Bioteknologi Dasar Ahyar Ahmad [PDF]

Citation preview

LAPORAN HIBAHPENULISAN BUKUAJAR



MATAKULIAH



BIOTEKNOLOGI DASAR



Oleh: Prof. Dr. Ahyar Ahmad



Dibiayaioleh DanaDIPALayanan Umum UniversitasHasanuddin Tahun 2014 SesuaidenganSKRektor UnhasNomor:813/UN4.12/PP.12/2014, Tanggal 8April 2014



PROGRAMSTUDIKIMIAJURUSANKIMIA FAKULTASMATEMATIKADAN ILMU PENGETAHUANALAM UNIVERSITASHASANUDDIN TAHUN 2014



KEMENTERIAN PENDIDIKAN DANKEBUDAYAAN UNIVERSITAS HASANUDDIN



LEMBAGAKAJIANDANPENGEMBANGANPENDIDIKAN JL.PerintisKemerdekaanKm.10 Makassar90245 (GedungPerpustakaan UnhasLantaiDasar) Telp.(0411) 586200, Ext.1064 Fax.(0411) 585 188 e-mail:[email protected]



HALAMAN PENGESAHAN HIBAH PENULISAN BUKUAJAR BAGITENAGA AKADEMIK UNIVERSITASHASANUDDIN TAHUN 2014



Judul Buku Ajar Nama Lengkap NIP/NIDN Pangkat/Golongan Jurusan/Bagian/Program Studi Fakultas/Universitas Alamat e-mail Biaya Dibiayai oleh



: : : : : : : : :



BioteknologiDasar Prof. Dr. Ahyar Ahmad 196712311991031020/0031126362 Pembina Utama /IVe Jurusan Kimia/Kimia FMIPA/Universitas Hasanuddin [email protected] Rp.5.000.000,- (Limajutarupiah) DanaDIPA BOPTNUniversitas Hasanuddin Tahun2014, Sesuai denganSurat KeputusanRektor UniversitasHasanuddin Nomor : 813/UN4.12/PP.12/2014, Tanggal 8April 2014 Makassar, 19 September 2014



Dekan Fakultas MIPA



Penulis



Prof. Dr. H. Hanapi Usman, M.S NIP. 195702281987031001



Prof. Dr. Ahyar Ahmad NIP.196712311991031020



Mengetahui : Ketua Lembaga Kajian dan Pengembangan Pendidikan (LKPP) Universitas Hasanuddin,



Prof.Dr. Ir.LellahRahim,M.Sc NIP.196305011988031004



SURATPERNYATAAN



Sayapenulisbukuini Nama lengkap



: Prof. Dr. Ahyar Ahmad



NIDN



: 0031126362



Denganinimenyatakanbahwa: 1.



Bukuini



benar



saya



tulis,bukan



karya



plagiat.Sumber



rumus,atauopinidarioranglainyangada



semua



gambar,



didalamnyatelahdicantumkan



padaDaftarPustaka. 2.



Bukuini



sayaserahkankepadaLembagaKajiandanPengembangan



Pendidikan(LKPP)Unhas,untukselanjutnyadijadikan PusatUnhasdandalambentuksoftcopydipajangdi



koleksiPerpustakaan www.unhas.ac.idyang



dapatdiaksesolehsemuapengguna,khususnyamahasiswapeserta



mata



kuliahBioteknologiProgramStudi S1KimiaUnhas. Demikianpernyataaninisayabuatdengansungguh-sungguh.



Makassar, 19 September 2014 Penulis,



Prof. Dr. Ahyar Ahmad NIDN:0031126362



ii



KATAPENGANTAR Alhamdulillah, puji syukur kami panjatkan ke hadirat Allah SWT karena atas rahmat dan hidayah-Nya sehingga buku Bioteknologi Dasar ini dapat diselesaikan dengan baik. Kebutuhan akan tersedianya buku-buku ajar yang berbahasa Indonesia di perguruan tinggi memang sangat dirasakan hingga saat ini, terutama oleh para mahasiswa dalam menunjang penerimaan materi kuliah. Buku ajar ini merupakan penunjang utama untuk perkuliahan Bioteknologi Dasar di Perguruan Tinggi, khususnya di Jurusan Kimia Fakultas MIPA Universitas Hasanuddin. Meskipunbukuinidibuatsecara



khususuntukmahasiswa



telahmenempuhmatakuliah“Bioteknologi



Dasar”,



kemungkinanadanyamahasiswadiluar



kimiaS1semester4



namuntidak



kelompoktersebutyang



yang



menutup tertarikuntuk



mempelajarinya.Buku ajar ini telah disusun secara sungguh sungguh yang diambil dari berbagai sumber-sumber buku teks Bioteknologi baik yang berbahasa asing maupun dari diktat yang telah kami susun sebelumnya dan telah dilakukan perbaikan semaksimal mungkin yang isinya disesuaikan dengan perkembangan Bioteknologi pada umumnya, yang membahas tentang Pengantar Bioteknologi, Proses fermentasi, Bioinsektisida, Sel Induk (selpunca), dan Bioinformatika.Penulis akan senang menerima kritik yang membangun dan berguna dari semua pihak, yang kiranya akan dapat menjadi bahan untuk perbaikan pada penyusunan edisi selanjutnya. Penulis mengucapkan terima kasih kepada semua pihak yang telah membantu baik moril maupun dana hingga penulisan buku ajar bioteknologi dasar ini dapat terlaksana dan semoga dapat bermanfaat bagi para mahasiswa tingkat diploma dan sarjana khususnya yang mengambil mata kuliah Bioteknologi Dasar. Penyusunanbukuini karenaitupada



tidakterlepasdari



kesempataninikami



campurtanganberbagai



mengucapkanbanyakterima



semuapihakyangmembantusehinggapenyusunanbukudapatterselesaikan baik,khususnyakepadaRektorUniversitas



kasih



pihak,oleh kepada dengan



Hasanuddinyangtelahmemberikan



bantuanpendanaan melalui sumber dana DIPA BOPTN tahun 2014. Makassar, September 2014



Penulis



iii



DAFTAR ISI HALAMAN PENGESAHAN ............................................................................



i



SURAT PERNYATAAN ..................................................................................



ii



KATA PENGANTAR .......................................................................................



iii



DAFTAR ISI ....................................................................................................



iv



BAB 1 PENDAHULUAN 1.1 Visi Program Studi Kimia ...........................................................



1



1.2 Misi Program Studi ....................................................................



1



1.3 Tujuan Program Studi ...............................................................



1



1.4 Profil Lulusan Program Studi .....................................................



1



1.5 Kompetensi Lulusan ..................................................................



2



1.6 Struktur dan Isi Kurikulum .........................................................



4



1.7 Analisis Kebutuhan Pembelajaran .............................................



5



1.8 Rancangan Pembelajaran .........................................................



8



1.9 Tinjauan Mata Kuliah .................................................................



12



BAB 2 PENGERTIAN, RUANG LINGKUP, DAN PERKEMBANGAN BIOTEKNOLOGI 2.1 Pendahuluan .............................................................................



13



2.2 Batasan dan Pengertian Bioteknologi .......................................



17



2.3 Peranan Ilmu Biologi, Biokimia, dan Keteknikan dalam perkembangan Bioteknologi Molekular .....................................



18



2.4 Teknik-teknik dalam Bioteknologi Molekular..............................



34



2.5 Ringkasan .................................................................................



51



Contoh Soal .......................................................................................



52



iv



Daftar Pustaka ...................................................................................



53



Senarai Istilah dan Artinya .................................................................



54



BAB 3 BIOTEKNOLOGI PADA PROSES FERMENTASI 3.1 Pendahuluan .............................................................................



55



3.2 Fermentasi Yoghurt ..................................................................



59



3.3 Fermentasi Nata de Coco..........................................................



63



3.4. Fermentasi Kecap .....................................................................



70



3.5 Ringkasan .................................................................................



76



Contoh Soal ......................................................................................



77



Daftar Pustaka ...................................................................................



78



Senarai Istilah dan Artinya .................................................................



80



BAB 4 BIOINSEKTISIDA MIKROBA DAN VIRUS 4.1 Pendahuluan .............................................................................



81



4.2 Bioinsektisida dari Mikroba ........................................................



82



4.3 Bioinsektisida dari Virus ............................................................



93



4. 4 Ringkasan .................................................................................



101



Contoh Soal ......................................................................................



101



Daftar Pustaka ...................................................................................



102



Senarai Istilah dan Artinya .................................................................



104



BAB 5 PRODUKSI ANTIGEN SEBAGAI KANDIDAT VAKSIN 5.1 Pendahuluan .............................................................................



105



5.2 Tinjauan Umum Protein Manusia ..............................................



105



5.3 Tinjauan Umum Rekayasa Genetika .........................................



107



5.4 Kegunaan Teknologi Rekombinan ............................................



109



5.5 Tinjauan Umum Vaksin .............................................................



110 v



5.6 Vaksin Rekombinan untuk Beberapa Penyakit..........................



113



5.7 Ringkasan .................................................................................



119



Contoh Soal ......................................................................................



119



Daftar Pustaka ...................................................................................



120



Senarai Istilah dan Artinya .................................................................



122



BAB 6 SEL INDUK DALAM BIOTEKNOLOGI KESEHATAN 6.1 Pendahuluan .............................................................................



123



6.2 Pengertian Sel Induk .................................................................



124



6.3 Karakteristik dan Jenis Sel Induk ..............................................



125



6.4 Aplikasi Kultur Sel Induk ............................................................



129



6.5 Perkembangan Penelitian dan Penerapan Sel Induk di Indonesia 136 6.6 Bioetika dan kontroversi pada Penggunaan Sel Induk (Stem Cells)...............................................................................



137



6.7 Ringkasan .................................................................................



139



Contoh Soal .......................................................................................



140



Daftar Pustaka ...................................................................................



141



Senarai Istilah dan Artinya .................................................................



142



BAB 7 PENGGUNAAN ANTIBODI MONOKLONAL PADA BIDANG KESEHATAN 7.1 Pendahuluan .............................................................................



143



7.2 Sistem Kekebalan Tubuh Antibodi ............................................



144



7.3 Antibodi Monoklonal ..................................................................



153



7.4 Ringkasan .................................................................................



167



Contoh Soal .......................................................................................



168



Daftar Pustaka ...................................................................................



169



Senarai Istilah dan Artinya .................................................................



170 vi



RANCANGAN PEMBELAJARAN BERBASIS KBK NAMA / KODE MATAKULIAH



: BIOTEKNOLOGI DASAR/333H3102



KOMPENTENSI UTAMA



: Kemampuan memahami konsep dasar bioteknologi dan menerapkan pengetahuan bioteknologi dalam berbagai bidang ilmu seperti : sains, pertanian, farmasi, dan kedokteran



KOMPENTENSI PENDUKUNG



: Memiliki kemampuan dan keterampilan dalam berkomunikasi, presentasi materi tentang pengetahuan bioteknologi, dan bekerjasama dalam suatu tim (team working skill)



KOMPENTENSI LAINNYA (INSTITUSIONAL)



: Memiliki kesadaran, kepedulian dan komitmen terhadap pengembangan dan pemanfaatan produk bioteknologi dalam peningkatan kualitas hidup manusia.



MINGGU KE



SASARAN PEMBELAJARAN



MATERI PEMBELAJARAN



STRATEGI PEMBELAJARAN - Umpan balik



INDIKATOR PENILAIAN - Persetujuan



1



- Menjelaskan ruang lingkup dan tujuan pembelajaran Bioteknologi - Menjelaskan atas kontrak pembelajaran



- Deskripsi ruang lingkup mata kuliah dan tujuan belajar bioteknologi - Kontrak pembelajaran



2



- Menjelaskan sejarah, batasan bioteknologi dan aplikasinya - Memprediksi strategi dan arah perkembangan bioteknologi dimasa depan dan hubungannya dengan bidang ilmu lainnya



- Pengertian, sejarah, dan aplikasi bioteknologi - perkembangan bioteknologi dimasa depan dan hubungannya dengan bidang ilmu lainnya



- Active Learning :Kuliah, penelusuran pustaka dan tugas mandiri



- Kelengkapan isi,



- Menjelaskan model fermentasi dan mampu membedakan fermentasi sistim tertutup, kontinyu, dan fed-batch - Menjelaskan parameter



- Model Fermentasi (Fermentasi sistim tertutup, kontinyu, dan fed-batch)



- Collaborative Learning :Kuliah, presentasi dan kerja kelompok



- Kejelasan uraian,



3-4



- Parameter lingkungan fisik dan kimiawi



1



BOBOT NILAI (%) 0



5



kejelasan uraian, kerjasama tim dan kreativitas.



sistematis dan ketepatan penerapan konsep pada



10



5



6-7



9-10



lingkungan fisik dan kimiawi fermentor - Menggambarkan struktur dan menyebutkan jenis/macam fermentor - Menjelaskan kondisi-kondisi aseptis yang dibutuhkan fermentor



- Struktur dan jenis fermentor



- Menjelaskan proses Fermentasi Yoghurt - Menjelaskan proses Fermentasi Nata de Coco - Menjelaskan proses Fermentasi Kecap



- Produk Yoghurt - Produk Nata de Coco - Produk Kecap



- Menjelaskan pengertian dan penggolongan bioinsektisida - Menjelaskan Bioinsektisida dari Mikroba - Menjelaskan Bioinsektisida dari Virus



- Pengertian dan penggolongan bioinsektisida - Bioinsektisida dari Mikroba - Bioinsektisida dari Virus



- MenjelaskanTinjauan Umum Protein Manusia - Menjelaskan Tinjauan Umum Rekayasa Genetika - Menjelaskan Kegunaan Teknologi Rekombinan - Menjelaskan Tinjauan Umum Vaksin - Menjelaskan Vaksin Rekombinan untuk Beberapa



- Tinjauan Umum Protein Manusia - Tinjauan Umum Rekayasa Genetika - Kegunaan Teknologi Rekombinan - Tinjauan Umum Vaksin - Vaksin Rekombinan untuk Beberapa Penyakit



jawaban



- Pencapaian kondisi aseptis dalam fermentor



- Active Learning :Kuliah,tutorial, Kunjungan industry, kerja kelompok dan presentasi



- Problem Base Learnin, Penelusuran pustaka, Presentasi



- Problem Based Learning, presentasi, Kerja individu



2



- Kejelasan uraian,



10



sistematis dan ketepatan penerapan konsep pada jawaban - Kejelasan langkah



10



uraian, ketepatan penerapan dan konsep pada jawaban - Ketepatan



penerapan konsep dan sistematis pada jawaban



10



Penyakit 11



12-13



14-15



8 dan 16



- Menjelaskan Pengertian Sel Induk - Menjelaskan Karakteristik dan Jenis Sel Induk - Menjelaskan Aplikasi Kultur Sel Induk - Menjelaskan Bioetika dan kontroversi pada Penggunaan Sel Induk



- Pengertian Sel Induk - Karakteristik dan Jenis Sel Induk - Aplikasi Kultur Sel Induk - Bioetika dan kontroversi pada Penggunaan Sel Induk



- Problem Based Learning :Penelusuran pustaka, kerja kelompok



- Kejelasan langkah



- MenjelaskanSistem Kekebalan Tubuh Antibodi - Menjelaskan Produksi Antibodi Monoklonal - MenjelaskanMekanisme kerja Antibodi Monoklonal



- Sistem Kekebalan Tubuh Antibodi - Produksi Antibodi Monoklonal - Mekanisme kerja Antibodi Monoklonal



- Problem Based Learning :Penelusuran pustaka, kerja kelompok



- Kejelasan langkah



- MenjelaskanPengertian, Batasan dan Klasifikasi Bioinformatika - MenjelaskanPenerapan Bioinformatika dalam Bidang Sains, Kedokteran, dan Kesehatan - Menjawab soal-soal ujian



- Pengertian, Batasan dan Klasifikasi Bioinformatika - Penerapan Bioinformatika dalam Bidang Sains, Kedokteran, dan Kesehatan



- Problem Based Learning :Penelusuran pustaka, kerja kelompok



- Kejelasan langkah



- Tes tertulis (Problem Solving)



- Kerja individu



- Kejelasan langkah sistimatis dalam menyelesaikan soal ujian



uraian, ketepatan penerapan dan konsep pada jawaban



10



uraian, ketepatan penerapan dan konsep pada jawaban 10



uraian, ketepatan penerapan dan konsep pada jawaban



Pustaka: 1. Brown, T. A. (1991) Pengantar Kloning Gene (terjemahan), Editor: Praseno, S. A. M. Penerbit Yayasan Essentia Medica, Yogyakarta.



3



5



30



2. Cooper, G. M. (2001). The Cell a molecular approach 2st Edition ASM press, Washington, D.C. 3. Glick Bernard R., and Jack,J. Pasternak, (1994). Molecular Biotechnology : Principles and Application of Recombinant DNA. 4. Lewin, B. (1997) Genes VI, Oxford Univ. Press. UK. 5. Sambrook, J., Fritsch, E. F. and Maniatis, T. 1989. Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd edn. ColdSpringHarbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor, NY. 6. Walker, S. (2009) Menyingkap Tabir bioteknologi: Panduan Belajar Mandiri (Terjemahan). Penerbit Buku Kedokteran EGC, Jakarta.



4



BAB 1 PENDAHULUAN



1.1



Visi Program Studi Kimia Pada tahun 2020, Prodi Kimia menjadi pusat unggulan dalam pemanfaatan sumber



daya alam benua maritim yang bermanfaat dan berkesinambungan. 1.2



Misi Program Studi a.



Menghasilkan lulusan yang profesional serta dapat bersaing di pasar kerja global.



b.



Mengembangkan



pendidikan



dan



penelitian



yang



berkualitas



serta



berkesinambungan. c.



Memberikan kontribusi seluas-luasnya dan manfaat sebesar-besarnya bagi masyarakat.



1.3



Tujuan Program Studi a.



Meningkatkan produktivitas dan kualitas lulusan yang dapat bersaing di pasar kerja global.



b.



Meningkatkan mutu prasarana, sarana, dan teknologi serta mewujudkan atmosfir akademik yang sehat dan kondusif serta bermanfaat bagi sivitas akademika untuk mendukung terselenggaranya misi program studi.



c.



Mampu berperan sebagai pusat kajian, pengembangan, dan pemanfaatan sumberdaya alam benua maritim yang berkesinambungan.



d.



Memupuk dan mengembangkan kerjasama kemitraan dengan sektor internal dan eksternal dalam rangka memberikan kontribusi dan manfaat yang seluas-luasnya bagi masyarakat.



e.



Mewujudkan serta menumbuhkembangkan institusi yang sehat dan kuat yang didukung oleh budaya ilmiah.



1.4



Profil Lulusan Program Studi a.



Memiliki Pengetahuan yang memadai dalam bidang kimia.



b.



Terampil mengoperasikan peralatan standar laboratorium kimia.



c.



Memiliki wawasan yang luas terhadap sumber daya alam benua maritim dari aspek kimia.



d.



Terampil berkomunikasi ilmiah, baik secara lisan maupun tulisan.



e.



Memiliki keterampilan bahasa Inggris dan Teknologi Informasi. 1



f. 1.5



Mampu beradaptasi dengan berbagai jenis lapangan pekerjaan.



Kompetensi Lulusan a.



Penguasaan Pengetahuan (PP) 1.



Menguasai konsep teoritis tentang struktur, sifat, perubahan energi dan kinetik, identifikasi, pemisahan, karakterisasi, transformasi, sintesis bahan kimia dan terapannya.



2.



Menguasai pengetahuan tentang fungsi, cara mengoperasikan instrumen kimia yang umum, dan analisis data dari instrumen tersebut.



3.



Menguasai prinsip dasar piranti lunak analisis dan sintesis pada bidang kimia umum atau lebih spesifik (kimia organik, biokimia, kimia analitik, kimia fisika, atau kimia anorganik).



b.



Kemampuan Kerja (KK) 1.



Memiliki keterampilan analisis dan kemampuan untuk menerapkan berbagai metode, prinsip dasar, dan logika kimia dalam memecahkan masalah kimia.



2.



Memiliki kemampuan dan keterampilan dalam pengolahan data dan informasi secara kimia.



3.



Memiliki kemampuan dan keterampilan melakukan penelitian dengan menerapkan pengetahuan dan teknologi terkait dalam proses identifikasi, isolasi, transformasi, dan sintesis kimia secara mandiri.



4.



Memiliki kemampuan mengelola bahan kimia di lingkungan dan proses manufaktur pada institusi pemerintah dan swasta.



5.



Memiliki kemampuan menerapkan konsep kimia dalam berwirausaha.



6.



Memiliki kemampuan mengidentifikasi dan menganalisis permasalahan yang ada pada masyarakat.



7. c.



Memiliki kemampuan mengikuti perkembangan IPTEKS.



Karakter dan Kepribadian (KDK) 1.



Bertakwa kepada Tuhan Yang Maha Esa.



2.



Memiliki moral, etika, dan kepribadian yang baik dalam menjalankan tugasnya.



3.



Berperan sebagai warga negara yang bangga dan cinta tanah air serta mendukung perdamaian dunia.



4.



Memiliki kesadaran, kepedulian, dan komitmen terhadap pengembangan dan pemanfaatan sumber daya alam berbasis benua maritim.



2



5.



Memiliki pemahaman, kesadaran dan kearifan tentang berbagai aspek sosial, ekonomi dan budaya akibat dampak laju perkembangan IPTEKS yang pesat.



6.



Menghargai keanekaragaman budaya, pandangan, kepercayaan, dan agama serta pendapat/temuan original orang lain.



Untukmenghasilkanlulusandenganprofilseperti



yang



telah



disebutkan



diatas



makaperluadanya deskripsikompetensi yang seharusnya dimiliki oleh para lulusan prodi Kimia.Adapun kaitanantaraprofillulusanProdi Kimia FMIPA Unhas dengan kompetensi yang seharusnya dimiliki oleh para lulusandipaparkan seperti dalam Tabel 1.1. Tabel 1.1. Matriks hubungan antara Profil dan Kompetensi Lulusan Kompetensi yang seharusnya dimiliki Penguasaan Karakter dan Kemampuan Kerja pengetahuan Kepribadian Menguasai konsep teoritis Memiliki keterampilan Bertakwa kepada tentang struktur, sifat, analisis dan Tuhan Yang Maha Esa perubahan energi dan kemampuan untuk kinetik, identifikasi, menerapkan berbagai pemisahan, karakterisasi, metode, prinsip dasar, transformasi, sintesis dan logika kimia bahan kimia dan dalam memecahkan terapannya masalah kimia. Memiliki kemampuan Memiliki moral, etika, dan keterampilan dan kepribadian yang Integritas dalam pengolahan baik dalam data dan informasi menjalankan tugasnya. secara kimia Berperan sebagai warga negara yang bangga dan cinta tanah air serta mendukung perdamaian dunia. Menguasai pengetahuan Memiliki kemampuan tentang fungsi, cara dan keterampilan mengoperasikan melakukan penelitian instrumen kimia yang dengan menerapkan umum, dan analisis data pengetahuan dan dari instrumen tersebut. teknologi terkait dalam proses identifikasi, isolasi, Inovatif transformasi, dan sintesis kimia secara mandiri. Memiliki kemampuan menerapkan konsep kimia dalam berwirausaha Profil Lulusan



3



Katalitik



Menguasai prinsip dasar piranti lunak analisis dan sintesis pada bidang kimia umum atau lebih spesifik (kimia organik, biokimia, kimia analitik, kimia fisika, atau kimia anorganik)



Memiliki kemampuan mengikuti perkembangan IPTEKS



Memiliki kemampuan mengidentifikasi dan menganalisis permasalahan yang ada pada masyarakat. Memiliki kemampuan mengelola bahan kimia di lingkungan dan proses manufaktur pada institusi pemerintah dan swasta



Arif



1.6



Memiliki kesadaran, kepedulian, dan komitmen terhadap pengembangan dan pemanfaatan sumber daya alam berbasis benua maritim. Memiliki pemahaman, kesadaran dan kearifan tentang berbagai aspek sosial, ekonomi dan budaya akibat dampak laju perkembangan IPTEKS yang pesat. Menghargai keanekaragaman budaya, pandangan, kepercayaan, dan agama serta pendapat/temuan original orang lain.



Struktur dan Isi Kurikulum Setelah semua kompetensi lulusan terumuskan, langkah selanjutnya adalah mengkaji



apakah kompetensi tersebut telah mengandung kelima elemen kompetensi seperti yang diwajibkan dalam Kepmendiknas No.045/U/2002. Kelima elemen kompetensi tersebut adalah : (a) landasan kepribadian, (b) penguasaan ilmu dan keterampilan, (c) kemampuan berkarya, (d) sikap dan perilaku dalam berkarya menurut tingkat keahlian berdasarkan ilmu dan keterampilan yang dikuasai, dan (e) pemahaman kaidah berkehidupan bermasyarakat sesuai dengan pilihan keahlian dalam berkarya. 4



Adabeberapa



point



dari



kompotensitersebut



diatasyangditunjangolehMatakuliahBioteknologi Dasarsebagaimanadipaparkandalam Tabel 1.2. Tabel1.2.KompetensiLulusanProdi KimiaFMIPA olehMataKuliahBioteknologi Dasar. MK



PK 1



2



UnhasyangDidukung



KK 3



1



2



3



4



KDK



5



6



7



1



2



3



4



5



6



BioteknologiDasar √



1.7



√ √√



√



√ √



AnalisisKebutuhanPembelajaran Pembelajaran Bioteknologi Dasarmemilikiperan pentingdidalampembelajaranmata



kuliahRekayasa Genetika dan Bioteknologi Molekular pada semester berikutnya dan sekaligus menunjang pencapaian kompetensi lulusan Prodi Kimia,namun masih dianggap sulitdimengerti bagi para mahasiswa peserta mata kuliah tersebut.Halinimenjaditantangan bagipengajaruntukmembuat



mata



kuliah



tersebut



menjadi



menarikdan



dimengerti.Untukituperludipikirkandengan



mudah sungguh-



sungguhtentangnormapedagogisyangakandigunakan



didalam



pembelajarannya.Normapedagogisiniakanmengarahkan



kepadapemilihan



metodedanmateri ajar untukkepentinganpembelajaran. Dalamupayauntukmemahami kebutuhanpembelajaran



mata



normapedagogisyangsejalandengan kuliahBioteknologi



Dasar,



makaperluadanya



pembahasantentang:



1.7.1



1)



Kondisi awal mahasiswa;



2)



Normapedagogispemilihan materi pembelajaran;



3)



Pendekatanpembelajaran yangdilakukan; dan



4)



Metodepembelajaran yangdigunakan.



Kondisi awal mahasiswapesertamatakuliahBioteknologi Dasar MahasiswapesertamatakuliahBioteknologi



Dasaradalahmahasiswasemester



VIsehinggadapatdiharapkan telahmemilikipengetahuandasartentangbeberapa bidangilmu kimia.Darisegipsikologi, mereka telahmulaimemasukiranah kedewasaan, sehinggadalam sistem pembelajaran yang diterapkan kepadanya harus mempertimbangan aspek pedagogis



pelajar



dewasa,



diantaranya:



menelusurimateripembelajarandibanyakmedia,dan(2)



(1)



mereka



sudahmampu



sukamengespresikandirimereka,



mempresentasikansesuatu,dan mengemukakan pendapat. Akan tetapi, kemampuan 5



berpikir secara analisis dan sintesis tidak paraleldengan kedewasan, melainkan melaluilatihanproblemsolving.Padahal



kemampuansemacamitusangat



diperlukandalamduniakerja. Kondisiawal



mahasiswasebagaimana



telahdijelaskan



diatassangat



cocok



denganpenerapan sistempembelajaran dengan metodeStudentCenterLearning (SCL) yangsecara bertepatan dengan sistem pembelajaran yangdipilihdan ditetapkanoleh pimpinan Unhas.Disampingdapatmeningkatkanpengetahuan mahasiswa tentangsubstansi pembelajaran,sistemini juga memberikan peluang kepada setiap mahasiswa untuk mengekspresikan



diri



melalui



teknik



presentasi



dan



mengemukakanpendapat



tanpamengucilkanpendapatoranglain. 1.7.2



Normapedagogispemilihanmateripembelajaran Substansipembelajaran Bioteknologi Dasaradalahbagaimanamengkaitkanantara ilmu



Biologi dan Biokimiadengan dengan ilmu keteknikan untuk menghasilkan barang dan jasa dengan melibatkan sel hidup dan bagian-bagiannya.Halinimelibatkan beberapakonsep hasilpemikirananalisisdansintesisberbagai



fenomenayang



diperlihatkanolehsenyawa-



senyawayang ditemukan dalam sel hidup, seperti kabohidrat, lemak, protein, dan asam nukleat. Substansi



pembelajaran



Bioteknologi



Dasarmempunyai



menuntutmahasiswauntukberpikirsecaraanalisisdansintesissehingga peningkatan



daya



berpikir



secara



analisis



dan



sintesis



karakter



yang



cocok



untuk



mahasiswa.



Oleh



karenaitu,normapedagogispembelajarannyasecarasignifikan



mengarahkan



pengajardalampemilihanmateriyangsesuaidengan



karaktertersebut,serta



memberikanlatihansecaralangsunguntuk menjelaskansecara sistematik peranan sel hidup untuk menghasilkan produk yang berguna untuk kemaslahatan umat manusia. 1.7.3



PendekatanpembelajaranBioteknologi Dasar Pendekatan yangdigunakan dalampembelajaran Bioteknologi Dasar dititik beratkan



pada



penggunaan



konsep-konsep



teoritis



karakterdansifat-sifatyangdiperlihatkanoleh Sistempembelajaran



menggunakanmetode



yang



senyawa



telah kimia



adauntuk dalam



SCLdimana,pengajar



atau



menjelaskan sel



hidup.



dosendalam



pembelajaran lebih banyak memfungsikan dirinya sebagai fasilitator dan mitra bagi para mahasiswa. Dalam halini, pengajaratau dosenmemberikanpenjelasan singkat tentang GBRP, membuat kontrakkuliah, sertamelakukan pembagian kelompok dan tugas kelompokdisetiapawalperkuliahan. dipresentasikanpadapertemuan



Hasilpekerjaankelompokakan berikutnya.



perkuliahan,pengajarmelakukanumpanbaliksebagai



Pada



setiapsegmenakhir



koreksiapasaja



yang 6



telahdipresentasikan. 1.7.4



MetodepembelajaranBioteknologi Dasar



Untukmenetapkanpilihanmetodepembelajarannsuatumata



kuliah,adabeberapahal



yangseharusnyadipertimbangkandiantaranya adalah kondisiawalpeserta kuliah, jumlah peserta



kuliah,



fasilitasyangtersedia,



dansasaranpembelajaran.



Sebagaimanatelahdijelaskansebelumnyabahwa(1)pesertamata



kuliahBioteknologi



DasaradalahmahasiswasemesterVIdenganjumlahpesertarataratadiatas40orangperkelas,dan penggunaan



pembelajaranBioteknologi



konsep-konsepteoritisdan



praktis



Dasardititikberatkanpada



yangtelahadauntukmenjelaskan



karakterdan sifat-sifatyangdiperlihatkansuatuspesiesbiomolekul yang meliputi struktur dan fungsi fisiologinya,makauntukkondisiseperti itucukupidealapabilapengajar atau dosen menerapkan



metodepembelajaran



SCL.Adabeberapa



metode



pembelajaran



yanglazimdigunakandalamsistempembelajaranSCL,di antaranyaadalah: 1.



Small GroupDiscussion



2.



Role-Play&Simulation



3.



CaseStudy



4.



DiscoveryLearning(DL)



5.



Self-DirectedLearning(SDL)



6.



CooperativeLearning(CL)



7.



CollaborativeLearning(CbL)



8.



ContextualInstruction(CI)



9.



ProjectBasedLearning(PBL)



10. ProblemBasedLearningandInquiry(PBL) Berdasarkan kondisidiatas maka metodeyangdapatditerapkan didalam pembelajaran Bioteknologi Dasar adalah Collaborative Learning (CbL) dan ProjectBasedLearning(PBL). Di



dalamProjectBasedLearning(PBL),



kelompokdandiberitugasuntukdikerjakan,



mahasiswadibagi



menjadi



masing-masing



beberapa



kelompokakan



menpresentasikanhasilpekerjaan dalam bentuk makalah ataupun tugas lainnyadidepan kelasdandilanjutkandiskusiantara



kelompokpresenter



dengankelompok



yangbukan



presenter atau peserta. Pada akhir presentasi,dosen sebagai fasilitatorakanmelakukan koreksidan



membuatkesimpulan.Sedangkan



didalam



ProjectBasedLearning(PBL),fasilitatorakanmemberikansoalyang



berhubungan



tentangfaktayangdiperolehsenyawa atau produktertentu dari sel hidupuntukdijelaskan oleh pesertamata



kuliahsecarabergilirandenganmenggunakan



konsep-konsepyang 7



telahdipelajari.



8



1.8 RANCANGAN PEMBELAJARAN BERBASIS KKNI



NAMA / KODE MATAKULIAH



: BIOTEKNOLOGI DASAR/333H3102



KOMPENTENSI UTAMA



: Kemampuan memahami konsep dasar bioteknologi dan menerapkan pengetahuan bioteknologi dalam berbagai bidang ilmu seperti : sains, pertanian, farmasi, dan kedokteran



KOMPENTENSI PENDUKUNG



: Memiliki kemampuan dan keterampilan dalam berkomunikasi, presentasi materi tentang pengetahuan bioteknologi, dan bekerjasama dalam suatu tim (team working skill)



KOMPENTENSI LAINNYA (INSTITUSIONAL)



: Memiliki kesadaran, kepedulian dan komitmen terhadap pengembangan dan pemanfaatan produk bioteknologi dalam peningkatan kualitas hidup manusia.



MINGGU



SASARAN PEMBELAJARAN



MATERI PEMBELAJARAN



KE



STRATEGI PEMBELAJARAN



INDIKATOR PENILAIAN



BOBOT NILAI (%)



1



- Menjelaskan ruang lingkup dan tujuan pembelajaran Bioteknologi - Menjelaskan atas kontrak pembelajaran



- Deskripsi ruang lingkup mata kuliah dan tujuan belajar bioteknologi - Kontrak pembelajaran



- Umpan balik



- Persetujuan



0



2



- Menjelaskan sejarah, batasan bioteknologi dan aplikasinya



- Pengertian, sejarah, dan aplikasi bioteknologi



- Active Learning :Kuliah, penelusuran



- Kelengkapan isi, kejelasan uraian,



5



9



3-4



5



6-7



- Memprediksi strategi dan arah perkembangan bioteknologi dimasa depan dan hubungannya dengan bidang ilmu lainnya



- perkembangan bioteknologi dimasa depan dan hubungannya dengan bidang ilmu lainnya



pustaka dan tugas mandiri



- Menjelaskan model fermentasi dan mampu membedakan fermentasi sistim tertutup, kontinyu, dan fed-batch - Menjelaskan parameter lingkungan fisik dan kimiawi fermentor - Menggambarkan struktur dan menyebutkan jenis/macam fermentor - Menjelaskan kondisi-kondisi aseptis yang dibutuhkan fermentor



- Model Fermentasi (Fermentasi sistim tertutup, kontinyu, dan fed-batch)



- Collaborative Learning :Kuliah, presentasi dan kerja kelompok



- Kejelasan uraian, sistematis dan ketepatan penerapan konsep pada jawaban



10



- Menjelaskan proses Fermentasi Yoghurt - Menjelaskan proses Fermentasi Nata de Coco - Menjelaskan proses Fermentasi Kecap



- Produk Yoghurt - Produk Nata de Coco - Produk Kecap



- Active Learning :Kuliah,tutorial, Kunjungan industry, kerja kelompok dan presentasi



- Kejelasan uraian, sistematis dan ketepatan penerapan konsep pada jawaban



10



- Menjelaskan pengertian dan penggolongan bioinsektisida - Menjelaskan Bioinsektisida dari Mikroba - Menjelaskan Bioinsektisida



- Pengertian dan penggolongan bioinsektisida - Bioinsektisida dari Mikroba - Bioinsektisida dari Virus



- Problem Base Learnin, Penelusuran pustaka, Presentasi



- Kejelasan langkah uraian, ketepatan penerapan dan konsep pada jawaban



10



- Parameter lingkungan fisik dan kimiawi



kerjasama tim dan kreativitas.



- Struktur dan jenis fermentor - Pencapaian kondisi aseptis dalam fermentor



10



dari Virus



9-10



- Menjelaskan Tinjauan Umum Protein Manusia - Menjelaskan Tinjauan Umum Rekayasa Genetika - Menjelaskan Kegunaan Teknologi Rekombinan - Menjelaskan Tinjauan Umum Vaksin - Menjelaskan Vaksin Rekombinan untuk Beberapa Penyakit



- Tinjauan Umum Protein Manusia - Tinjauan Umum Rekayasa Genetika - Kegunaan Teknologi Rekombinan - Tinjauan Umum Vaksin - Vaksin Rekombinan untuk Beberapa Penyakit



- Problem Based Learning, presentasi, Kerja individu



- Ketepatan penerapan konsep dan sistematis pada jawaban



10



11



- Menjelaskan Pengertian Sel Induk - Menjelaskan Karakteristik dan Jenis Sel Induk - Menjelaskan Aplikasi Kultur Sel Induk - Menjelaskan Bioetika dan kontroversi pada Penggunaan Sel Induk



- Pengertian Sel Induk - Karakteristik dan Jenis Sel Induk - Aplikasi Kultur Sel Induk - Bioetika dan kontroversi pada Penggunaan Sel Induk



- Problem Based Learning :Penelusuran pustaka, kerja kelompok



- Kejelasan langkah uraian, ketepatan penerapan dan konsep pada jawaban



5



12-13



- Menjelaskan Sistem Kekebalan Tubuh Antibodi - Menjelaskan Produksi Antibodi Monoklonal - Menjelaskan Mekanisme kerja Antibodi Monoklonal



- Sistem Kekebalan Tubuh Antibodi - Produksi Antibodi Monoklonal - Mekanisme kerja Antibodi Monoklonal



- Problem Based Learning :Penelusuran pustaka, kerja kelompok



- Kejelasan langkah uraian, ketepatan penerapan dan konsep pada jawaban



10



11



14



8 dan 15



16



- Menjelaskan Pengertian, Batasan dan Klasifikasi Bioinformatika - Menjelaskan Penerapan Bioinformatika dalam Bidang Sains, Kedokteran, dan Kesehatan - Menjawab soal-soal ujian



- Pengertian, Batasan dan Klasifikasi Bioinformatika - Penerapan Bioinformatika dalam Bidang Sains, Kedokteran, dan Kesehatan



- Problem Based Learning :Penelusuran pustaka, kerja kelompok



- Kejelasan langkah uraian, ketepatan penerapan dan konsep pada jawaban



- Tes tertulis (Problem Solving)



- Kerja individu



- Kejelasan langkah sistimatis dalam menyelesaikan soal ujian



10



30



Remedial



Pustaka: 1. 2. 3. 4. 5.



Brown, T. A. (1991) Pengantar Kloning Gene (terjemahan), Editor: Praseno, S. A. M. Penerbit Yayasan Essentia Medica, Yogyakarta. Cooper, G. M. (2001). The Cell a molecular approach 2st Edition ASM press, Washington, D.C. Glick Bernard R., and Jack,J. Pasternak, (1994). Molecular Biotechnology : Principles and Application of Recombinant DNA. Lewin, B. (1997) Genes VI, Oxford Univ. Press. UK. Sambrook, J., Fritsch, E. F. and Maniatis, T. 1989. Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd edn. ColdSpringHarbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor, NY. 6. Walker, S. (2009) Menyingkap Tabir bioteknologi: Panduan Belajar Mandiri (Terjemahan). Penerbit Buku Kedokteran EGC, Jakarta.



12



1.9



Tinjauan MataKuliah Matakuliah Bioteknologi Dasarmembahastentangpengertian, ruang lingkup, dan



perkembangan



bioteknologi,menjelaskan



peranan



bioteknologi



pada



proses



fermentasi,menjelaskan bioinsektisida mikroba dan virus, membahas produksi antigen sebagai kandidat vaksin, membahas sel induk dalam bioteknologi kesehatan, membahas produksi



dan



bioinformatika



mekanisme pada



kerjaantibodi



perkembangan



monoklonal, bioteknologi



dan



menjelaskan



modern.



aplikasi



Prasyarat



MatakuliahBioteknologi Dasar adalah matakuliah Biokimia Dasar dan Biokimia Lanjutan yangdiajarkan pada dua semestersebelumnya.Pemahaman yangbaik yangadadalamkeduamata kuliahtersebutakan sangatmembantu mempelajaridan



mengerti



Dasar.Disampingitu,



tentangbahasantopik materi



secaraanalisisdansintesisakan



pada



tentangmateri



mahasiswauntukdapat



matakuliah



Bioteknologi



pembelajaranyangmenekankanpadacaraberpikir memberikanmodalyangsangatbaik



dan



fleksibelbagimahasiswadalambekerjapada berbagai bidang terutama bidang bioteknologi industridikemudianhari.



13



BAB 2 PENGERTIAN, RUANG LINGKUP, DAN PERKEMBANGAN BIOTEKNOLOGI 2.1



Pendahuluan Pada bagian ini yang akan menjadi sasaran pembelajaran adalah (1) menjelaskan



sejarah, batasan bioteknologi dan aplikasinya, dan (2) memprediksi strategi dan arah perkembangan bioteknologi dimasa depan dan hubungannya dengan bidang ilmu lainnya.Dalam kurun waktu 20 tahun terakhir ini, bioteknologi telah mengalami perkembangan sangat pesat. Pesatnya perkembangan ini sejalan dengan tingkat kebutuhan umat manusia dimuka bumi. Di beberapa negara maju, seperti AS, Cina, dan Jepang, bioteknologi mendapatkan perhatian serius dan dikembangkan secara intensif dengan harapan dapat memberi solusi untuk mengatasi berbagai permasalahan yang dihadapi umat manusia pada saat ini maupun yang akan datang terutama yang menyangkut; kebutuhan pangan, obat-obatan, penelitian, yang pada gilirannya semuanya bertujuan untuk meningkatkan kesejahteraan dan kualitas hidup umat manusia. Istilah bioteknologi pertama kali dikemukakan oleh Karl Ereky, seorang insinyur Hongaria pada tahun 1917 untuk mendeskripsikan produksi babi dalam skala besar dengan menggunakan bit gula sebagai sumber pakannya (Suwanto,1998). Beragam batasan dan pengertian



dikemukakan



oleh



berbagai



lembaga



untuk



menjelaskan



tentang



bioteknologi.Bioteknologi berasal dari kata: Bios: hidup; Teuchos: alat; Logos: ilmu; sehingga bioteknologi dapat diartikan sebagai cabang ilmu yang mempelajari pemanfaatan makhluk hidup (bakteri, fungi, virus, dan lain-lain) maupun produk dari makhluk hidup (protein bioaktif, enzim, vitamin, asam basa organik, alkohol, dan lain lain) dalam proses produksi untuk menghasilkan barang dan jasa. Menurut Smith, JE. (2009), bioteknologi memiliki beberapa defenisi sebagai berikut:



1. Sebuahkata benda yang mewakili aplikasibiologi,sistem organisme atauproses untukindustrimanufaktur dan jasa.



2. Penggabungan



ilmubiokimia,



mikrobiologidan



rekayasa



terpadudalam



rangka



meningkatkan aplikasiteknologi(industri) darimikroorganisme,kultur jaringan sel-seldan bagian-bagiannya.



3. Sebuah



teknologimenggunakan



fenomenabiologis



untukmenyalindan



membuatberbagai jeniszatatau senyawa yang berguna.



4. Penerapanprinsip-prinsip



ilmiahdan



rekayasa



untukpengolahan



bahanoleh



agenbiologiuntuk menyediakanbarang dan jasa.



13



5. Ilmu tentang proses produksi berdasarkan aktifitas mikroorganisme dan komponen aktifnya dan proses produksi yang melibatkan penggunaan sel dan jaringan dari organisme yang lebih tinggi.



6. Tidak lebih darinama yang diberikanuntuk sebuah set teknikdan proses-prosesnya. 7. Penggunaan organisme hidup dan komponen-komponennya dalam bidang pertanian, pangan, dan proses industri lainnya.



8. Penguaraian dan penggunaan pengetahuanbiologi dan kimia. 9. Aplikasi pengetahuan dan pemahaman kita tentang biologi untuk memenuhi kebutuhan praktis. Menurut EFB (European Federation of Biotechnology), bioteknologi sebagai perpaduan dari ilmu pengetahuan alam dan ilmu rekayasa yang bertujuan untuk meningkatkan aplikasi organisme hidup, sel, bagian dari organisme hidup, dan/atau analog molekuler untuk menghasilkan barang dan jasa. DefinisiEFBini berlaku untukkedua bioteknologi



'tradisional



atau



Bioteknologitradisionalmengacu



tua'



dan



bioteknologi



'baru



padateknikkonvensionalyang



telah



atau



modern'.



digunakanselama



berabad-abaduntuk menghasilkanbir, anggur, keju dan makananlainnya sejak zaman Yunani dan Mesir kuno,sedangkan bioteknologi 'baru atau modern'mencakupsemua metodemodifikasi genetikoleh DNArekombinandan teknikfusiseldengan perkembangan proses bioteknologimodern dari bioteknologi'tradisional'. Menurut But et al, (1982) bioteknologi merupakan penerapan asas-asas sains (ilmu pengetahuan alam) dan rekayasa (teknologi) untuk pengolahan suatu bahan dengan melibatkan aktivitas jasad hidup untuk menghasilkan barang dan/atau jasa. Sedangkan Primrose (1987), bioteknologi merupakan eksploitasi komersial organisme hidup atau komponennya seperti: sel, enzim dan senyawa organik lainnya. Organization for Economic Co-operation and Development (OECD)(1982), mendefinisikan bahwa bioteknologi merupakan penerapan prinsip-prinsip ilmu pengetahuan dan kerekayasaan untuk penanganan dan pengolahan bahan dengan bantuan agen biologis untuk menghasilkan bahan dan jasa yang mendukung pertumbuhan ekonomi. Berdasarkan definisi dan pengertian di atas, maka bioteknologi secara holistik adalah suatu proses yang unsur-unsurnya sebagai berikut: 1.



Input yaitu bahan kasar (raw material) yang akan diolah seperti; beras, anggur, susu, dan sebagainya.



2.



Proses yaitu mekanisme pengolahan yang meliputi; proses penguraian atau penyusunan oleh agen hayati.



3.



Output yaitu produk baik berupa barang dan/atau jasa, seperti; alkohol, enzim, antibiotika, hormon, dan pengolahan limbah (Nurcahyo, 2011). 14



Banyak batasan yang diberikan oleh para ahli akan tetapi komponen utama proses bioteknologi terdiri atas tiga bagian pokok, yaitu bagianberkaitan dengankatalis biologis (enzim)yang terbaikuntuk fungsi tertentuatau proses (agen biologis mikroba; enzim, sel tanaman, sel hewan), bagian keduamenciptakan(dengan konstruksi dan operasi teknis) kondisiterbaikuntuk proses katalis (pendayagunaan secara teknologis dan industrial), dan bagianketiga



(pengolahan



downstream)



berkaitan



denganpemisahan



danpemurnianprodukesensialatau produkdariproses fermentasi (produk dan jasa yang diperoleh). Dahulu bioteknologi dianalogikan dengan industri mikrobiologi (industri yang berbasis pada peran agen-agen mikroba). Tetapi perkembangan selanjutnya, tanaman dan hewan juga dieksploitasi secara komersial seperti; hortikultura dan agrikultura. Dengan demikian,



“payung”



bioteknologi



sangatlah



luas



mencakup



semua



teknik



untuk



menghasilkan barang dan jasa dengan memanfaatkan sistem biologi atau sel hidup. Produk-produk bioteknologi sangat erat dengan perkembangan bioteknologi pada zamannya. Adapun era bioteknologi dapat dibagi atas (Suharto, 1995): 1.



Era Pra Pasteur (sebelum 1865), perbaikan teknik fermentasi oleh mikroorganisme misalnya minuman beralkohol.



2.



Era Pasteur (1865-1940), pengembangan industri fermentasi pembuatan etanol, butanol dan asam organik, perlakuan air buangan.



3.



Era Antibiotika (1940-1960), pembuatan penisilin yang mulai digunakan pada saat pendaratan tentara Amerika di Normandy selama perang dunia kedua, vaksin virus, teknologi kultur sel hewan.



4.



Era Pasca Antibiotika (1960-1975), asam-asam amino, eluidasi struktur DNA, protein sel tunggal, enzim untuk deterjen, gasohol, biogas, dan teknologi rekombinan DNA.



5.



Era Bioteknologi Modern (1975 - sampai saat ini), rekayasa genetika, zat antibodi monoklonal, hormon insulin, dan hormon pertumbuhan ikan tuna, dan lain-lain. Kemajuan dan perkembangan bioteknologi tidak dapat terlepas dari kemajuan dan



dukungan ilmu-ilmu dasar seperti: mikrobiologi, biokimia, biologi molekuler, dan genetika. Bioteknologi modern lahir pada awal tahun 70-an diawali dengan inovasi para ilmuwan Amerika Serikat (AS) mengembangkan teknologi DNA rekombinan. Berkat penemuan ini lahirlah perusahaan bioteknologi pertama di dunia, yaitu Genentech di AS yang berhasil memproduksi protein hormon insulin recombinant yang dibutuhkan penderita diabetes, dalam sel bakteri E.coli. Selama ini insulin hanya bisa didapatkan dalam jumlah sangat terbatas dari organ pankreas sapi atau babi (Witarto, 2003). Perkembangan bioteknologi modern tidak lepas dari perkembangan bioteknologi molekuler yang didorong oleh pengetahuan tentang biologi sel dan molekular. Bioteknologi molekular ditujukan untuk 15



memanipulasi suatu organisme pada taraf selular dan molekular (rekayasa genetika dan biologi molekular). Tahapan perkembangan bioteknologi yang dimulai dari bioteknologi konvensional sampai bioteknologi modern dapat dilihat pada Tabel 2.1. Tabel 2.1. Sejarah Perkembangan Bioteknologi No 01 02 03 04 05 06 07 08 09 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23



Tahun 1917 1943 1944 1953 1961 1966 1970 1972 1973 1975 1976 1978 1980 1981 1981 1982 1982 1983 1983 1990 1997 2002 2003



Kejadian/Penemuan Karl Ereky memperkenalkan istilah bioteknologi Produksi penisilin dalam skala industri Avery, Mac Leod dan McMarty menemukan DNA sebagai materi genetika Watson dan Crick menemukan struktur ganda heliks DNA Jurnal bioteknologi dan bioengineering pertama diterbitkan Kode genetika berhasil diuraikan Enzim restriksi endonuklease berhasil diisolasi Khorona dkk. mensintesis gen tRNA Boyer dan Cohen memantapkan teknologi DNA rekombinan Kohler dan Milstein memproduksi antibodi monoklonal Buku petunjuk DNA rekombinan diluncurkan pertama kali Perusahaan Genetech memproduksi insulin manusia dalam bakteri E. coli Mahkamah Agung AS memutuskan mikroba transgenik dapat dipatenkan Mesin sintesis DNA otomatis pertama kali dijual secara komersial Antibodi monoklonal berbasis kit diagnostik digunakan pertama kali di AS Vaksin dari hewan transgenik diproduksi pertama kali Hormon insulin rekombinan mulai dijual secara komersial Mesin plasmid Ti digunakan untuk transformasi gen tanaman Metode PCR untuk amplifikasi DNA secara in vitro diperkenalkan oleh Mullis Proyek pemetaan genom manusia mulai dilakukan Kloning sel inti pada mamalia dengan menggunakan sel epitel domba Padi transgenik yang mengandung -karoten mulai diproduksi Proyek pemetaan genom manusia telah rampung



Sumber: Modifikasi dari Glick dan Pasternak (2003). Bioteknologi memiliki beberapa jenis atau cabang ilmu seperti diantaranya diasosiasikan dengan beberapa jenis warna, yaitu : 1.



Bioteknologi merah (red biotechnology) adalah cabang ilmu bioteknologi yang mempelajari aplikasi bioteknologi di bidang medis. Cakupannya meliputi seluruh spektrum pengobatan manusia, mulai dari tahap preventif, diagnosis, dan pengobatan. Contoh penerapannya adalah pemanfaatan organisme untuk menghasilkan obat dan vaksin, penggunaan sel induk untuk pengobatan regeneratif, serta terapi gen untuk mengobati penyakit genetik dengan cara menyisipkan atau menggantikan gen abnomal dengan gen yang normal.



2.



Bioteknologi putih/abu-abu (white/gray biotechnology) adalah bioteknologi yang diaplikasikan dalam industri seperti pengembangan dan produksi senyawa baru serta pembuatan sumber energi terbarukan. Dengan memanipulasi mikroorganisme seperti bakteri dan khamir/ragi, enzim-enzim juga organisme-organisme yang lebih baik telah tercipta untuk memudahkan proses produksi dan pengolahan limbah industri. Pelindian



16



(bleaching)



minyak



dan



mineral



dari



tanah



untuk



meningkatkan



efisiensi



pertambangan, dan pembuatan bir dengan khamir. 3.



Bioteknologi hijau (green biotechnology) mempelajari aplikasi bioteknologi di bidang pertanian dan peternakan. Di bidang pertanian, bioteknologi telah berperan dalam menghasilkan tanaman tahan hama, bahan pangan dengan kandungan gizi lebih tinggi dan tanaman yang menghasilkan obat atau senyawa yang bermanfaat. Sementara itu, di bidang peternakan, binatang-binatang telah digunakan sebagai "bioreaktor" untuk menghasilkan produk penting contohnya kambing, sapi, domba, dan ayam telah digunakan sebagai penghasil antibodi-protein protektif yang membantu sel tubuh mengenali dan melawan senyawa asing (antigen).



4.



Bioteknologi biru (blue biotechnology) disebut juga bioteknologi akuatik/perairan yang mengendalikan proses-proses yang terjadi di lingkungan akuatik. Salah satu contoh yang paling tua adalah akuakultura, menumbuhkan ikan bersirip atau kerangkerangan dalam kondisi terkontrol sebagai sumber makanan, (diperkirakan 30% ikan yang dikonsumsi di seluruh dunia dihasilkan oleh akuakultura). Perkembangan bioteknologi akuatik termasuk rekayasa genetika untuk menghasilkan tiram tahan penyakit dan vaksin untuk melawan virus yang menyerang salmon dan ikan lainnya. Contoh yang lain adalah salmon transgenik yang memiliki hormon pertumbuhan secara berlebihan sehingga menghasilkan tingkat pertumbuhan sangat tinggi dalam waktu yang singkat.



2.2



Batasan dan Pengertian Bioteknologi Bioteknologi adalah proses transformasi dengan memanfaatkan pengetahuan biologi,



biokimia, mikrobiologi, biologi molekuler, biofarmasi dan kemajuan rekayasa dalam sebuah penelitian memakai sel hidup yang akan membawa penemuan baru dan penyempurnaan pemecahan masalah di berbagai bidang kehidupan manusia.Rekayasa genetik mempunyai dampak terhadap perbaikan dan keamanan produk, dan memberikan pemecahan teknis dalam penyebarluasan pemakaian obat dengan bahan baku yang terbatas. Prinsip yang mendasari penggunaan rekayasa genetik adalah bahwa satu atau sejumlah gen patogen dimasukkan ke dalam vektor untuk kemudian dipindahkan ke dalam pembawa yang cocok. Penggabungan antara teknologi DNA rekombinan dengan bioteknologi melahirkan suatu bidang studi yang sangat dinamis dan kompetitif yang disebut Bioteknologi Molekuler. Dalam arti luas, bioteknologi molekular adalah penggunaan teknik laboratorium untuk mempelajari dan memodifikasi asam nukleat dan protein untuk aplikasi di berbagai bidang kehidupan seperti kesehatan manusia dan hewan, pertanian, dan lingkungan. Bioteknologi molekuler ditujukan memanipulasi suatu organisme pada taraf selular dan 17



molekular (rekayasa genetika dan biologi molekular). Hasil manipulasi dapat diprediksi dan diarahkan dengan ketepatan yang lebih tinggi, dapat mengkonstruksi galur/varietas baru dengan bahan genetik tambahan yang tidak pernah ada pada galur asalnya. Sel prokariota atau eukariota dapat digunakan sebagai “pabrik biologis” untuk porduksi senyawa metabolit primer maupun metabolit sekunder (www.mb.kumc.edu/whatis.html). Bioteknologi molekul hasil dari konvergensi dari banyak bidang penelitian, seperti biologi molekuler, mikrobiologi, biokimia, imunologi, genetika, dan biologi sel. Ini adalah bidang yang sangat menarik karena didorong oleh kemampuan untuk mentransfer informasi genetik antara organisme dengan tujuan memahami proses biologi penting atau menciptakan produk yang bermanfaat. Penyelesaian proyek genom manusia pada tahun 2003 telah membuka banyak peluang untuk menciptakan obat baru dan perawatan, serta pendekatan untuk meningkatkan aktivitas obat-obatan yang ada. 2.3



Peranan Ilmu Biologi, Biokimia, dan Keteknikan dalam Perkembangan Bioteknologi Molekular Perkembangan bioteknologi tidak hanya didasari pada biologi semata, tetapi juga



pada ilmu-ilmu terapan dan murni lain, seperti biologi molekuler, mikrobiologi, biokimia, imunologi, genetika, dan biologi sel. Dengan kata lain, bioteknologi adalah ilmu terapan yang menggabungkan berbagai cabang ilmu yang dapat dikelompokkan dalam dua cabang ilmu, yaitu ilmu biologi, kimia, dan ilmu teknik dalam proses produksi barang dan jasa, seperti yang ditunjukkan dengan diagram pada Gambar 2.1.



Gambar 2.1: Diagram yang menghubungkan peranan ilmu biologi, ilmu kimia, dan ilmu teknik untuk mendukung bidang bioteknologi dalam proses produksi barang dan jasa. 2.3.1 Ilmu Biologi 18



Ilmu biologi merupakan ilmu pengetahuan yang mempelajari makhluk hidup atau secara terperinci dapat dikatakan sebagai ilmu pengetahuan yang mengkaji secara umum kehidupan hewan dan tumbuhan termasuk aspek morfologi, fisiologi, asal-usul, perkembangan, penyebaran, kehidupan hewan dan tumbuhan dalam satu daerah dan mempelajari fenomena biologik yang berkaitan dengan organisme secara individual atau dalam suatu kelompok. Dalam perkembangan bioteknologi molekular ada beberapa cabang ilmu biologi yang memegang peranan penting, seperti biologi molekular, biologi sel, mikrobiologi, dan ilmu genetika. a. Biologi Molekular Biologi molekular dapat didefenisikan sebagai ilmu yang mempelajari fungsi dan organisasi jasad hidup (organisme) ditinjau dari struktur dan regulasi molekular unsur atau komponen penyusunnya. Beberapa penulis mendefenisikan biologi molekuler sebagai ilmu yang mempelajari organisasi, aktivitas dan regulasi gen pada level molekul. Dalam kajian ini juga termasuk mengenai replikasi DNA, transkripsi, translasi, rekombinasi, dan translokasi. Aspek biologi yang secara khusus dipelajari dalam biomolekular antara lain adalah bahan genetik dan proses sintesis protein. Kedua aspek tersebut merupakan satu kesatuan yang tidak dapat dipisahkan karena proses sintesis protein tergantung pada informasi yang ada pada bahan genetik. Di lain pihak, replikasi bahan genetik juga tergantung pada aktivitas bermacam-macam protein. Pembahasan mengenai kedua aspek tersebut dapat diperluas mulai dari struktur dasarnya sampai proses pengendalian sintesisnya (Yuwono, 2005). Asam nukleat dan protein merupakan senyawa polimer utama yang terdapat pada sel. Asam nukleat berfungsi menyimpan dan mentransmisikan informasi genetik dalam sel. Sel mempunyai dua jenis molekul asam nukleat yaitu DNA (asam deoksiribonukleat) dan RNA (asam ribonukleat). DNA menyimpan informasi genetik yang spesifik untuk setiap individu dan spesies tertentu, yang akan diwariskan ke generasi berikutnya. Semua sel menggunakan sistem dimana informasi yang terdapat dalam DNA di copy menjadi RNA dan kemudian diubah menjadi protein oleh mesin molekul yang disebut ribosom. Pada tingkat molekul, sel-sel memiliki lebih banyak kesamaan daripada perbedaan. 1.



Lokasi DNA dan RNA



DNA dan RNA berperan sebagai materi genetik pada sel prokariot dan eukariot, virus, dan plasmid, masing-masing mempunyai pengaturan dan lokasi yang berbeda. Pada prokariot, DNA tidak terpisah dari komponen sel lain. Pada eukariot DNA berlokasi dalam nukleus terpisah dari komponen sel lain oleh selaput inti. DNA eukariot berikatan dengan protein,



membentuk



kompleks



yang



disebut



kromatin.



Sebelum



proses



mitosis



19



(pembelahan sel), DNA mengalami replikasi, menghasilkan dua kromosom identik yang disebut sister kromatid. Kurang dari 0,1% total DNA dalam sel terdapat dalam mitokondria. Informasi genetik dalam mitokondrion dikode oleh kurang dari 20.000 pasang basa DNA. Informasi genetik dalam kromosom haploid manusia (contohnya: sel telur dan sel sperma) dikode 9



oleh kira-kira 3 x 10 (3 milyar) pasang basa yang mengode 30.000-40.000 gen. DNA dan sistem sintesis protein dalam mitokondria lebih kurang sama dengan sistem bakteri, dimana tidak terdapat membran yang menutupi organel. Virus merupakan partikel penginfeksi yang kecil dan terdiri dari genom DNA atau RNA (tidak keduanya), protein yang diperlukan untuk patogenesis atau replikasi dan mantel protein. Virus tidak memiliki semua sistem untuk replikasi, transkripsi dan translasi, sehingga konsekuensinya virus harus menginfeksi sel lain dan menggunakan perangkat sintesis protein sel inang (host) untuk bereproduksi. Eukariot dan prokariot dapat diinfasi oleh virus. Plasmid merupakan molekul DNA sirkular kecil yang dapat masuk ke dalam bakteri dan bereplikasi sendiri, terpisah dari genom inang. Kebalikan dari virus, plasmid tidak bersifat menginfeksi, plasmid tidak merubah sel inang menjadi pabrik untuk memproduksi plasmid. Plasmid biasanya mengkode gen yang memberikan sifat tertentu pada bakteri, misalnya gen pengkode resistan antibiotik. Ahli rekayasa genetika menggunakan plasmid sebagai alat untuk mentransfer gen asing ke dalam bakteri karena sepotong DNA dengan cepat bergabung dengan DNA plasmid. 2.



Struktur DNA dan RNA



Asam nukleat yang merupakan polimer dari nukleotida sebagai pendukung dari DNA dan RNA yang terdiri dari basa-basa heterosiklik purin dan pirimidin, ribosa atau deoksiribosa dan gugus fosfat. Asam nukleat mempunyai urutan nukleotida yang unik sama seperti urutan asam amino yang unik dari suatu protein tertentu. Di samping itu juga kita dapat melihat bahwa nukleotida merupakan biomolekul dengan struktur tiga dimensi, penggabungan asam-asam nukleat dan protein untuk membentuk struktur-struktur sejenis ribosom dan virus.



DNA dan RNA merupakan polimer linier (polinukleotida) yang tersusun dari subunit atau monomer nukleotida. Komponen penyusun nukleotida terdiri dari tiga jenis molekul, yaitu gula pentosa (deoksiribosa pada DNA atau ribosa pada RNA), basa nitrogen, dan gugus fosfat (Gambar 2.2). Basa yang ditemukan pada nukleotida adalah basa purin (adenin = A, guanin = G) dan basa pirimidin (cytosin = C, tymin = T, urasil = U) (Gambar 2.3). Monomer nukleotida mempunyai gugus hidroksil pada posisi karbon 3’, gugus fosfat pada posisi karbon 5’ dan basa nitrogen pada posisi 20



karbon 1’ molekul gula pentosa. Nukleotida satu dengan yang lainnya berikatan melalui ikatan fosfodiester antara gugus 5’fosfat dengan gugus 3’hidroksil.



Gambar 2.2:Struktur Nukleotida pada penyusun RNA Berdasarkan model DNA dari James Watson dan Francis Crick yang menunjukkan bahwa DNA memiliki model heliks ganda (double helix). Di bagian luar terdapat deretan gula-pospat (yang membentuk tulang punggung dari “double helix). Di bagian dalam dari “double helix” terdapat basa purin dan pirimidin. Maka satu spiral penuh (360o) mengandung 10 pasangan basa. Sedangkan jarak antara satu basa dengan basa lainnya ialah 3,4o A. Panjang molekul DNA pada umumnya tersusun dalam ribuan pasangan basa atau kilobase pavis (kbp). Setiap pasangan basa dipisahkan dari urutan sebelumnya sekitar 0,34 nm atau sekitar 3,4 x 10-7mm. Polaritas dari rantai DNA ditunjukkan dengan sebutan ujung 5‛ dan ujung 3‛. Arah pembacaan basa nukleotida dari ujung-5‛ menuju ujung-3‛. 3‛ membawa gugus –OH bebas pada posisi 3‛ dari cincin gula, dan ujung 5‛ membawa gugus fosfat bebas pada posisi 5‛ dari cincin gula(Suryo, 1998; Campbell, 2002; Jawetz, 2005; Fatchiyah, 2006). DNA double heliks dapat dikopi secara persis karena masing-masing untai mengandung sekuen nukleotida yang persis berkomplemen dengan sekuen untai pasangannya. Masing-masing untai dapat berperan sebagai cetakan untuk sintesis dari untai komplemen baru yang identik dengan pasangan awalnya (Campbell, 2002; Fatchiyah, 2006). Struktur DNA mirip dengan struktur RNA. Perbedaan diantara keduanya terdapat pada jenis gula dan basa pada monomernya serta jumlah untai penyusunnya. Pada DNA, tidak terdapat gugus hidroksil pada posisi karbon 2’ dari molekul gula pentosa (2deoksiribosa) sementara pada RNA molekul gula pentosanya adalah ribosa. Basa nitrogen yang terdapat pada DNA adalah adenin, guanin, sitosin dan timin, sedangkan pada RNA jenis basanya adalah adenin, sitosin, guanin dan urasil. RNA merupakan polinukleotida yang membentuk satu rantai/untai sedangkan DNA merupakan polinukleotida yang membentuk 2 untai (heliks ganda). 21



Gambar 2.3. Struktur basa purin dan pirimidin (Adenin dan Guanin; Cytosin, Tymin dan Urasil) 3.



Nukleosida dan Nukleotida



Bila basa purin dan pyrimidin bergabung dengan gugus gula ribosa atau deoksiribosa akan menghasilkan senyawa yang disebut nukleosida. Terdapat dua jenis nukleosida: ribonukleosida dan deoksiribonukleosida. Jadi adenin yang berkondensasi dengan gula ribosa membentuk senyawa ribonukleosida adenosin, untuk guanin diberi nama guanosin, sitosin membentuk sitidin dan urasil membentuk uridin. Ribonukleosida diatas dapat terbentuk pada hidrolisis parsial molekul RNA. Nukleosida turunan gula 2deoksiribosa



dikenal



dengan



nama



deoksiribonukleosida,



yaitu:



deoksiadenosin,



deoksiguanosin, deoksisitidin dan deoksitimidin (Tabel 2.1). Nukleotida merupakan ester dari asam fosfat dan nukleosida. Asam fosfat terikat pada gugus hidroksil dari salah satu atom karbon dalam cincin pentosa. Nukleotida terdapat bebas dalam sel, dan dapat terbentuk dari hidrolisis bertahap asam nukleat dengan enzim nuklease. Seperti halnya nukleosida, nukleotida dibagi menjadi dua golongan: deoksiribonukleotida dan ribonukleotida. 22



Tabel 2.1: Tata nama nukleosida, nukleotida, dan asam nukleat



4.



Struktur Primer Asam Nukleat



Asam nukleat merupakan polimer dari ratusan, ribuan, bahkan jutaan nukleotida yang bergabung satu sama lainnya melalui ikatan fosfodiester. Ikatan fosfodiester terbentuk antara gugus OH pada posisi 3’ dengan gugus fosfat pada posisi 5’, sehingga tulang punggung molekul DNA dan RNA terdiri dari gugus fosfat dan pentosa secara bergantian. Oleh karena basa purin dan pirimidin dari asam nukleat mengandung gugus fungsional yang memungkinkan terjadinya ikatan hidrogen, maka pada struktur molekul DNA terdapat pasangan-pasangan basa purin dan pirimidin dengan ikatan hidrogen yang sangat menentukan struktur asam nukleat dan fungsi asam-asam amino. Secara keseluruhan molekul DNA tersusun dari dua rantai polinukleotida yang bergabung sepanjang rantai dan bergulung menurut suatu sumbu untuk menghasilkan suatu ganda heliks (spiral). Dua rantai polinukleotida saling berikatan melalui ikatan atom hidrogen antara basa- basa nitrogen dari rantai yang berbeda. yaitu antara pasangan purin dan pirimidin tertentu. Adenin hanya dapat berpasangan dengan timin, yang dihubungkan oleh dua atom H, sedangkan guanine hanya dapat berpasangan dengan sitosin yang dihubungkan oleh tiga atom H. Jadi dua deretan nukleotida itu komplementer satu dengan lainnya, artinya urutan nukleotida dalam satu mendikte urutan nukleotida dari deret pasangannya (Suryo, 1998).



23



Gambar 2.4: Struktur primer dari molekul DNA dan RNA



24



5.



Struktur Sekunder DNA (Heliks Ganda)



Struktur sekunder DNA pertama kali ditemukan oleh Watson dan Crick pada tahun 1953, dengan menggunakan teknik difraksi sinar X. Struktur molekul DNA merupakan rantai ganda heliks yang memutar ke kanan (Gambar 2.5). Kedua rantai polinukleotida memutar pada sumbu yang sama dan bergabung menjadi satu dengan yang lainnya melalui ikatan hidrogen antara basa-basa nitrogen. Basa guanin berpasangan dengan basa cytosin, sedangkan basa adenin berpasangan dengan basa tymin. Antara basa guanin dan basa cytosin terbentuk tiga ikatan hidrogen, sedang antara basa adenin dan tymin terbentuk dua ikatan hidrogen. Sehingga dalam molekul DNA jumlah basa G akan selalu sama dengan jumlah basa C, sedangkan jumlah basa A=T. Kemudian jumlah basa purin (A + G) akan sama dengan jumlah basa pyrimidin (C + T). Kedua untai DNA saling berkomplementasi melalui basa penyusunnya dengan arah antiparalel (berlawanan 5’→ 3’ vs 3’→5’), ujung yang mengandung gugus fosfat bebas disebut ujung 5’ sedangkan pada ujung lainnya yang mengandung gugus hidroksil bebas disebut ujung 3’. Kedua untai tersebut saling melilit satu sama lain membentuk struktur ganda heliks. Gugus fosfat dan gula yang tersusun bergantian menjadi tulang punggung (backbone) molekul DNA sementara pada bagian dalam terdapat basa yang melekat pada molekul gula (pentosa).



Gambar 2.5: Struktur double heliks molekul DNA Untuk memudahkan pembacaan dan penulisannya, urutan DNA hanya dituliskan nama-nama basanya dengan menuliskan tanda 5’ dan 3’ pada ujung-ujungnya, karena urutan DNA selalu diawali gugus pospat yang terikat pada C-5 dari gula pentosa dan 25



diakhiri gugus –OH yang terikat pada C-3 dari gula pentose (Gambar 2-3). Untuk memudahkan penulisannya, DNA untai ganda biasanya hanya dituliskan satu untai saja dengan menuliskan tanda 5’ dan 3’ pada ujung-ujungnya atau diawali dari ujung 5’ dan diakhiri dari ujung 3’. Rantai RNA berbentuk untai tunggal sehingga tidak membentuk struktur heliks yang teratur seperti DNA. Walaupun demikian RNA mungkin bisa membentuk struktur sekunder dan tersier karena pasangan basa bisa terbentuk pada daerah yang membentuk loops. Terdapat tiga tipe molekul RNA dalam sel, yaitu mRNA, tRNA dan rRNA. Molekul mRNA mengandung urutan nukleotida yang akan mengkode urutan asam amino dari protein pada proses translasi. mRNA eukariot terdiri dari urutan leader pada ujung 5’, daerah pengkode, dan ekor poli A pada ujung 3’. Molekul rRNA dan tRNA merupakan perangkat untuk sintesis protein, tapi tidak mengkode protein. Struktur rRNA mengandung banyak loops, dan terdapat pasangan basa diantara loops, sedangkan struktur tRNA berbentuk seperti daun (cloverleaf). rRNA memiliki pasangan basa internal yang membentuk kompleks dengan protein membentuk partikel ribonukleoprotein yang disebut ribosom. Semua RNA dibuat sebagai salinan (copy) dari salah satu rantai polinukleotida DNA. Dengan demikian maka semua RNA adalah komplementer dengan DNA. Seperti pada DNA maka RNA disintesiskan dari keempat ribonukleotida trifosfat yang dihubungkan dengan pelepasan pirofosfat. Sintesis ini berlangsung dalam inti sel, karena DNA terlokalisasi pada organel sel tersebut. Ada tiga macam RNA yang dapat dibedakan berdasarkan fungsinya, yaitu : 1.



RNA –penyampai (m-RNA); berperan memindahkan informasi genetis dari susunan basa DNA yang telah disalin ke dalam deretannya sendiri ke luar dari inti sel ke ribosom tempat sintesis protein. Messenger-RNA (m-RNA) yang mempunyai berat molekul sampai beberapa ratus ribu dan tidak memiliki konformasi ruang tertentu.



2.



RNA pemindah (t-RNA); yaitu berperan dalam proses penterjemahan dari susunan basa m-RNA menjadi susunan asam amino dari protein atau pembawa asam amino spesifik pada pembentukan polipeptida.



3.



RNA-ribosomal (r-RNA); berperan sebagai komponen utama ribosoma sebagai tempat sintesis protein. r-RNA ini mempunyai susunan basa nukleotida terdiri dari beberapa ribu, dan memiliki konformasi yang belum diketahui serta banyak mengandung basa Guanin dan Sitosin.



26



Gambar 2.6: Perbedaan struktur DNA dan RNA 6.



Fungsi Asam Nukleat



Asam nukleat DNA berperan penting dalam menjaga kelestarian spesies dari generasi ke generasi. DNA melalui urutan basanya membawa kode informasi genetik yang spesifik untuk setiap individu dan untuk spesies tertentu yang diturunkan dari generasi ke generasi berikutnya. Informasi genetik pada DNA akan ditranskripsi menjadi RNA dan selanjutnya RNA akan ditranslasikan menjadi protein. Tidak semua informasi genetik tersimpan dalam bentuk DNA, seperti pada virus tertentu seperti retrovirus materi genetik tersimpan dalam bentuk RNA. Dalam biologi molekular dikenal dogma central yang memiliki arti penting dalam perkembangan bioteknologi molekular.



27



Gambar 2.7: Dogma central biologi molekular (sumber : ncbi.nlm.nih.gov) Secara umum bioteknologi molekular berkaitan dengan tiga bahan molekul yang yang menjadi dasar dari aplikasi teknik-teknik biologi molekular, yaitu ; DNA, RNA dan protein. Perubahan DNA menjadi RNA dapat terjadi adalam proses yang disebut dengan transkripsi, sedangkan RNA ke protein dapat dihasilkan dengan proses translasi (ncbi.nlm.nih.gov). b. Mikrobiologi Ilmu biologi berikutnya yang sangat berperan dalam bioteknologi molekular adalah ilmu mikrobiologi. Mikrobiologi merupakan cabang ilmu biologi yang khusus mempelajari jasad-jasad renik atau mikroorganisme. Mikrobiologi berasal dari bahasa yunani (micros: kecil, bios: hidup, dan logos: pengetahuan) sehingga secara singkat dapat diartikan bahwa mikrobiologi adalah ilmu yang mempelajari tentang makhluk-makhluk hidup yang kecilkecil.



Makhluk-makhluk



hidup



yang



kecil-kecil



tersebut



disebut



juga



dengan



mikroorganisma, mikroba, jasad renik atau protista. Ilmuwan menyimpulkan bahwa mikroorganisme sudah dikenal lebih kurang 4 juta tahun yang lalu dari senyawa organik kompleks yang terdapat di laut, atau mungkin dari gumpalan awan yang sangat besar yang mengelilingi bumi. Sebagai makhluk hidup pertama di bumi, mikroorganisme diduga merupakan nenek moyang dari semua makhluk hidup. Awal perkembangan ilmu mikrobiologi pada pertengahan abad ke-19 oleh beberapa ilmuwan dan telah membuktikan bahwa mikroorganisme berasal dari mikroorganisme sebelumnya bukan dari tanaman ataupun



hewan



yang



membusuk.



Selanjutnya



ilmuwan



membuktikan



bahwa



mikroorganisme bukan berasal dari proses fermentasi tetapi merupakan penyebab proses fermentasi, misalnya buah anggur menjadi minuman yang mengandung alkohol. Ilmuwan juga menemukan bahwa mikroba tertentu menyebabkan penyakit tertentu. Pengetahuan ini merupakan awal pengenalan dan pemahaman akan pentingnya mikroorganisme bagi 28



kesehatan dan kesejahteraan manusia. Pada awal abad 20 yang lalu, ahli mikrobiologi telah meneliti dan membuktikan bahwa mikroorganisme mampu menyebabkan berbagai macam perubahan kimia baik melalui penguraian maupun sintesis senyawa organik yang baru. Hal inilah yang disebut dengan biochemical diversity atau keanekaragaman biokimia yang menjadi ciri khas mikroorganisme. Disamping itu, hal yang penting lainnya adalah mekanisme perubahan kimia oleh mikroorganisme sangat mirip dengan unity in biochemistry yang artinya bahwa proses biokimia pada mikroorganisme adalah sama dengan proses biokimia pada semua makhluk hidup termasuk manusia. Bukti yang lebih baru menunjukkan bahwa informasi genetik pada semua organisme dari mikroba hingga manusia adalah DNA. Pengambilan informasi genetika dari mikrorganisme karena sifatnya sederhana dan perkembangbiakan yang sangat cepat serta adanya berbagai variasi metabolisme. Saat ini mikroorganisme diteliti secara intensif untuk mengetahui dasar fenomena biologi. Mikroorganisme juga merupakan sebagai sumber produk dan proses yang menguntungkan masyarakat, misalnya: alkohol yang dihasilkan melalui proses fermentasi dapat digunakan sebagai sumber energi. Strain-strain dari mikroorganisme yang dihasilkan melalui proses rekayasa genetika dapat diterima. Sekarang insulin yang dibutuhkan manusia dapat diproduksi dalam jumlah tak terhingga oleh bakteri yang telah direkayasa.



Mikroorganisme



juga



mempunyai



potensi



yang



cukup



besar



untuk



membersihkan lingkungan, misalnya: dari tumpukan minyak di lautan dipergunakan sebagai herbisida dan insektisida di bidang pertanian. Hal ini disebabkan karena mikroorganisme mempunyai kemampuan untuk mendekomposisi/menguraikan senyawa kimia kompleks. Kemampuan mikroorganisme yang telah direkayasa untuk tujuan tertentu menjadikan lahan baru dalam mikrobiologi industri yang dikenal dengan bioteknologi. Jika anda



membaca



tentang



mikroorganisme



anda



akan



menghargai,



mengagumi



mikroorganisme seperti bakteri, alga, protozoa dan virus merupakan organisme yang sering tidak terlihat. Beberapa diantaranya bersifat patogen bagi manusia, hewan maupun tumbuhan. Beberapa dapat menyebabkan lapuknya kayu dan besi. Tetapi banyak diantaranya berperan penting dalam lingkungan sebagai dekomposer. Beberapa diantaranya digunakan dalam menghasilkan (manufacture) substansi yang penting di bidang kesehatan maupun industri pangan. Beberapa aspek yang dibahas dalam mikrobiologi, antara lain mengkaji tentang: a.



Karakteristik sel hidup dan bagaimana mereka melakukan kegiatan.



b.



Karakteristik mikroorganisme, suatu kelompok organisme penting yang mampu hidup bebas, khususnya bakteri.



c.



Keanekaragaman dan evolusi, membahas perihal bagaimana dan mengapa muncul macam-macam mikroorganisme. 29



d.



Keberadaan mikroorganisme pada tubuh manusia, hewan dan tumbuhan.



e.



Peranan mikrobiologi sebagai dasar ilmu pengetahuan biologi.



f.



Bagaimana memahami karakteristik mikroorganisme dapat membantu dalam memahami proses-proses biologi organisme yang lebih besar termasuk manusia.



Bioteknologi tidak terlepas dari mikroorganisme sebagai subyek (pelaku). Mikroorganisme yang dimaksud adalah virus, bakteri, cendawan, alga, dan protozoa. Menurut Siregar 1996, mikroorganisme menjadi subyek pada proses bioteknologi karena beberapa hal berikut ini: 1)



Reproduksinya sangat cepat. Dalam hitungan menit telah dapat berkembang biak sehinggamerupakan sumber daya hayati yang sangat potensial.Mikroorganisme dapat memproses bahan-bahan menjadi suatuproduk dalam waktu yang singkat.



2)



Mudah diperoleh dari lingkungan kita.



3)



Memiliki sifat tetap, tidak berubah-ubah.



4)



Melalui teknik rekayasa genetik dapat dengan cepat memodifikasi/ mengubah sifat mikroorganisme sehingga dapat menghasilkan produk yang sesuai dengan yang kita inginkan.



5)



Dapat menghasilkan berbagai produk yang dibutuhkan oleh manusia dan tidak tergantung musim/iklim.



c. Genetika Genetika (dari bahasa Yunani genno yang berarti "melahirkan") merupakan cabang biologi yang penting saat ini. Ilmu ini mempelajari berbagai aspek yang menyangkut pewarisan sifat dan variasi sifat pada organisme maupun suborganisme (seperti virus dan prion). Ada pula yang dengan singkat mengatakan, genetika adalah ilmu tentang gen. Nama "genetika" diperkenalkan oleh William Bateson pada suatu surat pribadi kepada Adam Chadwick dan ia menggunakannya pada Konferensi Internasional tentang Genetika ke-3 pada tahun 1906. Bidang kajian genetika dimulai dari wilayah molekular hingga populasi. Secara lebih rinci, genetika berusaha menjelaskan: 1.



material pembawa informasi untuk diwariskan (bahan genetik),



2.



bagaimana informasi itu diekspresikan (ekspresi genetik), dan



3.



bagaimana informasi itu dipindahkan dari satu individu ke individu yang lain (pewarisan genetik).



Meskipun orang biasanya menetapkan genetika dimulai dengan ditemukannya kembali naskah artikel yang ditulis Gregor Mendel pada tahun 1900, sebetulnya kajian genetika sudah dikenal sejak masa prasejarah, seperti domestikasi dan pengembangan 30



trah-trah murni (pemuliaan) ternak dan tanaman. Orang juga sudah mengenal efek persilangan dan perkawinan sekerabat serta membuat sejumlah prosedur dan peraturan mengenai hal tersebut sejak sebelum genetika berdiri sebagai ilmu yang mandiri. Silsilah tentang penyakit pada keluarga, misalnya, sudah dikaji oleh para ahli sebelum itu. Pada masa itu, kajian semacam ini disebut "ilmu pewarisan" atau hereditas. Pada dasarnya, semua sifat-sifatorganismetergantung padajumlahgen mereka. Ada duakategori



besar



darigen-gen,



strukturalmenyandikan



yaitu



sekuens



genstruktural



asamamino



dan



genregulator.



dariprotein,



Gen-gen



sepertienzim



yang



menentukankemampuanbiokimiaorganismedengankatalisisreaksisintetik ataukataboliktertentu atau, alternatifnya, memainkan peranlebih statissebagai komponen daristruktur selular. Sebaliknya,gen regulatormengontrol ekspresigen-gen strukturaldengan menentukantingkatproduksi produkprotein merekasebagai respons terhadap sinyalintraatau ekstraselular. Derivasi dariprinsip-prinsip initelah dicapaidengan menggunakan teknikgenetikterkenal. Penelitiandari



Watsondan



anmenemukanmodelganda



Crickdan



heliks



yang



peneliti



lainnya



diawal



menggambarkanstrukturmolekulDNA,



1950dan



hipotesisberikutnya padaimplikasibagi pemahamanreplikasigen. Sejak itutelah terungkap secaraspektakuler interaksi senyawa kompleks yang diperlukanuntuk mengungkapkan kodeinformasi kimiadari molekulDNA ke dalamsel dan ekspresiorganisme. Perubahanpada molekul



DNAyang



membentukkomplemengenetik



evolusiorganismedanmenyesuaikan



diridengan



darisuatu



lingkungan



organismeadalahsarana baru.



Peranyang



tepat



dariDNAbertindaksebagai reservoirinformasi genetik. Di alam, perubahan dalam DNAsuatu organismedapat terjadidalam duacara: 1.



Mutasi, yang merupakanpenghapusanataupenambahan satuatau lebihbagianbagiankimia darimolekul DNA.



2.



Pertukaraninformasi



genetikatau



DNAantaraorganisme



sepertireproduksi



seksual biasanya, dan olehtransfer horisontalpada bakteri. Pada sel eukariota,reproduksi seksualterjadimelalui proseskonjugasidi mana adadonor, yang disebutjantan,dan penerima, yang disebut betina. Hal ini ditentukan secarafisiologis dan bukan secaramorfologis. Konjugasi bakterimelibatkan transferDNA daridonorke sel resipien. DNAditransfer (biasanyaDNA plasmid) selaludalam bentukuntai tunggaldanuntai



komplementeryang



transferDNAdimediasioleh



disintesisdalam



virusbakteri(bakteriofag



penerima.



ataufag)



menerimapentransduksiDNAdisebut



dan



sel



yangtelah



sebagaitransduktan.



TransformasimelibatkanpenyerapanDNAterisolasiatau lingkunganorganismemenjadi



Transduksiadalah



penerimasel,yang



DNAhadir



di



kemudiandisebut 31



sebagaisuatutransforman.



Transfer



genetikdengan



karakteristikalami



inipada



bakterimerupakan



dariberbagaigenusbakterisepertiCampylobacter,



NeisseriadanStreptomyces. secaraalamidapat



cara



Strainbakteri



dilakukan



tidak



mampu



denganmengisolasi



melakukan



DNAdengan



transformasi perlakuankimia



atauolehelektroporasi. d. Biologi Sel Bagian ilmu biologi lainnya adalah Biologi sel. Biologi sel (juga disebut sitologi, dari bahasa Yunani kytos, "wadah") adalah ilmu yang mempelajari sel dan organelnya. Hal yang dipelajari dalam biologi sel yang mencakup sifat-sifat fisiologis sel seperti struktur dan organel yang terdapat di dalam sel, lingkungan dan antaraksi sel, daur hidup sel, pembelahan sel dan fungsi sel (fisiologi), hingga kematian sel. Hal-hal tersebut dipelajari baik pada skala mikroskopik maupun skala molekular, dan sel biologi meneliti baik organisme bersel tunggal seperti bakteri maupun sel-sel terspesialisasi di dalam organisme multisel seperti manusia. Pengetahuan akan komposisi dan cara kerja sel merupakan hal mendasar bagi semua bidang ilmu biologi. Pengetahuan akan persamaan dan perbedaan di antara berbagai jenis sel merupakan hal penting khususnya bagi bidang biologi sel dan biologi molekular.Persamaan dan perbedaan mendasar tersebut menimbulkan tema pemersatu,



yang



memungkinkan



prinsip-prinsip



yang



dipelajari



dari



suatu



sel



diekstrapolasikan dan digeneralisasikan pada jenis sel lain. Penelitian biologi sel berkaitan erat dengan genetika, biokimia, biologi molekular, dan biologi perkembangan. Yuwono (2005), membedakan jasad hidup dalam dua bentuk, yaitu jasad hidup seluler dan jasad hidup bukan seluler. Jasad hidup seluler mempunyai satuan (unit) dasar berupa sel, misalnya bakteri dan tanaman tingkat tinggi. Jasad hidup bukan seluler tidak tersusun atas sel melainkan satuan yang lain, misalnya virus yang satuan dasarnya virion. Istilah sel pertama kali digunakan oleh Robert Hooke (1653 – 1703), ilmuwan Inggris yang menjelaskan struktur potongan tipis gabus dibawah mikroskop. Sel adalah suatu satuan yang dinamis oleh karena selalu mengalami perubahan, baik pertambahan ukuran dan volume, karena adanya proses pertumbuhan, maupun perubahan fungsi, misalnya karena proses diferensiasi. Sel memiliki fungsi utama, yaitu (1) sebagai piranti kimiawi yang melakukan proses metabolisme, dan (2) sebagai piranti yang menyimpan kode-kode informasi biologis yang akan diturunkan ke anakannya atau generasi berikutnya. Dari segi satuan dasar individu, jasad hidup seluler yang ada di alam digolongkan menjadi organisme uniseluler dan organisme multiseluler. Penggolongan jasad seluler berdasarkan struktur dan organisasi sel yaitu jasad prokariota dan jasad eukariota. Struktur sel prokariota terdiri atas struktur utama berupa: dinding sel, membran plasma sel, ribosom, dan bahan genetik. Sel jasad eukariota mempunyai struktur dan organisasi yang lebih 32



kompleks dibandingkan sel prokariot. Pada jasad eukariota bahan genetiknya (DNA) berada dalam membran nukleus sehingga memiliki struktur nukleus yang jelas. Membran nukleus ini terdiri atas dua lapis, yaitu membran dalam dan membran luar. Bahan genetiknya terdiri atas lebih dari satu kromosom linear yang dikemas sedemikian rupa dan adanya protein histon pada nukleosome. Dan pada beberapa eukariota tingkat rendah, memiliki ekstrakromosom yang disebut plasmis. Ciri lain dari eukariota adalah ada pembagian ruang yang jelas di dalam sel sehingga ada bermacam-macam organel yang masing-masing mempunyai fungsi khusus. Beberapa organel itu adalah mitokondria (tempat produksi energi seluler), retikulum endoplasma kasar (berperan dalam proses sekresi protein dan tempat melekatnya ribosom), retikulum endoplasma halus (tempat detoksifikasi senyawa-senyawa tertentu dan sintesis lemak), badan golgi (berperan dalam sekresi dan sortasi protein), kloroplas (tempat berlangsungnya fotosisntesis pada tumbuhan), vakuola (tempat penyimpanan air serta produk metabolisme), dan organelorganel sel lain. e. Biokimia Biokimia adalah kimia makhluk hidup. Biokimiawan mempelajari molekul dan reaksi kimia yang dikatalisis oleh enzim yang berlangsung dalam semua organisme hidup. Biokimia merupakan ilmu yang mempelajari struktur dan fungsi komponen selular, seperti protein, karbohidrat, lipid, asam nukleat, dan biomolekul lainnya. Saat ini biokimia lebih terfokus secara khusus pada kimia reaksi termediasi enzim dan sifat-sifat protein.Saat ini, biokimia metabolisme sel telah banyak dipelajari. Bidang lain dalam biokimia diantaranya sandi genetik (DNA, RNA), sintesis protein, angkutan membran sel, dan transduksi sinyal. Kebangkitan biokimia diawali dengan penemuan pertama molekul enzim, diastase, pada tahun 1833 oleh Anselme Payen. Tahun 1828, Friedrich Wöhler menerbitkan sebuah buku tentang sintesis urea, yang membuktikan bahwa senyawa organik dapat dibuat secara mandiri. Penemuan ini bertolak belakang dengan pemahaman umum pada waktu itu yang meyakini bahwa senyawa organik hanya bisa dibuat oleh organisme. Istilah biokimia pertama kali dikemukakan pada tahun 1903 oleh Karl Neuber, seorang kimiawan Jerman. Sejak saat itu, biokimia semakin berkembang, terutama sejak pertengahan abad ke-20, dengan



ditemukannya



teknik-teknik



baru



seperti



kromatografi,



difraksi



sinar



X,



elektroforesis, RMI (nuclear magnetic resonance, NMR), pelabelan radioisotop, mikroskop elektron, dan simulasi dinamika molekular. Teknik-teknik ini memungkinkan penemuan dan analisis yang lebih mendalam berbagai molekul dan jalur metabolik sel, seperti glikolisis dan siklus Krebs. Perkembangan ilmu baru seperti bioinformatika yang akan dibahas secara detail pada BAB 8, juga banyak membantu dalam peramalan dan pemodelan struktur molekul raksasa. Saat ini, penemuan-penemuan biokimia digunakan di berbagai 33



bidang, mulai dari genetika hingga biologi molekular dan dari pertanian hingga kedokteran. Penerapan biokimia yang pertama kali adalah dalam pembuatan roti dan anggur menggunakan khamir, sekitar 5000 tahun yang lalu pada zaman Yunani dan mesir kuno (Siregar, 2008). Jasad hidup dapat tumbuh dan berkembang karena adanya ribuan reaksi biokimia yang berlangsung di dalam sel. Reaksi-reaksi biokimia tersebut pada dasarnya dibedakan menjadi reaksi biosintetik (anabolik) dan reaksi degradatif (katabolik). Reaksi biosintetik merupakan reaksi biokimia yang dilakukan oleh sel untuk menyusun komponen-komponen sel, misalnya asam-asam amino, asam nukleat dan lain-lain. Reaksi degradatif adalah reaksi biokimia perombakan senyawa kimia untuk diubah menjadi senyawa lain, baik untuk produksi energi selular maupun sebagai prekursor dalam biosintesis komponen-komponen sel. Reaksi biosintetik dan degradatif merupakan serangkaian reaksi yang saling berkaitan satu sama lain dan secara umum dikenal sebagai proses metabolisme jasad hidup. Reaksi degradatif seringkali diikuti oleh serangkaian reaksi yang berpuncak pada sintesis senyawa yang mengandung ester fosfat atau ikatan pirofosfat, misalnya adenosin trifosfat (ATP). ATP adalah nukleotida yang terdiri atas adenin, gugus ribosa, dan satu satuan trifosfat. ATP merupakan molekul berenergi tinggi karena gugus trifosfatnya mengandung dua ikatan fosfoanhidrid. Jika ATP dihidrolisis, menjadi ADP dan ortofosfat (Pi), atau menjadi AMP dan pirofosfat (PPi), maka dibebaskan menjadi energi sebesar 7,3 kkal. Dalam reaksi biokimia dibutuhkan suatu protein yang mempunyai fungsi khusus sebagai biokatalis. Protein ini dikenal dengan nama enzim yang merupakan sekelompok protein yang disintesis oleh sel hidup. Hampir semua reaksi biokimia dalam sel dikatalisis oleh enzim. Enzim memiliki kemampuan mempercepat reaksi transformasi kimiawi paling tidak sampai sejuta kali lipat jika dibandingkan dengan transformasi kimia tanpa katalis. Meskipun demikian, enzim tidak mengubah keseimbangan reaksi, melainkan menurunkan energi aktivasi suatu reaksi enzimatik. Enzim memiliki karakteristik utama, yaitu kemampuan katalitik dan spesifitas. Dalam studi molekuler dan rekayasa genetika, peranan enzim sangat vital. Telah diketahui banyak enzim yang mapu memotong DNA (enzim endonuklease restriksi) hanya pada urutan nukleotida tertentu. Selain itu ada enzim yang dapat digunakan untuk menyambung dua potongan DNA (DNA ligase). 2.4



Teknik-Teknik dalam Bioteknologi Molekular Penerapan dari ilmu biologi dan biokimia sebagai ilmu yang mendasari dan



mendukung perkembangan bioteknologi molekuler dapat dilakukan dengan teknik rekayasa genetik atau DNA rekombinan. 34



Teknologi DNA rekombinan (recombinant DNA technology) adalah suatu metode untuk merekayasa genetik dengan cara menyisipkan (insert) gen yang dikehendaki ke dalam suatu organisme. Teknologi transgenik bertujuan untuk mengubah sifat alami suatu individu menjadi sifat yang dikehendaki oleh manusia. Teknologi DNA rekombinan atau sering juga disebut rekayasa genetika merupakan teknologi yang memanfaatkan proses replikasi, transkripsi dan translasi untuk memanipulasi, mengisolasi dan mengekspresikan suatu gen dalam organisme yang berbeda. Biasanya gen dari organisme yang lebih tinggi diekspresikan pada organisme yang lebih rendah. Teknologi ini juga memberikan kesempatan yang tidak terbatas untuk menciptakan kombinasi baru dari gen yang tidak ada pada kondisi normal. Melalui rekayasa genetika, akan dihasilkan kombinasi baru dari materi genetik melalui penyisipan molekul asam nukleat kedalam suatu sistem DNA vektor (plasmid bakteri, virus dan lain-lain) dan kemudian memasukkan vektor ini kedalam suatu inang sehingga akan dihasilkan suatu produk gen dalam jumlah banyak Gen mungkin bisa diibaratkan seperti software biologi yang diprogram untuk menjalankan pertumbuhan, perkembangan dan fungsi organisme. Dengan merubah software dengan cara yang tepat dan terkontrol, akan memungkinkan untuk menghasilkan perubahan yang diinginkan dalam organisme. DNA dapat di isolasi dari sel tanaman, binatang atau mikroorganisme, dan dapat dipotong dengan enzim tertentu. Fragmen DNA ini kemudian dapat di gabung dengan fragmen DNA lain (DNA vektor) dan kemudian dimasukkan ke sel inang, sehingga menjadi bagian dari komplemen genetik sel inang. Sel inang kemudian dapat diperbanyak dalam skala besar untuk membentuk sifat genetik yang baru dan kemampuan kimia yang tidak dapat dicapai dengan cara konvensional. Kita akan melihat bagaimana informasi genetik dapat dimanipulasi. Gen dapat dimanipulasi untuk berbagai keperluan, misalnya untuk terapi, meningkatkan hasil pertanian, menciptakan organisme yang dapat membersihkan limbah, juga untuk membuktikan tersangka kriminal melalui test DNA. Untuk setiap keperluan di atas, terdapat beberapa teknik rekayasa genetika yang biasa dilakukan di laboratorium, yaitu : (1) isolasi DNA, (2) amplifikasi atau perbanyakan fragmen DNA, (3) pemotongan DNA dengan enzim restriksi, (4) kloning gen, (5) penentuan urutan DNA, (6) hibridisasi, (7) analisis RFLP, dan (8) produksi protein rekombinan. 2.4.1 Isolasi DNA Semua organisme disusun oleh sel yang mengandung elemen genetik yang sama yaitu DNA yang terdapat dalam kromosom. Kromosom eukariot berbentuk linear sedangkan kromosom prokariot berbentuk sirkular. Selain itu prokariot juga mengandung 35



satu atau lebih plasmid. Plasmid merupakan mulekul DNA sirkular dengan ukuran yang jauh lebih kecil dibanding kromosom. a.



Isolasi DNA kromosom. Prinsipnya adalah memisahkan DNA kromosom atau DNA genom dari komponen-



komponen sel lain. Sumber DNA bisa dari tanaman, kultur mikroorganise, atau sel manusia. Membran sel dilisis dengan menambahkan detergen untuk membebaskan isinya, kemudian pada ekstrak sel tersebut ditambahkan protease (yang berfungsi mendegradasi protein) dan RNase (yang berfungsi untuk mendegradasi RNA), sehingga yang tinggal adalah DNA. Selanjutnya ekstrak tersebut dipanaskan sampai suhu 90°C untuk menginaktifasi enzim yang mendegradasi DNA (DNase). Larutan DNA kemudian di presipitasi atau diendapkan dengan etanol dan bisa dilarutkan lagi dengan air. b.



Isolasi DNA plasmid DNA plasmid merupakan wadah yang digunakan untuk kloning gen, sehingga DNA



plasmid harus di pisahkan dari DNA kromosom. DNA plasmid mempunyai ukuran yang jauh lebih kecil daripada DNA kromosom. Untuk memisahkan DNA plasmid, maka memerlukan perlakuan yang sedikit berbeda dengan prosedur di atas. Pertama, membran sel dilisis dengan penambahan detergen. Proses ini membebaskan DNA kromosom, DNA plasmid, RNA, protein dan komponen lain. DNA kromosom dan protein diendapkan dengan penambahan potasium. Kompleks DNA, protein, dan potasium yang mengendap dipisahkan dengan cara sentrifugasi. Supernatan yang mengandung DNA plasmid, RNA dan protein yang tersisa dipisahkan. Kemudian ditambahkan RNase dan protease untuk mendegradasi RNA dan protein. Akhirnya DNA plasmid dapat diendapkan atau dipresipitasi menggunakan etanol. c.



Isolasi RNA RNA, terutama mRNA merupakan materi genetik yang mengkode suatu protein.



Jumlah populasi mRNA akan lebih banyak dibading dengan DNA. mRNA eukariot dapat dipisahkan dari DNA dengan menggunakan oligonukleotida dTatau RNA total juga dapat di isolasi dari sel dengan menambahkan enzim DNase yang berfungsi untuk mendegradasi DNA. 2.4.2



PCR (Polymerase Chain Reaction) PCR (Polymerase Chain Reaction) merupakan suatu teknik perbanyakan



(amplifikasi) potongan DNA secara in vitro pada daerah spesifik yang dibatasi oleh dua buah primer oligonukleotida. Primer yang digunakan sebagai pembatas daerah yang diperbanyak adalah DNA untai tunggal yang urutannya komplemen dengan DNA 36



templatnya. Proses tersebut mirip dengan proses replikasi DNA secara in vivo yang bersifat semi konservatif. PCR memungkinkan adanya perbanyakan DNA antara dua primer, hanya di dalam tabung reaksi, tanpa perlu memasukkannya ke dalam sel (in vivo). Pada proses PCR dibutuhkan DNA untai ganda yang berfungsi sebagai cetakan (templat) yang mengandung DNA-target (yang akan di amplifikasi) untuk pembentukan molekul DNA baru, enzim DNA polimerase, deoksinukleosida trifosfat (dNTP), dan sepasang primer oligonukleotida. Pada kondisi tertentu, kedua primer akan mengenali dan berikatan dengan untaian DNA komplemennya yang terletak pada awal dan akhir fragmen DNA target, sehingga kedua primer tersebut akan menyediakan gugus hidroksil bebas pada karbon 3’. Setelah kedua primer menempel pada DNA templat, DNA polimerase mengkatalisis proses pemanjangan kedua primer dengan menambahkan nukleotida yang komplemen dengan urutan nukleotida templat. DNA polimerase mengkatalisis pembentukan ikatan fosfodiester antara OH pada karbon 3’ dengan gugus 5’ fosfat dNTP yang ditambahkan. Sehingga proses penambahan dNTP yang dikatalisis oleh enzim DNA polimerase ini berlangsung dengan arah 5’→3’ dan disebut reaksi polimerisasi. Enzim DNA polimerase hanya akan menambahkan dNTP yang komplemen dengan nukleotida yang terdapat pada rantai DNA cetakan. PCR melibatkan banyak siklus yang masing-masing terdiri dari tiga tahap berurutan, yaitu pemisahan (denaturasi) rantai DNA templat, penempelan (annealing) pasangan primer pada DNA target dan pemanjangan (extension) primer atau reaksi polimerisasi yang dikaalisis oleh DNA polimerase. a.



Tahapan PCR 1)



Denaturasi



Selama proses denaturasi, DNA untai ganda akan membuka menjadi dua untai tunggal. Hal ini disebabkan karena suhu denaturasi yang tinggi menyebabkan putusnya ikatan hidrogen diantara basa-basa yang komplemen. Pada tahap ini, seluruh reaksi enzim tidak berjalan, misalnya reaksi polimerisasi pada siklus yang sebelumnya. Proses denaturasi biasanya dilakukan antara suhu 90°C – 95°C. 2)



Penempelan primer



Pada tahap penempelan primer (annealing), primer akan menuju daerah yang spesifik yang komplemen dengan urutan primer. Pada proses annealing ini, ikatan hidrogen akan terbentuk antara primer dengan urutan komplemen pada DNA templat. Proses ini biasanya dilakukan pada suhu 50 °C – 60 °C. Selanjutnya, DNA polymerase akan berikatan sehingga ikatan hidrogen tersebut akan menjadi sangat kuat dan tidak akan 37



putus kembali apabila dilakukan reaksi polimerisasi selanjutnya, biasanya pada suhu 72 °C. 3)



Reaksi polimerisasi (extension) o



Umumnya, reaksi polimerisasi atau perpanjangan rantai ini, terjadi pada suhu 72 C. Primer yang telah menempel tadi akan mengalami perpanjangan pada sisi 3’nya dengan penambahan dNTP yang komplemen dengan templat oleh DNA polimerase.



Gambar 2.8. Siklus PCR, yang terdiri dari denaturasi, penempelan primer (annealing) dan polimerisasinya (microfluidics.stanford.edu) Jika siklus dilakukan berulang-ulang maka daerah yang dibatasi oleh dua primer akan di amplifikasi secara eksponensial (disebut amplikon yang berupa untai ganda), sehingga mencapai jumlah copy yang dapat dirumuskan dengan (2n)x. Dimana n adalah jumlah siklus dan x adalah jumlah awal molekul DNA (template). Jadi, seandainya ada 1 copy DNA sebelum siklus berlangsung, setelah satu siklus, akan menjadi 2 copy, sesudah 2 siklus akan menjadi 4, sesudah 3 siklus akan menjadi 8 kopi dan seterusnya. Sehingga perubahan ini akan berlangsung secara eksponensial. PCR dengan menggunakan enzim Taq DNA polimerase pada akhir dari setiap siklus akan menyebabkan penambahan satu nukleotida A pada ujung 3’ dari potongan DNA yang dihasilkan. Sehingga nantinya produk PCR ini dapat di kloning dengan menggunakan vektor yang ditambahkan nukleotida T pada ujung-ujung 5’-nya. Proses PCR dilakukan menggunakan suatu alat yang disebut thermocycler.



38



Gambar 2.9. Jumlah penggandaan fragmen DNA pada tahapan PCR. b.



Komponen PCR 1)



Enzim DNA Polymerase



Dalam sejarahnya, PCR dilakukan dengan menggunakan Klenow fragment DNA Polimerase I selama reaksi polimerisasinya. Enzim ini ternyata tidak aktif secara termal selama proses denaturasi, sehingga peneliti harus menambahkan enzim di setiap siklusnya. Selain itu, enzim ini hanya bisa dipakai untuk perpanjangan 200 bp dan hasilnya menjadi kurang spesifik. Untuk mengatasi kekurangan tersebut, dalam perkembangannya kemudian dipakai enzim Taq DNA polymerase yang memiliki aktivitas pada suhu tinggi. Oleh karenanya, penambahan enzim tidak perlu dilakukan di setiap siklusnya, dan proses PCR dapat dilakukan dalam satu mesin (thermocycle). 2)



Primer



Primer merupakan oligonukleotida pendek rantai tunggal yang mempunyai urutan komplemen dengan DNA templat yang akan diperbanyak. Panjang primer berkisar antara 20-30 basa. Untuk merancang urutan primer, perlu diketahui urutan nukleotida pada awal dan akhir DNA target. Primer oligonukleotida di sintesis



dengan ukuran seperti yang



disebutkan diatasmenggunakan suatu alat yang disebut DNA synthesizer. 3)



Reagen lainnya



Selain enzim dan primer, terdapat juga komponen lain yang ikut menentukan keberhasilan reaksi PCR. Komponen tersebut adalah dNTP untuk reaksi polimerisasi, dan buffer yang mengandung MgCl2. Konsentrasi ion Mg2+dalam campuran reaksi merupakan 39



hal yang sangat kritis. Konsentrasi ion Mg2+ini sangat mempengaruhi proses primer annealing, denaturasi, spesifisitas produk, aktivitas enzim dan fidelitas reaksi. c.



Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction (RT-PCR) RT-PCR merupakan singkatan Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction.



Seperti namanya, proses RT-PCR merupakan bagian dari proses PCR biasa. Perbedaanya dengan PCR yang biasa, pada proses ini berlangsung satu siklus tambahan yaitu adanya perubahan RNA menjadi cDNA (complementary DNA) dengan menggunakan enzim Reverse Transkriptase. Reverse Transcriptase adalah suatu enzim yang dapat mensintesis molekul DNA secara in vitro menggunakan template RNA. Seperti halnya PCR biasa, pada pengerjaan RT-PCR ini juga diperlukan DNA Polimerase, primer, buffer, dan dNTP. Namun berbeda dengan PCR, templat yang digunakan pada RTPCR adalah RNA murni. Oleh karena primer juga dapat menempel pada DNA selain pada RNA, maka DNA yang mengkontaminasi proses ini harus dibuang. Untuk proses amplifikasi mRNA yang mempunyai poly(A) tail pada ujung 3', maka oligo dT, random heksamer, maupun primer spesifik untuk gen tertentu dapat dimanfaatkan untuk memulai sintesis cDNA. d.



Metoda Deteksi Produk PCR Produk PCR adalah segmen DNA (amplikon) yang berada dalam jumlah jutaan



copy, tetapi tidak dapat dilihat dengan mata telanjang. Oleh karena itu PCR perlu diikuti dengan suatu tahap akhir yang bertujuan untuk memvisualisasikan produk PCR serta sekaligus bertujuan untuk mengetahui ukuran produk PCR dan mengetahui apakah produk yang dihasilkan adalah benar seperti yang diinginkan. Salah satu metoda deteksi yang umum dilakukan adalah elektroforesis pada gel agarosa. Metoda ini didasarkan pada pergerakan mulekul bermuatan dalam media penyangga matriks stabil yang direndam ke dalam larutan buffer



di bawah pengaruh



medan listrik. Media yang umum digunakan adalah gel agarosa atau poliakrilamid. Elektroforesis gel agarosa digunakan untuk memisahkan fragmen DNA yang berukuran lebih besar dari 100 pb dan dijalankan secara horizontal, sedangkan elektroforesis poliakrilamid dapat memisahkan 1 pb dan dijalankan secara vertikal. Elektroforesis poliakrilamid biasanya digunakan untuk menentukan urutan DNA (proses sekuensing). Larutan DNA yang bermuatan negatif dimasukkan ke dalam sumur-sumur yang terdapat pada gel agarosa dan diletakkan di kutup negatif, apabila dialiri arus listrik dengan menggunakan larutan buffer yang sesuai maka DNA akan bergerak ke kutup positif. Laju migrasi DNA dalam medan listrik berbanding terbalik dengan massa DNA. Migrasi DNA



40



terutama ditentukan oleh ukuran panjang dan bentuk DNA. Fragmen DNA yang berukuran kecil akan bermigrasi lebih cepat dibanding yang berukuran besar, sehingga elektroforesis mampu memisahkan fragmen DNA berdasarkan ukuran panjangnya. Untuk visualisasi maka ditambahkan larutan etidium bromida yang akan masuk diantara ikatan hidrogen pada DNA, sehingga pita fragmen DNA akan kelihatan dibawah lampu UV, seperti yang divisualisasikan pada Gambar 2.10. Panjang amplikon bisa diperkirakan dengan membandingkannya dengan pita DNA standar atau marker (M).



Gambar 2.10. Visualisasi produk PCR hasil elektroforesis pada gel agarosa. 2.4.3



Kloning Gen Sejak ditemukannya enzim restriksi (enzim yang dapat memotong DNA pada



urutan yang spesifik) dan ditemukannya enzim ligase (enzim yang dapat menyambungkan potongan DNA), maka DNA dari organisme apa saja dapat diisolasi, dipotong-potong, disambungkan kembali dan dipindahkan ke organisme lain. Proses mengkombinasikan beberapa DNA dan memperbanyak DNA rekombinan tersebut di dalam sel disebut kloning (Gambar 2.11). Proses memasukkan DNA ke dalam sel disebut transformasi dan sel yang dihasilkan disebut transforman. Agar suatu DNA dapat diperbanyak di dalam sel, maka DNA tersebut harus disisipkan ke dalam suatu plasmid (berfungsi sebagai vektor/pembawa) yang dapat bereplikasi di dalam sel. Kumpulan sel-sel yang mengandung plasmid rekombinan yang sama disebut sebagai suatu klon. Pada kloning gen, suatu fragmen DNA yang mengandung gen yang akan di klon disisipkan pada molekul DNA vektor untuk menghasilkan molekul DNA rekombinan. DNA rekombinan ini digunakan untuk mentransformasi sel inang (biasanya bakteri). Di dalam sel, vektor mengadakan replikasi, menghasilkan banyak copy atau turunan yang identik, baik vektornya maupun gen yang dibawanya. Ketika sel inang membelah, copy molekul



41



DNA rekombinan diwariskan pada progeni. Setelah terjadi sejumlah besar pembelahan sel, maka dihasilkan koloni atau klon sel inang yang identik. Tiap-tiap klon mengandung satu copy atau lebih molekul DNA rekombinan.



Gambar 2.11. Tahapan dan prinsip dasar pada proses kloning gen. Kloning melibatkan lima komponen utama, yaitu : fragmen DNA (gen) yang akan di kloning (disebut juga DNA sisipan), DNA vektor (bisa plasmid, bakteriofage atau cosmid), enzim restriksi, enzim ligase, dan sel inang (bakteri atau ragi). a.



DNA sisipan (Insert).



Tujuan kloning adalah memperbanyak suatu fragmen DNA dari suatu organisme dalam suatu sel inang. Namun tujuan akhirnya bisa bermacam-macam, diantaranya: produksi protein penting dengan skala besar, untuk deteksi patogen atau sel abnormal, dan identifikasi DNA sidik jari pada kasus forensik dan hubungan kekerabatan antara individu. DNA sisipan bisa diperoleh dengan dua cara, yaitu : 1.



Produk PCR.



2.



Fragmen DNA hasil pemotongan dengan enzim restriksi yang spesifik. b.



DNA vektor / plasmid



Vektor merupakan suatu mulekul DNA sirkular yang bertindak sebagai wadah untuk membawa DNA sisipan masuk ke dalam sel inang dan bertanggung jawab atas replikasinya. Berdasarkan fungsinya vektor dapat dibagi dua, yaitu : vektor kloning dan vektor ekspresi. Vektor kloning hanya berfungsi untuk memperbanyak fragmen DNA yang disisipkan, sehingga fragmen DNA tersebut hanya direplikasi, tidak di transkripsi. Biasanya 42



vektor ini digunakan untuk tujuan sekuensing atau untuk perbanyakan DNA yang nantinya akan di sisipkan ke vektor ekspresi. Sementara vektor ekspresi digunakan untuk memproduksi protein dari gen yang diklon. Jenis vektor ekspresi tergantung dari sel inang yang akan digunakan dan ukuran DNA yang akan disisipkan ke dalam vektor tersebut. Syarat suatu vektor adalah : (1) mampu memasuki sel inang, (2) bereplikasi sendiri (memiliki ori), (3) menghasilkan jumlah copy yang banyak dan (4) mempunyai ukuran yang relatif kecil (< 10 kb). Molekul DNA yang memenuhi persyaratan tersebut adalah : plasmid dan kromosom virus terutama bakteriofage. Plasmid merupakan DNA rantai ganda yang berbentuk sirkular dan terdapat bebas di dalam sel. Plasmid dapat bereplikasi sendiri di dalam sel inang karena mempunyai suatu urutan DNA spesifik yang disebut ori (origin of replication/titik awal replikasi). Plasmid hampir selalu membawa satu gen atau lebih yang menyebabkan ciri-ciri penting yang ditunjukkan oleh bakteri inang, misalnya plasmid yangmembawa gen resistan antibiotik Banyak spesies bakteri mempunyai plasmid, tetapi plasmid yang digunakan dalam teknologi DNA rekombinan bukan plasmid dalam bentuk alami, melainkan yang sudah direkayasa. Plasmid tersebut telah diberi sisi pengenalan beberapa enzim restriksi agar dapat disisipi dengan DNA asing. Plasmid juga telah diberi dua gen marker, satu gen diperlukan untuk mendeteksi dengan mudah adanya plasmid di dalam sel, dan gen yang kedua diperlukan untuk mendeteksi adanya DNA asing. c.



Bakteriofage



Bakteriofage merupakan virus yang menginfeksi bakteri. Bakteriofage mempunyai struktur yang sangat sederhana, hanya terdiri dari satu molekul DNA atau RNA yang membawa sejumlah gen, dan dikelilingi oleh selubung atau kapsid yang disusun oleh molekul protein. Pada proses infeksi bakteri oleh faga, partikel faga melekat pada bagian luar bakteri dan memasukkan DNA kromosomnya ke dalam sel. Molekul DNA faga kemudian mengadakan replikasi, gen-gen faga mengatur sintesis protein komponen kapsid. Partikel-partikel fage yang baru kemudian dirakit dan dilepaskan dari bakteri. Sel bakteri mengalami lisis. Sama seperti plasmid, DNA fage yang digunakan dalam teknologi DNA rekombinan umumnya sudah dimodifikasi dengan penambahan sisi atau urutan nukleotida yang dikenal oleh enzim restriksi. Urutan nukleotida yang dikenal oleh enzim restriksi tersebut dapat disisipkan pada waktu merancang sepasang primer yang akan digunakan pada proses PCR. Perbedaannya dengan plasmid, bakteriofage dapat menampung fragmen DNA dengan ukuran yang lebih besar. d.



Vektor ekspresi



43



Vektor ekspresi merupakan vektor yang mana disamping dapat bereplikasi sendiri juga mengandung sinyal-sinyal ekspresi, sehingga gen yang di klon juga akan ditranskripsi menjadi mRNA dan kemudian ditranslasi menjadi protein. Vektor ekspresi memungkinkan untuk produksi protein hewan, manusia atau tanaman di dalam bakteri. Tiga sinyal ekspresi yang paling penting adalah : (1) Promotor transkripsi, (2) terminator transkripsi, dan (3) tempat pengikatan ribosom. Selain sistem vektor ekspresi untuk bakteriE. coli, juga terdapat beberapa sistem vektor ekspresi untuk yeast Saccaromyces cerevisiae dan vektor ekspresi untuk yeastPichia pastoris. Kedua jenis sistem ekspresi ini terbukti dapat memproduksi protein eukariot dengan hasil yang tinggi dan berfungsi seperti protein natif (asli). e.



Tahapan-tahapan kloning.



Tahapan pengerjaan kloning DNA/gen adalah sebagai berikut : 1.



Isolasi/ preparasi DNA sisipan dan DNA vektor



2.



Pemotongan molekul DNA



3.



Penggabungan fragmen DNA sisipan ke DNA vektor (proses ligasi)



4.



Transformasi (proses memasukkan molekul DNA plasmid rekombinan ke dalam sel inang.



5.



Identifikasi sel yang mengandung DNA plasmid rekombinan.



6.



Isolasi DNA rekombinan.



1)



Isolasi/ preparasi DNA



Sebelum disisipkan ke suatu DNA vektor, maka DNA sisipan harus diisolasi terlebih dulu. Beberapa prinsip isolasi DNA sudah dijelaskan di atas. Selain itu DNA sisipan juga dapat diperoleh dari produk PCR. 2)



Pemotongan DNA dengan enzim restriksi Molekul plasmid yang digunakan sebagai vektor harus dipotong untuk membuka



DNA lingkaran, sehingga molekul DNA asing bisa disisipkan. Enzim restriksi merupakan suatu endonuklease yang mengenal urutan spesifik pada molekul DNA dan memotong pada urutan yang spesifik tersebut. Sisi pengenalan enzim restriksi umumnya merupakan suatu polindrom, dimana urutan nukleotida rantai atas sama dengan urutan nukleotida rantai bawah. Misalnya: Enzim restriksi hanya terdapat pada beberapa bakteri, dan berfungsi untuk mempertahankan diri dari infeksi bakteriofage.



44



Tabel 3. Beberapa enzim restriksi dan sisi pengenalannya (palindrome) Nama enzim AluI BamHI ClaI EcoRI HaeIII HindIII KpnI NotI PstI XbaI XhoI



3)



Sumber bakteri Arthrobacter luteus Bacillus Caryophanon latum Escherichia coli Haemophilus aegyptius Haemophylus influenzae Klebsiella pneumonia Nocardia otidiscaviarum Providencia stuartii Xanthomonas bradii Xanthomonas holcicola



Urutan pengenalan AG↓CT G↓GATCC AT↓GCAT G↓AATTC GG↓CC A↓AGCTT GGTAC↓C GC↓GGCCGC CTGCA↓G T↓CTAGA C↓TCGAG



Penyambungan DNA dengan enzim ligase. Apabila dua molekul DNA mempunyai ujung rantai tunggal yang komplementer,



maka kedua ujung DNA tersebut dapat berpansangan, kemudian enzim ligase dapat membentuk ikatan fosfodiester antara kedua molekul DNA tersebut. Reaksi enzimatik ini memerlukan energi dari ATP. 4)



Transformasi sel Untuk memasukkan DNA ke dalam sel bakteri, sel tersebut harus diberi perlakukan



agar menjadi sel kompeten, yaitu sel yang mampu menerima DNA dari luar. Kemampuan paling tinggi untuk memasukkan DNA dari luar terjadi pada sel yang berada dalam fase logaritmik, yaitu pada waktu pertumbuhan sel sedang cepat. Perlakukan dengan CaCl2menyebabkan dinding sel menjadi lebih permeabel dan bermuatan positif, sehingga dapat menarik DNA yang bermuatan negatif. Transformasi (pengambilan DNA oleh sel bakteri) dapat dilakukan dengan dua cara, yaitu : (1) dengan cara heat shock (kejutan panas) dimana campuran sel dan DNA plasmid rekombinan didinginkan dalam waktu yang lama, kemudian di panaskan dengan segera pada suhu 42 °C. (2) dengan cara elektroporasi (kejutan listrik) menggunakan suatu alat yang dialiri arus listrik yang terkontrol voltase dan waktunya. 5)



Seleksi klon rekombinan Sel inang yang telah ditansformasi kemudian ditumbuhkan pada media padat yang



sesuai pada suhu 37 °C. Setelah inkubasi semalam, maka kita akan mendapatkan kolonikoloni bakteri yang tumbuh di media padat. Satu koloni bakteri terdiri dari jutaan sel bakteri yang mempunyai sifat yang sama. Sehingga klon-klon ini perlu dipilih untuk menentukan mana koloni bakteri yang membawa plasmid rekombinan. Terdapat beberapa cara seleksi klon rekombinan, diantaranya: (1) Seleksi berdasarkan sifat resistan terhadap antibiotik. Pada seleksi ini plasmid yang digunakan mempunyai dua gen resistan terhadap antibiotik. 45



Misalnya gen Ampr(gen resistan ampisilin dan gen Tetr(gen resistan terhadap tetraciclin). Penyisipan DNA asing dilakukan di dalam gen Tetr, sehingga bila mengandung sisipan DNA asing gen Tetrtidak akan aktif. Bakteri transforman pertama ditumbuhkan pada media yang mengandung Ampicilin, sehingga koloni yang tumbuh adalah koloni yang membawa plasmid. Kemudian koloni-koloni ini dipindahkan ke media yang mengandung tetrasiklin, sehingga koloni yang mengandung DNA sisipan (dimana gen Tetr-nya sudah tidak aktif) tidak akan tumbuh. Maka kita akan tahu koloni maka yang mengandung DNA sisipan. (2) Seleksi dengan melibatkan gen LacZ. Pada seleksi ini plasmid yang digunakan mempunyai gen Amprdan gen LacZ. Gen LacZ mengkode enzim β-galakotosidase yang mengkatalisis pemecahan laktosa menjadi glukosa dan galaktosa. Penyisipan DNA dilakukan di dalam gen LacZ ini, sehingga bila mengandung DNA sisipan maka gen LacZ akan inaktif. Seleksi dilakukan dengan menambahkan substrat analog laktosa yaitu X-gal yang akan dipecah oleh enzim β-galakotosidase menjadi senyawa yang berwarna biru (5-bromo-4 kloro-3indigo). IPTG (isopropil tiogalaktopiranosida) digunakan sebagai inducer. Bakteri transforman ditumbuhkan pada media yang mengandung Ampicilin, X-gal dan IPTG. Koloni yang tumbuh adalah koloni yang membawa plasmid. Akan tetapi terdapat dua jenis koloni, yaitu yang berwarna putih dan biru. Koloni yang berwarna biru menandakan terdapat senyawa 5-bromo-4 kloro-3-indigo (hasil penguraian X-gal oleh β-galaktosidase), artinya gen LacZnya aktif sehingga tidak ada DNA sisipan. Sedangkan koloni yang berwarna putih, adalah koloni yang tidak menghasilkan senyawa berwarna, gen LacZ inaktif dan mengandung DNA sisipan diantara gen LacZ. Visualisasi koloni putih biru pada medium agar yang mengandung ampicilin, X-gal dan IPTG dapat dilihat pada Gambar 2.12.



Gambar 2.12.Visualisasi koloni putih biru pada medium LB agar mengandung Ampicilin, X-gal dan IPTG 46



6)



Isolasi DNA plasmid rekombinan. DNA plasmid rekombinan, kemudian dapat diisolasi untuk kepentingan pengerjaan



berkutnya dengan menggunakan metoda yang sudah dijelaskan di atas. DNA ini selanjutnya dapat di karakterisasi, misalnya disekuensing untuk menentukan urutan nukleotidanya atau dapat juga di potong dengan enzim restriksiyang sesuai kemudian di kloning ke vektor ekspresi sesuai dengan jenis sel inang yang dipakai. 2.4.4



Sekuensing DNA Sekuensing DNA merupakan suatu metode yang digunakan untuk mengetahui



urutan nukleotida atau basa dalam suatu fragmen DNA. DNA menyimpan informasi genetik dalam bentuk urutan nukleotida. Dengan mengetahui urutan nukleotida suatu gen, maka dapat ditentukan urutan asam amino protein yang dikodenya. Sebaliknya, urutan asam amino protein tidak dapat memberikan informasi lengkap tentang urutan nukleotida gen yang mengkodenya. Karena alasan tersebut, selain karena mahalnya sekuensing protein, maka sekuensing DNA jauh lebih banyak digunakan. Metode sekuensing DNA yang paling banyak digunakan adalah metode dideoksi Sanger. Reaksi sekuensing dimulai dengan reaksi PCR untuk memperbanyak fragmen DNA dan diikuti dengan elektroforesis gel poliakrilamida untuk memisahkan basa-basa DNA. Seperti proses PCR, reaksi sekuensing juga meniru proses pembentukan leading strand pada replikasi DNA di alam. Ada tiga tahapan penting yang harus dilakukan pada sekuensing atau pembacaan urutan nukleotida pada molekul DNA, yaitu: 1.



Pembentukan fragmen-fragmen DNA untai tunggal dengan berbagai ukuran melalui proses PCR .



2.



Pemisahan fragmen-fragmen DNA dengan gel elektroforesis poliakrilamida



3.



Pembacaan hasil elektroforesis. Tahap pertama reaksi sekuensing serupa dengan teknik PCR yang memerlukan



siklus suhu berulang. Sekuensing dilakukan dengan menggunakan enzim DNA polimerase untuk memperpanjang primer sepanjang templat DNA untai tunggal dengan adanya empat deoksinukleotida trifosfat (dNTP: dATP, dTTP, dGTP, dCTP). Berbeda dengan PCR, DNA yang akan disekuensing dapat berupa untai tunggal maupun untai ganda dan primer yang diperlukan hanya satu. Komponen



kunci



dalam



reaksi



sekuensing



adalah



analog



dNTP



yaitu



dideoksinukleotida trifosfat (ddNTP) yang tidak memiliki gugus 3’-OH. Reaksi sekuensing diterminasi secara acak dengan masuknya ddNTP. Dengan menggunakan sejumlah kecil ddNTP (dibandingkan dengan dNTP), maka setelah 20-30 siklus suhu akan diperoleh 47



fragmen-fragmen DNA yang panjangnya berbeda-beda dengan selisih satu nukleotida yang semuanya memiliki ddNTP pada ujung 3’-nya. Pada tahap kedua, fragmen-fragmen DNA ini dipisahkan dengan elektroforesis gel poliakrilamid. DNA bermuatan negataif, jadi akan bergerak dari kutub negatif ke kutub positif. Gel harus memiliki kemampuan yang cukup tinggi untuk memisahkan fragmenfragmen yang ukurannya hanya berbeda satu nukleotida. Fragmen DNA yang lebih kecil akan bergerak lebih cepat daripada fragmen yang lebih besar. Fragmen yang pertama mencapai ujung bawah gel merupakan fragmen terkecil. Pembacaan hasil elektroforesis dapat dilakukan bila ada label pada fragmen-fragmen DNA yang terbentuk. Label dapat berbentuk isotop radioaktif atau fluoresen. Pelabelan dapat dilakukan terhadap primer maupun pada ddNTP yang digunakan. 1)



Pelabelan dengan Radioisotop



Pada awal perkembangan teknik DNA sekuensing, pelabelan fragmen DNA dilakukan dengan menggunakan radioisotop, seperti



32



P. Komponen reaksi yang dilabel



adalah primer atau ddNTP. Dengan menggunakan pelabelan radioisotop, reaksi pembentukan fragmen DNA harus dilakukan dalam empat tabung terpisah, masingmasing mengandung ddNTP yang berbeda. Keempat hasil reaksi sekuensing tersebut selanjutnya harus di-run di empat lajur yang berbeda pada elektroforesis gel poliakrilamid. 2)



Pelabelan dengan Pewarnaan Fluoresen



Pelabelan fluoresen dilakukan dalam satu tabung, sehingga memungkinkan pemisahan fragmen-fragmen hasil reaksi sekuensing dilakukan hanya pada satu lajur gel poliakrilamid karena fragmen dengan nukleotida terakhir yang berbeda akan memberikan warna yang berbeda. Terdapat dua cara pelabelan, yaitu menggunakan dye primer dan dye terminator. a.



Dye primer



Jika pewarnaan fluoresensi dilakukan pada primer, reaksi pembentukan fragmen DNA harus dilakukan dalam empat tabung terpisah, masing-masing mengandung ddNTP yang berbeda dan primer yang dilabel dengan empat warna yang berbeda. Keempat hasil reaksi sekuensing tersebut selanjutnya di-run di satu lajur pada elektroforesis gel poliakrilamid. b.



Dye terminator



Pelabelan fluoresensi yang dilakukan pada ddNTP (dye terminator labeling) memberikan kemudahan karena reaksi sekuensing dapat dilakukan hanya dalam satu tabung, dan tentu saja di-run di satu lajur pada elektroforesis gel poliakrilamid.



48



Mesin sekuensing otomatis dilengkapi dengan laser penginduksi fluoresensi yang bergerak bolak-balik horisontal sepanjang gel poliakrilamid. Jika ada DNA pada lokasi tersebut maka laser akan mengeksitasi dye yang terikat pada primer atau ddNTP. Sebuah kamera atau tabung fotomultiplier akan menangkap sinar yang diemisikan. Keempat jenis dye mengemisi sinar dengan warna (panjang gelombang) yang berbeda-beda. 2.4.5



Teknik Hibridisasi Teknik ini berdasarkan kemampuan urutan asam nukleat yang kompelmen untuk



berikatan satu sama lain. Dengan hibridisasi fragmen DNA tertentu dapat diidentifikasi dan dipisahkan dari fragmen lain. Untuk melakukan hibridisasi, maka terlebih dahulu kita harus mengetahui urutan gen yang dicari. Teknik hibridisasi dapat digunakan untuk mengidentifikasi klon yang mengandung DNA sisipan. Pertama, kita harus membuat replika menggunakan master plate (plate/petri yang mengandung koloni bakteri pada permukaanya). Replika ini dibuat menggunakan filter nitroselulosa. Sel bakteri yang menempel pada replika di lisis dengan menambahkan detergen, dan DNAnya dibebas ke filter. DNA untai ganda akan didenaturasi oleh nantrium hidroksida, DNA untai tunggal yang dihasilkan akan tetap menempel pada filter pada posisi yang sama dengan koloni asalnya. Sehingga pola koloni pada master plate akan sama dengan pola DNA yang menempel pada filter. Selanjutnya ditambahkan probe radioaktif. Probe adalah oligonukleotida untai tunggal yang komplemen dengan urutan DNA yang kita cari. Probe di label sehingga dapat divisualisasi. Bila probe ditambahkan, maka akan berikatan dengan urutan yang komplemen, membentuk hibrida untai ganda. Setelah itu filter dicuci, sehingga probe yang tidak berikatan akan terbuang, dan divisualisasikan dengan sinar X. DNA yang berikatan dengan probe akan kelihatan seperti spot hitam. Spot ini dibandingkan posisinya dengan koloni pada master plate, sehingga koloni yang mengandung fragmen DNA yang diklon dapat diketahui posisinya. Hibridisasi merupakan teknik yang sangat bermanfaat. Teknik ini sangat sensitif: sejumlah kecil probe yang berikatan ke membran dapat dideteksi, dan selektif: karena berdasarkan komplementari urutan DNA sehingga urutan spesifik dapat diidentifikasi. Hibridisasi dapat dilakukan terhadap DNA dan RNA, dari koloni atau dari gel. Bila kita tidak memiliki informasi tentang urutan DNA untuk merancang probe, maka kita bisa juga memperkirakan dari urutan asam amino dari protein. Dengan adanya kode genetik, maka kita dapat menerjemahkan urutan nukleotida dari urutan asam amino. Masalahnya adalah 49



terdapat degenerasi pada kode genetik, terdapat beberapa asam amino yang memiliki lebih dari satu kodon. Untuk mengatasi masalah ini maka kita dapat merancang berbagai urutan probe yang mungkin, dan mensintesisnya dengan DNA syntetizer. Aplikasi utama dari hibridisasi adalah penelitian tentang regulasi gen. Regulasi ekspresi gen sangat vital pada sel-sel tertentu. Peneltian yang intensif telah dilakukan untuk menentukan bagaimana gen-gen tertentu diregulasi untuk menyediakan tipe sel tertentu, atau untuk memungkinkan sel merespon perubahan lingkungan. Karena regulasi berhubungan dengan tingkat transkripsi, maka penelitian tentang produksi mRNA dari gen tertentu sangatlah penting. Sebagai contoh, mari kita lihat satu tipe sel dengan dua kondisi lingkungan yang berbeda. Sel-sel pada kulit kita terpapar terhadap semua kondisi lingkungan: dingin, panas, angin, air, cahaya, dan gelap. Dalam merespon kondisi ini, sel mensintesis protein yang dapat membantu memproteksi sel terhadap lingkungan. Sebagai contoh, kebanyakan sel merespon sinar UV dosis tinggi dengan mensintesis sejumlah enzim yang terlibat pada perbaikan mutasi DNA. Sinar UV merupakan mutagen yang potensial. Tanpa enzim untuk repair (perbaikan), mutasi akan terakumulasi dan mungkin dapat menyebabkan kanker. Namun, pada kondisi normal enzim repair tidak akan diproduksi, sehingga gennya inaktif. Jadi ekspresi dari gen ini di induksi oleh sinar UV. Induksi ekspresi gen dapat di deteksi dengan metoda hibridisasi. Pertama, bila perlu gen tersebut dikloning, Pelacak atau probenya dirancang, selanjutnya hibridisasi. Sel-sel kulit dapat diambil dan dikulturkan dilaboratorium. Setelah waktu pemaparan yang berbedabeda, mRNA diisolasi dari sel, dipisahkan dengan gel elektroforesis, dan kemudian ditransfer ke membran nitroselulosa dan dihibridisasi dengan probe. Ketebalan atau densitas pita yang terlihat setelah autoradiografi menggambarkan jumlah mRNA tertentu dalam sel. 2.4.6



Analisis RFLP Teknik lain yang berdasarkan elektroforesis dan hibridisasi adalah analisis



Restriction fragment length polymorphism (RFLP). Sebagian besar DNA eukariot tidak mengkode protein. Dalam daerah noncoding lebih banyak terdapat mutasi dibandingkan di dalam gen, karena mutasi ini tidak berpengaruh terhadap sel, jaringan, organ dan organisme. Karena mutasi pada daerah noncoding tidak menghasilkan perubahan fenotip, sehingga tidak menunjukkan perbedaan diantara individu. Jika dua individu X dan Y, masing-masing mengandung gen A dan B yang dipisahkan oleh daerah noncoding pada kromosom. Dalam gen A dan B pada kedua 50



individu tersebut terdapat sisi restriksi enzim HindIII. Sisi ini sama pada kedua individu tersebut, karena tidak ada mutasi pada gen A dan B. Namun terdapat juga sisi restriksi di antara gen A dan B. Pada sisi restriksi ini, kedua individu tersebut berbeda, individu X memiliki dua sisi pemotongan, dan individu Y hanya memiliki satu sisi pemotongan. Mutasi pada individu Y telah merubah satu basa pada salah satu sisi pengenalan enzim HindIII, sehingga tidak bisa memotong pada sisi tersebut. Keberadaan mutasi ini dapat dideteksi dengan mengisolasi DNA dari kedua individu tersebut, kemudian dilakukan pemotongan dengan enzim HindIII. Fragmen DNA dipisahkan dengan gel elektroforesis, kemudian ditransfer ke membran nitroselulosa dan dilakukan hibridisasi dengan menggunakan probe spesifik seperti yang sudah dijelaskan diatas. RFLP sama seperti mutasi lain, merupakan marker genetik yang diturunkan dari satu generasi ke generasi berikutnya. Namun tidak terdapat fenotip yang berhubungan dengannya, hanya menghasilkan variasi panjang fragmen restriksi. Banyaknya penemuan mutasi gen yang berhubungan dengan penyakit manusia, kemampuan untuk mengkloning gen ini dan mempelajarinya, menjadi bermanfaat. Lebih banyak informasi yang diketahui tentang gen ini, semakin mudah mengkloningnya. Marker genetik berguna untuk memetakan gen. Peta gen lebih mudah dibuat menggunakan RFLP sebagai marker. 2.5



Ringkasan Bioteknologi molekuler adalah penggunaan teknik laboratorium untuk mempelajari



dan memodifikasi asam nukleat dan protein untuk aplikasi di berbagai bidang seperti kesehatan manusia dan hewan, pertanian, dan lingkungan. Bioteknologi molekuler ditujukan memanipulasi suatu organisme pada taraf selular dan molekular (rekayasa genetika dan biologi molekular). Bioteknologi molekul hasil dari konvergensi dari banyak bidang penelitian, seperti biologi molekuler, mikrobiologi, biokimia, imunologi, genetika, dan biologi sel. Biologi molekuler meupakan ilmu yang mempelajari fungsi dan organisasi jasad hidup (organisme) ditinjau dari struktur dan regulasi molekuler unsur atau komponen penyusunnya. Aspek biologi yang dikaji adalah bahan genetik dan sisntesis ptrotein. Bioteknologi tidak terlepas dari mikroorganisme sebagai subyek (pelaku) dalam hal ini adalah mikroorganisme berupa virus, bakteri, cendawan, alga, protozoa yang dikaji dalam ilmu mikrobiologi. Ilmu pendukung bioteknologi lain adalaha genatika yang didefenisikan sebagai ilmu yang mempelajari berbagai aspek yang menyangkut pewarisan sifat dan variasi sifat pada organisme maupun sub-organisme (seperti virus dan prion) atau ilmu tentang gen. Bagian ilmu yang menjadi penyokong bioteknologi adalah biologi sel, biokimia,dan ilmu teknik. Hal yang dipelajari dalam biologi sel mencakup sifat-sifat fisiologis 51



sel seperti struktur dan organel yang terdapat di dalam sel, lingkungan dan interaksi sel, daur hidup sel, pembelahan sel dan fungsi sel (fisiologi), hingga kematian sel. Biokimia merupakan ilmu yang mempelajari struktur dan fungsi komponen selular, seperti protein, karbohidrat, lipid, asam nukleat, dan biomolekul lainnya dan lebih terfokus secara khusus pada kimia reaksi termediasi enzim dan sifat-sifat protein. Multidisiplin ilmu ini dapat diterapkan dalam teknik DNA rekombinan atau rekayasa genetika. Dimana Teknologi DNA rekombinan (recombinant DNA technology) adalah suatu metode untuk merekayasa genetik dengan cara menyisipkan (insert) gen yang dikehendaki ke dalam suatu organisme. Teknologi transgenik bertujuan untuk mengubah sifat alami suatu individu menjadi sifat yang dikehendaki oleh manusia dan memanfaatkan proses replikasi, transkripsi dan translasi untuk memanipulasi, mengisolasi dan mengekspresikan suatu gen dalam organisme yang berbeda. Teknologi DNA rekombinan ini memberikan banyak manfaat dibeberapa sektor, seperti pada bidang kesehatan, pangan, lingkungan, energi, dan lainlain. Contoh Soal: 1. Jelaskan secara singkat tapi jelas apa yang dimaksud dengan: a. Bioteknologi b. Bioinformatika c. Biotransformasi d. Kloning gen e. Enzim restriksi



f. Antimikroba g. Fermentasi h. RT- PCR



2. Sebutkan dan jelaskan era perkembangan bidang bioteknologi dari awal perkembangannya hingga dewasa ini. 3. Sebutkan kelebihan dan kekurangan masing-masing dari kultur sel bakteri, kultur sel khamir, dan kultur sel mamalia dalam kaitannya dengan proses produksi protein rekombinant serta contoh protein yang berhasil diproduksi dengan teknik rekayasa genetika. 4. Sebutkan dan jelaskan era perkembangan bidang bioteknologi dari awal perkembangannya



hingga



dewasa



ini



(bioteknologi



konvensional



hingga



bioteknologi modern). 5. Apa perbedaan antara green biotechnology dengan blue biotechnology.



52



DAFTAR PUSTAKA Glick B.R., and Pasternak, J.J. (1994). Molecular Biotechnology :



Principles and



Application of Recombinant DNA. Gaffar, S. 2007. Buku Ajar Bioteknologi Molekul. Jurusan Kimia Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam Universitas Padjadjaran. Bandung. Nurcahyo, H. 2011. Diktat Bioteknologi. Jurusan Pendidikan Biologi Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam Universitas Negeri Yogyakarta. Yogyakarta. Sajidan.



2009.



Tentang



Bioteknologi.



http://sajidan.staff.fkip.uns.ac.id/2011/02/18/



tentang-bioteknologi/. Siregar, AZ., 2008. Biologi Pertanian. Departemen Pendidikan Nasional. Jakarta. Smith, JE. 2009. Biotechnology. CAMBRIDGE UNIVERSITY PRESS. Subowo, Peranan Biologi molekuler dalam Perkembangan Ilmu Kedokteran dan Disiplin Lain yang Terkait. Universitas Padjajaran Bandung. Yuwono, T. 2005. Biologi Molekuler. Penerbit Erlangga. Jakarta.



53



Senarai IstilahdanArtinya Istilah



Arti



Bioteknologi



Penerapan



asas-asas



sains



dan



rekayasa



untuk



pengolahan suatu bahan dengan melibatkan aktivitas jasad hidup untuk menghasilkan barang dan/atau jasa. Plasmid atau Vektor



Molekul DNA sirkular kecil yang dapat masuk ke dalam bakteri dan bereplikasi sendiri, terpisah dari genom inang.



Transduksi



Transfer DNA dimediasi oleh virus bakteri (bakteriofag atau fag) dan sel yang telah menerima pentransduksi DNA disebut sebagai transduktan.



Reaksi degradatif



Reaksi biokimia perombakan senyawa kimia untuk dirubah menjadi senyawa lain, baik untuk produksi energi selular maupun sebagai prekursor dalam biosintesis komponen-komponen sel.



Teknologi DNA rekombinan



Metode



untuk



merekayasa



genetik



dengan



cara



menyisipkan (insert) gen yang dikehendaki ke dalam suatu organisme. Polymerase Chain Reaction



Teknik perbanyakan (amplifikasi) potongan DNA secara in vitro pada daerah spesifik yang dibatasi oleh dua buah primer oligonukleotida.



Enzim Restriksi



enzim yang dapat memotong DNA pada urutan yang spesifik.



Transformasi



Proses memasukkan DNA ke dalam sel.



Klon



Sekumpulan



sel-sel



yang



mengandung



plasmid



rekombinan yang sama. Sekuensing DNA



Metode yang digunakan untuk mengetahui urutan atau susunan nukleotida atau basa dalam suatu fragmen DNA.



Origin of replication (Ori)



Urutan DNA spesifik



pada DNA plasmid yang dapat



bereplikasi sendiri di dalam sel inang/host.



54



BAB 3 BIOTEKNOLOGI PADA PROSES FERMENTASI 3.1



Pendahuluan Pada bagian ini yang akan menjadi sasaran pembelajaran adalah (1) menjelaskan



model fermentasi dan mampu membedakan fermentasi sistim tertutup, kontinyu, dan fedbatch,



(2)



menjelaskan



parameter



lingkungan



fisik



dan kimiawi



fermentor,



(3)



menggambarkan struktur dan menyebutkan jenis/macam fermentor, (4) menjelaskan kondisi-kondisi aseptis yang dibutuhkan fermentor, (5) menjelaskan proses fermentasi yoghurt, (6) menjelaskan proses fermentasi nata de coco, dan (7) menjelaskan proses fermentasi kecap.Seperti yang telah diuraikan pada bagian sebelumnya, bioteknologi adalah suatu cara manusia untuk menghasilkan suatu produk atau jasa menggunakan makhluk hidup secara utuh atau bagiannya. Meskipun bioteknologi tampak seperti ilmu yang sangat pesat kemajuannya, beberapa contoh penerapannya telah lama dilakukan oleh manusia pada era peradaban Yunani dan Mesir kuno. Pemanfaatan mikroorganisme untuk merubah bahan baku menjadi suatu produk atau jasa merupakan salah satu contoh penerapan bioteknologi. Mikroorganisme atau mikroba adalah makhluk hidup satu sel yang tidak dapat dilihat secara kasat mata, dapat berupa bakteri, jamur, atau alga bersel satu. Peranan bioteknologi, di antaranya dalam bidang pangan, kesehatan, pertanian, peternakan, lingkungan, dan pertambangan (Firman, 2008). Bioteknologi secara sederhana sudah dikenal oleh manusia sejak ribuan tahun yang lalu. Sebagai contoh, di bidang teknologi pangan adalah pembuatan bir, roti, maupun keju yang sudah dikenal sejak abad ke-19, pemuliaan tanaman untuk menghasilkan varietasvarietas baru di bidang pertanian, serta pemuliaan dan reproduksi hewan. Di bidang medis, penerapan bioteknologi di masa lalu dibuktikan antara lain dengan penemuan vaksin, antibiotik, dan insulin fermentasi



walaupun masih dalam jumlah yang terbatas akibat proses



yang tidak sempurna. Perubahan signifikan terjadi setelah penemuan



bioreaktor oleh Louis Pasteur. Dengan alat ini, produksi antibiotik maupun vaksin dapat dilakukan secara massal pada waktu yang relatif singkat (Anonim a, 2010). Pada masa kini, bioteknologi berkembang sangat pesat, terutama di negara negara maju. Kemajuan ini ditandai dengan ditemukannya berbagai macam teknologi seperti rekayasa genetika, kultur jaringan, rekombinan DNA, pengembangbiakan sel induk, kloning, dan lain-lain. Teknologi ini memungkinkan kita untuk memperoleh penyembuhan penyakit-penyakit genetik maupun kronis yang belum dapat disembuhkan secara 55



konvensional, seperti penyakit kanker dan AIDS. Penelitian di bidang pengembangan sel induk juga memungkinkan para penderita stroke ataupun penyakit lain yang mengakibatkan kehilangan atau kerusakan pada jaringan tubuh dapat sembuh seperti sediakala. Pembahasan tentang sel induk secara detail akan diberikan pada bagian berikutnya. Di bidang pangan, dengan menggunakan teknologi rekayasa genetika, kultur jaringan dan rekombinan DNA, dapat menghasilkan tanaman dengan sifat dan produk unggul karena mengandung zat gizi yang lebih jika dibandingkan tanaman biasa (tanaman nontransgenik atau wild type), serta juga lebih tahan terhadap hama maupun tekanan lingkungan. Penerapan bioteknologi di masa kini juga dapat dijumpai pada pelestarian lingkungan hidup dari polusi. Sebagai contoh, pada penguraian minyak bumi yang tertumpah ke laut oleh bakteri pengurai hidrokarbon, dan penguraian zat-zat yang bersifat toksik (racun) di sungai atau laut dengan menggunakan bakteri jenis baru (Anonim a, 2010). Bioteknologi adalah penggunaan organisme atau sistem hidup untuk memecahkan suatu masalah atau untuk menghasilkan produk atau jasa yang berguna. Jadi bioteknologi bukanlah merupakan terobosan teknologi yang revolusioner, karena sebetulnya teknologi ini sudah ada sejak adanya peradaban manusia (Sofa, 2008). Pada umumnya bioteknologi menggunakan mikroorganisme karena dapat tumbuh dengan cepat yang dapat dikontrol pertumbuhannya, mengandung protein yang cukup tinggi, dapat menggunakan produk-produk sisa sebagai substratnya misalnya dari limbah dapat menghasilkan produk yang tidak toksik dan reaksi biokimianya dapat dikontrol oleh enzim organisme itu sendiri. Bioteknologi dengan menggunakan mikroorganisme dapat menghasilkan produk makanan dan minuman, penghasil obat, pembasmi hama tanaman, pengolah limbah, pemisah logam dari bijih logam, dan lain sebagainya (Ahmadi, 2010). Fermentasi merupakan kegiatan mikroba pada bahan pangan sehingga dihasilkan produk yang dikehendaki. Mikroba yang umumnya terlibat dalam fermentasi adalah bakteri, khamir dan kapang. Contoh bakteri yang digunakan dalam fermentasi adalah Acetobacter xylinum pada pembuatan nata decoco, Acetobacter aceti pada pembuatan asam asetat. Contoh khamir dalam fermentasi adalah Saccharomyces cerevisiae dalam pembuatan alkohol sedang contoh kapang adalah Rhizopus sp. pada pembuatan tempe, Monascus purpureus pada pembuatan angkak dan sebagainya. Fermentasi dapat dilakukan menggunakan kultur murni ataupun alami serta dengan kultur tunggal ataupun kultur campuran. Fermentasi menggunakan kultur alami umumnya dilakukan pada proses fermentasi tradisional yang memanfaatkan mikroorganisme yang ada di lingkungan. Salah satu contoh produk pangan yang dihasilkan dengan fermentasi alami adalah gatot dan growol yang dibuat dari singkong. Tape merupakan produk fermentasi tradisional yang 56



diinokulasi dengan kultur campuran dengan jumlah dan jenis yang tidak diketahui sehingga hasilnya sering tidak stabil. Ragi tape yang bagus harus dikembangkan dari kultur murni. Kultur murni adalah mikroorganisme yang akan digunakan dalam fermentasi dengan sifatdan karaktersitik yang diketahui dengan pasti sehingga produk yang dihasilkan memiliki stabilitas kualitas yang jelas. Dalam proses fermentasi kultur murni dapat digunakan secara tunggal ataupun secara campuran. Contoh penggunaan kultur murni tunggal adalah Lactobacillus casei pada fermentasi susu sedang contoh campuran kultur murni adalah pada fermentasi kecap, yang menggunakan Aspergillus oryzaepada saat fermentasi kapang dan saat fermentasi garam digunakan bakteri Pediococcus sp dan khamir Saccharomyces rouxii (Nurhidayat, 2007). Proses fermentasi dari suatu organisme dapat mengubah suatu makanan dan minuman. Proses fermentasi merupakan perubahan enzimatik secara anaerob dari suatu senyawa organik dan menjadi produk organik yang lebih sederhana. Senyawa organik dapat dijadikan sebagai sumber makanan bagi mikroorganisme



karena mereka dapat



tumbuh menjadi dua kali lipat (doubling time) dan juga massa mikroba minimal mengandung 40% protein dan memiliki kandungan vitamin dan mineral yang tinggi (Ahmadi, 2010). Peranan mikroorganisme dalam berbagai kehidupan manusia, di antaranya dalam bidang kesehatan, pangan dan pertanian. Kemajuan dalam teknologi fermentasi dan rekayasa genetika sangat membantu dan mendukung bioteknologi, sehingga pemanfaatan mikroba sekarang ini jauh lebih maju dibanding yang telah lalu yang masih memakai caracara tradisional dan skala kecil. Produksi makanan seperti keju, roti, susu asam, kecap, minuman bir, anggur, asam cuka, asam sitrat, dan produksi biomassa seperti insektisida, Protein sel tunggal (PST) dan vaksin sudah diproduksi dalam skala industri secara besarbesaran sehingga manfaatnya telah dirasakan dan sedikit banyak meringankan beban manusia. Mikroba sangat ideal digunakan dalam memproduksi senyawa-senyawa yang sangat berguna bagi kehidupan manusia (Sofa, 2008). Fermentasi dapat terjadi karena adanya aktivitas mikroba penyebab fermentasi pada substrat organik yang sesuai. Terjadinya fermentasi ini dapat menyebabkan perubahan sifat bahan, sebagai akibat dari pemecahan kandungan makromolekul, khususnya karbohidrat dari bahan tersebut. Bakteri laktat (lactobacillus) merupakan kelompok mikroba dengan habitat dan lingkungan hidup sangat luas, baik di perairan (air tawar ataupun laut), tanah, lumpur, maupun batuan. Bakteri ini juga menempel pada jasad hidup lain seperti tanaman, hewan, serta manusia (Sumantri, 2004). Yoghurt merupakan salah satu produk hasil fermentasi susu yang paling tua dan cukup populer di seluruh 57



dunia. Yoghurt bentuk dan tampilannya mirip bubur atau es krim tetapi dengan rasa agak asam. Selain dibuat dari susu segar, yoghurt juga dapat dibuat dari susu skim (susu tanpa lemak) yang dilarutkan dalam air dengan perbandingan tertentu bergantung pada kekentalan produk yang diinginkan. Selain dari susu hewani, belakangan ini yoghurt juga dapat dibuat dari campuran susu skim dengan susu nabati (susu kacang-kacangan) (Sumantri, 2004). Teknik pembuatan yoghurt menggunakan bahan baku susu sapi segar dengan menggunakan starter yang berbeda, yaitu Yakult™ dengan bahan susu sapi segar. Fermentasi ialah proses baik secara aerob maupun anaerob yang menghasilkan berbagai produk yang melibatkan aktivitas mikroba atau ekstraknya dengan aktivitas mikroba terkontrol (Ganesha, 2007). Mikroba dalam industri fermentasi merupakan faktor utama, sehingga harus memenuhi syarat-syarat tertentu yaitu (Nurhidayat, 2007): 1.



Murni, dalam proses-proses tertentu harus menggunakan biakan murni (dari satu strain tertentu) yang telah diketahui sifat-sifatnya. Untuk menjaga agar biakan tetap murni dalam proses maka kondisi lingkungan harus dijaga tetap steril. Penggunaan kultur tunggal mempunyai resiko yang tinggi karena kondisi harus optimum. Untuk mengurangi kegagalan dapat digunakan biakan campuran. Keuntungan penggunaan biakan campuran adalah mengurangi resiko apabila mikrobia yang lain tidak aktif melakukan fermentasi. Dalam bidang pangan penggunaan biakan campuran dapat menghasilkan aroma yang spesifik. Pengembangan inokulum yang terdiri campuran biakan murni belum berkembang di Indonesia. Sebagai contoh, inokulum tempe yang dibuat LIPI masih merupakan inokulum kultur tunggal sehingga produsen tempe sering mencampur inokulum murni dengan inokulum tradisional dengan maksud memperoleh hasil yang baik. Inokulum tape (ragi tape) juga belum berkembang. Di Malaysia, telah dikembangkan campuran kultur murni untuk membuat tape rendah alkohol. Ini merupakan upaya untuk memenuhi tuntutan masyarakat yang sebagian besar muslim. Isolatnya sendiri diperoleh dari ragi yang telah ada di pasaran. Penggunaan



inokulum



campuran



harus



memperhatikan



kebutuhan



nutrisi



mikroorganismenya. Kultur campuran yang baik adalah model suksesi sehingga antar organisme tidak bersaing namun saling mendukung untuk pembentukan produk. 2.



Unggul,pada kondisi fermentasi yang diberikan, mikrobia harus mampu menghasilkan perubahan-perubahan yang dikehendaki secara cepat dan hasil yang besar. Sifat unggul yang ada harus dapat dipertahankan. Hal ini berkaitan dengan kondisi proses yang diharapkan. Proses rekayasa genetik dapat dilakukan untuk memperbaiki sifat 58



jasad dengan maksud mempertinggi produk yang diharapkan dan mengurangi produkproduk ikutan. 3.



Stabil,pada kondisi yang diberikan, mikroba harus mempunyai sifat-sifat yang tetap, tidak mengalami perubahan karena mutasi atau pengaruh lingkungan.



4.



Bukan Patogen,mikroba yang digunakan adalah bukan patogen bagi manusia maupun hewan, kecuali untuk produksi bahan kimia tertentu. Jika digunakan mikroba patogen harus dijaga, agar tidak menimbulkan akibat samping pada lingkungan. Reaksi dalam fermentasi berbeda-beda tergantung pada jenis gula yang digunakan



dan produk yang dihasilkan. Secara singkat, glukosa (C6H12O6) yang merupakan gula paling sederhana , melalui fermentasi akan menghasilkan etanol (2 C2H5OH). Reaksi fermentasi ini dilakukan oleh ragi, dan digunakan pada produksi makanan. Persamaan reaksi kimia (Anonim c, 2010): C6H12O6 → 2 C2H5OH + 2CO2 + 2 ATP (Energi 118 kJ per mol)………………. (1) Pembuatan tempedan tape (baik tape ketan maupun tape singkong) adalah proses fermentasi yang sangat dikenal sejak lama di Indonesia. Proses fermentasi menghasilkan senyawa-senyawa yang sangat berguna, mulai dari makanan sampai obat-obatan. Proses fermentasi pada makanan yang sering dilakukan adalah proses pembuatan yoghurt, nata, dan kecap. 3.2



Fermentasi Yoghurt Kata diambil dari bahasa Turki yoğurt diambil dari kata sifat „yoğun‟, yang berarti



“padat” dan “tebal”, atau dari kata kerja yoğurmak, yang berarti “memijat” dan kemungkinan berarti “membuat padat” aslinya bagaimana yoghurt dibuat (Anonim d, 2010). Yoghurt sebenarnya sudah lama dikenal sebagai minuman tradisional masyarakat daerah Balkan dan Timur Tengah. Namun manfaat yoghurt bagi kesehatan baru mulai populer ketika tahun 1908 seorang peneliti bernama E. Metchnikoff membuat hipotesis yang mengatakan bahwa ada hubungan erat antara umur panjang masyarakat pegunungan di Bulgaria dengan kebiasaan mereka mengonsumsi susu fermentasi. Kendati data empiris yang ada masih terbatas, hipotesis tersebut dianggap menarik untuk dikaji dan diungkap lebih lanjut. Metchnikoff sendiri akhirnya mendapat penghargaan Nobel dan sejak saat itu produk susu fermentasi terus dikembangkan dan diteliti. Di beberapa negara 59



yoghurt dikenal dengan nama berbeda-beda. Semisal Jugurt (Turki), Zabady (Mesir, Sudan), Dahee (India), Cieddu (Italia), dan Filmjolk (Skandinavia) (Nikita, 2006). Yoghurt atau yogurt adalah sebuah produk susu yang dihasilkan oleh bakteri fermentasi susu. Fermentasi dari laktosa menghasilkan asam laktat yang bekerja pada protein susu sehingga membuat yoghurt lebih padat serta memiliki tekstur dan aroma yang khas. Umumnya yoghurt dibuat menggunakan susu sapi, namun ada beberapa yoghurt juga menggunakan susu kedelai (Anonim e, 2010).



Gambar 3.1. Yoghurt yang dipasarkan untuk kebutuhan sehari-hari Bakteri yang digunakan dalam pembuatan yoghurt ada 2, yaitu Streptococcus thermopilus dan Lactobacillus bulgaricus. Cita rasa khas yoghurt ditentukan dari terbentuknya asam laktat, asetaldehid, asam asetat dan asetil. Keberadaan kedua bakteri tersebut sangat penting. Bakteri Streptococcus thermopilus membantu menciptakan kondisi lingkungan yang lebih baik bagi bakteri Lactobacillusbulgaricus untuk menghasilkan enzimnya. Sementara itu bakteri Lactobacillus bulgaricus menghasilkan asetaldehid sehingga cita rasa yang khas pada yoghurt dapat tercapai (Wahyu, 2009). A.



Jenis yoghurt Berdasarkan daerah asalnya, yoghurt dibedakan atas beberapa jenis, yaitu (Anonim



d, 2010): 1.



Yoghurt Dahi, yoghurt Dahi dari subkontinen India dikenal dengan rasanya yang unik. Istilah Inggris untuk yoghurt spesifik di Bangladesh, India, dan Pakistan adalah curd.



2.



Dadiah atau dadih adalah yoghurt tradisional dari Sumatera Barat yang dibuat dari susu kerbau. Dadiah difermentasi dalam tabung bambu.



3.



Labneh atau LabanehYoghurt Labneh dari Lebanon adalah yoghurt yang telah dipadatkan yang digunakan untuk sandwich. Minyak olive, potongan mentimun, olive, dan berbagai macam herba hijau terkadang ditambahkan. Labneh dapat ditebalkan lagi dan digulung membentuk bola, lalu diawetkan dalam minyak olive, dan 60



difermentasi untuk beberapa minggu. Terkadang digunakan beserta bawang bombay, daging, dan kacang untuk Lebanese pie atau Kebbeh balls. 4.



Bulgarian Yoghurt Bulgaria, umumnya dikonsumsi apa adanya, populer karena rasa, aroma dan kualitasnya. Kualitas muncul dari Lactobacillus bulgaricus dan Streptococcus thermophilus strain yang digunakan di Bulgaria dan Macedonia. Produsen yoghurt Bulgaria mengambil langkah untuk melindungi trademark yoghurt Bulgaria di Eropa dan untuk membedakannya dengan produk lain yang tidak mengandung bakteri hidup. Yoghurt Bulgaria dan Macedonia seringkali disaring dengan cara menggantungnya pada pakaian untuk beberapa jam untuk mengurangi kadar air. Hasil yoghurtnya lebih creamy, kaya dan lembut pada rasanya karena peningkatan lemak. Dengan cara menggantungnya semalaman menghasilkan yoghurt yang terkonsentrasi mirip dengan keju krim. Yoghurt juga digunakan untuk menyiapkan salad susu Bulgaria. Sup dingin populer yang dibuat di Bulgaria (Yoghurt Bulgaria), umumnya dikonsumsi apa adanya, populer karena rasa, aroma dan kualitasnya. Kualitas muncul dari strain Lactobacillus bulgaricus dan Streptococcus thermophilus yang digunakan dalam produksi yoghurt pada musim panas di Bulgaria, Macedonia, dan Turki.



5.



Lassi, adalah semacam minuman berbasis yoghurt yang asal mulanya dari subkontinen India (seperti India, Pakistan, dan Bangladesh), biasanya dibuat asin atau manis. Lassi asin biasanya diberi rasa cumin yang dibakar dalam tanah dan cile pepper; sedangkan rasa manis dengan rosewater, lemon, mangga atau jus buah lainnya. Minuman berbasis yoghurt lainnya, minuman asin yang disebut ayran, populer di Azerbaijan, Turki, Bulgaria, Macedonia, Kazakhstan dan Kyrgystan. Dibuat dengan cara mencampur yoghurt dengan air dan menambah garam. Minuman sama yang dikenal tan di Armenia dan "Laban Ayran" di Syria. Minuman yang mirip, Doogh, populer di Timur Tengah antara Lebanon dan Iran; berbeda dari ayran karena menambah herbal, biasanya mint, dan dikarbonisasi, biasanya dengan air seltzer. Di AS, minuman berbasis yoghurt seringkali dijual dalam nama seperi "yoghurt smoothie" atau "drinkable yoghurt". a.



Minuman yoghurt yang populer di Kanada, Inggris, dan Irlandia, disebut Yop yang dijual di supermarket dan toko-toko tertentu.



b.



Kefir,adalah minuman susu fermentasi berasal di Kaukasus. Beberapa peternakan Amerika menawarkan minuman yang disebut "kefir" untuk beberapa tahun dengan rasa buah tapi tanpa karbonisasi atau alkohol. Hingga 2002, bernama



seperti



"drinkable



yoghurt"



dan



"yoghurt



smoothie"



telah



diperkenalkan. 61



Berdasarkan teksturnya, yoghurt dibagi lagi menjadi beberapa jenis, yaitu (Anonim f, 2010) : 1.



Set Yoghurt, merupakan yoghurt dengan tekstur sangat kental. Umumnya merupakan plain yoghurt yaitu yoghurt tanpa penambahan gula, rasa, atau aroma. Warnanya putih dan terasa sangat asam.



2.



Stir Yoghurt, teksturnya lebih encer dibandingkan set yoghurt tetapi masih terasa kental mirip dengan ice cream. Stir yoghurt sudah mengalami penambahan pemanis, perasa



atau



buah-buahan



pelengkap.



Untuk



menikmati



stir



yoghurt,



kita



membutuhkan sendok. 3.



Drink yoghurt, yoghurt bentuk ini dapat langsung diminum. Bentuknya cair sama seperti susu cair.



B.



Teknik Pembuatan Yoghurt Bagi orang yang menggemari yoghurt atau ingin merasakan khasiat yoghurt, kita



dapat pula membuatnya sendiri di rumah. Bahan dasar yang diperlukan adalah susu cair, susu bubuk, gula pasir dan yoghurt tawar yang berfungsi sebagai bibit (Anonim f, 2010). Proses pembuatan yoghurt secara sederhana adalah sebagai berikut: Masukkan susu cair dalam panci, dicampur dengan susu bubuk dan gula pasir. Panaskan diatas kompor dengan api kecil sampai mencapai suhu 75 – 80 oC. Diamkan selama 15 menit kemudian angkat dan biarkan sampai mencapai suhu 35 oC. Bila ingin menghasilkan yoghurt rendah lemak, maka gunakan susu rendah lemak dalam pembuatannya (Anonim f, 2010). Kemudian masukkan yoghurt tawar (yoghurt tanpa penambah rasa, tanpa gula, tanpa penambah aroma) atau atau bibit yoghurt yang dijual di pasaran dan aduk rata. Pastikan bahwa yoghurt telah mencapai suhu 35 oC sebelum memasukkannya agar bakteri pada bibit atau starter ini tidak mati. Tutup rapat panci agar susu mengalami proses fermentasi. Biarkan selama 24 jam (Anonim f, 2010). Setelah terbentuk yoghurt, Anda dapat menambahkan buah-buahan atau tambahkan sirup atau gula bila yoghurt terasa kurang manis (Anonim f, 2010). C.



Penyimpanan Yoghurt Setelah



yoghurt



terbentuk,



cara



terbaik



penyimpanannya



adalah



dengan



menaruhnya dalam lemari es. Simpan dalam suhu 4-7 oC. Sebaiknya yoghurt diletakkan dalam wadah yang tertutup rapat (Anonim f, 2010). 62



D.



Manfaat Yoghurt Berikut ini beberapa manfaat dari yoghurt untuk kesehatan manusia, antara lain:



1.



Menyehatkan pencernaan, berdasarkan hasil penelitian, yoghurt dapat mengatasi berbagai masalah pencernaan seperti diare, radang usus, kanker usus atau intoleransi laktosa.



2.



Mengurangi risiko terjadinya infeksi pada vagina, wanita yang mengkonsumsi yoghurt dapat mengurangi tingkat keasaman (pH) sehingga dapat mengurangi perkembangan infeksi jamur.



3.



Menurunkan risiko darah tinggi, dengan mengkonsumsi yoghurt 2-3 porsi sehari, dapat mengurangi risiko tekanan darah tinggi.



4.



Mencegah osteoporosis, karena berbahan dasar susu, maka dalam yoghurt mengandung kalsium dan vitamin D. Kedua senyawa ini dapat membantu seseorang terhindar dari osteoporosis.



5.



Membantu kita lebih kenyang, kandungan kalori yang terdapat dalam yoghurt menjadikan yoghurt makanan yang dapat membantu seseorang merasa lebih kenyang.



3.3



Fermentasi Nata De Coco Nata De Coco merupakan jenis komponen minuman yang terdiri dari senyawa



selulosa (dietry fiber), yang dihasilkan dari air kelapa melalui proses fermentasi, yang melibatkan jasad renik (mikroba), yang selanjutnya dikenal sebagai bibit nata. Pada prinsipnya untuk menghasilkan nata de coco yang bermutu baik, maka perlu disediakan media yang dapat mendukung aktivitas Acetobacter xylinum untuk memproduksi selulosa ekstraseluler atau yang kemudian di sebut nata de coco. Berbagai penelitian ilmiah mencoba menggantikan air buah kelapa dengan bahan lain seperti whey tahu, sari buah nenas, sari buah pisang dll. Kegiatan ilmiah ini menghasilkan produk yang akrab disebut nata de soya, nata de pina dll. Sebagian peneliti mencoba menggantikan air buah kelapa dengan bahan baku yang lain dan tidak berasal dari kelapa. Ternyata selain air buah kelapa, skim santan juga dapat dipergunakan sebagai bahan baku utama pembuatan nata de coco. Aktivitas dari bakteri Acetobacter xylinum dalam memproduksi nata de coco. Proses terbentuknya nata adalah sebagai berikut: selsel Acetobacter xylinum mengambil glukosa dari larutan gula, kemudian digabungkan dengan asam lemak membentuk prekursor pada membran sel, kemudian keluar bersama63



sama enzim yang mempolimerisasikan glukosa menjadi selulosa diluar sel. Prekursor dari polisakarida tersebut adalah GDP glukosa. Pembentukan prekursor ini distimulir oleh adanya katalisator seperti Ca2+dan Mg2+. Prekursor ini kemudian mengalami polimerisasi dan berikatan dengan aseptor membentuk selulosa. Bibit nata sebenarnya merupakan golongan bakteri dengan nama Acetobacter xylinum. Dalam kehidupan jasad renik, bakteri dapat digolongkan ke dalam tiga kelompok yaitu



bakteri



yang



membahayakan,



bakteri



yang



merugikan



dan



bakteri



yang



menguntungkan. Adapun yang termasuk dalam kelompok bakteri yang membahayakan antara lain adalah bakteri yang menghasilkan racun atau menyebabkan infeksi, sedangkan ternasuk dalam kelompok bakteri yang merugikan adalah bakteri pembusuk makanan. Sementara yang termasuk dalam kelompok bakteri yang menguntungkan adalah jenis bakteri yang dapat dimanfaatkan oleh manusia hingga menghasilkan produk yang berguna. Acetobacter xylinum merupakan salah satu contoh bakteri yang menguntungkan bagi manusia seperti halnya bakteri asam laktat pembentuk yoghurt, asinan dan lainnya. Bakteri Acetobacter xylinum dapat membentuk nata jika ditumbuhkan dalam air kelapa yang sudah diperkaya dengan unsur hara Karbon (C) dan Nitrogen (N), melalui proses yang terkontrol. Dalam kondisi demikian, bakteri tersebut akan menghasilkan enzim akstraseluler yang dapat menyusun zat gula menjadi ribuan rantai serat atau selulosa. Dari jutaan renik yang tumbuh pada air kelapa tersbeut, akan dihasilkan jutaan lembar benangbenang selulosa yang akhirnya nampak padat berwarna putih hingga transparan, yang disebut sebagai nata. Nata yang dihasilkan tentunya bisa beragam kualitasnya. Kualitas yang baik akan terpenuhi apabila air kelapa yang digunakan memenuhi standar kualitas bahan nata, dan prosesnya dikendalikan dengan cara yang benar berdasarkan pada faktor-faktor yang mempengaruhi pertumbuhan dan aktivitas Acetobacter xylinum yang digunakan. Apabila rasio antara karbon dan nitrogen diatur secara optimal, dan prosesnya terkontrol dengan baik, maka semua cairan akan berubah menjadi nata tanpa meninggalkan residu sedikitpun. Air kelapa yang digunakan dalam pembuatan nata harus berasal dari kelapa yang masak optimal, tidak terlalu tua atau terlalu muda. Bahan tambahan yang diperlukan oleh bakteri antara lain karbohidrat sederhana, sumber nitrogen, dan asam asetat. Pada umumnya senyawa karbohidrat sederhana dapat digunakan sebagai suplemen pembuatan nata de coco, diantaranya adalah senyawa-senyawa maltosa, sukrosa, laktosa, fruktosa dan manosa. Dari beberapa senyawa karbohidrat sederhana itu sukrosa merupakan 64



senyawa yang paling ekonomis digunakan dan paling baik bagi pertumbuhan dan perkembangan bibit nata. Adapun dari segi warna yang paling baik digunakan adalah sukrosa putih. Sukrosa coklat akan mempengaruhi kenampakan nata sehingga kurang menarik. Sumber nitrogen yang dapat digunakan untuk mendukung pertumbuhan aktivitas bakteri nata dapat berasal dari nitrogen organik, seperti misalnya protein dan ekstrak yeast, maupun Nitrogen an organik seperti misalnya ammonium fosfat, urea, dan ammonium slfat. Namun, sumber nitrogen anorganik sangat murah dan fungsinya tidak kalah jika dibandingkan dengan sumber nitrogen organik. Bahkan diantara sumber nitrogen anorganik ada yang mempunyai sifat lebih yaitu amonium sulfat. Kelebihan yang dimaksud adalah murah, mudah larut, dan selektif bagi mikroorganisme lain. Asam asetat atau asam cuka digunakan untuk menurunkan pH atau meningkatkan keasaman air kelapa. Asam asetat yang baik adalah asam asetat glasial (99,8%). Asam asetat dengan konsentrasi rendah dapat digunakan, namun untuk mencapai tingkat keasaman yang diinginkan yaitu pH 4,5 – 5,5 dibutuhkan dalam jumlah banyak. Selain asam asetat, asam-asam organik dan anorganik lain bisa digunakan. Seperti halnya pembuatan beberapa makanan atau minuman hasil fermentasi, pembuatan nata juga memerlukan bibit. Bibit tape biasa disebut ragi, bibit tempe disebut usar, dan bibit nata de coco disebut starter. Bibit nata de coco merupakan suspensi sel A. xylinum. Untuk dapat membuat bibit nata de coco seseorang perlu mengetahui sifat-sifat dari bakteri ini. Acetobacter



xylinum



merupakan



bakteri



berbentuk



batang



pendek,



yang



mempunyai permukaan dinding yang berlendir. Bakteri ini bisa membentuk rantai pendek dengan satuan 6-8 sel. Bakteri ini bersifat nonmotil dan dengan pewarnaan Gram menunjukkan Gram negatif. Bakteri ini juga tidak membentuk endospora maupun pigmen. Pada kultur sel yang masih muda, individu sel berada sendiri-sendiri dan transparan. Koloni yang sudah tua membentuk lapisan menyerupai gelatin yang kokoh menutupi sel koloninya. Pertumbuhan koloni pada medium cair setelah 48 jam inokulasi akan membentuk lapisan pelikel dan dapat dengan mudah diambil dengan jarum ose. Bakteri ini dapat membentuk asam dari glukosa, etil alkohol, dan propil alkohol, tidak membentuk indol dan mempunyai kemampuan mengoksidasi asam asetat menjadi CO2 dan H2O. sifat yang paling menonjol dari bakteri itu adalah memiliki kemampuan untuk mempolimerisasi glukosa sehingga menjadi selulosa. Selanjutnya selulosa tersebut membentuk matriks yang dikenal sebagai nata. Faktor lain yang dominan mempengaruhi



65



sifat fisiologi dalam pembentukan nata adalah ketersediaan nutrisi, derajat keasaman, temperatur, dan ketersediaan oksigen. Bakteri Acetobacter xylinum mengalami pertumbuhan sel. Pertumbuhan sel didefinisikan sebagai pertumbuhan secara teratur semua komponen di dalam sel hidup. Bakteri Acetobacter xylinum mengalami beberapa fase pertumbuhan sel yaitu fase adaptasi, fase pertumbuhan awal, fase pertumbuhan eksponensial, fase pertumbuhan lambat, fase pertumbuhan tetap, fase menuju kematian, dan fase kematian. Apabila bakteri dipindah ke media baru maka bakteri tidak langsung tumbuh melainkan beradaptasi terlebih dahulu. Pada fase ini terjadi aktivitas metabolisme dan pembesaran sel, meskipun belum mengalami pertumbuhan. Fase pertumbuhan adaptasi dicapai pada 0-24 jam sejak inokulasi. Fase pertumbuhan awal dimulai dengan pembelahan sel dengan kecepatan rendah. Fase ini berlangsung beberapa jam saja. Fase eksponensial dicapai antara 1-5 hari. Pada fase ini bakteri mengeluarkan enzim ektraseluler polimerase sebanyak-banyaknya untuk menyusun polimer glukosa menjadi selulosa (matriks nata). Fase ini sangat menentukan kecepatan suatu strain Acetobacter xylinum dalam membentuk nata. Fase pertumbuhan lambat terjadi karena nutrisi telah berkurang, terdapat metabolik yang bersifat racun yang menghambat pertumbuhan bakteri dan umur sel sudah tua. Pada fase ini pertumbuhan tidak stabil, tetapi jumlah sel yang tumbuh masih lebih banyak dibanding jumlah sel mati. Fase pertumbuhan tetap terjadi keseimbangan antara sel yang tumbuh dan yang mati. Matriks nata lebih banyak diproduksi pada fase ini. Fase menuju kematian terjadi akibat nutrisi dalam media sudah hamper habis. Setelah nutrisi habis, maka bakteri akan mengalami fase kematian. Pada fase kematian sel dengan cepat mengalami kematian. Bakteri hasil dari fase ini tidak baik untuk strain nata. Faktor-faktor yang mempengaruhi Acetobacter xylinum mengalami pertumbuhan adalah nutrisi, sumber karbon, sumber nitrogen, serta tingkat keasaman media temperatur, dan udara (oksigen). Senyawa karbon yang dibutuhkan dalam fermentasi nata berasal dari monosakarida dan disakarida. Sumber dari karbon ini yang paling banyak digunakan adalah gula. Sumber nitrogen bisa berasal dari bahan organik seperti ZA, urea. Meskipun bakteri Acetobacter xylinum dapat tumbuh pada pH 3,5 – 7,5, namun akan tumbuh optimal bila pH nya 4,3, sedangkan suhu ideal bagi pertumbuhan bakteri Acetobacter xylinumyaitu pada suhu 28 – 31°C. Bakteri ini sangat memerlukan oksigen (aerob),sehingga dalam fermentasi tidak perlu ditutup rapat namun hanya ditutup dengan aluminium foil atau kapas steril untuk mencegah kotoran masuk kedalam media yang dapat mengakibatkan kontaminasi pada kultur fermentasi. 66



Air kelapa dalam jumlah besar hasil samping industri pembuatan kopra dan desiccated coconut yang dibuang begitu saja ke lingkungan akan terbentuk asam yang akan menurunkan pH tanah ataupun air, yang akhirnya menggangu pertumbuhan tanaman sekitar dan menimbulkan bau. Dalam air kelapa cukup banyak mengandung zat–zat gizi yang dapat dimanfaatkan oleh makhluk hidup. Komposisi air kelapa antara lain karbohidrat (sukrosa, glukosa, fruktosa dan sorbitol) mineral (K, Na, Mg, P, Cl, Fe dan Cu), protein (asam–asam amino essencial) dan vitamin B dan C. Air kelapa dapat dimanfaatkan untuk pembuatan “nata de coco “, yaitu jenis makanan berbentuk seperti gelatin yang dihasilkan oleh bakteri Acetobacter xylinum. Nata de coco dihidangkan setelah dimasak dalam sirup kental, sering disajikan bersama campuran es buah. Komposisi nata de coco sebagian besar terdiri dari polisakarida, kemungkinan dekstrosa atau selulosa, tetapi struktur sebenarnya belum diketahui. Keberhasilan dalam pembuatan nata de coco dipengaruhi oleh viabilitas (kemampuan hidup) bakteri, kandungan nutrisi media air kelapa dan lingkungannya. Viabilitas bakteri yang baik akan menghasilkan nata yang baik dan cepat. Kandungan nutrisi yang cukup terutama gula sebagai sumber karbon untuk bahan baku pembentukan nata sangat diperlukan. Demikian pula ketersediaan sumber nitrogen dan mineral, walaupun



tidak



digunakan



langsung



pembentuk



nata,



sangat



diperlukan



untuk



pertumbuhan bakteri Acetobacter xylinum. Pemberian Amonium sulfat (NH4)2SO4 atau ZA (Zink amonium sulfat) sebagai sumber nitrogen (N) akan membantu pertumbuhan bakteri dan merangsang terbentuknya struktur nata yang tebal kompak. Penambahan KH2PO4 (Kalium dihidropospat) berfungsi sebagai buffer pada medium, sehingga pH akan konstan yaitu sekitar 3-4. Penstabilan pH optimum sangatlah penting bagi pertumbuhan bakteri Acetobacter xylinum agar diperoleh nata yang baik. Acetobacter xylinum dapat tumbuh dengan baik pada kondisi aerob, yaitu perlu adanya oksigen bebas dari udara dan dalam suasana asam (pH 3 – 4). Untuk membuat suasana aerob biasanya wadah untuk fermentasi memiliki permukaan yang luas dan penutupan dengan penutup yang masih bisa ditembus oleh udara, misalnya dengan kertas yang berpori–pori. Penutup dapat digunakan kertas koran, karena harganya relatif lebih murah dan mudah dalam penggunaannya. Sedangkan untuk membuat suasana asam yang sesuai bagi pertumbuhan bakteri perlu ditambahkan asam–asam organik, misalnya asam asetat. Suhu optimum yang dikehendaki sekitar 28-32ºC, sedangkan pada suhu rendah aktivitas pertumbuhannya lambat. Suhu inokulasi tidak boleh terlalu tinggi atau lebih 40 ºC, karena bisa menginaktifkan bakteri. Reaksi yang terjadi pada proses fermentasi Nata de coco ini yakni reaksi polimerisasi dimana glukosa diubah menjadi selulosa. Selulosa disini berfungsi sebagai 67



serat, olehnya itu, nata de coco menjadi makanan yang sehat dan tidak menggemukkan, cukup gizi dan seimbang. Sedangkan untuk kandungan Nitrogen dan juga karbon yang cukup pada kelapa dapat dimaksimalkan dengan menambahkan senyawa ZA seperti yang telah dijelaskan sebelumnya. A.



Bahan baku pada pembuatan Nata de coco Nata dapat dibuat dari limbah air kelapa, limbah kulit nenas dari industri



pengalengan, tetes tebu (molases), filtrat kecambah kacang hijau, santan air kelapa, limbah cair pembuatan tahu (whey), air pencucian beras dan lain-lain. Nata yang dibuat dari air kelapa dikenal dengan nama nata de coco, nata dari nenas disebut nata de pina , nata dari tetes tebu disebut nata de molases, sedangkan nata yang dibuat dari limbah air tahu di sebut nata de soya. Ketersediaan dan kemudahaan mendapatkan bahan baku secara kontinyu, murah, tidak memerlukan perlakuan lain, dan nata yang dihasilkan memenuhi standar pasar adalah kriteria yang harus diperhatikan untuk menentukan bahan baku mana yang cocok digunakan memproduksi nata. Salah satu bahan baku yang banyak digunakan oleh industri pengolahan nata adalah limbah air kelapa. Limbah ini relatif mudah didapat dan umumnya terbuang dari hasil pengolahan kopra, kelapa parut kering (desiccated coconut), industri kecil pengolahan simping, dodol dan jasa pemarutan kelapa di pasar. Bogor, Cianjur dan Sukabumi adalah sentra industri nata de coco di Jawa Barat. Air kelapa bukan lagi limbah yang mudah didapat dan murah. Tengkulak air kelapa dapat mematok harga dua ratus sampai tiga ratus rupiah setiap liternya. Air kelapa adalah primadona yang diperebutkan. Dengan demikian bisnis ini tidak lagi menjanjikan keuntungan yang besar karena bahan utamanya adalah limbah yang mahal. Kemampuan untuk terus mengembangkan bahan baku selain air kelapa adalah langkah yang baik, agar usaha nata dapat langgeng dan tidak tergantung dari satu macam bahan baku. Selain air kelapa, bahan peramu yang digunakan untuk membuat nata adalah gula, ZA (Zink amonium sulfat) dan asam asetat glasial. Gula yang digunakan adalah gula pasir, ZA dan asam asetat (CH3COOH) atau asam cuka. Penggunaan asam asetat pekat dimaksudkan untuk menurunkan pH sampai 3- 4 tanpa banyak menambah volume. Menggunakan asam asetat pekat harus hati-hati, karena dapat mengeluarkan bau yang menyengat, bahaya kalau tertelan, menetes dikulit dan terpercik di mata. Formula untuk pengembangan bibit dan pembuatan nata lempeng berkembang sejalan dengan kemajuan hasil penelitian dan pengalaman.



B.



Bahan pendukung pada pembuatan Nata de coco 68



Bahan pembantu yang digunakan dalam pembuatan nata terdiri dari koran, karet gelang, karet ban dan sabun colek. Koran yang dibutuhkan adalah koran bekas yang bersih, tidak bolong, rapuh, tidak tercemar kotoran seperti minyak, pestisida, tepung dan lain-lain. Koran berfungsi untuk menutup botol dan penutup loyang selama fermentasi. Untuk menutup botol bibit digunakan potongan koran 7 x 7 cm, sedangkan untuk menutup loyang selama fermentasi dibutuhkan koran agak lebar, kira-kira satu lembar koran dibagi dua. Koran tersebut dapat digunakan berulang-ulang, asalkan tidak sobek dan berlubang. Selama pemanenan nata, koran dipisahkan tersendiri dan diusahakan tidak basah karena sisa cairan nata yang tumpah, dan sobek sewaktu membuka karet. Koran selanjutnya dijemur sampai kering. Koran yang kusut dirapikan, dan digulung untuk digunakan kembali. Perlu diingat koran juga sebagai sumber kontaminasi. Untuk itu lakukan sortasi koran yang tercemar jamur. Koran sebelum dipakai dipanaskan dulu diatas kompor atau disetrika (sekaligus merapikan) sebelum koran digunakan untuk menutup loyang dan botol bibit. Karet gelang berbeda dengan karet ban. Biasanya karet gelang sering digunakan untuk mengikat bungkusan dan banyak digunakan untuk mainan anak. Karet ban lebih panjang dan sering dipakai untuk karet ketapel. Karet ban dapat dibuat sendiri dengan memotong karet ban dalam sepeda dengan lebar 1 cm dan panjang disesuaikan ukuran loyang yang akan digunakan. Karet gelang digunakan untuk mengikat koran di botol bibit dan loyang fermentasi.Setiap loyang diikat dengan dua karet gelang, yang berfungsi untuk menahan agar permukaan koran penutup tidak kendor dan menghindari menempelnya cairan di



Gambar 3.2. Diagram alir proses penyiapan dan pengembangan bibit nata



69



Gambar 3.3. Diagram alir proses penyiapan dan pembuatan nata lempeng koran selama fermentasi. Karet ban harus dipotong sesuai ukuran panjang dan lebar loyang. Karet ini digunakan setelah loyang yang telah diberi cairan media ditutup dengan koran, kemudian sekeliling bibir loyang diikat dengan karet tersebut. Secara singkat proses penyiapan bibit nata dan penyiapan dan pembuatan nata lempeng dapat dilihat pada Gambar 3.2 dan 3.3. 3.4



Fermentasi Kecap Secara umum, kecap dapat dibuat atau diproduksi dalam usaha skala kecil atau



menengah bahkan rumah tangga. Namun demikian masing masing industri kecap memiliki "bumbu rahasia" atau resep khusus sehingga rasa kecap yang dihasilkannya memiliki nilai lebih ("lebih enak") dibandingkan dengan yang lain. Kecap merupakan jenis makanan cair hasil fermentasi kedelai. Meskipun bahan baku pembuatan kecap adalah kedelai hitam, tetapi tidak menutup kemungkinan kecap dibuat dari kedelai kuning. Kecap dapat dibuat melalui 3 cara, yaitu fermentasi, hidrolisis asam, dan kombinasi fermentasi dan hidrolisis asam. Kecap yang dibuat secara fermentasi biasanya mempunyai cita rasa dan aroma yang lebih disukai konsumen. Pada prinsipnya



70



pembuatan kecap secara fermentasi berkaitan dengan penguraian protein, lemak, dan karbohidrat menjadi asam amino, asam lemak, dan monosakarida (Koswara, 1997). Telah lama diketahui bahwa kedelai mengandung senyawa isoflavon. Isoflavon dalam kedelai terdapat dalam 4 bentuk, yaitu malonil-glikosida, asetil-glikosida, glikosida, dan aglukon (Kudou dkk, 1991; Lee dan Chou, 2006). Perendaman kedelai dapat mengubah semua isoflavon malonil-glikosida dan asetil-glikosida menjadi isoflavon glikosida. Selanjutnya, isoflavon glikosida dapat berubah menjadi isoflavon aglukon selama perendaman kedelai. Perendaman pada suhu 60°C selama 6 jam mampu menghasilkan isoflavon aglukon paling optimal (Ha dkk, 1992). Perubahan isoflavon glikosida menjadi isoflavon aglukon diakibatkan oleh aktivitas enzim glukosidase yang dijumpai di sekitar biji kedelai (Ha dkk, 1992; Coward dkk, 1993). Rhizopus mampu mentransformasi isoflavon glikosida menjadi isoflavon aglikon selama fermentasitempe (Purwoko dkk, 2001). Isoflavon aglukon diketahui memiliki aktivitas antioksidatif. Mekanisme antioksidasi isoflavon aglukon adalah memangsa radikal bebas oleh adanya gugus fenolat. Radikal bebas di dalam sel dapat merusak membran sel dan membran inti, sehingga material genetik mudah diserang oleh berbagai agen mutagenik (Jacob, 1994). Akibatnya sel dapat bermutasi menjadi sel tumor dan bahkan dapat berubah menjadi kanker. Menurut Coward dkk (1993) tempe dan miso mengandung isoflavon aglukon tertinggi dibandingkan derivat fermentasi kedelai lainnya. Hal ini karena aktivitas kapang Rhizopus dan Aspergillus dalam mengubah isoflavon glikosida menjadi aglukon lebih kuat daripada mikroba lainnya. Menurut Lee dan Chou (2006) aktivitas transformasi isoflavon glikosida menjadi aglukon selama fermentasi koji/tempe oleh Rhizopus sp. lebih kuat daripada Aspergillus awamori, A. oryzae dan A. sojae. Bahan kedelai mula-mula difermentasi oleh kapangAspergillus sp. dan Rhizopus sp. menjadi semacam tempe kedelai. Kemudian "tempe" ini dikeringkan dan direndam di dalam larutan garam. Garam merupakan senyawa yang selektif terhadap pertumbuhan mikroba. Hanya mikroba tahan garam saja yang tumbuh pada rendaman kedelai tersebut. Mikroba yang tumbuh pada rendaman kedelai pada umumnya dari jenis khamir dan bakteritahan garam, seperti khamir Zygosaccharomyces dan bakteri susu Lactobacillus. Mikroba ini merombak protein menjadi asam-asam amino dan komponen rasa dan aroma, serta menghasilkan asam. Fermentasi dapat berlangsung dengan baik jika kadar garam cukup tinggi, yaitu antara 15 sampai 20%. Proses fermentasi kecap terdiri dari 2 tahap, yaitu fermentasi padat (fermentasi koji/tempe) dan fermentasi cair (fermentasi moromi). Kapang yang digunakan dalam fermentasi padat, adalah Aspergillus sp. dan Rhizopus sp. (Rahayu dkk., 1993). 71



Fermentasi padat memerlukan waktu selama 3-5 hari. Hasil fermentasi padat disebut koji/tempe, jika menggunakan Aspergillus sp. dan disebut tempe, jika menggunakan Rhizopus sp. Selanjutnya, koji/tempe dikeringkan, kemudian direndam dalam air garam 2030%. Proses perendaman koji/tempe dalam air garam disebut fermentasi moromi. Mikroba yang berperan dalam fermentasi moromi, adalah mikroba tahan garam seperti Hansenula sp., Zygosaccharomeces sp., dan Lactobacillus sp. (Rahayu, 1985). Fermentasi moromi memerlukan waktu selama 14-28 hari. Cairan hasil fermentasi moromi disebut moromi. Selanjutnya moromi ditambah dengan rempah rempah dan dikentalkan sehingga diperoleh kecap. Ampas dari fermentasi moromi dapat digunakan sebagai pakan ternak. Kandungan protein merupakan parameter kualitas kecap manis (Direktorat Gizi Depkes RI, 1996). Menurut Standar Industri Indonesia (SII) kecap manis berkualitas baik (I) harus mengandung protein minimal 6%. Penelitian sebelumnya menunjukkan bahwa kecap tanpa bumbu tanpa fermentasi moromi mengandung protein lebih tinggi dibandingkan kecap tanpa bumbu dengan fermentasi moromi (Septiani, 2004). Mikroba yang diintroduksi secara langsung adalah pada saat fermentasi padat, sedangkan fermentasi moromi merupakan fermentasi yang terjadi secara spontan (tanpa introduksi). Karakteristik nilai nutrisi sangat ditentukan oleh jenis kapang pada saat fermentasi padat (Septiani, 2004). Oleh karena itu, pemilihan kapang untuk fermentasi padat sangat menentukan komposisi nutrisi kecap. 3.4.1 Pembuatan Kecap Dua sampel bubuk tempe kering (500 g) yang masing-masing diinokulasi R. oryzae dan R. oligosporus, direndam dalam 1 L air garam 20% dan dibiarkan selama 2 minggu (dengan fermentasi moromi). Sedangkan, dua sampel lainnya direndam dalam 1 L air hangat bersuhu 50°C selama 24 jam (tanpa fermentasi moromi). Semua sampel kemudian disaring dan diambil filtratnya saja. Filtrat kecap ditambah bumbu-bumbu, yaitu 20 g jahe, 20 g lengkuas, 10 g kayu manis, 10 g bawang putih, 10 g kunyit, 10 g kemiri, dan 10 g ketumbar (Warintek 2003). Kecap tanpa fermentasi moromi ditambah 150 g gula kelapa, sedangkan kecap dengan fermentasi moromi ditambah 250 g gula kelapa. Filtrat kecap berbumbu direbus sampai volume filtrat menjadi 500 mL (kental), kemudian dimasukkan dalam botol dan disterilisasi dengan autoklaf pada suhu 121 °C selama 15 menit. Kecap steril disimpan di suhu kamar sebelum dianalisis. 3.4.2 Analisis Protein Analisis protein kecap manis terdiri dari 2 metode, yaitu metode Kjeldahl untuk protein (N) total (Sudarmaji dkk., 1984) dan metode Lowry-Folin untuk protein terlarut 72



pendek (Alexander dan Griffiths, 1992). Secara rinci metode Kjeldahl adalah sebagai berikut. Sampel kecap manis (5 g) dimasukkan dalam labu Kjeldahl dan ditambah 3 g campuran CuSO4 dan K2SO4 (1:9; b/b) dan 20 mL H2SO4 pekat. Labu Kjedahl dipanaskan sampai warna larutan menjadi putih, kemudian didinginkan. Larutan sampel ditambah 3 tetes indikator fenolftalen dan didestilasi. Destilat ditambah 50 mL larutan asam borat 2% dan 5 tetes indikator Tashiro dan ditambah NaOH sampai larutan sampel menjadi alkalis. Sampel dititrasi dengan HCl 0,1 N sampai larutan sampel menjadi merah muda. Metode Lowry-Folin adalah sebagai berikut. Sampel kecap manis (5 g) ditambah 5 mL akuades, kemudian disentrifugasi pada kecepatan 5.000 rpm selama 5 menit. Bagian cair (supernatan) diambil dan ditambah akuades sampai mencapai volume 100 mL. Sampel diambil 1 mL dan ditambah 1 mL reagen Lowry D (campuran reagen Lowry A, B, dan C; 20:1:1 v/v), kemudian dikocok dengan vortex dan dibiarkan pada suhu kamar selama 15 menit. Larutan sampel ditambah 3 mL reagen Lowry E, kemudian dikocok dan dibiarkan pada suhu kamar selama 45 menit. Larutan sampel diambil 1 mL dan diukur nilai penyerapan



cahaya



(OD)



pada



panjang



gelombang



590



nm



dengan



UV-VIS



spektrofotometer. Nilai OD590 dikonversi ke kadar protein terlarut berdasarkan kurva standar protein BSA (Bovine Serum Albumin). 3.4.3 Kandungan Protein Kandungan protein yang diukur dalam produk kecap adalah protein terlarut dan protein total. Protein terlarut merupakan oligopeptida dan mudah diserap oleh sistem pencernaan. Protein total merupakan pengukuran kandungan nitrogen (N) dalam sampel. Oleh karena itu, terdapat senyawa non-protein yang ikut terdeteksi dan terkalkulasi dengan metode Kjeldahl. Namun interferensi ini relatif kecil dan dapat diabaikan. Metode LowryFolin hanya dapat mengukur molekul peptida pendek dan tidak dapat mengukur molekul peptida panjang (Alexander dan Griffiths, 1992). Prinsip kerja metode Lowry adalah reduksi Cu2+ (reagen Lowry B) menjadi Cu+ oleh tirosin, triptofan, dan sistein yang terdapat dalam protein. Ion Cu+ bersama dengan fosfotungstat dan fosfomolibdat (reagen Lowry E) membentuk warna biru, sehingga dapat menyerap cahaya. Protein merupakan polimer heterogen molekul-molekul asam amino. Protein yang terkandung dalam kedelai merupakan protein globuler. Dalam protein globuler, rantairantai samping hidrofil dan polar berada di bagian luar dan rantai samping hidrofob dan nonpolar berada di bagian dalam. Kandungan protein total pada kecap manis hasil fermentasi R. oligosporus tanpa fermentasi moromi (17,433%) lebih tinggi daripada kecap manis hasil fermentasi R. oryzae (11,987%). Kandungan protein terlarut kecap manis hasil fermentasi R.oligosporus lebih tinggi daripada kecap manis hasil fermentasi R. oryzae. Hasil ini sesuai dengan hasil yang 73



diperoleh Septiani (2004). Hal ini menunjukkan aktivitas proteolitik R. oligosporus lebih rendah daripada R. oryzae. Hasil aktivitas proteolitik adalah protein terlarut dan asam amino. Protein terlarut rantai pendek dan asam amino dikonsumsi oleh kapang Rhizopus. Rendahnya kandungan protein terlarut pada R. oryzae merupakan indikasi kuat aktivitas konsumsi protein oleh R. Oryzae untuk pertumbuhannya. Pada beberapa hasil penelitian menunjukkan waktu sporulasi R. oryzae lebih cepat daripada R. oligosporus. Kemungkinan besar protein dikonsumsi secara cepat untuk proses sporulasi. Meskipun kandungan protein total kecap manis hasil fermentasi R. oligosporus dengan fermentasi moromi lebih besar daripada kecap manis hasil fermentasi R. Oryzae dengan fermentasi moromi, tetapi karena jumlah awal kandungan protein total kecap manis hasil fermentasi R.oligosporus dengan fermentasi moromi juga lebih besar daripada kecap manis hasil fermentasi R. oryzae dengan fermentasi moromi. Oleh karena itu aktivitas proteolitik mikroba halotoleran selama fermentasi moromi pada kecap manis hasil fermentasi R. oligosporus relatif seimbang pada kecap manis hasil fermentasi R. oryzae. Terdapat aktivitas konsumsi protein terlarut (1,818%) signifikan selama fermentasi moromi oleh mikroba halotoleran pada kecap manis hasil fermentasi R.Oligosporus.Sedangkan aktivitas konsumsi protein terlarut (0,594%) tidak signifikan oleh mikroba halotoleran pada kecap manis hasil fermentasi R. oryzae. SII tidak merujuk secara detail jenis protein yang digunakan sebagai standar dalam menentukan kualitas kecap. Secara umum SII menentukan bahwa kualitas kecap manis terdiri atas 3 yaitu kualitas baik (I), menengah (II), dan rendah (III). Kecap manis berkualitas baik (I) memiliki kandungan protein minimal 6%, sedangkan kecap manis berkualitas menengah (II) memiliki kandungan protein minimal 4% dan kecap manis berkualitas rendah (III) memiliki kandungan protein minimal 2%. Oleh karena itu dalam penelitian ini yang dipakai sebagai patokan dalam menentukan kualitas kecap adalah kandungan protein terlarut. Kandungan protein terlarut kecap manis hasil fermentasi R. oligosporus dengan dan tanpa fermentasi moromi masing-masing adalah 6,389 dan 8,207%. Dengan demikian kecap manis hasil fermentasi R. oligosporus dengan dan tanpa fermentasi moromi memenuhi kualitas baik kecap manis di Indonesia. Sedangkan kandungan protein terlarut kecap manis hasil fermentasi R. oryzae dengan dan tanpa fermentasi moromi masingmasing adalah 3,461 dan 4,055%. Dengan demikian kecap manis hasil fermentasi R. oryzae tanpa fermentasi moromi termasuk kecap berkualitas menengah (II). Pemilihan kapang tempe/koji sangat menentukan kualitas kecap. Dari 2 jenis Rhizopus yang digunakan dalam pembuatan kecap tanpa fermentasi moromi, menunjukkan bahwa R. oligosporus baik untuk pembuatan kecap berkualitas baik (I). Kapang yang baik dipakai 74



untuk menghasilkan makanan terfermentasi berprotein tinggi, adalah kapang yang memiliki aktivitas proteolitik rendah, tetapi mampu menghasilkan protein terlarut rantai pendek dan asam amino esensial tinggi. Kedua parameter tersebut bersifat kontradiktif. Kecap dapat memiliki nilai tambah jika mengandung substansi yang bermenfaat bagi kesehatan manusia. Menurut Wang dkk (2007), kecap hitam mengandung antioksidan lain, yaitu 3hydroxy-2-methyl-4H-pyran-4-one (maltol). Cairan moromi kecap (dengan kadar garam kurang dari 8%) mengandung amina non-volatil, yaitu tyramine, histamine, phenethylamine, putrescine, cadaverine, spermidine, dan spermine (Ibe dkk, 2003). Lebih lanjut dilaporkan juga bahwa tyramine dihasilkan oleh aktivitas enzim yang dihasilkan oleh bakteri kokus gram positif. 3.4.4 Tingkat Kesukaan Konsumen pada produk kecap Tingkat kesukaan konsumen diukur berdasarkan kesukaan konsumen terhadap aroma dan cita rasa kecap manis tanpa fermentasi moromi dan membandingkannya dengan kecap komersial. Berdasarkan pengamatan di lapangan terdapat satu produk kecap manis, yaitu Lombok Gandaria yang disukai konsumen di daerah solo dan sekitarnya. Produk kecap manis lainnya adalah kecap manis Bango yang diproduksi oleh perusahaan multinasional dan beredar luas di seluruh Indonesia. Responden untuk penentuan skor aroma berbeda dengan cita rasa. Lubang hidung responden untuk penentuan skor cita rasa ditutup. Hal ini untuk menghilangkan pengaruh aroma terhadap penentuan cita rasa, karena cita rasa suatu makanan sangat dipengaruhi oleh aroma. Skor tingkat kesukaan konsumen terhadap aroma kecap manis hasil fermentasi R. oligosporus dan R. oryzae tanpa fermentasi moromi masing-masing adalah 3,57 dan 3,77. Sedangkan skor tingkat kesukaan konsumen terhadap aroma kecap manis komersial Lombok Gandaria dan Bango masing-masing adalah 4,40 dan 4,60. Hal ini menunjukkan konsumen lebih menyukai aroma yang dihasilkan oleh kecap manis komersial. Kecap manis tanpa fermentasi moromi memiliki aroma langu khas kedelai. Aroma tersebut tidak disukai oleh konsumen. Penambahan bumbu tidak mampu menghilangkan aroma langu tersebut, tetapi hanya mengurangi aroma langu. Hasil analisis statistik menunjukkan bahwa tingkat kesukaan konsumen terhadap aroma keempat kecap manis beda signifikan (p95%) dan sisanya adalah sejumlah kecil karbohidrat ( 10), maka polihedra akan pecah melepaskan virion infektif. Virion yang terlepas dari matrik protein (pembungkus) akan memulai infeksi ke dalam sel-sel saluran pencernaan ulat yang kemudian DNA akan mengadakan reflikasi di inti sel. Proses infeksi SlNPV atau SeNPV dimulai dari tertelannya polihedra (berisi virus) bersama pakan. Di dalam saluran pencernaan yang bersuasana alkalis, polihedra larut sehingga membebaskan virus (virion). Selanjutnya virus menginfeksi sel-sel yang rentan. Dalam waktu 1 – 2 hari setelah polihedra tertelan, ulat yang terinfeksi akan mengalami gejala abnormal secara morfologis, fisiologis dan perilakunya. Secara morfologis, hemolimfa ulat yang semula jernih berubah keruh dan secara fisiologis, ulat tampak berminyak dan perubahan warna tubuh menjadi pucat kemerahan, terutama bagian perut. Sedangkan secara perilaku, ulat cenderung merayap ke pucuk tanaman, yang kemudian mati dalam keadaan menggantung dengan kaki semunya pada bagian tanaman. Permukaan kulit ulat akan mengalami perubahan warna dari pucat mengkilap pada awal terinfeksi kemudian akan menghitam dan hancur. Apabila tersentuh, tubuh ulat akan mengeluarkan cairan kental berbau seperti nanah yang berisi partikel virus. Ulat mati dalam 99



waktu 3 – 7 hari setelah polihedra VIR (berisi virus) tertelan. Sebelum mati ulat masih dapat merusak tanaman, namun kerusakan yang diakibatkan ulat yang sudah terinfeksi sangat rendah, karena terjadi penurunan kemampuan makan dari ulat grayak sampai 84 %. 4.3.4 Aplikasi dan Efektivitas Pemakaian Bioinsektisida VIR-L dan VIR-X yang berbahan aktif SeNPV dan SlNPV diaplikasikan dengan alat semprot, sama seperti yang digunakan untuk menyemprot pestisida (knapsack sprayer). Aplikasi sebaiknya ditujukan untuk mengendalikan ulat instar 1–3. Penyemprotan sebaiknya diarahkan ke permukaan daun bagian bawah dan dilakukan pada sore atau malam hari agar tidak langsung terkena pengaruh sinar matahari, disamping itu ulat grayak Spodopteramemiliki sifat nocturnal yaitu mencari makan pada malam hari(instar : fase antar 2 ganti kulit larva/ulat) Cara penyimpanan, letakkan dus VIR ditempat yang tidak terkena langsung sinar matahari dan VIR dapat disimpan pada suhu kamar selama lebih kurang 4 bulan. Untuk penggunaan VIR dalam waktu yang cukup lama, sebaiknya simpan dus VIR tersebut dalam lemari es (virus akan bertahan hidup pada suhu dingin). Sinar ultra violet matahari penyebab utama menurunnya efektivitas NPV di lapangan. Selain itu NPV juga peka terhadap suhu. Pada suhu 40 °C efektivitasnya masih stabil, tetapi dengan meningkatnya suhu efektivitasnya cepat berkurang. Untuk mengurangi kepekaan terhadap sinar matahari, maka virus ini diberi bahan pelindung berupa talk dan molase. Persistensi/ketahanan NPV di lapangan setelah disemprotkan, mampu bertahan sampai dengan 7 hari. 4.3.5 Keuntungan NPV 1.



Memiliki inang spesifik dalam genus/famili yang sama, sehingga aman terhadap organisme bukan sasaran.



2.



Tidak mempengaruhi parasitoid, predator dan serangga berguna lainnya.



3.



Dapat mengatasi masalah resistensi ulat grayak terhadap insektisida kimia.



4.



Kompatibel dengan insektisida kimiawi yang tidak bersifat basa kuat.



5.



Efektif membunuh hama/ulat sasaran yang menyerang pada tanaman bawang merah, bawang putih, bawang daun, kacang-kacangan, tembakau, tomat dan cabe.



6.



Ulat yang telah terinfeksi akan mati, kemudian dapat dijadikan pengendali hama berikutnya bagi ulat yang sehat.



7.



Tidak berbahaya bagi musuh alami ulat tersebut



100



8.



Tidak berbau dan tidak berbahaya atau beracun bagi manusia dan hewan perliharaan/ternak.



9.



Dapat dicampur dengan perekat atau pupuk organik cair



10.



Ramah lingkungan



11.



Spesifik selektif (hanya dapat menginfeksi ulat dari spesies atau genus dimana dia diisolasi)



12.



Efektif untuk hama-hama yang sudah resisten terhadap pestisida



13.



Dapat dipadukan dengan teknologi pengendalian yang lainnya



4.4



Ringkasan Dari hasil-hasil penelitian yang telah dilakukan, bioinsektisida yang berbahan aktif



bakteri B. thuringiensis, fungi B. bassiana, dan ekstrak tumbuhan cukup prospektif untuk dimanfaatkan sebagai alternatif dalam pengendalian hama pada hutan tanaman karena efektif, selektif, dan aman terhadap lingkungan. Penggunaan B. thuringiensis dalam dua bentuk, yaitu sebagai microbial spray biopesticide dan tanaman transgenik Bt. Cara kerja Bt adalah sebagai racun pencernaan di mana dendotoksin (protein) yang telah mengalami proteolisis dari nonaktif menjadi aktif menempel di sel pada epithelial, yang menyebabkan keseimbangan osmosis sel terganggu, dan menyebabkan sel pecah dan disertai matinya serangga. NPV adalah virus yang berbentuk segi banyak dan terdapat di dalam inclusion bodies yang disebut polihedra dan bereplikasi di dalam inti sel (nukleus). NPV telah ditemukan pada 523 spesies serangga, sebagian besar NPV bersifat spesifik inang, yaitu hanya dapat menginfeksi dan mematikan spesies inang alaminya. Virus NPV merupakan virus yang dapat dimanfaatkan sebagai musuh alami terutama dalam menurunkan populasi hama. Oleh karena itu, daripada memberantas hama menggunakan insektisida yang dimana tidak aman bagi lingkungan dan manusia sebaiknya menggunakan virus NPV yang aman terhadap lingkungan dan sebagai agen hayati. Contoh Soal: 1. Sebutkan



dan



jelaskan



apa



yang



dimaksud



dengan



bioinsektisida



dan



pengelompokkan bioinsektisida berdasarkan karakteristik bahan kimianya. 2. Jelaskan secara singkat disertai gambar dari proses toksifikasi kristal protein Bt. terhadap larva nyamuk atau insekta lainnya. 3. Sebutkan dan jelaskan kelebihan dan kekurangan bioinsektisida dibadingkan denganinsektisida kimiawi. 101



4. Sebutkan dan jelaskan pengelompokan virus



yang biasa digunakan sebagai



bioinsektisida dan kelebihan serta kekurangan penggunaan bioinsektisida yang berasal dari material virus. 5. Jelaskan secara singkat mengapa paparan sinar UV dapat menurunkan sensitivitas dari bioinsektisida Nuclear Polyhedrosis Virus (NPV). 6. Sebutkan dan jelaskan peranan bidang rekayasa genetika dalam pengembangan bioinsektisida



mikroba serta kelebihan



dan



kekurangan



dari



penggunaan



bioinsektisida mikroba hasil rekayasa genetika.



102



DAFTAR PUSTAKA



Agrios. 1998. Plant Pathologi.Hlmn : 262. ISBN 0120445654. New York: Academic Press. Anonim, 2010a, Virus (Online), www.wikipedia.com, diakses tanggal 9 Mei 2010 pukul 12.36 wita Anonim, 2010b, Patogen Serangga, diakses tanggal 9 Mei 2010 pukul 13.17 wita Anonim, 2011, Bioinsektisida (online), http://id.wikipedia.org/wiki/Bioinsektisida, diakses tanggal 10 September 2011, Makassar. Asmaliyah dan B. Ismail.



1998.



Uji Pengendalian Hama Pemakan Daun (Clouges



glauculalis pada Tanaman Pulai (Alstonia scholaris) dengan InsektisidaBiologi secara In-Vitro. Buletin Teknologi Reboisasi 08. Palembang. Asmaliyah, 2005, Prospek Pemanfaatan Bioinsektisida Sebagai Alternatif Dalam Pengendalian Hama Pada Hutan Tanaman, 115-124. Asmaliyah, E. Martin dan F.W. Sari. 2005. Karakteristik Serangan Hama Clouges glauculalis



pada



Hutan



Tanaman



Pulai



(Alstonia



spp.)



dan



UpayaPengendaliannyaMakalah Disampaikan pada Ekspose Hasil PenelitianHutan Tanaman”Optimalisasi Peran IPTEK dalam Mendukung PeningkatanProduktivitas Hutan dan Lahan, Baturaja 7 Desember 2005. Asmaliyah.



2001.



Pengujian Efektivitas Insektisida Mikroba Bacillus thuringiensis



Terhadap Penggerek Pucuk Mahoni Hypsipyla robusta. Buletin Teknologi Reboisasi 11(1). Palembang Bahagiawati,



2002,



Buletin



AgroBio,



Penggunaan



Bacillus



thuringiensis



sebagai



Bioinsektisida, 5(1):21-28. Firn, R.C., 2005, The Implications of the Screening Hypothesis, The Pharmaceutical Industry and Bioprospecting, Biology Module 867. 3 pp. Hardi, T.W dan H.H. Siringoringo. 2000. Identifikasi Mangrove dan Pengendalian dengan Bakteri. Bul.Pen.Hut. 621:55-64. Puslitbang Hutan dan Konservasi Alam, Bogor. Hofte, H. and H.R. Whiteley. 1989.Insecticidal crystal proteins of Bacillusthuringiensis. Microbiol. Rev. 53:42-255. Intari, S.E.



1997.



Pengendalian Hama Kutu Sisik (Chionapsis sp.) yang Menyerang



Tanaman Mangrove di Bali.



Bul.Pen.Hut. 605:19-26.



Puslitbang Hutan dan



Konservasi Alam, Bogor. News Room, 2010, Mengendalikan Hama dan Penyakit Tanaman dengan Bioinsektisida (Online), diakses tanggal 9 Mei 2010 pukul 12.28 wita



103



Redana, I. W., 2011, Insektisida Mikroba (online), http://elangbiru3004.blogspot.com/, diakses tanggal 10 September 2011, Makassar. Sastrosiswojo, S. Indonesia.



2002.



Kajian Ekonomi dan Budaya Penggunaan Biopestisida di



Kumpulan Makalah Lokakarya Keanekaragaman Hayati Untuk



Perlindungan Tanaman, Yogyakarta 7 Agustus 2002. Smitley, D.R dan T.W. Davis.



1993.



Aerial Application Bacillus thuringiensis for



Suppression of Gypsy Moth (Lepidoptera; Lymantridae) pada Populus, Quercus Forest. Forest Entomology. Suharti, M, Asmaliyah dan P. Hawiati.



1995.



Tanaman Mimba (Azadirachta indica)



Sebagai Sumber Insektisida Nabati dalam Pengendalian HamaTanaman Hutan. Bul.Pen.Hut. 589. Puslitbang Hutan dan Konservasi Alam,Bogor. Sunarlim, N., dan Sutrisno, 2003, Perkembangan Penelitian Bioteknologi di Indonesia. Buletin AgroBio 6(1): 1−7. Widyariska, tanpa tahun, Teknologi Produksi Tanaman (Online), diakses tanggal 9 mei 2010 pukul 10.48 wita.



104



Senarai IstilahdanArtinya



Istilah



Arti



Bioinsektisida



Bahan-bahan



alami



yang



bersifat



racun



serta



dapat



menghambat pertumbuhan dan perkembangan, tingkah laku, perkembangbiakan, kesehatan, mempengaruhi kesetimbangan hormon, penghambat makan, membuat mandul, sebagai pemikat,



penolak,



dan



aktivitas



lainnya



yang



dapat



mempengaruhi organisme pengganggu tanaman Insektisida biokimia



Bahan yang terjadi secara alami yang dapat mengendalikan hama dengan mekanisme non-toksik



Virion



Occluded dalam tubuh protein dikenal sebagai polyhedra (NPV) atau granula (GV)



B. thuringiensis



Bakteri



yang



menghasilkan



kristal



protein



yang



bersifat



membunuh serangga (insektisidal) sewaktu mengalami proses sporulasi NPV



Virus yang berbentuk segi banyak dan terdapat di dalam inclusion bodies yang disebut polihedral dan mampu bereplikasi sendiri di dalam inti sel (nukleus).



105



BAB 5 PRODUKSI ANTIGEN REKOMBINAN SEBAGAI KANDIDAT VAKSIN 5.1



Pendahuluan Pada bagian ini yang akan menjadi sasaran pembelajaran adalah (1) menjelaskan



tinjauan umum protein manusia, (2) menjelaskan tinjauan umum rekayasa genetika, (3) menjelaskan kegunaan teknologi rekombinan, (4) menjelaskan tinjauan umum vaksin, dan (5) menjelaskan vaksin rekombinan untuk beberapa penyakit. Dalam perkembangannya, teknologi bergerak dalam tiga tahap yaitu penelitian, pengembangan dan pemasyarakatan. Diawali dengan penelitian dasar yang kurang memperhatikan kegunaan dari hasil penelitian, dilanjutkan dengan penelitian terapan yang bertujuan mencari keterangan lanjutan untuk program pengembangan, dan akhirnya dikembangkan dengan rancangan rekayasa, baik terhadap produk maupun cara pengolahan dalam menciptakan barangbarang baru untuk dimasyarakatkan atau dipasarkan. Hal yang paling baru dan ramai dibicarakan dewasa ini adalah revolusi industri bioteknologi, sebagai hasil dari penemuan dan meluasnya pengetahuan dasar tentang proses kehidupan pada tingkat molekul, sel dan genetik. Melalui bioteknologi, banyak permasalahan bersifat biologik yang pada masa lampau belum diketahui oleh para ahli, sekarang telah dapat dipecahkan. Bioteknologi dan rekayasa genetik yang menyajikan pemecahan baru terhadap masalah yang bersifat biologik telah dapat menantang para ahli untuk lebih menaruh perhatian yang besar dalam bidang ini. Berangkat dari dataran pemikiran yang membatasi bioteknologi sebagai sebuah sistem pendekatan baru dalam mengubah bahan mentah melalui pengubahan yang bersifat biologik menjadi produk yang berguna, maka paduan ilmu di bidang biologi, biokimia dan rekayasa genetik ini diharapkan menghasilkan penemuan baru atau penyempurnaan dalam pemecahan masalah kesehatan, pertanian dan lingkungan. Dengan tidak mengenyampingkan dua masalah yang disebutkan terakhir, pada bagian ini mencoba membatasi diri menatap perkembangan pengaruh bioteknologi dalam bidang kesehatan, yaitu sejauh mana penerapan pemikiran dan cara bioteknologi untuk pemecahan masalah kesehatan dewasa ini, khususnya produksi protein antigen rekombinan dengan menggunakan teknik rekayasa genetika sebagai kandidat vaksin. 5. 2



Tinjauan Umum Protein Manusia



105



Walaupun telah dapat dipastikan bahwainformasi genetika berlokasi dalam kromosom. Namun, dimana didalam kromosom itu masih banyak hal yang tidak diketahui. Ini merupakan pertanyaan yang sulit, karena kromosom disusun oleh dua substansi yang berlainan, protein dan asam nukleat. Dimana persenyawaan organik karena substansisubstansi ini ditemukan dalam organisme hidup dan mengandung elemen karbon dan hidrogen. Kita harus dapat menetapkan yang mana dari persenyawaan itu, protein atau asam nukleat yang sebenarnya gen itu. Protein adalah makromolekul, molekul besar yang kompleks, yang terdapat dalam semua sel. Protein memainkan peran penting dalam struktur sel tubuh kita, semua membran seluler mengandung protein. Tingkatan struktur suatu molekul protein dapat ditunjukkan melalui Gambar 5.1.



Gambar 5.1. Struktur dasar suatu protein dan berbagai tingkat struktur dan kompleksitas. Seperti halnya protein dan karbohidrat, asam nukleat merupakan makromolekul juga. Asam nukleat mengandung unit-unit yang disebut nukleotida yang dihubungkan oleh ikatan fosfodiester. Tiap nukleotida mengandung gula, asam fosfat dan suatu basa yang mengandung nitrogen. Gambar 5.2 memperlihatkan dari ketiga substansi ini. Bila berpautan satu dengan yang lain melalui ikatan fosfodiester, nukleotida membentuk suatu rantai yang disebut polinukleotida. Rantai polinukleotida disebut juga asam nukleat. Karena jenis gula yang terdapat dalam asam nukleat dari kromosom organisme kompleks adalah deoksiribosa, maka asam nukleat yang terdapat dalam kromosom kita disebut asam deoksiribonukleat (DNA). Untuk keperluan vaksin DNA inilah yang akan diklon untuk memproduksi protein-protein spesifik yang diinginkan (Pai, 1987). 106



Gambar 5.2.Subunit-subunit yang membentuk asam nukleat 5.3



Tinjauan Umum Rekayasa Genetika Genetika berasal dari kata gen, yaitu suatu unit pembawa faktor keturunan yang



terdapat pada kromosom dalam inti setiap sel hidup. Sekarang diketahui bahwa inti tersebut adalah DNA yang sangat berperan dalam biosintesis protein atau polipeptida. Pada abad XX, ilmu genetika mengalami perkembangan yang pesat. Banyak eksperimen dilakukan untuk mengetahui lebih dalam tentang faktor keturunan itu. Kebanyakan eksperimen menggunakan bakteri Escherichia coli. Oleh karena biosintesis protein ditentukan oleh struktur DNA yang terdapat dalam sel, maka apabila struktur DNA diubah, struktur polipeptida yang terbentuk juga berubah. Eksperimen untuk mengubah DNA ini merupakan awal dari rekayasa genetika yaitu usaha untuk mengatur polipeptida yang terbentuk agar sesuai yang dikehendaki. Dalam sel bakteri Eschericha coli terdapat DNA yang bentuknya melingkar disebut plasmid. Dengan menggunakan enzim endonuklease plasmid dapat dipotong (digestion) dan diisolasi lalu DNA asing dicampur dengan plasmid tersebut hingga terbentuk DNA baru yang merupakan gabungan DNA bakteri dan DNA dari luar, kemudian dimasukkan ke dalam bakteri lagi. DNA rekombinan ini akan membentuk protein atau polipeptida yang lain dari polipeptida yang biasanya dibentuk oleh bakteri tersebut. Demikianlah garis besar pembentukan DNA rekombinan yang selanjutnya menghasilkan polipeptida sebagaimana dikehendaki. Teknik ini sangat berguna untuk memproduksi protein yang terdapat dalam tubuh manusia. Pembentukan DNA rekombinan dapat dilihat pada Gambar 5.3 (Poedjadi, 1994).



107



Gambar 5.3 Pembentukan DNA Rekombinan Bioteknologi modern ditandai dengan kemampuan pada manipulasi DNA. Rantai/sekuen NA yang mengkode protein disebut gen. Gen ditranskripsikan menjadi mRNA, kemudian mRNA ditranslasikan menjadi protein. Protein sebagai produk akhir bertugas menunjang seluruh proses kehidupan, antara lain sebagai katalis reaksi biokimia dalam tubuh (disebut enzim), berperan serta dalam sistem pertahanan tubuh melawan virus, parasit dan lain-lain (disebut antibodi), menyusun struktur tubuh dari ujung kaki (otot terbentuk dari protein actin, myosin, dan sebagainya) sampai ujung rambut (rambut tersusun dari protein keratin), dan lain-lain. Beberapa hasil kloning gen manusia ditunjukkan pada Tabel 5.1. Tabel 5.1. Beberapa protein sebagai hasil kloning gen ( Brown, 1991) Protein



Penggunaan



Insulin Manusia



Mengatur kadar glokosa darah



Somatostatin Manusia



Mengatur pertumbuhan



Somatotropin manusia



Hormon pertumbuhan



Interferon Manusia



Senyawa antivirus



Mulut dan Kuku (VP1 dan VP2)



Vaksin terhadap virus



Antigen Inti Hepatitis B



Diagnosa hepatitis B



108



Dalam memanipulasi DNA, enzim-enzim yang berperan dapat berupa : (1) enzim nuklease yang berfungsi memotong, memendekkan dan mendegradasi asam nukleat; (2) enzim ligase yang menyambung asam nukleat menjadi satu; (3) enzim polimerase yang membuat kopi dari molekul; (4) enzim modifikasi yang menghilangkan atau menambah gugus kimiawi dan (5) enzim topoisomerase yang mengubah DNA berlilitan dari DNA sirkular yang tertutup secara kovalen (brown, 1991). 5.4



Kegunaan Teknologi Rekombinan Sumbangan utama teknologi DNA rekombinan adalah terhadap bidang biologi



molekul sendiri dan dalam penentuan proses asas biologi. Teknologi ini telah membolehkan kita melakukan analisis struktur gen dengan terperinci terutamanya terhadap gen eukariot. Kajian terhadap gen eukariot, terutamanya gen manusia ialah bidang yang penting kerana genomnya yang besar. Pengklonan telah digunakan untuk mendiagnosis penyakit yang diwarisi. Contoh beberapa penyakit adalah anemia sel bulan sabit, distrofi otot dan fibrosis bersista. Beberapa penyakit lain diberikan dalam Tabel 5.2. Pengklonan gen juga telah membolehkan kromosom manusia dipetakan dan banyak penyakit yang diwarisi telah pun dapat ditempatkan pada kromosom tertentu termasuk juga onkogenonkogen manusia. Dengan menggunakan kaedah penghibridan in situ radioaktif, gen-gen ini dapat ditempatkan pada tapak spesifik di kromosom. Kaedah ini melibatkan penggunaan DNA terion yang radioaktif. Teknologi ini juga digunakan bagi penghasilan vaksin dan protein yang penting dalam bidang pengobatan. Teknologi rekombinan DNA telah juga digunakan dalam industri yang menggunakan bakteria sebagai kilang untuk penghasilan protein yang penting. Tujuannya adalah supaya protein boleh dihasilkan dengan lebih cepat dan dengan harga yang lebih murah. Contohnya ialah produksi insulin manusia pada sel bakteri, interferon, pengaktif plasminogen, faktor VIII dan hormon pertumbuhan. Tabel 5.2.Beberapa penyakit genetik yang telah terdiagnosis dengan teknik rekayasa genetika. Penyakit metabolisme lipid Penyakit metabolisme karbohidrat Penyakit hemoglobin



Penyakit metabolisme lain



Penyakit Tay-Sachs Penyakit Grauchers Galaktosemia Anemia sel sabit Talasemia Hemofilia Sindrom Lesch-Nyhan Xeroderma pigmentosum



109



Produk lain yang dapat dikembangkan melalui rekayasa genetika adalah vaksin untuk manusia dan ternak. Vaksin biasanya mengandung virus atau mikroorganisme yang dilemahkan atau telah dimatikan, yang apabila diberikan kepada hewan atau manusia akan menyebabkan antibodi, tetapi tidak menyebabkan penyakit yang bersangkutan menjadi lebih parah. Bila kemudian dijumpai virus atau mikroorganisme yang benar-benar dapat menimbulkan penyakit, manusia dan hewan yang telah diberi vaksin akan mampu menanggulangi infeksi virus atau melawan mikroorganisme tadi dengan antibodi yang telah ditimbulkan oleh vaksin (Sardjiko, 1991). 5.5



Tinjauan Umum Vaksin Vaksin secara potensial dapat mencegah dan mengobati penyakit manusia.



Kemajuan baru di bidang vaksin seperti conjugated pneumococcal vaccines untuk orang dewasa, nasal spray vaccines influenza, dan acellular pertussis vaccines untuk orang dewasa, merupakan cara yang efisien untuk menghasilkan proteksi imun yang bertahan lama. Penelitian sedang dilakukan pada vaksin yang banyak digunakan untuk penyakitpenyakit di negara berkembang seperti malaria, hookworm, dengue, enterotoxigenic E. coli, shigella, tuberkulosis. Vaksin terhadap penyakit non infeksi (seperti kanker, diabetes, dan penyakit Alzheimer) dan ketergantungan nikotin dan kokain masih merupakan pengobatan alternatif. Vaksin terhadap senjata biologi akan dimungkinkan dengan kemajuan pada vaksin DNA. Satu pendekatan yang sangat diminati ialah merangsang respon imun protektif yang dikehendaki dengan cara menyuntikkan DNA yang direkayasa dari organisme infeksius (enginereed DNA sequences). Jika antigen dapat diidentifikasi, rangkaian DNA yang disandi untuk antigen protein sangat mungkin untuk disisipkan ke dalam pembawa/carrier genom (seperti beberapa poxvirus atau alphavirus). Bila diberikan ke dalam host, organisme ini (karena disisipi DNA) mengalami replikasi terbatas, protein yang dikehendaki diproduksi, dan di dalam host berkembang respon imun terhadap protein tersebut. Dengan strategi yang sama, naked DNA disuntik langsung ke dalam host untuk memproduksi respon imun. Naked DNA adalah rangkaian sederhana (simple sequences) dari DNA yang disisipkan ke dalam plasmid bakteri (extra-chromosomal rings of DNA) dan disuntikkan ke dalam host (Isbagio, 2005).



110



Menurut (Brown, 1991), ada tiga cara yang dikembangkan untuk produk vaksin rekombinan yaitu : 1.



Kloning Dalam Vektor ekspresi Jika gen yang mengkode protein antigen virus tertentu dapat diidentifikasi dan



diinsersikan ke dalam vektor ekspresi, maka cara-cara seperti yang diuraikan untuk sintesis protein hewan dapat digunakan untuk produksi vaksin rekombinan. Stretegi ini telah berhasil pada virus untuk penyakit mulut dan kuku serta hepatitis B. a.



Penyakit mulut dan kuku



Gen untuk protein mulut dan kuku yaitu VP1 dan VP3, telah diekspresikan dalam E. coli. Pada keduanya dapat diperoleh beberapa juta molekul protein per sel, tetapi sayang hanya VP3 yang terutama digunakan sebagai vaksin. b.



Penyakit Hepatitis B



Virus ini terdiri dari dua macam protein yaitu protein inti yang berhubungan dengan genom virus dan protein selubung atau antigen permukaan yang utama. Protein inti berhasil diproduksi dalam jumlah besar dalam E.coli rekombinan, sayang protein ini tidak berguna sebagai vaksin, walaupun berperan penting dalam diagnosa penyakit. Antigen permukaan utama yang akan merupakan vaksin yang berguna, tidak disintesis dalam jumlah besar dalam E.coli. walaupun baru-baru ini telah dicapai sukses yang lebih besar dengan gen untuk antigen permukaan yang diklon ke dalam ragi ( menggunakan vektor ekspresi berasal dari YEp) dan sel hewan (menggunakan vektor SV40). Prinsip penggunaan preparasi protein selubung virus yang diisolasi untuk dipakai sebagai vaksin diperlihatkan pada Gambar 5.4.



Gambar 5. 4. Prinsip penggunaan preparasi protein selubung virus yang diisolasi untuk dipakai sebagai vaksin 111



2.



Virus Vaksinia Rekombinan Penggunaan virus vaksinia hidup sebagai vaksin untuk cacar (variola) dilakukan



pada tahun 1796, ketika Jerner pertama kali menyadari bahwa virus yang tidak membahayakan manusia ini dapat merangsang timbulnya kekebalan terhadap virus cacar yang jauh kebih berbahaya. Istilah vaksin berasal dari vaksinia dan penggunaan vaksin ini mengakibatkan lenyapnya penyakit cacar secara resmi pada tahun 1980. Gagasan yang lebih baru bahwa virus vaksinia rekombinan dapat dipakai sebagai vaksin hidup terhadap penyakit-penyakit lain. Jika misalnya gen yang mengkode protein selubung virus, misalnya antigen permukaan virus hepatitis B disambung pada genom vaksinian di bawah kontrol promotor vaksinia, maka gen tersebut akan diekspresikan (gambar 5). Setelah diinjeksi ke dalam peredaran darah, replikasi virus rekombinan akan menghasilkan tidak hanya partikel vaksinia baru, tetapi juga antigen permukaan utama dalam jumlah yang berarti. Oleh karena itu akan timbul kekebalan terhadap penyakit cacar maupun hepatitis B.



Gambar 5.5 Penalaran dibalik penggunaan virus vaksinia rekombinan yang potensial



112



Teknik di atas mempunyai potensi yang besar. Virus vaksinia rekombinan yang mengekspresikan antigen permukaan utama virus hepatitis B (memberi kekebalan pada simpanse), gen hemaglutinin influenza dan gen herpes telah dikonstruksi. Suatu gen yang mengkode salah satu antigen permukaan pada protizoa yang menyebabkan malaria juga telah diinsersikan pada genom vaksinia. Tetapi yang paling menarik adalah kemungkinan produksi vaksin berspektrum lebar, yaitu vaksinia rekombinan yang mengekspresikan berbagai macam antigen virus, sehingga akan didapat ketahanan terhadap penyakitpenyakit hanya satu rangkaian inokulasi. 3.



Peptida Antigenik Komponen antigenik partikel virus dapat dikurangi bahkan di bawah protein



selubung yang dimurnikan. Segmen pendek protein selubung ini yang diisolasi juga dapat menstimulasi sintesis antibodi yang memberikan perlindungan terhadap virus hidup (Gambar 5.6). Pada virus mulut dan kuku, peptidedengan panjang 8 sampai 41 asam amino yang berasal dari VP1, bersifat antigenik. Segmen pendek protein selubung poliovirus juga dapat memberikan kekebalan. Sampai saat ini kebanyakan peptida digunakan untuk penelitian tersebut disintesis dalam tabung percobaan dari subunit asam amino, tetapi produksi peptida skala besar untuk digunakan dalam program vaksinasi dapat dicapai dengan cara sintesis gen yang sesuai, diikuti dengan insersi ke dalam vektor ekspresi yang diproduksi pada sel bakteri atau khamir.



Antibodi yang spesifik terhadap peptida dapat melekat pada partikel virus Partikel virus utuh Gambar 5.6. Penalaran penggunaan peptida untuk vaksin terhadap virus 5.6



Vaksin Rekombinan Untuk Beberapa Penyakit Salah satu perkembangan yang mendapat perhatian sangat tinggi dalam



pengobatan infeksi virus adalah pengobatan genetik. Dalam hal ini diharapkan dengan memasukkan gen yang secara spesifik menghambat atau menghalangi ekspresi atau 113



fungsi produk gen viral tertentu akan menyebabkan replikasi virus di dalam sel terhalang atau dibatasi. Selain itu mungkin pula sel direkayasa agar mampu mensekresi senyawa yang menghambat infektivitas virus yang berada ekstra seluler. Teoretis keberhasilan terapi genetik ini akan tergantung pada :(i) ketetapan seleksi sel atau jaringan, (ii) efisiensi delivery system, (iii) ketepatan ekspresi, regulasi dan stabilitas produk gen dan (iv) efisiensi penghambatan replikasi virus oleh produk gen tersebut. (Sjahrurachman, 2001). 1. Vaksin Cacar Pemberantasan cacar didasarkan pada pemberian vaksinasi dengan virus vaccinia. Jika menemukan penderita yang menyerupai cacar dan bukan cacar air: segera laporkan hal ini kepada dinas kesehatan setempat. Di Amerika Serikat vaksin cacar (vaccinia virus) dan Human Vaccinia Immune globulin untuk mengobati efek samping vaksinasi cacar tersedia di CDC. Virus vaccinia, adalah virus vaksin yang digunakan untuk memberantas variola (cacar), merupakan hasil rekayasa genetika menjadi vaksin rekombinan beberapa masih dalam taraf uji klinik) dengan risiko terendah terjadi penularan terhadap kontak non imun. “Immunization Practices Advisory Committee” (ACIP) merekomendasikan vaksinasi cacar untuk semua petugas laboratorium yang mempunyai risiko tinggi terkena infeksi yaitu mereka yang secara langsung menangani bahan atau binatang yang di infeksi dengan virus vaccinia atau orthopoxvirus lainnya yang dapat menginfeksi manusia. Vaksinasi juga perlu dipertimbangkan terhadap petugas kesehatan lain walaupun berisiko rendah terinfeksi virus seperti dokter dan perawat. Vaksinasi merupakan kontraindikasi bagi seseorang yang menderita defisiensi sistem imun (contoh: penderita AIDS dan kanker) mereka yang menerima transplantasi, dermatitis tertentu, wanita hamil, penderita eczema. Vaksin yang diberikan sudah dilengkapi dengan instruksi yang jelas (cara vaksinasi, kontraindikasi, reaksi, dan komplikasi) yang harus diikuti dengan tepat. Vaksin harus diulang kecuali muncul reaksi (salah satu reaksi adalah muncul indurasi eritematosa 7 hari setelah vaksinasi) Booster diberikan dalam waktu 10 tahun kepada mereka yang masuk kategori harus divaksinasi. WHO selalu menyimpan dan menyediakan vaccine seedlot (virus vaccine strain Lister Elstree) dipakai untuk keadaan darurat. Vaksin tersebut ada di Pusat kerjasama WHO (WHO Collaborating Center) untuk vaksin cacar di National Institute of Public and Environment Protection di Bilthoven, The Netherlands (Chin, 2000). 2. Vaksin Influenza Virus influensa adalah partikel berselubung berbentuk bundar atau bulat panjang, merupakan genom RNA rangkaian tunggal dengan jumlah lipatan tersegmentasi sampai 114



mencapai delapan lipatan, dan berpolaritas negatif. Virus influensa merupakan nama generik dalam keluarga Orthomyxoviridae dan diklasifikasikan dalam tipe A, B atau C berdasarkan perbedaan sifat antigenik dari nucleoprotein dan matrix proteinnya. Virus influensa unggas (Avian Influenza Viruses, AIV) termasuk tipe A. Telaah yang sangat bagus mengenai struktur dan pola replikasi virus-virus influensa sudah dipublikasikan barubaru ini (Sidoronko dan Reichi, 2005). Determinan antigenik utama dari virus influensa A dan B adalah glikoprotein transmembran hemaglutinin (H atau HA) dan neuroaminidase (N atau NA), yang mampu memicu terjadinya respons imun dan respons yang spesifik terhadap subtipe virus. Respons ini sepenuhnya bersifat protektif di dalam, tetapi bersifat protektif parsial pada lintas, subtipe yang berbeda. Berdasarkan sifat antigenisitas dari glikoprotein-glikoprotein tersebut, saat ini virus influensa dikelompokkan ke dalam enambelas subtipe H (H1-H16) dan sembilan N (N1-N9). Kelompok-kelompok tersebut ditetapkan ketika dilakukan analisis filogenetik terhadap nukleotida dan penetapan urutan (sequences) gen-gen HA dan NA melalui cara deduksi asam amino (Fouchier, 2005). Cara pemberian nama yang sesuai nomenklatur konvensional untuk isolat virus influensa harus mengesankan tipe virus influensa tersebut, spesies penjamu (tidak perlu disebut kalau berasal dari manusia), lokasi geografis, nomor seri, dan tahun isolasi. Untuk virus influensa tipe A, subtipe hemaglutinin dan neuroamidasenya ditulis dalam kurung. Salah satu induk strain virus influenza unggas dalam wabah H5N1 garis Asia yang terjadi akhir-akhir ini, berhasil diisolasikan dari seekor angsa dari provinsi Guangdong, China. Oleh karena itu ia diberi nama A/angsa/Guangdong/1/96 (H5N1) (Xu, 1999). Sedangkan isolat yang berasal dari kasus infeksi H5N1 garis Asia pada manusia yang pertama kali terdokumentasikan terjadi di Hong Kong (Claas, 1998), dan dengan demikian disebut sebagai A/HK/156/97 (H5N1). Hemaglutinin, sebuah protein yang mengalami glikosilasi dan asilasi (glycosylated and acylated protein) terdiri dari 562-566 asam amino yang terikat dalam sampul virus. Kepala membran distalnya yang berbentuk bulat, daerah eskternal yang berbentuk seperti tombol dan berkaitan dengan kemampuannya melekat pada reseptor sel, terdiri dari oligosakharida yang menyalurkan derivat asam neuroaminic (Watowich, 1994). Daerah eksternal (exodomain) dari glikoprotein transmembran yang kedua, neuroamidase (NA), melakukan aktivitas enzimatik sialolitik (sialolytic ensymatic activity) dan melepaskan progeni virus yang terjebak di permukaan sel yang terinfeksi sewaktu dilepaskan. Fungsi ini mencegah tertumpuknya virus dan mungkin juga memudahkan gerakan virus dalam selaput lendir dari jaringan epitel yang menjadi sasaran. Selanjutnya virus pun akan menempel ke sasaran (Matrosivich, 2004). Hal ini membuat neoroamidase merupakan 115



sasaran yang menarik bagi obat antivirus (Garman and Laver, 2004). Kegiatan yang terpadu dan terkoordinasi dapat menjadikan spesies glikoprotein antagonistik HA dan NA dari strain virus tertentu merupakan hal yang penting bagi proses pelekatan dan pelepasan virion (Wagner, 2002). Pelekatan ke protein permukaan sel dari virion-virion virus influensa A tercapai melalui glikoprotein HA virus tertrimerisasi yang matang (mature trimerised viral HA glycoprotein). Stratifikasi pelekatan tersebut didasarkan pada pengenalan spesies asam sialik (N-asetil- atau N-asam glikollineuraminat) ujung akhir yang jelas, tipe hubungan glikosidik ke galaktosa paling ujung (2-3 atau 2- 6) dan susunan fragmen yang terletak lebih dalam dari sialil-oligosakharida yang terdapat di permukaan sel (Herrier 1995, Gambaryan 2005). Sebuah varietas dari sialil-oligosakharida yang lain diekspresikan dengan pembatasan (restriksi) ke jaringan dan asal spesies di dalam penjamu lain dari virus influensa. Penyesuaian (adaptasi) glikoprotein HA maupun NA virus ke jenis reseptor yang khas (spesifik) dari spesies penjamu tertentu merupakan prasyarat bagi terjadinya replikasi DNA virus yang efisien (Ito 1999, Banks 2001, Mastrovich 2001, Suzuki 2000, Gambaryan 2004). Ini berarti terjadi perubahan bentuk unit pengikat dari protein HA setelah terjadi penularan antar spesies (Gambaryan, 2006). Bagan mekanistik dari berbagai tipe reseptor disajikan dalam Gambar 5.7. Virus influensa unggas biasanya menunjukkan afinitas tinggi terhadap asam sialik yang terkaitkan dengan á 2-3 karena unsur ini merupakan tipe reseptor yang paling dominan di jaringan epitel endodermik (usus, paru-paru) pada unggas yang menjadi sasaran virus-virus tersebut (Gambaryan 2005a, Kim 2005). Sebaliknya, virus influensa yang beradaptasi pada manusia terutama mencapai residu terkait 2-6 (2-6 linked residues) yang mendominasi sel-sel epitel tanpa silia (non-cilliated) dalam saluran pernafasan manusia. Sifat-sifat dasar reseptor seperti ini menjelaskan sebagian dari sistem pertahanan suatu spesies, yang membuat penularan influensa unggas ke manusia tidak mudah terjadi (Suzuki 2000, Suzuki 2005). Tetapi akhir-akhir ini ditemukan ada sejumlah sel epitel berbulu detar (cilliated cells) dalam trakhea manusia yang juga memiliki konjugat glikoprotein serupa reseptor unggas dengan densitas yang rendah (Matrosovich 2004b), dan juga dijumpai adanya sel-sel ayam yang membawa reseptor sialil yang serupa dengan yang ada pada manusia dengan konsentrasi yang rendah. Hal ini mungkin dapat menjelaskan mengapa manusia tidak sepenuhnya kebal terhadap infeksi virus influensa unggas strain tertentu (Beare and Webster 1991). Pada babi dan juga burung balam, kedua jenis reseptor tersebut dijumpai dalam densitas yang lebih tinggi yang membuat kedua hewan ini mempunyai potensi untuk menjadi tempat pencampuran bagi strain virus unggas



116



dan manusia (Kida 1994, Ito 1998, Scholtissek 1998, Peiris 2001, Perez 2003, Wan and Perez 2005).



Gambar 5.7.Bagan sifat-sifat dasar reseptor virus influensa A (Sumber: Gambaryan 2005) Ada sejumlah vaksin yang dikembangkan. Sebagian besar masih didasarkan pada penggunaan virus utuh yang dibuat tidak aktif yang pemberiannya dilakukan dengan menyuntikkan pada unggas satu persatu. Vaksin homolog yang sudah dilemahkan, menggunakan strain HPAI yang sesungguhnya, memicu perlindungan secara baik tetapi tidak memungkinkan pembedaan serologik baik pada vaksinnya maupun unggas yang terinfeksi. Sebaliknya vaksin heterolog yang dilemahkan dapat digunakan sebagai vaksin penanda ketika virus vaksin mengekspresikan subtipe HA yang sama tetapi subtipe NA yang berbeda dibandingkan dengan virus liar (mis. vaksin H5N9 vs. HPAI H5N2). Dengan mendeteksi antibodi yang spesifik terhadap subtipe NA, ciri serologik vaksin dan unggas yang terinfeksi dapat dibedakan (Cattoli 2003). Tetapi metoda ini dapat sangat rumit dan vaksin ini pun kurang sensitif. Meskipun demikian vaksin seperti itu dapat disimpan di bank vaksin yang mempunyai beberapa subtipe H5 dan H7 dengan subtipe NA yang tidak bersesuaian. Proses genetik berbalik (reverse genetics) akan sangat membantu pembuatan vaksin baik untuk kedokteran hewan maupun keperluan kedokteran manusia dengan 117



kombinasi HxNy yang diinginkan dalam lingkungan genetik yang mendukung (Liu 2003, Neumann 2003, Subbarao 2003, Lee 2004, Chen 2005, Stech 2005). Pada saat ini vaksin heterolog yang dilemahkan digunakan di lapangan di daerah wabah H5N1 di Asia Tenggara dan juga Meksiko, Pakistan dan Italia Utara (mis. Garcia 1998, Swayne 2001). Sebagai pengganti dari penggunaan sistem DIVA untuk vaksin dari virus yang dilemahkan, diusulkan untuk menggunakan pendeteksian adanya antibodi yang spesifik NS-1 (Tumpey 2005). Antibodi-antibodi ini terbentuk dengan titer yang tinggi pada unggas yang terinfeksi, tetapi rendah pada yang sudah divaksinasi dengan vaksin yang dilemahkan. Vaksin yang terbentuk melalui rekombinan dalam vektor hidup menampilkan gen HA jenis H5 atau H7 yang terdapat dalam kerangka virus atau bakteri yang dapat menginfeksi spesies unggas. Di satu sisi vaksin ini memungkinkan pembedaan cara DIVA secara jelas, di sisi lain imunitas terhadap virus vektor akan yang sudah ada sebelumnya akan mempengaruhi keberhasilan vaksinasi. Suatu pengujian dengan menggunakan vaksin rekombinan cacar unggas di lapangan sedang dilakukan di Meksiko dan AS. Pada akhirnya, keberhasilan vaksinasi dengan protein rekombinan HA dan DNA menggunakan plasmid penampil HA telah dibuktikan dalam suatu percobaan (Crawford 1999, Kodihall 1997). Kini sedang direncanakan vaksinasi yang dilakukan secara luas di negara-negara Asia Tenggara (Notmile 2005). 3. Vaksin Hepatitis B Pada mulanya vaksin hepatitis B berasal dari plasma-derived antigen yaitu antigen diisolasi dan dipurifikasi dari darah orang yang pernah terinfeksi virus hepatitis B. selama ini PT. Biofarma Persero (perusahaan farmasi pembuat vaksin) mengambil dari darah-darah di PMI (Palang Merah Indonesia) yang tercemar hepatitis B. Hal ini sangat berguna pada waktu awal vaksinasi hepatitis B, karena belum ada vaksin rekombinan, namun akhir-akhir ini sudah berhasil dikembangkan vaksin hepatitis B rekombinan yang diproduksi pada sel Saccaromyces cerevisiae. Biofarma paham bahwa pembuatan vaksin dari plasma-derived antigen ini hanya tahap sementara, karena untuk itu tergantung dari tersedianya darah yang tecemar hepatitis B. Kalau proses imunisasi massal berhasil, jumlah darah yang tercemar hepatitis B makin sedikit. Di samping itu makin lama kita makin prihatin dengan adanya potensi kontaminasi virus lain yang ada di darah misalnya HIV. Oleh karena itu, di banyak negara, bukan hanya di Indonesia, dengan munculnya teknologi rekayasa genetika, maka vaksin hepatitis B yang dipakai sudah berpindah ke vaksin hepatitis B rekombinan. Dalam vaksin rekombinan kita tidak perlu menumbuhkan bakteri/virus yang berbahaya untuk membuat vaksin, melainkan kita bisa ambil informasi 118



genetik dari bakteri/virus yang akan dipakai untuk imunisasi dan menklon informasi genetik ini ke dalam organisme industri. Jadi untuk vaksin hepatitis B kita bisa mengambil hanya informasi genetik yang kita perlukan untuk membuat vaksin hepatitis B. Kita bisa tanamkan informasi genetik itu ke dalam bakteri seperti E. coli, bisa kita masukkan ke sel ragi, chinese hamster ovary, atau sel serangga. Produksi vaksin rekombinan hepatitis B melalui proses fermentasi karena ragi yang sudah kita masukkan informasi genetik ke bentuk gen yang diperlukan hanya perlu ditumbuhkan di dalam fermentol dan produknya kemudian kita purifikasi. Sehingga, lanjutnya, kita tidak perlu lagi orgasnisme yang patogen. Ia mengatakan yang dipakai untuk generasi pertama dari vaksin rekombinan hepatitis B, baik di luar negeri maupun oleh Biofarma hanya small protein (Anonim, 2002). 5.7



Ringkasan Penerapan bioteknologi dalam bidang kesehatan meliputi diagnosis, pengobatan



dan pencegahan penyakit. Bioteknologi baik dari segi manipulasi gen ataupun rekayasa, keduanyadapat dimanfaatkan untuk menyempurnakan cara-cara diagnosis, pengobatan dan pencegahan penyakit. Dari teknik rekayasa genetika diperoleh bahwa protein manusia dapat diklon untuk memproduksi senyawa-senyawa yang sangat berguna termasuk keperluan vaksinasi terhadap penyakit tertentu. Senyawa vaksin ini dapat meningkatkan kekebalan tubuh terhadap serangan kuman penyakit yang disebut sebagai antibodi. Contoh Soal: 1. Sebutkan dan jelaskan disertai gambar atau diagram tahap-tahap kloning gene vaksin hepatitis B serta bahan/material yang diperlukan pada setiap tahap produksi protein rekombinant tersebut. 2. Sebutkan dan jelaskan dua tujuan utama dari kloning gene dan mengapa teknik kloning sangat menunjang pengembangan bioteknologi modern. 3. Sebutkan kelebihan dan kekurangan masing-masing dari kultur sel bakteri dan kultur sel mamalia dalam kaitannya dengan proses produksi protein rekombinant untuk keperluan vaksin recombinant subunit serta contoh protein vaksin yang berhasil diproduksi dengan teknik rekayasa genetika. 4. Sebutkan dan jelaskan aplikasi DNA rekombinant atau bioteknologi molekular dalam bidang Pengobatan dan Kesehatan pada manusia.



119



DAFTAR PUSTAKA Andi



(2003),



Peranan



Bioinformatika



dalam



Dunia



Kedokteran,



ttp://ikc.vlsm.org/populer/andi-bioinformatika.php per 1 Januari 2004. Anonim, 2002, Vaksin Rekombinan Hepatitis B dengan Galur Indonesia, Repuplika Online. Biotechnol Bioeng, 88, 1-14. Brown, T. A., 1991, Pengantar Kloning Gen, Yayasan Essentia Medica, Yogyakarta. Chin, J., 2000, Manual Pemberantasan Penyakit Menular Claas EC, Osterhaus AD, van Beek R, et al, 1998 Human influenza A H5N1 virus related to a highly pathogenic avian influenza virus. Lancet; 351: 472-7. Fouchier RA, Munster V, Wallensten A, et al, Characterization of a novel influenza A virus hemagglutinin subtype (H16) obtained from black-headed gulls. J Virol 2005; 79: 2814-22. Gambaryan A, Tuzikov A, Pazynina G, Bovin N, Balish A, Klimov A., 2006, Volution of the receptor binding phenotype of influenza A (H5) viruses. Virology, 344: 432 8. Garman E, Laver G., 2004, Controlling influenza by inhibiting the virus's neuraminidase. Curr Drug Targets; 5: 119-36. Herrler G, Hausmann J, Klenk H. D., 1995, Sialic acid as receptor determinant of orthoand paramyxoviruses. In: Rosenberg A (ed), Biology of the Sialic Acids, Plenum Press NY,. 315-336 Isbagio, D. W., 2005, Masa Depan Pengembangan Vaksin Baru, Cermin Dunia Kedokteran, (148), Jakarta, 12. Ito T, Kawaoka Y, Nomura A, Otsuki K., 1999, Receptor specificity of influenza A viruses from sea mammals correlates with lung sialyloligosaccharides in these animals. J Vet Med Sci; 61, (8), 955. Kim JA, Ryu SY, Seo S. H., 2005, Cells in the respiratory and intestinal tracts of chicken have different proportions of both human and avian influenza virus receptors. J Microbiol; 43: 366-9.



120



Matrosovich MN, Matrosovich TY, Gray T, Roberts NA, Klenk HD., 2004, Neuraminidase is important for the initiation of influenza virus infection in human airway epithelium. J Virol, 78 (7), 1266. Poedjiadi, A., 1994, Dasar-dasar Biokimia, UI-Press, Jakarta. Sardjoko, 1991, Bioteknologi, PT Gramedia Pustaka Utama, Jakarta. Shah, F. H., ______, Asas Teknologi DNA Rekombinan Sidorenko Y, Reichl U., 2004, Structured model of influenza virus replication in MDCK cells. Sjahrurachman, A, 2001, Fakta dan Tantangan dalam Virologi Kedokteran penekanan pada vaksinasi dan pengobatan, Cerminan Dunia Kedokteran, (130), 43. Sugiharto, B., Ermawati, N., Sakikibara, H, 2003, Pembuatan Antibodi Poliklonal Secara Cepat Untuk Deteksi Protein Drought-Inducible Pada TanamanTebu, Jurnal ILMU DASAR, 4 (2), 108-115. Wagner R, Matrosovich M, Klenk H. D., 2002, Functional balance between haemagglutinin and neuraminidase in influenza virus infections. Rev Med Virol, 12, 159-66. Watowich SJ, Skehel JJ, Wiley D. C., 1994, Crystal structures of influenza virus hemagglutinin in complex with high-affinity receptor analogs. Structure, 2, 719-31. Xu X, Subbarao, Cox NJ, Guo Y., 1999,



Genetic characterization of the pathogenic



influenza A/Goose/Guangdong/1/96 (H5N1) virus: similarity of its hemagglutinin gene to those of H5N1 viruses from the 1997 outbreaks in Hong Kong. Virology, 261: 15-9.



121



Senarai IstilahdanArtinya Istilah



Arti



Protein



Makromolekul yang kompleks tersusun atas residu asam amino yang terdapat dalam semua sel hidup.



Gene



Unit pembawa faktor keturunan yang tersusun atas molekul DNA terdapat pada kromosom dalam inti setiap sel hidup.



Virus influensa



Partikel berselubung berbentuk bundar atau bulat panjang, merupakan genom RNA rangkaian tunggal dengan jumlah lipatan tersegmentasi sampai mencapai delapan lipatan, dan berpolaritas negatif. Kelompok enzim restriksi yang mampu memotong molekul DNA



Endonuklease Palindrome



Susunan spesifik urutan nukleotida yang mampu dikenali oleh enzim restriksi untuk melakukan proses pemotongan.



Vektor ekspresi



Urutan DNA sirkuler untuk menyisipkan DNA asing sehingga dapat diekspresi menjadi protein recombinant.



122



BAB 6 SEL INDUK DALAM BIOTEKNOLOGI KESEHATAN 6. 1



Pendahuluan Pada bagian ini yang akan menjadi sasaran pembelajaran adalah (1) menjelaskan



pengertian sel induk, (2)menjelaskan karakteristik dan jenis sel induk, (3)menjelaskan aplikasi kultur sel induk, dan (3) menjelaskan perkembangan penelitian sel induk di Indonesia, dan (4) menjelaskan bioetika dan kontroversi pada penggunaan sel induk.Penanganan kesehatan yang berhubungan dengan penyakit kelainan fungsi organ semakin penting. Hal ini nampak pada data menyangkut kegiatan, permintaan transplantasi organ, dan ketersediaan organ transplan. Dari data tersebut, terdapat perbedaan yang sangat jauh antara permintaan organ dengan jumlah organ yang tersedia.Berbagai upaya telah dilakukan untuk memenuhi kebutuhan akan penyediaan organ tersebut, namun belumlah mencukupi mengingat jumlah permintaan yang meningkat tiap tahunnya. Pada dekade terakhir perhatian dan penelitian dalam bidang selinduk(stem cell) mengalami kemajuan yang amat pesat. Hal ini tidak terlepas dari upaya manusia untuk mengobati penyakit-penyakit yang sudah tidak mungkin untuk diobati lagi baik secara konservatif maupun operatif. Para ahli saat ini telah mulai menengok dan meneliti kemungkinan penggunaan selindukuntuk mengobati penyakit-penyakit atau kelainan-kelainan yang tak mungkin lagi untuk diobati dengan obat-obatan atau tindakan operatif, khususnya penyakit degeneratif maupun kelainan lainnya seperti trauma, keganasan dan sebagainya. Selain itu sel induk juga digunakan dalam penelitian untuk mencari obat-obat baru pada tingkat laboratorium maupun untuk mempelajari patogenesis penyakit. Perkembangan penelitian tentang penggunaan dan penerapan sel induk ini tidak terlepas dari potensi nilai ekonomi dan bisnis yang akan diraih manakala sel induk ini sudah dapat digunakan untuk mengobati penyakit atau kelainan pada penderita dan ditemukannya obat-obatan baru. Dalam perkembangannya semenjak tahun 1959 tentang keberhasilan pembuahan in vitro pada kelinci sampai saat ini telah mengalami banyak perkembangan yaitu keberhasilan dalam membiakkan jaringan manusia seperti sel islet pankreas, neuron, sel otot cardiac yang kesemuanya itu berasal dari sel induk(Stem Cell). Penelitian dan pemanfaatan sel induk sangat menarik perhatian masyarakat dunia karena potensinya dalam menunjang kesehatan manusia. Jaringan yang telah berhasil ditumbuhkan tersebut kemudian dapat ditransplantasikan atau dicangkokkan pada manusia sebagai suatu solusi atas berbagai permasalahan kesehatan, terutama penyakit keturunan secara genetis. 123



Terapi ESC cukup memberikan harapan bagi para penderita penyakit keturunan secara genetis yang relatif permanen seperti Alzheimer, Diabetes melitus, kerusakan permanen pada jaringan atau organ. Dalam bagian ini kita akan membahas masalah sel induk dan aplikasinya dalam bidang bioteknologi kesehatan. 6.2



Pengertian Sel Induk Dalam biologi klasik, sel digolongkan sebagai sel somatik atau sel benih. Sel ini



mengisi jaringan-jaringan dalam tubuh, mengandung dua salinan dari masing-masing kromosom, dan bersifat diploid. Sel somatik umumnya sangat terdiferensiasi atau matang. Sel terdiferensiasi biasanya berupa sel yang sangat terspesialisasi dan sudah sangat berkembang. Beberapa waktu yang lalu, para peneliti menemukan bahwa sel tak terdiferensiasi (sel dewasa) hidupdiantara sel somatik didalam organ tubuh. Kelompok sel ini memiliki kemampuan khusus, seperti dapat memilih tugas masing-masing. Sel semacam ini disebut sel induk. Secara definisi sederhana, sel induk (Stem cell) atau sel induk adalah sel yang dalam perkembangan embrio manusia menjadi sel awal yang tumbuh menjadi berbagai organ manusia. Sel ini belum terspesialisasi dan mampu berdeferensiasi menjadi berbagai sel matang dan mampu meregenerasi diri sendiri. Sel induk merupakan sel yang dapat bereplikasi menjadi mature cell dengan karakteristik dan bentuk khas (1,2). Stem cell adalah sel yang tidak atau belum terspesialisasi yang mempunyai 2 sifat yaitu pertama mempunyai kemampuan untuk berdiferensiasi menjadi sel lain. Dalam hal ini stem cell mampu berkembang menjadi berbagai jenis sel matang, misalnya sel saraf, sel otot jantung, sel otot rangka, sel pankreas, dan lain-lain. Kedua mempunyai kemampuan untuk memperbaharui atau meregenerasi dirinya sendiri (self-regenerate/self-renew). Dalam hal ini stem cell dapat membuat salinan sel yang persis sama dengan dirinya melalui pembelahan sel.9 Stem



cell



memiliki



kemampuan



klonogenik



dan



memperbaiki



diri,



serta



berdiferensiasi menjadi berbagai jenis sel (totipoten). Stem cell embrionik berasal dari sekumpulan sel di bagian dalam dari embrio mamalia pada awal konsepsi (stadium blastosist). Dalam pembiakan, sebagian sel ini tumbuh menjadi prekursor. Prekursor yang ditransplantasikan pada hewan percobaan yang mengalami degenerasi apoptotik, akan bermigrasi ke daerah yang mengalami degenerasi. Selanjutnya, sel tersebut akan berdiferensiasi menggantikan fungsi sel yang mengalami degenerasi. Sel induk pertama kali dikenal dan digunakan dalam pengobatan yang diisolasi dari bagian sumsum tulang belakang. Sel ini dapat berupa sel monosit, limfosit, neutrofil, 124



basofil, dan eritrosit. Sel-sel tersebut menyatu membentuk sel darah. Sel yang menjadi cikal bakal sel darah manusia disebut sel hematopoietik, sehingga sel induk yang ditemukan



dalam



sumsum



tulang



belakang



disebut



sel



indukhematopoietikatau



hematopoietic steam cell (HSC). 6.3



Karakteristik dan Jenis Sel induk (Stem cell) Sel induk mempunyai dua sifat yang khas yaitu:



1.



Differensiasi (Differentiate) yaitu kemampuan untuk berkembang menjadi sel lain. Selindukmampu berkembang menjadi berbagai jenis sel yang khas (spesifik) misalnya sel saraf, sel otot jantung, sel otot rangka, sel pankreas dan lain-lain



2.



Regenerasi (Self regenerate/self renew) yaitu kemampuan untuk memperbaharui atau meregenerasi dirinya sendiri. Sel induk mampu membuat salinan sel yang persis sama dengan dirinya melalui pembelahan sel.



Berdasarkan kemampuannya untuk berdifferensiasi sel induk dibagi menjadiempat jenis yaitu: 1.



Totipotent yaitu sel induk yang dapat berdifferensiasi menjadi semua jenis sel. Yang termasuk dalam sel induk totipotent adalah zigot. Sel ini merupakan sel embrionik awal yang mempunyai kemampuan untuk membentuk berbagai jenis sel termasuk membentuk satu individu yang utuh. Disamping mempunyai kemampuan untuk membentuk berbagai sel pada embrio sel totipotent juga dapat membentuk sel-sel yang menyusun plasenta. Sel ini berasal dari sel telur yang mempunyai kemampuan menjadi sel dan jaringan embrio serta jaringan yang mendukung pertumbuhan embrio itu sendiri. Mamalia mempunyai 200 jenis sel yang meliputi sel saraf (neuron), sel otot (miosit), sel kulit (epitelial), sel darah (eritrosit, monosit,linfosit dll), sel tulang (osteosit) dan sel kartilago (kondrosit). Sel yang juga berperan pada pertumbuhan embrio meliputi jaringan ekstraembrional, plasenta dan tali pusat.



2.



Pluripoten yaitu Sel berasal dari 3 lapisan germinal embrio yang berasal dari inner cell blastokis sebelum menempel pada dinding uterus. Ketiga lapisan tersebut terdiri dari; mesoderm, endoderm dan ektoderm yang merupakan cikal dari semua sel dalam tubuh. Mesoderm merupakan cikal dari sumsum tulang, korteks adrenal, jaringan limfe, otot polos, otot jantung, otot rangka, jaringan ikat, sistem urogenital dan sistim vaskular. Entoderm merupakan cikal dari timus, tiroid, paratiroid, laring, trakhea, paru, vesika 125



urinaria, vagina, uretra, GIT. Sedangkan lapisan terakhir, ektoderm merupakan cikal dari kulit, jaringan saraf, medula adrenal, hipofisis, jaringan ikat kepala dan wajah, mata dan telinga. tetapi tidak dapat menjadi jaringan ekstraembrionik seperti plasenta dan tali pusat. Yang termasuk stem cells pluripotent adalah embryonic stem cells. 3.



Multipotent yaitu stem cell yang dapat berdifferensiasi menjadi banyak jenis sel misalnya hemopoetic stem cells yang terdapat pada sumsum tulang yang mempunyai kemampuan untuk berdifferensiasi menjadi berbagai jenis sel yang terdapat dalam darah seperti eritrosit, lekosit dan trombosit. Contoh lainnya adalah neural stem cells yang mempunyai kemampuan berdifferensiasi menjadi sel saraf dan sel glia.



4.



Unipotent yaitu stem cells yang hanya dapat menghasilkan satu jenis sel. Berbeda dengan non stem cells, stem cells mempunyai sifat masih dapat memperbaharui atau meregenerasi diri (self-regenerate/self renew). Contohnya erythroid progenitor cells hanya mampu berdifferensiasi menjadi sel darah merah.



Gambar 6.1 Proses diferensiasi berbagai jenis sel pada jaringan tubuh manusia



Berdasarkan sumbernya 1,3,4 stem cell dapat dibagi menjadi lima jenis yaitu: 1.



Zigot yaitu pada tahap sesaat setelah sperma bertemu ovum (fertilisasi)



2.



Embryonic stem cells yaitu sel-sel stem yang diperoleh dari inner cell mass dari suatu blastocyst (embrio yang terdiri atas 50-150 sel, kira-kira hari ke-5 pasca 126



pembuahan). Embryonic stem cells biasanya didapatkan dari sisa embrio yang tidak dipakai dari IVF (in vitro fertilization). Penggunaan embryonic stem cells ini hingga kini masih menjadi isu etik yang kontroversial. Sel stem ini mempunyai sifat dapat berkembang biak secara terus menerus dalam media kultur optimal pada kondisi tertentu dan dapat diarahkan untuk berdifferensiasi menjadi berbagai sel yang terdifferensiasi seperti sel jantung, sel kulit, neuron, hepatosit dan sebagainya. 3.



Fetus yang dapat diperoleh dari klinik aborsi.



4.



Stem cell darah tali pusat yaitu stem cell yang diambil dari darah plasenta dan tali pusat segera setelah bayi lahir. Stem cells dari darah tali pusat merupakan jenis hematopoetic stem cells dan ada yang menggolongkan kedalam adult stem cells.



Gambar 6.3.Proses fertilisasi sel telur dan sperma zigot, morula, blastosit, dan sel induk yang diekstrak dari bagian dalam sel yang dibiakan secara in vitro sel menjadi sel jaringan lain yang tergantung dari media pertumbuhannya. 127



Sampai saat ini ada 2 tipe stem cells yang telah ditemukan dalam darah tali pusat yaitu hematopoetic stem cells, dan mesenchymal stem cells. Selain kedua jenis stem cells tersebut di dalam darah tali pusat masih ada beberapa tipe lain yang telah ditemukan seperti neuron like stem cells, tetapi hal ini masih memerlukan penelitian lebih lanjut5. Darah tali pusat mempunyai immunogenicity yang lebih rendah6, isolasinya tidak membutuhkan prosedur yang invasif dan untuk transplantasi tidak membutuhkan 100% ketepatan HLA (human leucocyte antigen)7. 5.



Adult stem cells yaitu stem cells yang diambil dari jaringan dewasa, misalnya a.



Sumsum tulang Ada 2 jenis stem cells pada sumsum tulang yaitu 1)



hematopoetic stem cells yaitu stem cells yang akan berkembang menjadi berbagai jenis sel darah.



2) b.



stromal stem cells atau disebut juga mesenchymal stem cell



Jaringan lain pada dewasa seperti pada susunan saraf pusat, adiposa (jaringan lemak), otot rangka, dan pankreas.



Gambar 6.4Proses differensiasi jaringan sel dewasa (adult stem cell) menjadi sel jaringan lain 128



Adult stem cell mempunyai sifat plastis artinya selain berdifferensiasi menjadi sel yang sesuai dengan jaringan asalnya adult stem cells juga dapat berdifferensiasi menjadi sel jaringan lain, misalnya neural stem cells dapat berubah menjadi sel darah, stromal stem cell dari sumsum tulang dapat berubah menjadi sel otot jantung dan sebagainya. 6.4



Aplikasi Kultur Sel Induk Stem cells dapat digunakan untuk keperluan baik dalam bidang riset maupun



pengobatan. Adapun penggunaan kultur stem cells adalah sebagai berikut: 1.



Terapi gen Stem cells khususnya hematopoetic stem cells digunakan sebagai pembawa transgen kedalam tubuh pasien dan selanjutnya dilacak apakah jejaknya apakah stem cells ini berhasil mengekspresikan gen tertentu dalam tubuh pasien. Adanya sifat self renewing pada stem cell menyebabkan pemberian stem cells yang mengandung transgen tidak perlu dilakukan berulang-ulang. Selain itu hematopoetic stem cells juga dapat berdifferensiasi menjadi bermacam-macam sel sehingga transgen tersebut dapat menetap diberbagai macam sel.



2.



Penelitian untuk mempelajari proses-proses biologis yang terjadi pada organisma termasuk perkembangan organisma dan perkembangan kanker



3.



Penelitian untuk menemukan dan mengembangkan obat-obat baru terutama untuk mengetahui efek obat terhadap berbagai jaringan



4.



Terapi sel (cell based therapy) Stem cell dapat hidup diluar tubuh manusia, misalnya di cawan petri. Sifat ini dapat digunakan untuk melakukan manipulasi pada stem cells yang akan ditransplantasikan ke



dalam



organ tubuh



untuk



menangani penyakit-penyakit



tertentu tanpa



mengganggu organ tubuh. 6.4.1 Penggunaan Stem cell Dalam Pengobatan Penyakit Para ahli saat ini sedang giat melakukan berbagai penelitian untuk menggunakan stem cell dalam mengobati berbagai penyakit. Penggunaan stem cells untuk mengobati penyakit dikenal sebagai Cell Based Therapy. Prinsip terapi adalah dengan melakukan transplantasi stem cells pada organ yang rusak. Tujuan dari transplantasi stem cells ini adalah 1.



Mendapatkan pertumbuhan dan perkembangan sel-sel baru yang sehat pada jaringan atau organ tubuh pasien 129



2.



Menggantikan sel-sel spesifik yang rusak akibat penyakit atau cidera tertentu dengan sel-sel baru yang ditranspalantasikan. Sel



stem



embryonic



sangat



plastik



dan



mempunyai



kemampuan



untuk



dikembangkan menjadi berbagai macam jaringan sel seperti neuron, kardiomiosit, osteoblast, fibroblast, sel-sel darah dan sebagainya, sehingga dapat dipakai untuk menggantikan jaringan yang rusak. Sel stem dewasa juga dapat digunakan untuk mengobati berbagai penyakit degeneratif, tetapi kemampuan plastisitasnya sudah berkurang. Keuntungan dari penggunaan sel stem dewasa yaitu tidak atau kurang menimbulkan masalah dan kontroversi etika. Darah tali pusat (umbilical cord blood) saat ini sedang gencar diteliti manfaatnya untuk mengatasi berbagai penyakit degeneratif karena lebih mudah didapat, banyak mengandung stem cells, immunogenecity rendah, plastisitasnya cukup baik dan tidak membutuhkan 100% kecocokan HLA. Dengan memberikan nutrisi yang cocok stem cell dapat memperbanyak diri pada media



spesifik



di



laboratorium



tanpa mengalami



proses



differensiasi,



sehingga



menghasilkan turunan stem cells dengan materi genetik yang sama yang berguna untuk riset. Ada beberapa alasan penggunaan stem cell dalam cell based therapy: 1.



stem cell dapat diperoleh dari pasien sendiri, artinya transplantasi dapat bersifat autolog sehingga menghindari potensi rejeksi. Berbeda dengan transplantasi organ yang membutuhkan organ donor yang harus cocok (match), transplantasi stem cells dapat dilakukan tanpa organ donor yang sesuai.



2.



mempunyai kemampuan untuk berproliferasi yang besar sehingga dapat diperoleh sel dalam jumlah besar dari sumber yang terbatas. Pada luka bakar yang luas jaringan kulit yang tersisa tidak cukup untuk menutupi lesi luka baker tersebut. Hal ini dapat diatasi dengan menggunakan terapi stem cell.



3.



mudah dimanipulasi untuk mengganti gen yang sudah tidak berfungsi lagi melalui metoda transfer gen.



4.



mempunyai kemampuan untuk bermigrasi kejaringan target misalnya ke otak.



5.



mempunyai kemampuan untuk berintegrasi dengan jaringan host dan berinteraksi dengan jaringan sekitarnya. Keuntungan penggunaan transplantasi stem cells untuk mengobati penyakit adalah:



1.



tidak perlu adanya kecocokan donor. 130



2.



transplantasi autologous lebih baik untuk digunakan.



3.



untuk mencegah terjadinya reaksi penolakan jaringan dapat digunakan metoda somatic cell nuclear transfer) atau terapi kloning. Therapeutic cloning atau disebut Somatic Cell Nuclear Transfer (SCNT)2,5 adalah suatu teknik yang bertujuan untuk menghindari resiko penolakan atau rejeksi. Pada teknik ini inti sel telur donor dikeluarkan dan diganti dengan inti sel resipien. Sel yang telah dimanipulasi ini kemudian akan membelah diri dan setelah menjadi



blastokista maka inner cell massnya akan diambil sebagai embryonic stem cells. Stem cells ini kemudian akan dimasukkan kembali kedalam tubuh resipien dan stem cells ini kemudian akan berdifferensiasi menjadi sel organ (sel beta pankreas, sel otot jantung dan lain-lain). Tanpa reaksi penolakan karena sel tersebut mengandung materi genetik resipien.



Gambar 6.5. Transplatasi Sel induk yang telah dimanipulasi menjadi blastokista yang dimasukkan kembali kedalam tubuh resipien dan berdifferensiasi menjadi sel organ. Embryonic stem cells dulu dipikirkan dapat memperbanyak diri sendiri secara tak terbatas, tetapi kini diketahui bahwa usia dan perbanyakan diri sendiri sel-sel stem juga ada batasnya. Hal ini disebabkan karena terjadinya mutasi pada gen-gen pada sel stem yang



131



diakibatkan karena pengaruh nutrisi dalam medium kultur. Penggunaan Embryonic stem cells pada Cell Based Therapymempunyai kelebihan dan kekurangan. Kelebihan penggunaan embryonic stem cells adalah: 1.



mudah didapatkan, biasanya diperoleh dari klinik fertilitas



2.



bersifat pluripotent artinya mempunyai kemampuan untuk berdifferensiasi menjadi berbagai macam sel yang merupakan turunan dari ke 3 lapis germinal (ektoder, mesoderm dan endoderm), tetapi tidak dapat membentuk selubung embrio.



3.



immortal artinya dapat berumur panjang sehingga dapat memperbanyak diri ratusan kali pada media kultur.



4.



reaksi penolakan rendah



Kekurangan penggunaan embryonic stem cells adalah sebagai berikut: 1.



dapat bersifat tumorigenik artinya setiap kontaminasi dengan sel yang tak berdifferensiasi dapat menimbulkan kanker.



2.



selalu bersifat allogenik sehingga berpotensi menimbulkan terjadinya rejeksi imunitas



3.



secara etik masih kontroversial.



Adult stem cells lebih sulit untuk diidentifikasi dan diisolasi diantara sel-sel yang bukan stem cells. Penggunaan adult stem cells mempunyai kelebihan dan juga kekurangan. Kelebihan penggunaan adult stem cells adalah 1.



dapat diperoleh dari sel pasien sendiri sehingga menghindari terjadinya penolakan imun.



2.



sudah terspesialisasi sehingga induksi menjadi lebih sederhana



3.



kurang atau tidak menimbulkan problem etika.



Kekurangan dari penggunaan adult stem cells yaitu, antara lain: 1.



jumlahnya sedikit dan sangat jarang ditemukan pada jaringan matur sehingga sulit mendapatkan adult stem cells dalam jumlah banyak.



2.



masa hidupnya tidak selama embryonic stem cells



3.



bersifat multipotent sehingga differensiasi tidak seluas embryonic stem cells yang bersifat pluripotent.



132



Stem cells yang diambil dari umbilical cord blood akhir-akhir ini menjadi harapan untuk cell based therapy. Kelebihan penggunaan stem cells dari umbilical cord blood adalah 1.



mudah didapatkan, bisa diperoleh dari bank darah tali pusat



2.



siap dipakai, karena telah melalui proses prescreening, testing dan pembekuan



3.



kontaminasi virus sangat minimal dibandingakn dengan stem cells yang berasal dari sumsum tulang



4.



cara pengambilan mudah, tidak beresiko atau menyakiti donor.



5.



Resiko Graft Versus Host Disease (GVHD) lebih rendah dibandingkan dengan menggunakan stem cells yang berasal dari sumsum tulang. Transplantasi tetap dapat dilakukan walaupun HLA matching tidak sempurna ataun toleransi terhadap ketidak sesuaian HLA matching lebih besar dibandingakn dengan stem cells dari sumsum tulang. Kekurangan penggunaan stem cells dari darah tali pusat yaitu: 1. kemungkinan terkena penyakit genetik. Ada beberapa penyakit genetik yang tidak terdeteksi saat lahir sehingga diperlukan pengamatan setelah donor meningkat menjadi dewasa. 2. jumlah stem cells relatif terbatas sehingga ada ketidak sesuaian antara jumlah stem cells yang diperlukan resipien dengan jumlah yang tersedia dari donor. Beberapa penyakit yang potensial dapat diterapi dengan menggunakan stem cells



adalah Parkinson dan Alzheimer, cidera medula spinalis, stroke, luka bakar, penyakit jantung, diabetes, distrofi otot, osteoporosis, sirosis hepatis, leukemia, anemia sel sabit (sickle cell anemia), osteoarthritis, cancer dan sebagainya.



133



Gambar 6.6. Diagram terapi sel induk menggunakan sistem penataan ulang inti sel 6.4.2 Penggunaan Stem Cells Pada Penyakit Stroke Pada penyakit stroke dahulu dianggap bahwa kematian sel yang terjadi akan menyebabkan terjadinya kecacatan permanen akibat sel otak tak mempunyai kemampuan regenerasi. Anggapan ini berubah setelah para ahli mengetahui adanya plastisitas pada sel-sel otak dan pengetahuan tentang stem cells. Pada penelitian penyakit stroke9,10 dengan menggunakan stem cells dari darah tali pusat menusia yang diberikan intra vena kepada



tikus



yang



arteri



serebri



medianya



dioklusi



menunjukkan



hasil



yang



menggembirakan. Pada penelitian ini didapatkan pemulihan kembali fungsi normal otak sebesar 70% pada kelompok yang mendapatkan transplantasi stem cells dari darah tali pusat manusia. Penelitian dengan menggunakan mesenchymal stem cells (MSC)5 dari sumsum tulang autolog yang diberikan intra vena pada 30 penderita stroke juga memperbaiki outcome yang dinilai dari parameter Barthel Index dan Modified Rankin Scale. Penelitian ini didasarkan pada hasil penelitian yang telah dilakukan sebelumnya ditempat lain. Mesenchymal stem cells pada penelitian ini diperoleh dari aspirasi sumsum tulang 12. 134



Setelah disuntikkan perifer, MSC akan melintas sawar darah otak pada daerah otak yang rusak13.Pemberian



MSC



intravenous



akan



mengurangi



terjadinya



apoptosis



dan



menyebabkan proliferasi sel endogen setelah terjadinya stroke5. 6.4.3 Penggunaan Stem Cells Pada Infark Miokard Pada infark miokard akut sel stem sumsum tulang (bone marrow) yang beredar dalam darah perifer dan stem cells yang sudah berada di jantung akan menuju ke daerah infark, tetapi jumlahnya tidak cukup dapat mengatasi dan menyembuhkan daerah yang infark tersebut. Sel induk ini akan membentuk sel kardiomiosit dan juga mengadakan neovaskularisasi. Karena jumlah stem cells endogen sangat terbatas maka asupan sel stem eksogen yang berasal dari sumsum tulang atau dari sumber lainnya misalnya dari darah tali pusat akan meningkatkan kesembuhan daerah yang mengalami infark. Bartinek5 telah melakukan intracoronary infusion bone marrow stem cells otolog pada 22 pasien dengan AMI dan mendapatkan hasil yang baik. Penelitian terkini menunjukkan bukti awal bahwa adult stem cells dan embryonic stem cells dapat menggantikan sel otot jantung yang rusak dan memberikan pembuluh darah baru. Strauer et al.5 mencangkok mononuclear bone marrow cell autolog ke dalam arteri yang menimbulkan infark pada saat PTCA 6 hari setelah infark miokard. Sepuluh pasien yang diberi stem cells area infarknya menjadi lebih kecil dan indeks volume stoke, left ventricular end systolic volume, kontraktilitas area infark dan perfusi miokard menunjukkan perbaikan dibandingkan dengan kelompok kontrol. 6.4.4 Penggunaan Stem Cells Pada Skin Replacement Dengan bertambahnya pengetahuan mengenai stem cells, maka peneliti telah dapat membuat epidermis dari keratinosit yang diperoleh dari folikel rambut. Pemakaian skin replacement ini bermanfaat dalam terapi ulkus atau luka bakar. Kulit merupakan jaringan yang banyak dibutuhkan dan saat ini para ahli telah dapat membuat epidermis dari keratinosit yang diperoleh dari folikel rambut yang dicabut. Hal ini memungkinkan transplantasi epidermis autolog, sehingga menghindari masalah penolakan. Pemakaian skin replacement ini bermanfaat dalam terapi ulkus vena, ulkus diabetik ataupun luka bakar. Pada bulan mei 1998 sebuah perusahaan di Amerika Serikat memproduksi jaringan kulit rekayasa (tissue engineered skin) dengan nama dagang Apligraf dan telah dipasarkan di USA dan Kanada. Apligraf seperti kulit normal terdiri atas dua lapisan yaitu dermis 135



sebagai dasar dan epidermis sebagai llapisan permukaan. Apligraf dibuat dengan cara mengumpulkan fibroblast (sel yang membentuk dermis) dan keratinosit dari kulit preputium bayi-bayi yang disunat. Fibroblast dan keratinosit mempunyai kemampuan proliferasi yang luar biasa Selanjutnya dibuat gel kolagen dari serat urat sapi dan disterilkan agar tidak merusak kolagen. Pada gel kolagen ini dapat tumbuh keratosit (sel epidermis). Apligraf diuji coba pada borok akibat varices dengan memberikan hasil penutupan borok 47% setelah 24 minggu. Apligraf dapat dipesan dalam keadaan segar dan dapat disimpan selama 5 hari dalam suhu kamar.6,9 6.4.5 Penggunaan Stem Cell pada penyakit keganasan lainnya Ada 3 golongan penyakit keganasan lainnya yang dapat diatasi oleh stem cell yaitu: a)



Penyakit autoimun. Misalnya pada lupus, artritis rheumatoid dan diabetes tipe 1. Setelah diinduksi oleh growth factor agar hematopoietic stem cell banyak dilepaskan darisumsum tulang ke darah tepi, hematopoietic stem celldikeluarkan dari dalam tubuh untuk dimurnikan dari selimun matur. Lalu tubuh diberi agen sitotoksik atau terapiradiasi untuk membunuh sel-sel imun matur yang tidakmengenal self antigen (dianggap sebagai foreign antigen).Setelah itu hematopoietic stem cell dimasukkan kembali ketubuh, bersirkulasi dan bermigrasi ke sumsum tulang untuk berdiferensiasi menjadi sel imun matur sehingga sistemimun tubuh kembali seperti semula.



b)



Penyakit degeneratif. Pada penyakit degeneratif sepertistroke, penyakit Parkinson, penyakit Alzheimer, terdapatbeberapa kerusakan atau kematian sel-sel tertentu sehinggabermanifestasi klinis sebagai suatu penyakit. Pada keadaanini stem cell setelah dimanipulasi dapat ditransplantasi kedalam tubuh pasien agar stem cell tersebut dapatberdiferensiasi menjadi sel-sel organ tertentu yangmenggantikan selsel yang telah rusak atau mati akibatpenyakit degeneratif.



c)



Penyakit keganasan. Prinsip terapi stem cell padakeganasan sama dengan penyakit autoimun. Hematopoieticstem cell yang diperoleh baik dari sumsum tulang ataudarah tali pusat telah lama dipakai dalam terapi leukemiadan penyakit darah lainnya.



6.5 Perkembangan Penelitian dan penerapan Sel Induk di Indonesia Besarnya potensi sel induk mendorong tumbuh suburnya bank sel induk di sejumlah negara. Di Singapura, Jepang, Inggris, dan Amerika Serikat, berdiri sejumlah bank sel induk. Sel-sel induk tidak hanya bisa dipakai keluarga penyimpan tapi juga dapat diberikan kepada pasien yangmembutuhkan.Di Indonesia, lembaga semacam ini belum ada sehingga orang-orang Indonesia banyak yang mulai menjadi ''nasabah" bank sel induk di 136



Singapura. Yang terkenal antara lain Stemcord serta Cordlife, keduanya bermarkas di Singapura. Stemcord kini punya 6.000 anggota, dan 105 di antaranya warga Indonesia. Sedangkan Cordlife menampung sel induk dari 200 orang Indonesia. Mereka itulah yang sudah lebih dulu melihat manfaat sel induk ini, terutama yang diambil dari tali pusar. Para nasabah itu harus menyimpan sel induk di Singapura. Caranya, saat bayi lahir, darah di tali pusar bayi disedot dan dimasukkan ke dalam kantong darah. Penyedotan bisa dilakukan di rumah sakit tempat si ibu melahirkan, lalu dikirim. Cordlife, misalnya, mengenakan biaya pengiriman dari Jakarta ke Singapura sebesar S$ 320, sekitar Rp 1,84 juta. Biaya penyimpanannya per tahun S$ 1.800 dan dikenakan pajak 5%. Kedua perusahaan itu juga menggaet beberapa rumah sakit swasta, antara lain Rumah Sakit Pondok Indah, Pantai Indah Kapuk, dan Graha Medika. Terapi sel induk sudah berkembang di Rumah Sakit Cipto Mangunkusumo dan Rumah Sakit Kanker Dharmais Jakarta yang bekerja sama dengan para peneliti dari Lembaga Biologi Molekuler Eijkman, Rumah Sakit Anak dan Bersalin Harapan Kita, serta Palang Merah Indonesia. Terapi sel induk dari sumsum tulang pernah dirintis oleh RSCM pada tahun 1987-1991. Para dokter Rumah Sakit Cipto Mangunkusumo memanfaatkan sel induk untuk kegiatan transplantasi sumsum tulang pasien leukemia. Tahun 1996-1998, giliran Rumah Sakit Kanker Dharmais yang melakukannya. Kondisi empat pasien yang menjalani transplantasi dilaporkan membaik. Namun setelah krisis moneter yang terjadi pada tahun 1998 kegiatan tersebut terhenti. Untuk pengadaan bank sel induk masih terbentur masalah biaya. Proses pengembangannya sangat lambat lantaran biaya pemeliharaannya juga mahal. Belum lagi mendatangkan mediumnya untuk menyimpan dan membiakkan sel-sel induk itu. Sehingga diperlukan waktu dan biaya untuk pengembangannya. Terlepas dari soal biaya, pengembangan teknologi sel induk tergolong sulit dan rumit. Prosesnya, darah diendapkan untuk memisahkan sel darah dengan sel induk. Kemudian sel induk dibiakkan dalam medium yang diberi zat pengawet dan disimpan dalam tabung berisi nitrogen cair untuk mencapai minus 196oC. Kesulitannya terutama memisahkan sel induk dari campuran berbagai sel. Begitu juga memelihara sel induk hingga bisa membiakkan diri dan mengalami diferensiasi sesuai tujuan sang peneliti. Itulah yang dihadapi saat menumbuhkan sel induk menjadi sel bagi jaringan tertentu, hingga jaringan tersebut kembali sehat dan menempuh hidup baru.Faktor lainnya adalah lingkungan biokimia dalam media biakan tentu tak persis sama dengan lingkungan dalam tubuh pasien. Artinya, sel induk hasil biakan bisa saja tak mampu tumbuh terdiferensiasi seperti yang diharapkan setelah disuntikkan ke tubuh pasien. 6.6



Bioetika dan kontraversi pada penggunaan sel induk (Stem Cells) 137



Berkembangnya penelitian stem cell dan penggunaan stem cell dalam upaya untuk mengobati penyakit pada manusia akan mengakibatkan timbulnya masalah dalam hal etik. Hal utama terkait dengan masalah etik adalah sumber stem cell tersebut. Berbagai masalah etika yang perlu dipikirkan adalah: 1.



Apakah penelitian embrio manusia secara moral dapat dipertanggung jawabkan?



2.



Apakah penelitian embrio yang menyebabkan kematian embrio merupakan pelanggaran terhadap hak azasi manusia (HAM) dan berkurangnya penghormatan terhadap mahluk hidup?



3.



Apakah penyalahgunaan dapat diketahui dan dikendalikan?



4.



Apakah penggunaan embrio sisa proses bayi tabung pada penelitian diperbolehkan?



5.



Apakah penelitian khusus membuat embrio untuk digunakanpada berbagai bidang kehidupan diperbolehkan? Isu bioetika utama dalam penelitian dan penggunaan stem cell adalah penggunaan



stem cell embrio terutama tentang sumber sel tersebut yaitu embrio. Sumber embrio dapat berasal dari hasil abortus, zigot sisa in vitro vertilisasi (IVF), dan hasil pengklonan. Pengklonan embrio manusia untuk memperoleh stem cell merupakan isu yang sangat menimbulkan kontroversi. Hal ini terkait dengan isu ”awal kehidupan” dan penghormatan terhadap kehidupan itu sendiri. Pengklonan embrio manusia untuk memperoleh stem cell menimbulkan kontroversi karena berhubungan dengan pengklonan manusia yang ditentang oleh semua agama. Dalam proses pemanenan stem cell embrio terjadi kerusakan pada embrio dan menyebabkan embrio tersebut mati. Adanya anggapan bahwa embrio berstatus sama dengan manusia menyebabkan hal tersebut tidak dapat diterima oleh umat beragama. Perdebatan yang cukup ramai adalah mengenai status moral embrio, apakah embrio harus diperlakukan sebagai manusia atau sebagai sesuatu yang berpotensi untuk menjadi manusia atau sebagai jaringan hidup tubuh lainnya. Lebih jauh lagi apakah embrio yang berkembang dianggap sebagai mahluk hidup. Penggunaan stem cell yang berasal dari surplus zigot pembuatan bayi tabung sendiri, juga menimbulkan kontroversi. Pendapat yang moderat mengatakan ketimbang surplus zigot itu dibuang, sebaiknya dipakai saja untuk penelitian. Sebaliknya ada juga yang berpendapat bahwa sisa itu harus dipelihara hingga zigot itu mati. Bagaimanapun stem Cell merupakan salah satu solusi masa depan bagi kehidupan manusia, khususnya dibidang kesehatan. 138



6.7



Ringkasan Sel induk dapat berfungsi sebagai sumber bagi banyak sel yang lebih banyak



terdiferensiasi. Sel induk dewasa telah diisolasi dari berbagai jaringan tubuh manusia dan bertujuan menyediakan mekanisme pemulihan dan pengobatan bagi organ spesifik pada tubuh manusia. Sel induk dewasa telah banyak digunakan secara klinis dalam transplatasi sumsum tulang belakang dan untuk membantu pembentukan organ kulit. Sel induk embrionik manusia dapat berdiferensiasi menjadi banyak sel yang dapat memotong beberapa tipe jaringan. Sel ini berasal dari embrio yang terbentuk selama proses IVF. Keturunan mereka dapat menghasilkan proses penghancuran embrio. Sel induk embrionik manusia memiliki potensi terapeutik yang sangat baik pada hewan percobaan. Para peneliti telah banyak melaporkan bahwa cedera tulang punggung, penyakit Parkinson, dan diabetes melitus dapat diterapi dan memberikan respon yang baik dengan terapi sel induk embrionik. Transfer inti sel somatik merupakan suatu serangkaian proses dimana ketika inti sel embrionik diganti dengan inti sel somatik. Sel embrionik kemudian berubah menjadi sebuah klon dari sel somatik dan membentuk sel induk embrionik. Proses tersebut adalah teknik yang digunakan untuk mengklon hewan yang berpotensi untuk memproduksisel induk embrionik identik secara genetik dengan individu yang mungkin dapat memberikan manfaat dari pemakaian terapeutik sel-sel tersebut. Kemajuan pesat pada bidang penelitian sel induk telah mengarah pada perkiraan mengenai masa depan ilmu kedokteran pada manusia. Potensi utamanya adalah pemahaman mengenai fenomena sel dasar seperti kontrol diferensiasi sel. Berdasarkan pengetahuan dasar ini, diduga akan muncul jenis terapi yang lebih revolusioner yang akan sangat menarik bagi publik. Beberapa



hasil



terapi



yang



cukup



menjanjikan,



seperti



potensi



untuk



menyembuhkan cedera tulang belakang atau penyakit Parkinson. Pada tikus percobaan, sel induk otak yang diinjeksikan ke dalam rongga kranial dapat berdiferensiasi dan melakukan fungsinya sepanjang sel neuron yang ada. Hal ini memberikan indikasi bahwa hewan yang diobati mengalami peningkatan fungsi otak. Dengan cara yang sama tikus yang diinjeksi dengan sel otot dapat tumbuh lebih besar dan lebih kuat serta lincah dibandingkan kelompok lainnya yang tidak mengalami perlakuan tersebut.



139



Contoh Soal: 1. Perbedaan sel induk dengan jenis sel lainnya adalah sebagai berikut: A. Tidak memiliki struktur anti gen pada permukaan selnya B. Mampu membelah tanpa batas meskipun tidak berdiferensiasi C. Hanya memiliki separuh komplemen kromosom (haploid) D. Jika diinduksi untuk membelah akan membetuk organisme utuh E. Jawaban a, b, dan d benar. 2. Hal yang dilakukan untuk menghasilkan kultur sel induk embrionik adalah: A. Satu sel telur terfertilisasi B. Sebuah donor sel somatik C. Media yang sesuai untuk pertumbuhan sel D. Telur terfertilisasi dalam jumlah yang banyak E. Jawaban a, b, dan d benar. 3. Kontroversi penggunaan sel induk mungkin karena disebabkan oleh hal berikut: A. Sel embrio harus dihancurkan untuk membuatnya B. Berpotensi untuk kloning manusia C. Berpotensi untuk disalahgunakan D. Dapat digunakan pada terapi penyakit genetik E. Jawaban a, b, dan c benar. 4. Sel induk telah berhasil digunakan secara klinis pada kasus berikut: A. Pengobatan kanker sel darah B. Pengobatan penyakit kardiovaskular C. Pengobatan cedera tulang belakang D. Pengobatan penyakit Parkinson E. Semua jawaban benar. 5. Berdasarkan sumbernya sel induk dibagi menjadi beberapa sumber sebagai berikut: A. Sel fetus B. Sel darah tali pusat C. Sel sumsum tulang belakang D. Sel embrionik E. Semua jawaban benar



140



DAFTAR PUSTAKA 1.



The Stem cells-stem cell information the official National Institute of Health Resource for Stem cell Research



2.



Anatomy



101:



Stem



Cells-Reeeve



Irvine



Research



Center-



http://www.reeve.uci.edu/anatomy /stemcells.php di download tgl 2 Desember 2009 3.



Stem Cells-Wikipdia- http://en.wikipedia.org/wiki/stem cell di download tgl 2 Desember 2009



4.



Stem Cells for Cell Based Therapies, Lauren Pecorino- American Institute of Biological Science



5.



Dasar-Dasar



Stem



Cell



dan



Potensi



Aplikasinya



dalam



Ilmu



Kedokteraninfotekmedical.blogspot.com/ di download tgl 2 Desember 2009 6.



Boenjamin Setiawan, Aplikasi terapeutik sel stem embrionik pada berbagai penyakit degeneratif, PT Kalbe Farma, 2007.



7.



Djati, M. S. , 2003. Diskursus Teknologi Embryonic Cells dan Kloning Dari Dimensi Bioetika dan Religiositas. Jurnal Universitas Paramadina.Vol 3 No.1: 102-123.



141



Senarai IstilahdanArtinya Istilah



Arti



Sel induk (sel Punca)



Sel embrio manusia menjadi sel awal yang tumbuh menjadi berbagai organ manusia yang belum terspesialisasi dan mampu berdeferensiasi menjadi berbagai sel matang dan mampu meregenerasi diri sendiri.



Totipotent



Sel induk yang dapat berdifferensiasi menjadi semua jenis sel.



Multipotent



Sel induk yang dapat berdifferensiasi menjadi banyak jenis sel misalnya hemopoetic stem cells yang terdapat pada sumsum tulang yang mempunyai kemampuan untuk berdifferensiasi menjadi berbagai jenis sel yang terdapat dalam darah seperti eritrosit, lekosit, dan trombosit.



Unipotent



Sel induk yang hanya dapat menghasilkan satu jenis sel saja.



Immortal



Sel yang dapat berumur panjang sehingga dapat memperbanyak diri ratusan kali pada media kultur spesifik.



Zigot



Sel telur (ovum) yang telah difertilisasi atau dibuahi oleh sel sperma.



Embryonic stem cells



Sel-sel stem yang diperoleh dari innert cell mass dari suatu blastocyst (embrio yang terdiri atas 50-150 sel, kirakira hari ke-5 pasca pembuahan).



Differensiasi



Kemampuan suatu sel untuk berkembang menjadi sel lain.



Regenerasi



Kemampuan suatu sel untuk memperbaharui atau meregenerasi dirinya sendiri.



Fibroblast



Sel yang mensintesis matriks ekstraseluler, kolagen, dan kerangka struktural (stroma) jaringanmanusia.



142



143



BAB 7 PENGGUNAAN ANTIBODI MONOKLONAL PADA BIDANG KESEHATAN 7.1



Pendahuluan



Pada bagian ini yang akan menjadi sasaran pembelajaran adalah (1) menjelaskan sistem kekebalan tubuh antibody, (2) menjelaskan produksi antibodi monoclonal, dan (3) menjelaskan mekanisme kerja antibodi monoclonal.Dalam dekade terakhir, pengobatan kanker memasuki era baru yang disebut target terapi (targeted therapy). Pencapaian inilah jawaban selama lebih dari ratusan tahun penelitian tentang diagnosis dan terapi kanker. Berbicara target terapi, berarti berbicara sisi lain sel kanker. Perbedaan spesifik antara sel kanker dan sel normal, menjadi bekal bagi para ilmuwan untuk menciptakan sebuah “peluru jitu” yang akan menyerang sel-sel kanker tanpa merusak sel-sel normal, sehingga meminimalkan efek samping. Agen pintar ini memiliki berbagai tipe dengan cara kerja berbeda. Tetapi semuanya berperan ikut campur atau merusak proses pertumbuhan dan pembelahan sel kanker serta dalam upaya sel kanker memperbaiki diri atau berkomunikasi dengan sel lain. Perbedaan tipe target terapi ditentukan dalam tiga kategori. Beberapa target terapi menitikberatkan pada komponen internal sel kanker. Terapi ini menggunakan molekul kecil yang bisa masuk ke dalam sel dan memporak-porandakan fungsi dalam sel dan pada akhirnya akan membunuh sel tersebut. Ada lagi target terapi yang fokus dengan target reseptor yang ada di permukaan sel, dikenal sebagai antibodi monoklonal. Sedangkan jenis target terapi yang lain adalah penggunaan obat-obat anti-angiogenesis, dengan sasaran “mematikan” pembuluh darah yang menyuplai oksigen ke sel kanker sebagai sumber kehidupan sel. Teknologi antibodi monoklonal yaitu teknologi menggunakan sel-sel sistem imunitas yang membuat protein yang disebut antibodi. Sistem kekebalan kita tersusun dari sejumlah tipe sel yang bekerja sama untuk melokalisir dan menghancurkan substansi yang dapat memasuki tubuh kita. Tipa tipe sel mempunyai tugas khusus. Beberapa dari sel tersebut dapat membedakan dari sel tubuh sendiri (self) dan sel-sel asing (non self). Salah satu dari sel tersebut adalah sel limfosit B yang mampu menanggapi masuknya substansi asing denngan spesivitas yang luar biasa. Antibodi monoklonal adalah antibodi monospesifik yang dapat mengikat satu epitop saja. Antibodi monoklonal ini dapat dihasilkan dengan teknik hibridoma. Dengan kata lain, antibodi monoklonal adalah zat yang diproduksi oleh sel gabungan tipe tunggal yang



143



memiliki kekhususan tambahan. Ini adalah komponen penting dari sistem kekebalan tubuh. Mereka dapat mengenali dan mengikat ke antigen yang spesifik. Hasil penggabungan sel iniadalah hibridoma, yang akan terus memproduksi antibodi. Antibodi monoklonal mengenalisetiap determinan yang antigen (bagian dari makromolekul yang dikenali oleh sistem kekebalan tubuh/epitope). Mereka menyerang molekul targetnya dan mereka bisa memilahantara epitope yang sama. Selain sangat spesifik, mereka memberikan landasan untuk perlindungan melawan patogen. Antibodi monoklonal sekarang telah digunakan untuk banyak masalah diagnostik seperti: mengidentifikasi agen infeksi, mengidentifikasi tumor, antigen dan antibodi auto, mengukur



protein



dan



level



drug



pada



serum,



mengenali



darah



danjaringan,



mengidentifikasi sel spesifik yang terlibat dalam respon kekebalan dan mengidentifikasi serta mengkuantifikasi hormon. 7.2



Sistem Kekebalan Tubuh Antibodi Antibodi merupakan senjata yang tersusun dari protein dan dibentuk untuk melawan



sel-sel asing yang masuk ke tubuh manusia. Senjata ini diproduksi oleh sel-sel B, sekelompok prajurit pejuang dalam sistem kekebalan. Antibodi akan menghancurkan musuh-musuh penyerbu. Antibodi mempunyai dua fungsi, pertama untuk mengikatkan diri kepada sel-sel musuh, yaitu antigen. Fungsi kedua adalah membusukkan struktur biologi antigen tersebut lalu menghancurkannya. Berada dalam aliran darah dan cairan non-seluler, antibodi mengikatkan diri kepada bakteri dan virus penyebab penyakit. Mereka menandai molekul-molekul asing tempat mereka mengikatkan diri. Dengan demikian sel prajurit tubuh dapat membedakan sekaligus melumpuhkannya Antibodi bersesuaian dengan musuhnya (antigen) secara sempurna, seperti anak kunci dengan lubangnya yang dipasang dalam struktur tiga dimensi. Tubuh manusia mampu memproduksi masing-masing antibodi yang cocok untuk hampir setiap musuh yang dihadapinya. Antibodi bukan berjenis tunggal. Sesuai dengan struktur setiap musuh, maka tubuh menciptakan antibodi khusus yang cukup kuat untuk menghadapi si musuh. Hal ini karena antibodi yang dihasilkan untuk suatu penyakit belum tentu mangkus bagi penyakit lainnya. Membuat antibodi spesifik untuk masing-masing musuh merupakan proses yang luar biasa, dan pantas dicermati. Proses ini dapat terwujud hanya jika sel-sel B mengenal struktur musuhnya dengan baik. Dan, kenyataannya di alam ini terdapat jutaan musuh (antigen).



144



7.2.1 Struktur Antibodi Sebelumnya telah dikatakan bahwa antibodi termasuk protein. Jadi, pertama-tama mari kita pelajari struktur protein tersebut. Protein tersusun dari asam amino. Dua puluh jenis asam amino ber-beda disusun dalam urutan yang berbeda untuk membentuk protein-protein yang berlainan, umpama membuat pelbagai kalung menggunakan manik-manik dengan dua puluh warna berbeda. Perbedaan utama antara protein-protein tersebut adalah urutan asam aminonya. Perlu diingat, setiap kesalahan dalam urutan asam amino akibat dari proses mutasi gen menjadikan protein tidak berguna, dan bahkan berbahaya bagi sel hidup. Karena itu, tidak boleh ada kesalahan sekecil apa pun dalam urutannya. Jadi, bagaimana penghasil protein dalam sel dapat mengetahui bagaimana urutan asam amino yang menyusun mereka, dan protein apa yang akan dihasilkan, Instruksi untuk setiap protein dengan ribuan tipe yang berbeda dilakukan oleh gen yang ditemukan di bank data genetik pada inti sel. Dengan demikian, gen-gen ini dibutuhkan untuk memproduksi antibodi. Ada suatu keajaiban penting disini. Di dalam tubuh manusia hanya ada seratus ribu gen, padahal antibodi yang dihasilkan 1.920.000. Artinya, sekitar sembilan ratus ribu gen hilang.



Gambar 7.1. Struktur kompleks antibodi



Sumber: http://www.britannica.com/EBchecked/media/17658/The-four-chain-structure-ofan-antibody-or-immunoglobulin-molecule Gambar 7.1 menunjukkan struktur dasar antibodi, dimanatempat melekat atau terikatnya antigen (warna orange) terdapat pada bagian bervariasi di ujung amino dan bagian malar terdapat pada hujung karboksi (biru). Domain yang dirangkumi ikatan disulfida ditunjukkan



145



sebagai gelang dan bagian engsel berwarna merah. Unit dasar terdiri dari dua rantai lampu identik (L) dan dua rantai identik berat (H), yang berikatan bersama oleh ikatan disulfida untuk membentuk bentuk Y fleksibel.Setiap rantai terdiri dari wilayah variabel (V) dan wilayah konstanta (C). Lalu bagaimana mungkin sekelompok kecil gen mampu memproduksi antibodi sebanyak sepuluh kali lipat dari jumlahnya? Di sinilah keajaiban itu tersingkapkan. Sel menggabungkan seratus ribu gen yang dikandungnya itu dengan kombinasi berbeda untuk membentuk suatu antibodi baru. Sel tersebut menerima informasi dari beberapa gen dan menggabungkannya dengan informasi gen lain dan membuat produksi yang diinginkan berdasarkan kombinasi informasi tersebut. Jika kita mendesain suatu molekul antibodi, bagaimana cara kita melakukannya? Pertama-tama, kita harus mengadakan penelitian menyeluruh sebelum menentukan bentuk molekul tersebut. Tentu Anda tidak dapat membentuknya secara acak tanpa tahu pasti tugas si molekul. Karena antibodi yang ingin diproduksi akan berkontak dengan antigen, Kita juga harus sangat menguasai struktur dan spesifikasi antigen tersebut. Terakhir, antibodi yang dihasilkan harus memiliki pola khusus dan unik pada salah satu ujungnya. Hanya dengan demikian ia dapat mengikatkan diri dengan antigen. Ujung yang lainnya harus serupa dengan antibodi lainnya. Inilah satu-satunya cara untuk menonaktifkan antigen perusak. Kesimpulannya, satu ujung bersifat standar, sedangkan ujung yang lainnya harus berbeda dengan lainnya (ada lebih dari satu juta tipe yang berbeda). Bagaimanapun juga, manusia tidak dapat menciptakan suatu antibodi, apa pun teknologi yang ada di hadapan mereka. Antibodi yang dihasilkan dari laboratorium tetap diperoleh dari contoh antibodi yang diambil dari tubuh manusia, atau dari tubuh makhluk hidup lainnya. 7.2.2 Pengelompokan Antibodi Sebelumnya telah kita sebutkan bahwa antibodi adalah sejenis protein. Proteinprotein yang berfungsi untuk melindungi tubuh lewat proses kekebalan ini dinamakan “imunoglobulin”, disingkat “Ig”. Protein paling khas pada sistem pertahanan, molekul imunoglobulin mengikatkan diri pada antigen untuk menginformasikan kepada sel-sel kekebalan lainnya tentang keberadaan antigen tersebut atau untuk memulai reaksi berantai perang penghancuran. Jika dirangsang oleh suatu antigen, limfosit B akan mengalami pematangan menjadi sel-sel yang menghasilkan antibodi. Antibodi merupakan protein yang bereaksi



146



dengan antigen yang sebelumnya merangsang limfosit B. Antibodi juga disebut Immunoglobulin. setiap molekul antibodi memiliki suatu bagian yang unik, yang terikat kepada suatu antigen khusus dan suatu bagian yang strukturnya menerangkan kelompok antibodi. Molekul imunoglobulin mempunyai struktur dasar yang terdiri dari 2 rantai ringan atau rantai L (light chain) yang sama besar dan 2 rantai berat atau rantai H (heavy chain) yang sama besar. Rantai-rantai ini digabungkan oleh ikatan-ikatan disulfida (disulfide bonds). Pada ujung amino terdapat 2 tempat penggabungan antigen (antigen binding site) pada setiap molekul imunoglobulin, kedua-duanya mempunyai kespesifikan dan akan bergabung dengan epitop yang serupa. Terdapat 2 jenis rantai L yaitu, kappa () dan lambda (). Terdapat 5 kelas utama antibodi yakniIgM, IgG, IgA, IgE dan IgD dengan rantai berat masing-masing (dan). Imunoglobulin G (IgG) IgG merupakan antibodi yang paling umum. Dihasilkan hanya dalam waktu beberapa hari, ia memiliki masa hidup berkisar antara beberapa minggu sampai beberapa tahun. IgG beredar dalam tubuh dan banyak terdapat pada darah, sistem getah bening, dan usus. Molekul IgG mengikuti aliran darah, langsung menuju musuh dan menghambatnya begitu terdeteksi. Mereka mempunyai efek kuat anti-bakteri dan penghancur antigen. Mereka melindungi tubuh terhadap bakteri dan virus, serta menetralkan asam yang terkandung dalam racun. Molekul IgG terdiri dari 2 rantai H jenis g dan 2 rantai L (k atau l) yang digabungkan oleh ikatan disulfida. Berat molekulnya lebih kurang 150 kDa dengan pengenapan 7S. Dalam manusia terdapat 4 subkelas IgG yaitu IgG1, IgG2, IgG3 dan IgG4 (Gambar 7.1). Semua imunoglobulin dalam suatu kelas (contoh: IgG1 dan IgG2) mempunyai lebih kurang 90% homologi asam amino, tetapi hanya lebih kurang 60% homologi antara imunoglobulin berlainan kelas (contoh: IgG dan IgA). Subkelas antibodi mempunyai perbedaan aktivitas kimia dan aktivitas biologi. Selain itu, IgG mampu menyelip di antara sel-sel dan menyingkirkan bakteri serta musuh mikroorganis yang masuk ke dalam sel-sel dan kulit. Karena kemampuannya serta ukurannya yang kecil, mereka dapat masuk ke dalam plasenta ibu hamil dan melindungi janin dari kemungkinan infeksi. Jika antibodi tidak diciptakan dengan karakteristik yang memung-kinkan mereka untuk masuk ke dalam plasenta, maka janin dalam rahim tidak akan terlindungi melawan mikroba. Hal ini dapat menyebabkan kematian sebelum lahir. Karena itu, antibodi sang ibu akan melindungi embrio dari musuh sampai anak itu lahir.



147



IgG juga merupakan antibodi yang bertindak sebagai antibodi, yang memudahkan proses fagositosis. Ia bergabung dengan antigen melalui bahagian Fab dan bahagian Fc menunjukkan ciri opsonin karena permukaan fagosit seperti makrofag dan sel polimorfonukleus mempunyai reseptor untuk bagian Fc IgG. Antigen yang diselaputi IgG akan bergabung kepada reseptor tersebut dan difagositosis.



Gambar 7.2.Proses fagositosis partikel yang dibungkusi antibody. Bahagian Fc molekul antibodi bergabung dengan reseptor Fc pada fagosit. Molekul IgG boleh mengaktifkan pelengkap. Pengaktifan pelengkap membebaskan beberapa bahan aktif dan boleh menyebabkan lisis jika antibodi itu tergabung kepada antigen pada permukaan sel. Setengah komponen pelengkap adalah opsonin dan sesetengah yang lain adalah kemotaktik (menarik fagosit). IgG juga sangat berkesan meneutralkan toksin seperti tetanus dan botulinus, serta menyahaktifkan racun ular (venom) melalui pergabungannya kepada tapak aktif toksin. Ini menjadikan IgG amat sesuai untuk pengimunan pasif terhadap toksin dan venom. IgG amat berkesan menghentikan pergerakan bakteria motil melalui tindak balasnya dengan antigen pada flagela dan silia mikroorganisma. Selain itu IgG juga efisien meneutralkan virus melalui pergabungannya kepada antigen permukaan virus yang terlibat dengan pergabungan virus kepada reseptor pada permukaan sel sasaran. Imunoglobulin M (IgM) Antibodi ini terdapat pada darah, getah bening, dan pada permukaan sel B. Pada saat organisme tubuh manusia bertemu dengan antigen, IgM merupakan antibodi pertama yang dihasilkan tubuh untuk melawan musuh.Berat molekulnya lebih kurang 900 kDa dengan pekali pengenapan 19S. Rantai Hnya mempunyai satu domain CH lebih berbanding IgG. IgM adalah molekul pentamer yaitu ia terdiri dari 5 unit imunoglobulin yang setiap satu terdiri dari 2 rantai L dan 2 rantai H (m). Semua unit-unit ini digabungkan oleh ikatan dwisulfida pada bahagian Fc, dan satu polipeptid yang dipanggil rantai J. Rantai J disintesis oleh sel plasma dan mempunyai berat molekul 15 kDa. Janin dalam rahim mampu memproduksi IgM pada umur kehamilan enam bulan. Jika musuh menyerang janin, jika



148



janin terinfeksi kuman penyakit, produksi IgM janin akan meningkat. Untuk mengetahui apakah janin telah terinfeksi atau tidak, dapat diketahui dari kadar IgM dalam darah. Imunoglobulin A (IgA) Antibodi ini terdapat pada daerah peka tempat tubuh melawan antigen seperti air mata, air liur, ASI, darah, kantong-kantong udara, lendir, getah lambung, dan sekresi usus. Kepekaan daerah tersebut berhubungan langsung dengan kecenderungan bakteri dan virus yang lebih menyukai media lembap seperti itu. Molekul IgA terdiri dari 2 rantai L dan 2 rantai H jenis α. Berat molekul IgA monomer ialah lebih kurang 160 kDa dengan pekali pengenapan 7S IgA dimer berberat molekul 400 kDa. IgA terdiri dari 2 subkelas, IgA1 dan IgA2. Secara keseluruhan IgA merupakan antibodi yang paling banyak dalam tubuh. Secara struktur, IgA mirip satu sama lain. Mereka mendiami bagian tubuh yang paling mungkin dimasuki mikroba. Mereka menjaga daerah itu dalam pengawasannya layaknya tentara andal yang ditempatkan untuk melindungi daerah kritis.Antibodi ini melindungi janin dari berbagai penyakit pada saat dalam kandungan. Setelah kelahiran, mereka tidak akan meninggalkan sang bayi, melainkan tetap melindunginya.



Gambar 7.3.Proses sintesis dan sekresi IgA dimer oleh sel plasma menuju sel epitel pada ASI untuk melindungi sel tubuh bayi dari infeksi virus dan bakteri. Setiap bayi yang baru lahir membutuhkan pertolongan ibunya, karena IgA tidak terdapat dalam organisme bayi yang baru lahir. Selama periode ini, IgA yang terdapat dalam ASI akan melindungi sistem pencernaan bayi terhadap mikroba. Seperti IgG, jenis antibodi ini juga akan hilang setelah mereka melaksanakan semua tugasnya, pada saat bayi telah berumur beberapa minggu.Gambar 7.3 menunjukkan sintesis dan sekresi IgA dimer oleh sel plasma. IgA kemudian bergabung dengan reseptor poli-Ig yang mengangkut IgA melalui sel epitelium. Reseptor ini dipotong oleh enzim dan membentuk komponen dimer. Imunoglobulin D (IgD)



149



IgD juga terdapat dalam darah, getah bening, dan pada permukaan sel B. Mereka tidak mampu untuk bertindak sendiri-sendiri. Dengan menempelkan dirinya pada permukaan sel-sel T, mereka membantu sel T menangkap antigen. Molekul IgD terdiri dari 2 rantai L dan 2 rantai H jenis d dan wujud sebagai monomer dengan berat molekul 180 kDa. Kepekatannya dalam serum amat rendah mungkin kerana ia tidak diperoleh dari sel plasma serta amat rentan terhadap aktivitas enzim proteolisis. IgD diekspresi bersama IgM pada permukaan sel B matang dan berfungsi sebagai reseptor sel B. Imunoglobulin E (IgE) IgE merupakan antibodi yang beredar dalam aliran darah. Antibodi ini bertanggung jawab untuk memanggil para prajurit tempur dan sel darah lainnya untuk berperang. Antibodi ini kadang juga menimbulkan reaksi alergi pada tubuh. Karena itu, kadar IgE tinggi pada tubuh orang yang sedang mengalami alergi. IgE terdiri dari 2 rantai L dan 2 rantai h jenis e. Seperti IgM rantai H IgE mempunyai satu domain CH lebih.



Gambar 7.4.Struktur 5 jenis antibodi menunjukkan rantai L (hijau), H (biru), domain dan ikatan disulfida. Warna orange menunjukkan tanda glikosilasi. IgM dan IgA polimer mengandungi rantai J. IgA dimer mempunyai komponen rembesan (merah). Domain ini membolehkan IgE bergabung dengan afinitas tinggi kepada reseptor (reseptor Fce) pada permukaan sel mast dan basofil. Apabila antigen bergabung dengan IgE yang sedia tergabung pada permukaan sel mast atau basofil, ia akan mengaruh pembebasan bahan aktif yang terlibat dalam gerak balas alergi. IgE dikenali sebagai antibodi reaginik. Kepekatannya dalam serum adalah paling rendah. Berat molekulnya ialah 200 kDa dengan pekali pengenapan 8S. Waktu paruhnyadalam serum selama 2 hari. IgE



150



tidak mengaglutinat atau mengaktifkan pelengkap tetapi berperanan dalam perlindungan terhadap parasit seperti helmin. Tabel 7.1. Ringkasan ciri-ciri immunoglobulin



Kelas



Berat molekul (kDa)



Kepekatan (mg/mL)



Jumlah total (%)



Waktu paruh (hari)



Pengaktifan pelengkap



Komponen tambahan



IgG



150



12



80



23



++



-



IgA



160 (monomer); 400 (rembesan)



1,8



13



5,5



-



Rantai J dan komponen S



IgM



900 (pentamer)



1



6



5



+++



Rantai J



IgD



180



0-0,04



0.2



2,8



-



-



IgE



200



0,0002



0.002



2



-



-



Adapun karakteristik dan mekanisme kerja antibodi pada sel tubuh manusia adalah sebagai berikut: 1.



Antibodi akan mengunci antigen yang memasuki tubuh.



2.



Dihasilkan antibodi berbeda untuk masing-masing musuh.



3.



Sel mampu menghasilkan ribuan antibodi berbeda untuk ribuan antigen berlainan.



4.



Produksi ini dimulai langsung pada saat musuh memasuki tubuh dan teridentifikasi.



5.



Terdapat kesesuaian antara antigen dengan antibodi tiga dimensi, yang dihasilkan khusus untuk antigen itu, persis seperti anak kunci cocok dengan lubangnya.



6.



Sel, jika dibutuhkan, dengan sengaja menyusun informasi yang dimilikinya dan menghasilkan antibodi-antibodi yang berbeda.



7.



Sembari melakukan hal itu, sel memperlihatkan kearifan dan perencanaan yang jauh melampaui batas pemahaman akal manusia.



8.



Antibodi tertentu, yang terdapat khusus dalam ASI, memenuhi kebutuhan antibodi bayi yang belum mampu untuk memproduksi antibodi ini sendiri.



9.



Lambung bayi tidak akan mencerna antibodi, melainkan melewatkannya agar dapat melindungi tubuh bayi. Di sini kita lihat sistem yang bekerja sempurna. Dalam sel-sel yang memproduksi



antibodi, Allah menempatkan informasi yang berisikan rancangan konstruksi antibodi. Kesemua informasi itu dapat mengisi penuh ribuan halaman ensiklopedi. Lebih jauh, Allah mengaruniai sel-sel itu kemampuan untuk membuat kombinasi yang melampaui pemikiran manusia.



151



Pada awalnya sistem pertahanan tubuh terdiri dari satu gen yang memproduksi satu tipe imunoglobulin (semacam protein). Akan tetapi gen ini dengan cepat memperbanyak dirinya sendiri dan mengembangkan kembarannya ini sehingga membentuk molekul imunoglobulin yang berbeda. Kemudian dikembangkan mekanisme kontrol yang akan mengawasi pembentukan gen-gen berbeda yang memiliki kemampuan untuk kombinasi ulang. Evolusionis mencoba memperlihatkan tahap ini sebagai sesuatu yang tak berarti dan mengelakkannya. Tetapi, bagaimana gen awal ini bermula harus dijelaskan. Secara ilmiah mustahil suatu gen membentuk dirinya sendiri. Antibodi saja tidak cukup untuk melindungi tubuh manusia. Agar sistem kekebalan berfungsi, dan agar tubuh manusia dapat bertahan hidup, diperlukan kerja sama antara makrofag, sel T penolong, sel T pembunuh, sel-sel T penekan, sel pengingat, sel B, dan banyak faktor lain.



Gambar 7.5. Penggandaan molekul antibodi dalam sel tubuh Satu sel B menggandakan antibodi spesifiknya dan mencantolkannya ke permukaan luar membran selnya. Antibodi memanjang keluar seperti jarum, aerial yang sudah menyesuaikan diri menunggu berkontak dengan sekeping protein tertentu yang bisa mereka kenali. Antibodi tersebut terdiri dari dua rantai ringan dan dua rantai berat asam amino yang bersambungan dalam bentuk Y. Bagian tetap dari rantai itu sama pada berbagai jenis antibodi. Tetapi bagian bergerak ujung lengan masing-masing mempunyai rongga berbentuk unik yang tepat sesuai dengan bentuk bagian protein yang “dipilih” antibodi.



152



Setelah digandakan sampai jutaan, sebagian besar sel B berhenti membelah dan menjadi sel plasma, jenis sel yang bagian dalamnya berisi alat untuk membuat satu produk antibodi. Sebagian sel B lain membelah terus tak berhingga, dan menjadi sel memori. Antibodi bebas yang dibuat oleh sel plasma berkeliling di darah dan cairan limpa. Ketika antibodi mengikatkan diri pada antigen sasarannya, bentuknya berubah. Perubahan bentuk inilah yang membuat antibodi “menempel” di bagian luar makrofag.



7.3 Antibodi Monoklonal 7.3.1 Sejarah Antibodi Monoklonal Pada tahun 1908, Metchnikoff dan Erlich mengemukakan mengenai teori imunologi yang membawa perubahan besar pada pemanfaatan antibodi untuk mendeteksi adanya antigen (zat asing) di dalam tubuh. Sebelum ditemukannya teknologi antibodi monoklonal, antibodi dahulunya diperoleh dengan cara konvensional yakni mengimunisasi hewan percobaan, mengambil darahnya dan mengisolasi antibodi dalam serum sehingga menghasilkan antibodi poliklonal. Apabila dibutuhkan antibodi dalam jumlah besar maka binatang percobaan yang dibutuhkan juga sangat besar jumlahnya. Selain itu bila diproduksi dalam jumlah besar antibodi poliklonal jumlah antibodi spesifik yang diproduksi juga sangat sedikit, sangat heterogen dan sangat sulit menghilangkan antibodi lain yang tidak diinginkan (Radji M. 2010). Maka dari itu dilakukan serangkaian penelitian untuk membuat antibodi spesifik secara in vitro, sehingga dapat diproduksi antibodi spesifik dalam jumlah besar, dan tidak terkontaminasi dengan antibodi lainnya.Tahun 1975, Georges Köhler, César Milstein, and Niels Kaj Jerne menemukan cara baru dalam membuat antibodi dengan mengimunisasi hewan percobaan, kemudian sel limfositnya difusikan dengan sel mieloma, sehingga sel hibrid dapat dibiakkan terus menerus. Sel mieloma adalah sel limfosit B yang abnormal yang mampu bereplikasi terus-menerus dan menghasilkan sebuah antibodi spesifik berupa para protein, sel mieloma disebut juga dengan sel B kanker. Mereka juga mampu membuat antibodi yang homogen yang diproduksi oleh satu klon sel hibrid. Antibodi tersebut lebih spesifik dibandingkan dengan antibodi poliklonalkarena dapat mengikat 1 epitop antigen dan dapat dibuat dalam jumlah yang tak terbatas.Definisi epitop sendiri adalah daerah spesifik pada antigen yang dapat dikenali oleh antibodi (Riechmann, 1992). Antibodi yang homogen dan spesifik ini disebut antibodi monoklonal. Berkat temuan antibodi monoklonaloleh Georges Köhler, César Milstein, and Niels Kaj Jerne mendapatkan hadiah nobel di bidang fisiologi dan kedokteran pada tahun 1985. Antibodi monoklonal



153



dibuat dengan cara penggabungan atau fusi dua jenis sel yaitu limfosit B yang memproduksi antibodi dengan sel kanker (sel mieloma) yang dapat hidup dan membelah terus menerus. Hasil fusi antara sel limfosit B dengan sel kanker secara in vitro ini disebut dengan hibridoma. Apabila sel hibridoma dibiakkan dalam kultur sel, sel yang secara genetik mempunyai sifat identik akan memproduksi antibodi sesuai dengan antibodi yang diproduksi oleh sel aslinya yaitu sel limfosit B. Hal yang penting untuk diperhatikan adalah proses pemilihan sel klon yang identik yang dapat mensekresi antibodi yang spesifik. Karena antibodi yang diproduksi berasal dari sel hibridoma tunggal (mono-klon), maka antibodi yang diproduksi disebut dengan antibodi monoklonal. Sel hibridoma mempunyai kemampuan untuk tumbuh secara tidak terbatas dalam kultur sel, sehingga mampu memproduksi antibodi homogen yang spesifik (monoklonal) dalam jumlah yang hampir tak terbatas. Antibodi monoklonal merupakan senyawa yang homogen, sangat spesifik dan dapat diperoleh dalam jumlah yang besar sehingga sangat menguntungkan jika digunakan sebagai alat diagnostik. Beberapa jenis kit antibodi monoklonal telah tersedia di pasaran untuk mendeteksi bakteri patogen dan virus, serta untuk uji kehamilan. 7.3.2 Hubungan HGPRT dengan Antibodi Monoklonal Pada dasarnya, sel memiliki dua jalur dalam sintesis nukleotida, yaitu jalur denovo dan jalur salvage. Sel di kultur jaringan dapat bertahan hidup dengan menggunakan kedua jalur tersebut. Akan tetapi, mutasi pada enzim untuk sintesis nukleotida mungkin terjadi dan sekarang menjadi suatu hal yang biasa terjadi dan bahkan sering dimanipulasi untuk menjadi target mutagenesis pada sel mamalia. Enzim yang umumnya menjadi target adalah



anzimhipoxantin-guanin



fosforibosil



transferase



(HGPRT).



Enzim



HGPRT



merupakan substansi yang penting dalam jalur salvage. Enzim ini mengkatalisis pembentukan nukleotida purin (precursor untuk sintesis DNA) dari ribosa dan hipoxantin serta guanine. Mutasi gen pada HGPRT bisa diseleksi dengan cara menumbuhkan sel pada media yang mengandung analog purin seperti 8-azoguanin. Enzim HGPRT akan menganggap 8-azoguanintersebut sebagai suatu substrat dan mengubahnya menjadi nukleotida monofosfat.8-AG yang mengandung nukleotida ini kemudian diproses lebih lanjut dan berikatan dengan DNA dan RNA, dimana hal ini merupakan suatu substitusi yang beracun. Sehingga, sel yang memiliki enzim HGPRT yang tumbuh pada media yang mengandung 8-AG akan mati.



154



Gambar 7.6. Siklus pembentukan nukleotida Bagaimanapun juga, karena enzim HGPRT adalah bagian dari jalur pembentukan nukleotida yang nonessensial (jalur de novo masih ada), sel yang memiliki gen mutan HGPRT dapat tetap tumbuh. Oleh karena itu, seleksi dengan menggunakan 8-AG akan membunuh sel yang memiliki HGPRT tetapi tidak akan berefek pada sel mutan HGPRT. Laju normal dari mutagenesis penting untuk menghilangkan sel dengan 8-AG dan sel yang tetap hidup adalah sel yang memiliki defisiensi HGPRT. Dalam hubungannya dengan antibodi monoklonal, sel myeloma yang nantinya akan difusikan dengan sel penghasil antibodi, tidak mensintesis atau mensekresikan rantai immunoglobulin serta HGPRT. Untuk menyeleksi hibridoma yang cocok, kita bisa menggunakan medium HAT. Obat-obatan seperti aminopterin akan memblok sintesis nukleotida jalur de novo karena aminopterin analog dengan koenzim (f-THFA) yang penting untuk sintesis purin lewat jalur de novo. Hal ini menyebabkan adanya pemblokan pada jalur de novo karena adanya kompetisi untuk ikatan enzim dengan f-THFA. Sehingga, sel akan dipaksa untuk menggunakan jalur salvage untuk mensintesis nukleotida purin. Namun, sel myeloma yang digunakan untuk pembentukan antibodi monoklonal ini sendiri memiliki defisiensi enzim HGPRT dan akan mati pada media yang mengandung aminopterin. Splenosit (kebanyakan limfosit) tidak bisa tumbuh pada medium HAT karena jangkahidupnya yang pendek yakni sekitar 1



155



minggu,sehingga, hanya hibridoma yang merupakan fusi sel dari sel myeloma dengan splenositlah yang bisa bertahan hidup pada medium HAT. Ini karena induk splenosit akan menyumbangkan enzim HGPRTnya dan sel myeloma memberikan kemampuan untuk bisa hidup dan berkembang terus. Dalam jangka waktu 7-10 hari, pada medium akan terdapat banyak sel-sel mati tetapi juga terdapat beberapa koloni sel hidup yakni koloni dari sel-sel hibridoma hasil fusi sel myeloma dengan sel B. Hibridoma yang terbentuk ini akan tumbuh terus secara in vitro dan mensekresikan antibodi monoklonal. Dalam hal ini, penting bagi kita untuk melakukan skrining awal, karena hybrid yang tidak menghasilkan antibodi akan tumbuh melebihi hybrid yang bisa menghasilkan antibodi. Untuk skrining ini, kita bisa memakai metode ELISA. Jadi, dengan kata lain, medium HAT ini bisa membantu kita untuk mengisolasi hibridoma yang sesuai yang bisa menghasilkan antibodi monoklonal.



Gambar 7.7. Proses seleksi antibodi monoklonal pada medium HAT



156



Gambar 7.8. Proses fusi sel myeloma dan sel B serta sel hibridoma terpilih 7.3.3 Pembuatan Antibodi Monoklonal Cara pembuatan antibodi monoklonal untuk menghasilkan antibodi yang homogen: 1.



Imunisasi mencit Antigen berupa protein atau polisakarida yang bersal dari bakteri atau virus, disuntikkan secara subkutan pada beberapa tempat atau secara intra peritoneal. Setelah 23 minggu disusul dengan suntikan antigen sekali atau beberapa kali suntikan. Mencit dengan kekebalan terbaik dipilih, 12 hari setelah suntikan terakhir, antibodi yang terbentuk pada mencit diperiksa dan diukur titer antibodinya, mencit dimatikan dan limpanya diambil secara aseptis, kemudian dibuat suspensi sel atau limpa untuk memisahkan sel B yang mengandung antibodi. Cara ini dia anggap cukup baik dan banyak sekali dipakai, walaupun kadangkala dipengaruhi oleh sifat antigen atau respon imun binatang yang berbeda-beda. Cara imunisasi yang lain juga sering dilakukan adalah imunisasi sekali suntik intralimpa. Pada cara imunisasi konvensional, antigen dipengaruhi bermacam-macam



157



faktor. Bila disuntikkan ke dalam darahsebagian besar akan dieliminasi secara alami, sedangkan melalui kulit akan tersaringoleh kelenjar limfe, makrofag, dan sel retikuler. Hanya sebagian kecil antigen yangterlibat dalam proses imun. Oleh sebab itu, untuk mencegah eliminasi antigen olehtubuh dilakukan suntikan imunisasi langsung pada limpa dan ternyata hasilnya lebihbaik dari cara konvensional. Menyuntik hewan laboratorium (mencit) dengan antigendan kemudian, setelah antibodi telah terbentuk, mengumpulkan antibodi dari serumdarah hewan tersebut (antibodi yang mengandung serum darah disebut antiserum). 2.



Fusi sel limpa kebal dan sel mieloma Pada kondisi biakan jaringan biasa, sel limpa yang membuat antibodi akan cepat mati, sedangkan sel mieloma yang dapat dibiakan terus menerus. Fusi sel dapat menciptakan sel hibrid yang terdiri-dari gabungan sel limpa yang dapat membuatantibodi dan sel mieloma yang dapat dibiakan terus-menerus, sehingga sel hibrid dapat memproduksi antibodi secara terus-menerus dalam jumlah yang tidak terbatas secara in vitro. Fusi sel diawali dengan fusi membran plasma sehingga menghasilkan sel besar dengan dua atau lebih inti sel, yang berasal dari kedua induk sel yang berbeda jenis yang disebut heterokarion. Pada waktu tumbuh dan membelah diri terbentuk satu inti yang nengandung kromosom kedua induk yang disebut sel hibrid. Frekuensi fusi dipengaruhi beberapa faktor antara lain jenis medium; perbandingan jumlah sel limpa dengan sel myeloma; jenis sel myeloma yang digunakan; dan bahan yang mendorong timbulnya fusi (fusogen). Penambahan polietilen glikol (PEG) dan dimetilsulfoksida(DMSO) dapat menaikkan efisiensi fusi sel. Mentransfer campuran fusi sel (sel limfosit B dan sel myeloma ke medium kultur yang disebut medium HAT (karena mengandung Hipoxantin Aminopterin Timidin). Sel mieloma (sel-sel tumor sum-sum tulang yang akan tumbuh tanpa batas dilaboratorium dan menghasilkan imunoglobulin) yang tidak mengalami fusi tidak dapat tumbuh karena kekurangan HGPRT. Sel limfosit B (limpa mencit yang telah terkena antigen sehingga memproduksi antibodi X) yang tidak mengalami fusi tidak dapat tumbuh terus karena punyabatas waktu hidup. Sel hibridoma (dihasilkan oleh fusi yang berhasil) dapat tumbuh tanpa batas karena sel limpa dapat memproduksi HGPRT dan sel mieloma dapat membantu sel limpa. Fusi ini mengabungkan kemampuan untuk tumbuh terus menerus dari sel mielomadan kemampuan untuk menghasilkan sejumlah besar antibodi dari sel limfosit B murni.



158



3.



Eliminasi Sel Induk yang Tidak Berfusi Frekuensi terjadinya hibrid sel limpa-sel mieloma biasanya rendah, karena itu penting untuk mematikan sel yang tidak fusi yang jumlahnya lebih banyak agar sel hibrid mempunyai kesempatan untuk tumbuh dengan cara membiakkan sel hibrid dalam



media



selektif



yang



mengandung



hypoxanthine,



aminopterin,



dan



thymidine(HAT). Aminopterin menghambat jalur biosintesis purin dan pirimidin sehingga memaksa sel menggunakan salvae pathway. Seperti kita ketahui bahwa sel mieloma mempunyai kelainan untuk mensintesis nukleotida yaitu sel mieloma yang tidak mempunyai enzim timidin kinase atau hypoxanthine phosphoribosyl transferase, sehingga sel mieloma yang tidak berfusi, karena tidak mempunyai enzim timidin kinase atau hypoxanthine phosphonibosyl transferase akan mati, sedangkan sel hibrid karena mendapatkan enzim tersebut dan sel mamalia yang difusikan dapat menggunakan salvae pathway, sehingga tetap hidup dan berkembang. 4.



Isolasi dan Pemilihan Klon Hibridoma Sel hibrid dikembangbiakkan sedemikian rupa, sehingga tiap sel hibrid akan membentuk koloni homogen yang disebut hibridoma. Tiap koloni kemudian dipelihara terpisah satu sama lain. Hibridoma yang tumbuh diharapkan mensekresi antibodi ke dalam medium, sehingga antibodi yang terbentuk bisa diisolasi. Umumnya penentuan antibodi yang diinginkan dilakukan dengan cara enzyme linked immunosorbent assay (EL1SA) atau radioimmunoassay (RIA).



Gambar 7. 9. Cara memproduksi antibodi monoklonal (http://www.scribd.com/doc/52527802/antibodi-monoklonal)



159



Gambar 7.10. Cara memproduksi antibodi monoklonal (http://www.majalah-farmacia.com/rubrik/one_news_print.asp?IDNews=282) Pemilihan klon hibridoma dilakukan dua kali, pertama adalah dilakukan untuk memperoleh hibridoma yang dapat menghasilkan antibodi; dan yang kedua adalah memilih sel hibridoma penghasil antibodi monoklonal yang potensial menghasilkan antibodimonoklonal yang tinggi dan stabil, seperti yang ditunjukkan pada Gambar 7.9 dan 7.10. 7.3.4 Mekanisme kerja dan aktivitas antibodi monoklonal Antibodi monoklonal menggunakan mekanisme kombinasi untuk meningkatkan efek sitotoksin sel tumor. Mekanisme komponen sistem imun adalah antibody dependent cellular cytotoxicity (ADCC), complement dependent cytotoxicity (CDC), mengubah signal transduksi sel tumor atau menghilangkan sel permukaan antigen. Antibodi dapat digunakan sebagai target muatan (radioisotop, obat atau toksin) untuk membunuh sel tumor atau mengaktivasi prodrugpada sel tumor, antibody directed enzyme prodrug therapy (ADEPT). Antibodi monoklonal digunakan secara sinergis melengkapi mekanisme kerja kemoterapi untuk melawan tumor. 1.



Antibody dependent cellular cytotoxicity (ADCC) Antibody dependent cellular cytotoxicity (ADCC) terjadi jika antibodi mengikat



antigen sel tumor dan Fc antibodi melekat dengan reseptor Fc pada permukaan sel imun efektor. Interaksi Fc reseptor ini berdasarkan kemanjuran antitumor dan sangat penting pada pemilihan suatu antibodi monoklonal. Sel efektor yang berperan masih belum jelas tapi diasumsikan sel fagosit mononuklear dan atau natural killer (NK). Struktur Fc domain di manipulasi untuk menyesuaikan jarak antibodi dan interaksi dengan Fc reseptor. Antibody dependent cellular cytotoxity (ADCC) dapat meningkatkan respons klinis secara langsung



160



menginduksi destruksi tumor melalui presentasi anti gen dan menginduksi respons sel T tumor. Anti body monoklanal berikatan dengan antigen permukaan sel tumor melalui Fc reseptor permukaan sel NK. Hal ini memicu pelepasan perforin dan granzymes untuk menghancurkan sel tumor (Gambar 7.11a). Sel-sel yang hancur ditangkap antigen presenting cell (APC) lalu dipresentasikan pada sel B sehingga memicu penglepasan antibody kemudian antibody ini akan berikatan dengan target antigen (Gambar 7.11b-d). Sel cytotoxic T lymphocytes (CTLs) dapat mengenali dan membunuh sel target antigen (Gambar 7.11d).4,10



Gambar 7.11. Antibody dependen cellular cytotoxicity (ADCC) 2.



Complement dependent cytotoxicity (CDC) Pengikatan antibody monoklonal dengan antigen permukaan sel akan mengawali



kaskade komplement. Complement dependent cytotoxicity (CDC) merupakan suatu metode pembunuh sel tumor yang lain dari antibody. Imunoglobulim G1 dan G3 sangat efektif pada CDC melalui jalur klasik aktivasi komplement (Gambar 7.12a).



Gambar 7.12. Complement-dependent cytotoxicity



161



Formasi kompleks antigen antibody merupakan komplemen C1q berikatan dengan lgG sehingga memicu komplement protein lain untuk mengawali penglepan proteolitik sel efektor komotaktik/agen aktivasi C3a dan C5a (Gambar 7.12b). Kaskade komplement ini diakhiri dengan formasi membrane attack complex (MAC) (Gambar 7.12c) sehingga membentuk suatu lubang pada sel membran. Membrane attack complex (MAC) memfasilitasi keluar masuknya air dan Na+1



yang akan menyebabkan sel target lisis



(Gambar 7.12d). 3.



Perubahan Transduksi Signal Reseptor growth factor merupakan suatu antigen target tumor, ekspresinya



berlebihan pada keganasan. Aktivasi transduksi signal pada kondisi signal pada kondisi normal akan menginduksi respons mitogenik dan meningkatkan kelangsungan hidup sel, hal ini diikuti dengan ekspresi perkembangan sel tumor yang berlebihan yang juga menyebabkan tumor tidak sensitif terhadap zat kemoterapi. Antibodi monoklonal menormalkan laju perkembangan sel dan membuat sel sensitif terhadap zat sitotoksik dengan menghilangkan signal reseptor ini. Target antibody EGFR permukaan sel tumor atau membersikan ligan seperti VEGF. Pengikatan ligand reseptor growth factor memicu proses dimerisasi dan aktivasi kaskade signal (Gambar 7.13a) sehingga terjadi proliferasi sel dan hambatan terhadap zat sitotoksik (Gambar 7.13b). Antibody monoklonal menghambat signal dengan cara menghambat dimerisasi atau mengganggu ikatan ligand (Gambar 7.13c).



Gambar 7.13. Perubahan transduksi signal 7.3.5 Antibodi Monoklonal Generasi Baru



162



Beberapa antibodi monoklonal yang digunakan untuk pengobatan berasal dari sel mencit atau tikus sehingga sering menimbulkan reaksi alergi pada pasien yang menerima antibodi monoklonal tersebut. Untuk mengatasi masalah tersebut maka para peneliti melakukan pengembangan antibodi monoklonal yang memiliki sedikit efek penolakan dari sistem imun pasien. Perkembangan tersebut menciptakan antibodi monoklonal generasi antara lain : 1.



Chimeric monoklonal antibodies Antibodi chimeric mengambil nama mereka dari Chimera, sebuah binatang mistis



dengan kepala singa, tubuh seekor kambing dan ekor naga. Rituxan atau Rituximab adalah jenis tertentu obat-obatan yang dikenal sebagai Chimeric. Rituxan merupakan hibrida dari antibodi dari dua sumber, yaitu manusia dan tikus. Antigen CD20 disuntikkan ke tikus, mendorong produksi antibodi. Antibodi sel kemudian diisolasi dari limpa hewan kemudian digabungkan dengan sel myeloma.Hal ini menghasilkan baris sel yang akan terus memproduksi antibodi tanpa batas. Rekayasa genetika lebih lanjut menghilangkan unsur-unsur sel tikus yang biasanya akan menghasilkan reaksi (alergi) kekebalan jika disuntikkan ke manusia.Terapi antibodi monoklonal basis awal untuk kanker terganggu dengan sejumlah masalah. Pada eksperimen awal, terdapat reaksi alergi dari bagian asing antibodi eksperimental dari tikus, yang disebut HAMA (Human Anti Mouse Antibody) yang membatasi kegunaan dan mencegah digunakan lebih dari sekali. Para pengembang Rituxan mengatasimasalah ini dengan menghapus bagian antigen dari bagian tikus tersebut dengan antibodichimeric. 2.



Humanized MonoklonalAntibodies Humanized antibodies adalah antibodi dari spesies non-manusia yang sekuens



proteinnya telah dimodifikasi untuk meningkatkan kesamaan mereka pada varian antibodi yang dihasilkan secara alami pada manusia. Proses "humanisasi" biasanya diterapkan untuk antibodi monoklonal yang dikembangkan untuk manusia (misalnya, antibodi yang dikembangkan sebagai obat anti-kanker). Humanisasi ini diperlukan pada saat proses pengembangan antibodi spesifik yang melibatkan makhluk hidup lain dalam sistem kekebalan tubuh manusia, seperti pada tikus. Urutan protein antibodi yang diproduksi dengan cara ini adalah sedikit berbeda dari homolog antibodi yang terjadi secara alami pada manusia, oleh karenanya berpotensi imunogenik jika diberikan kepada pasien manusia. Tidak semua antibodi monoklonal dirancang untuk administrasi manusia perlu dilakukan proses humanized karena banyak yang merupakan terapi intervensi jangka pendek.



163



Menurut The International Nonproprietary nama akhir antibodi yang telah dimanusiawikan berakhiran -mab, seperti di omalizumab. Proses ini mempunyai keuntungan yang dapat dibuktikan dari fakta bahwa produksi antibodi monoklonal dapat dicapai dengan menggunakan DNA rekombinan untuk membuat konstruksi yang mampu berekspresi pada kultur sel mamalia. Segmen gen yang mampu memproduksi antibodi diisolasi dan dikloning ke dalam sel yang dapat tumbuh dalam sebuah tangki fermentor sehingga protein antibodi yang dihasilkan dari DNA dari gen kloning dapatdipanen secara massal. Tidak semua metode untuk menurunkan antibodi dimaksudkan untuk terapi manusia memerlukan langkah humanisasi (misalnya tampilan fag) tetapi pada dasarnya semua tergantung pada teknik yang sama memungkinkan "sisipan" bagian dari molekul antibodi. 3.



Fully Human Mono lonal Antibodies Antibodi ini merupakan antibodi yang paling ideal untuk menghindari terjadinya



respon imun karena protein antibodi yang disuntikkan ke dalam tubuh seluruhnya merupakan protein yang berasal dari manusia. Salah satu pendekatan yang dilakukan untuk merancang pembentukan antibodi monoklonal yang seluruhnya mengandung protein manusia tersebut adalah dengan teknik rekayasa genetika untuk menciptakan mencit transgenik yang membawa gen yang berasal dari manusia, sehingga mampu memproduksi antibodi yang diinginkan. Pendekatan lainnya adalah merekayasa suatu binatang transgenik yang dapat mensekresikan antibodi manusia dalam air susu yang dikeluarkan oleh binatang tersebut. Salah satu contoh fully human monoclonal antibodies adalah Panitumumab. Panitumumab ini sebelumnya memiliki nama ABX-EGF, merupakan fully humanmonoclonal antibodies pertama yang spesifik untuk reseptor faktor pertumbuhan epidermal(juga dikenal sebagai reseptor EGF, EGFR, ErbB-1 dan HER1 pada manusia). Panitumumab ini disetujui oleh lembaga obat dan makanan di Amerika pada September 2006 untuk terapi untuk metastasis kanker usus besar yang diekspresikan oleh EGFR. EGFR ini merupakan protein transmembran. Panitumumab bekerja dengan cara mengikat pada bagian ekstraseluler membran EGFR untuk mencegah aktivasinya. Sehingga sinyal intraseluler yang terkait dengan reseptor ini akan terputus atau terhambat. Panitumumab ini dikembangkan dengan cara imunisasi mencit transgenik yang disebut dengan XenoMouse yang mampu menghasilkan immunoglobulin manusia rantai berat dan ringan. Setelah dilakukan imunisasi, klon spesifik sel B yang memproduksi antibodi untuk melawan EGFR dipilih dan diawetkan pada sel CHO (Chinese hamster ovary). Sel ini kemudian digunakan pada produksi skala besar. Panitumumab ini diproduksi oleh Amgen dan diperjualbelikan dengan nama dagang Vectibix.



164



7.3.6 Tipe Antibodi Monoklonal yang Digunakan untuk Terapi Kanker Dua tipe antibodi monoklonal yang digunakan untuk terapi kanker, adalah : 1.



Nakedmonoclonal antibodies Naked monoclonal antibodies atau antibodi monoklonal murni adalah antibodi yang



penggunaanya tanpa dikombinasikan dengan obat lain atau material radioaktif. Antibodi murni mengikatkan diri mereka pada antigen spesifik milik sel-sel kanker dengan berbagai cara. Misalnya, memberi tanda pada sel kanker agar bisa dikenali dan dirusak oleh sistem imun tubuh. Cara lain dengan mengikatkan diri pada antigen tertentu yang disebut reseptor, tempat di mana molekul-molekul yang berfungsi menstimulasi pertumbuhan sel kanker juga akan mengikatkan diri. Dengan menghambat molekul-molekul pertumbuhan untuk tidak mengikatkan diri, maka antibodi monoklonal ini sama saja mencegah sel kanker untuk tumbuh dengan cepat. Trastuzumab (Herceptin), yang merupakan MAb murni dan digunakan untuk kanker payudara stadium lanjut, adalah contoh antibodi monoklonal yang bekerja dengan cara ini. Beberapa MAbs murni yang sudah disetujui FDA antara lain : a.



Rituximab (Rituxan): Rituximab digunakan untuk terapi sel B pada non-Hodgkin lymphoma. Agen ini merupakan antibodi monoklonal dengan sasaran antigen CD20, yang ditemukan pada sel B.



b.



Trastuzumab (Herceptin): Trastuzumab adalah antibodi yang menyerang protein HER2. Protein ini terlihat dalam jumlah besar pada sel-sel beberapa kasus kanker payudara. Agen ini disetujui untuk pengobatan tahap lanjut kanker payudara.



c.



Alemtuzumab (Campath): Alemtuzumab merupakan antibodi yang menyerang antigen CD52, yang terlihat pada sel B maupun sel T. Agen ini digunakan untuk terapi B celllymphocytic leukemia (B-CLL) kronik yang sudah mendapat kemoterapi.



d.



Cetuximab (Erbitux): Cetuximab, antibodi dengan sasaran protein EGFR (epidermal growth factor receptors). EFGR nampak dalam jumlah besar pada beberapa sel kanker. Agen ini digunakan berbarengan dengan obat kemoterapi irinotecan untuk kanker kolorektal stadium lanjut. Selain itu juga digunakan untuk terapi kanker leher dan kepala yang tidak bisa diselesaikan dengan bedah.



e.



Bevacizumab (Avastin): Bevacizumab bekerja melawan protein VEGF (Vascular Endhotelial Growth Factor) yang normalnya membantu tumor membangun jaringan pembuluh darah baru (proses angiogenesis) sebagai satu cara mendapatkan oksigen dan



nutrisi.



Terapi



anti-angiogenesis



ini



digunakan



bersama-sama



dengan



kemoterapi untuk terapi kanker kolorektal metastatik.



165



Kemajuan pengobatan dengan antibodi melalui serangkaian uji klinis sungguh suatu langkah yang berani. Antibodi ini bisa membantu pasien kanker yang tidak mengalami kemajuan dengan terapi standar. Berbagai uji klinis menunjukkan obat ini efektif, dan kemungkinan bisa digunakan sebagai terapi standart (awal) atau sebagai terapi tambahan pada kemoterapi. Antibodi monoklonal diberikan intravena. Dibandingkan dengan efek samping kemoterapi, efek samping naked MAbs atau MAbs murni biasanya lebih ringan dan sering dikaitkan dengan reaksi “alergi”. Efek ini terlihat biasanya di awal terapi, misalnya demam, menggigil, lemah, nyeri kepala, mual, muntah, diare, tekanan darah turun, dan rashes. Beberapa MAbs juga bisa berimbas pada sumsum tulang seperti halnya pada pemberian obat kemoterapi. Hal ini sebagai akibat rendahnya kadar sel darah. Efek samping ini bisa memicu peningkatan risiko pendarahan dan infeksi pada pasien. 2.



Conjugated Monoclonal Antibodies Conjugatedmonoclonal antibodies adalah antibodi yang dikombinasikan dengan



berbagai jenis obat, toksin, dan materi-materi radioaktif. Obat ini hanya berperan sebagai “kendaraan” yang akan mengantarkan substansi-substansi obat, racun, dan materi radioaktif, menuju langsung ke sasaran yakni sel-sel kanker. Antibodi monoklonal jenis ini akan berkeliling ke seluruh bagian tubuh sampai ia berhasil menemukan sel kanker yang cocok dengan antigen yang ia bawa. Agen ini kemudian akan menghantarkan racun di tempat paling krusial, namun hebatnya, ia bisa meminimalkan dosis pada sel normal untuk menghindari kerusakan di seluruh bagian tubuh. Sayangnya, antibodi gabungan ini secara umum masih menimbulkan efek samping lebih banyak dibandingkan antibodi monoklonal yang murni. Efek yang ditimbulkan tergantung pada tipe substansi yang ikut serta atau menempel padanya. Conjugated MAbs kadang dikenal juga sebagai "tagged”, "labeled", atau "loaded" antibodies. Perbedaannya sebagai berikut: MAbs yang dikombinasikan dengan obat-obat kemoterapi disebut chemolabeled. Saat ini agen ini hanya tersedia di Amerika Serikat, itupun hanya dalam rangka uji klinis.MAbs yang dikombinasikan dengan partikel radioaktif disebut radiolabeled, dan tipe terapi ini sering juga disebut radioimmunotherapy (RIT). Pada 2002, FDA menyetujui radiolabeled pertama yang boleh digunakan untuk terapi kanker (tak hanya untuk uji klinis) yakni Ibritumomab tiuxetan (Zevalin). Obat ini digunakan untuk terapi kanker B lymphocytes. Kini obat ini juga digunakan untuk terapi B cell non-Hodgkin lymphoma yang tidak efektif dengan terapi standar.



166



Radiolabeled kedua yang disetujui FDA adalah tositumomab (Bexxar), pada 2003. Obat ini digunakan untuk tipe tertentu non-Hodgkin lymphoma yang juga tidak menunjukkan respon dengan rituximab (Rituxan) atau kemoterapi. Di samping untuk kanker, antibodi radiolabeled juga digunakan bersamaan dengan kamera khusus untuk mendeteksi penyebaran sel kanker dalam tubuh. Penggunaannya sudah disetujui FDA yakni OncoScint (untuk deteksi kanker kolorektal dan kanker ovarium) serta ProstaScint (deteksi kanker prostat). MAbs yang melekat dengan racun disebut immunotoxins. Imunotoksin dibuat dengan menempelkan racun-racun (berasal dari tanaman maupun bakteri) ke antibodi monoklonal. Berbagai racun dibuat untuk ditempelkan pada antibosi monoklonal seperti diphtherial toxin (DT), pseudomonal exotoxin (PE40), atau yang dibuat dari tanaman yakni ricin A atau saporin. Studi awal menunjukkan imunotoksin cukup menjanjikan untuk menyusutkan sebagian kecil kanker, khususnya limfoma. Namun masalah besar masih menunggu dipecahkan sebelum bentuk baru terapi kanker ini bisa digunakan secara luas. Satu-satunya imunotoksin yang mendapat persetujuan FDA untuk terapi kanker adalah gemtuzumab ozogamicin (Mylotarg). Obat ini mengandung racun calicheamicin. Racun ini melekat pada antibodi yang langsung menuju sasaran antigen CD33, yang nampak pada sebagian besar sel leukemia. Saat ini Gemtuzumab digunakan untuk terapi myelogenous leukemia (AML) akut yang sudah menjalani kemoterapi atau tidak memenuhi syarat untuk kemoterapi. Imunotoksin lain yakni BL22, juga cukup menjanjikan melalui studi awal untuk terapi hairy cell leukemia, bahkan pada pasien yang tidak menunjukkan respon sama sekali dengan kemoterapi. Pada uji klinis awal, lebih dari dua pertiga pasien menunjukkan respon komplit terhadap pengobatan yang berlangsung 2 tahun. Uji klinis imunotoksin juga tengah berlangsung untuk jenis leukemia tertentu, limfoma, kanker otak, dan kanker lainnya. 7.4



Ringkasan



Antibodi Monoklonal adalah Antibodi yang diproduksi berasal dari sel hibridoma tunggal (mono-klon) sebagai hasil penggabungan limfosit B (memproduksi antibodi) dan sel kanker (hidup dan membelah terus menerus) secara in vitro. Senyawa homogen dari hasil penggabungan diperoleh bersifat sangat spesifik hanya mengikat 1 epitop antigen dan diperoleh dalam jumlah yang sangat besar.



167



Tahap pembentukan



dan produksi antibodi monoklonal adalah berturut turut



sebagai berikut: 1. Imunisasi mencit dengan antigen yang akan dibuat antibody monoklonalnya. 2. Limpa mencit diambil dan dibuat suspensi termasuk sel B yang mengandung antibody terhadapantigen yang disuntikan. 3. Fusi sel limpa dengan sel myeloma. 4. Seleksi sel dengan membiakkan sel dalam media selektif, dimana hanya sel hybrid saja yang bisa tumbuh. 5. Sel hybrid berproliferasi membentuk klon yang disebut hibridoma 6. Seleksi sel hybrid ma unggul yg menghasilkan antibody monoklonal. 7. Penentuan analisis antibodi dengan cara enzyme linked immunosorbent assay (ELISA) atau radioimmunoassay (RIA). Antibodi monoklonal telah banyakdimanfaatkan dalam bidang kesehatan, baik diagnostik (mis: test urin kehamilan) maupun pengobatan (mis: pengobatan kanker).Para peneliti telah mengembangkan pembuatan antibodi monoklonal generasi baru, yaitu suatu monoklonal antibodi yang sebagian atau seluruhnya terdiri dari protein yang berasal dari manusia. Beberapa jenis antibodi monoklonal generasi baru adalah Chimaric Monoclonal Antibodies, Humanized Monoclonal Antibodies, dan Fully Human Monoklonal Antibodies.



Contoh Soal: 1.



Sebutkan dan jelaskan penggolongan antibodi dan fungsinya masing-masing.



2.



Jelaskan tahapan proses pembuatan antibodi monoklonal.



3.



Jelaskan mekanisme kerja antibodi monoklonal pada proses diagnostik dan dan terapi penyakit pada manusia.



4.



Sebutkan dan jelaskan proses fagositosis kuman penyakit/antigen.



5.



Sebutkan dan Jelaskan beberapa jenis antibodi monoklonal generasi baru dan aplikasinya pada terapi penyakit.



6.



Sebutkan dan jelaskan jenis-jenis antibodi pada manusia dan fungsinya masingmasing secara spesifik.



168



DAFTAR PUSTAKA Radji, Maksum. Imunologi &Virologi. Penerbitan PT ISFI; Jakarta.2010. Hal 84-89. Riechmann L, Clark M, Waldmann H, Winter G. Reshapin human antibodies for therapy. Nature; 1988. Hal 332.vivalapharmacy.blogspot.com (9 November 2011) Ali Demirsoy, Kalitim ve Evrim (Inheritance and Evolution), Ankara: Meteksan Yayinlari. Michael J. Behe, Darwin's Black Box, New York: Free Press, 1996, Sjahrurachman A. 1995. Perkembangan teknik hibridoma. Cermin Dunia Kedokteran. http://biologigonz.blogspot.com/2010/02/membuat-antibody-monoklonal.html diakses pada 10 desember 2011 http://www.scribd.com/doc/52527802/antibodi-monoklonal. diakses pada 10 desember 2011 http://www.majalah-farmacia.com/rubrik/one_news_print.asp?IDNews=282. diakses pada 10 desember 2011. http://www.britannica.com/EBchecked/media/17658/The-four-chain-structure-of-anantibody-or-immunoglobulin-molecule. diakses pada 10 desember 2011.



169



Senarai IstilahdanArtinya



Istilah



Arti



Antibodi Monoklonal



Antibodi yang diproduksi berasal dari sel hibridoma tunggal (monoklon) sebagai hasil penggabungan limfosit B (memproduksi antibodi) dan sel kanker (hidup dan membelah terus menerus) secara in vitro.



Epitop



Daerah spesifik pada antigen yang dapat dikenali oleh antibodi.



Conjugated monoclonal antibodies



Antibodi yang dikombinasikan dengan berbagai jenis obat, toksin, dan materi-materi radioaktif untuk keperluan diagnosis dan terapi kanker.



Naked monoclonal antibodies



Antibodi



monoklonal



murni



yang



penggunaanya



tanpa



dikombinasikan dengan obat lain atau material radioaktif.



170