dihantarkan melalui membrane keluar sel maka dia perlu tiket utk melalui membrane tsb. Tiket yg digunakan utk melalui membrane disebut signal peptide. Signal peptide adanya hanya di ujung N dan di paling depan. Signal peptide spesifik utk masing-masing inang. Signal peptide mirip tiket, kalau ditambahkan signal peptide untuk dia bisa melewati membrane lalu dibawa keluar itu signal peptidanya dipotong ketika melalui membrane/barrier. Untuk memasukkan signal peptide itu dilakukan di level DNA. Bisa juga protein fusi sudah disediakan oleh plasmid ekspresinya (dijual). pelB (contoh signal peptide) : untuk menghantarkan protein ke daerah periplasma. Setelah sampai ke periplasma, protein sudah tdk memiliki pelB. Kalau sudah melakukan konstruksi, sudah memiliki clone membawa vector yg punya DNA sisipan stlh itu melakukan produksi, DNA menghasilkan protein, protein dipanen. Pada saat memanen protein pasti ada pengotor yg bercampur, stlh kita panen harus dilakukan proses pemurnian melalui elektrofosis utk protein. Sel Inang untuk Teknologi DNA Rekombinan Untuk memproduksi protein yg diinginkan. Ada inang bakteri (eukariot), ragi, mamalia. Pemilihan dilakukan berdasarkan oleh : - Jenis dan jumlah protein yg akan dihasilkan, lihat sifat proteinnya, kalau kecil dan sederhana itu cukup pakai bakteri. Kalau kompleks maka hrs menggunakan sel yg lebih lengkap - Modifikasi struktur protein (glikosilasi), kalau ditambahkan gula maka tdk bisa menggunakan bakteri. Ada kasus protein aslinya terglikosilasi tp kalau mau digunakan utk terapi protein tanpa gula itu aktivitasnya tidak bermasalah, nah itu bisa memproduksi proteinnya tanpa gula jadi bisa pakai sel inang bakteri. Tapi kalau perlu gugus gulanya harus pakai eukariot - Biaya produksi Faktor-faktor yg harus diperhatikan : - Pola pertumbuhan (cepat vs lambat) - Biaya pertumbuhan (biaya, media, fermentor, dan komponen lain misalnya inducer) - Tingkat ekspresi - Sekresi produk (memurnikan pemurnian) - Ketersediaan vector dan vector shuttle



Gram negative punya dua membrane yg memiliki ruang periplasma.



Badan inklusi : protein tidak larut, pelipatan salah, protein tidak aktif.



Pembentukkan ikatan disulfida oleh asam amino sistein krn punya SH kalau dalam kondisi redoks maka S-S akan bertemu dan membentuk ikatan disulfida. Di prokariot krn satu ruang kosong dan memiliki kromosom jadi tdk ada kondisi redoks krn kl dalam kondisi redoks DNA akan rusak. Sedangkan di eukariot, sitoplasmanya memungkinkan terjadi reaksi redoks sementara di nucleus aman (DNA di nucleus). Kl di prokariot, mau produksi protein tidak bisa membuat jembatan disulfida. Tapi kl di eukariot bisa terjadi reaksi redoks shg bisa membentuk ikatan disulfida. Tapi ada kondisi dimana di prokariot bisa terjadi reaksi redoks, adanya di periplasma. Ada enzim di periplasma yg berfungsi untuk membentuk ikatan disulfida tapi ada keterbatasan lain yaitu space nya kecil.



Ruang periplasma di gram negative. Protein scr umum asam amino pertamanya adalah metionin. Kl pada prokariot, metioninnya itu bukan metionin biasa tapi formilmetionin. Khusus metionin yang ditempelkan di start kodon itu adalah metilmetionin kalau di sel prokariot. Kalau protein obat harus syarat ikut syarat di kompendial. Sel Inang yg Dapat digunakan pada system ekspresi eukariot - Saccharomyces cerevisiae - Pichia Patoris - Baculovirus-serangga - Sel mamalia Sistem Ragi Ragi bisa melakukan glikosilasi. Salah satu contoh adalah Saccharomyces cerevisiae yang biasa digunakan hanya saja ia memiliki kecenderungan ketika beda sel eukariot itu pola glikosilasinya berbeda. Padahal beda-beda gula ini bisa mempengaruhi ke aktivitas, keamanan, dll. Jadi, memberikan gula itu posisinya harus tepat dan gulanya harus semirip mungkin dgn yg seharusnya. Saccharomyces cerevisiae ini kalau memberikan gula akan overglikosilasi (gugus gula besar) jadi strukturnya menjadi jauh berbeda. Pichia pastoris : pola glikosilasi lebih mirip pola pada sel mamalia. Proses cloning pada ragi : Kloningnya dilakukan 2 tahap, yaitu : 1. Kloning pada E. coli : inang yg digunakan utk karakterisasi. Utk melakukan ligase, konfirmasi itu dilakukan di inang pertama. Nanti kalau sudah terkonfirmasi baru kita isolasi plasmidnya (sel dilisis), plasmid yg sudah jadi dikloning ke inang yg utk produksi 2. Kloning pada ragi Kalau eukariot, itu harus dikloning dl di prokariot utk ligasi dan karakterisasi. Vector shuttle itu punya ori di inang pertama (prokariot) dan ori di inang kedua (eukariot/mamalia) Tapi kalau yg vector suicide dia hanya memiliki satu ori utk di inang pertama utk konstruknya saja.



Prosedur standar ragi : 1. Konstruksi vector rekombinannya (bisa shuttle atau ga shuttke) 2. Transformasi ke E. coli 3. Konfirmasi klon E. Coli 4. Isolasi vector rekombinan 5. Transformasi ke sel ragi 6. Konfirmasi klon ragi Ketika plasmid diisolasi dipakai purifikasi dulu kemudian baru ditransformasi ke inang kedua dan dikonfirmasi kebenarannya. Hal-hal yg perlu diperhatikan vector shuttle & ekspresi : - Konstruksi di e. coli - Ekspresi gen di inang ke-2 (produksi protein) - Komponen replikasi dikenali e. coli dan inang ke-2 - Ada 2 ori ( 1 utk e. coli dan 1 utk inang ke-2) - Komponen ekspresi dikenali inang ke-2 - System seleksi vector (harus ada utk e. coli dan inang ke-2) Inang pertama utk kloning. Inang kedua utk ekspresi. Hal-hal yg perlu diperhatikan suicide vector dan ekspresi : - Konstruksi vector di e. coli - Ekspresi gen (produksi protein) di inang ke-2 - Komponen replikasi dikenali hanya e. coli (vector terintegrasi ke kromosom inang ke-2) - Hanya ada 1 ori yg dikenali e. coli - Komponen ekspresi dikenali inang ke-2 - System seleksi vector (harus ada utk e. coli dan inang ke-2) Marka seleksi dan promotor utk beda inang itu berbeda. Contoh regulasi ekspresi gen pada S. cerevisiae : Promotor gal diinduksi menggunakan galaktosa Promotor gal direpresi oleh glukosa Gal4 adalah aktivator tapi activator tdk bisa jalan kalau dia ditempeli repressor.. Ketika ada galaktosa (inducer), galaktosa akan mengikat repressor shg repressor berubah bentuknya shg merubah keseluruhan strukturnya shg activator bisa bekerja. Kalau ada galaktosa maka ekspresi menjadi ON. Kalau ada glukosa, repressor bisa menempel pada operator dan ekspresi terganggu. UAS = ada jauh di belakang promotor, jadi inducer duduk di atas UAS gunanya untuk mendorong RNA polymerase. Marka seleksi ragi, - Gen resistensi thd inhibitor (methrotrexat dan tembaga). - Gen pengkode biosintesis asam amino/basa nukleotida (auksotrof) a. Gen LEU2 b. Gen TRP1



c. Gen URA3



Salah satu sistem seleksi sel di mamalia adalah mutan DHFR atau gs. Kalau dhfr itu hubungannya dgn kebutuhan sel thd hipoxathin dan thimidin sedangkan gs itu glutamin. Jadi kalau dhfr pasangannya sama methotrexat. Metothrexat itu inhibitor dhfr, jadi dhfr itu membantu mengubah folat menjadi glisin, nukleotida purin, dan asam timidilat yg nnt akan dipake oleh sel. Metothrexat menghambat kerja dhfr. Pada kondisi alami di sel itu resistensi bisa terjadi melalui 3 mekanisme di atas. Mekanisme ketiga digunakan untuk strategi utk memproduksi protein menggunakan CHO :



pCMV : promotor konstitutif (tdk diregulasi) SV40 ori : ori mamalia pUC ori : ori di bakteri dhfr : marka seleksi utk peningkatkan ekpresi di sel mamalia