Husna Proposallll [PDF]

Citation preview

PROPOSAL “AKTIVITAS ANTIBAKTERI FRAKSI RIMPANG Meistera chinensis TERHADAP Streptococcus mutans MENGGUNAKAN METODE KLT BIOAUTOGRAFI”



Usulan Penelitian Untuk Karya Tulis Ilmiah



Diajukan Oleh :



HUSNAWATY F.18.023



PROGRAM STUDI D-III FARMASI POLITEKNIK BINA HUSADA KENDARI 2021



BAB I PENDAHULUAN A. Latar Belakang Penelitian Negara indonesia adalah negara yang kaya akan keanekaragaman hayati. Khususnya untuk tumbuhan, ada begitu banyak spesies yang beraneka ragam yang bisa kita manfaatkan untuk menunjukan kehidupan kita, baik sebagai bahan makanan, maupun sebagai bahan untuk obat. Pemanfaatan tanaman sebagai obat akhir-akhir ini semakin populer dimasyarakat. Semakin mahalnya harga obat-obatan membuat masyarakat mencari alternatif lain untuk pengobatan yakni dengan memanfaatkan tanaman yang berkhasiat obat (Ngajow dkk, 2013) Salah satu tumbuhan yang menarik untuk diidentifikasi khasiatnya adalah tumbuhan Meistera chinensis. Meistera chinenis merupakan salah satu generasi baru dari famili Zingiberaceae. Zingeberaceae merupakan salah satu famili tumbuhan penting yang memiliki aktifitas biologis berpotensi tinggi yang mampu mengobati berbagai penyait. Beberapa generasi baru ditemukan oleh Cinnamomum, Meistera, dan Wurfbainia dalam keluarga Zingiberaceae yang baru ditemukan. Sehingga penting untuk mengetahui potensi tumbuhan obat dengan membuat kajian tentang tumbuhan obat (Musdalipah, dkk, 2021).



Meistera chinensis merupakan tumbuhan lokal Sulawesi Tenggara dan ditemukan di Kabupaten Konawe. Secara empiris, masyarakat konawe menggunaan daun, batang, buah, dan rimpang sebagai penambah rasa pada makanan, mengobati nyeri, dan meningkatkan kekebalan tubuh (Musdalipah, dkk, 2020). Penelitian yang dilakukan oleh Musdalipah, dkk, 2020 bahwa seluruh bagian tumbuhan Meistera chinensis memiliki kandungan metabolit skunder antaranya senyawa fenolik, flavonoid, steroid, terpenoid, alkaloid, dan saponin. Tanaman Meistera chinensis memiliki potensi sebagai antibakteri, kebutuhan akan antibakteri sangat besar sebagai pengobatan penyakitpenyakit infeksi. Penggunaan antibakteri yang tepat memberikan manfaat yang besar namun bila antibakteri digunakan dan diresepkan secara tidak tepat akan menimbulkan kerugian (Utami, 2012). Streptococcus mutans adalah bakteri penyebab karies pada gigi. Karies merupakan penyakit gigi dan mulut yang paling banyak diderita oleh lapisan masyarakat di Indonesia yang menyebabkan infeksi ke jaringan lunak sekitar gigi, nyeri, bau mulut, dan dianggap sebagai penyebab utama kehilangan gigi. Kesehatan gigi dan mulut akhir-akhir ini telah mengalami peningkatan, namun prevalensi karies gigi masih tetap tinggi di masyarakat dari berbagai ras, tingkatan ekonomi, dan usia serta merupakan masalah kesehatan yang perlu mendapatkan perhatian (Erlyn, 2016).



Aktivitas antibakteri dari bahan alam dapat ditentukan dengan menggunakan metode KLT bioautografi. Bioautografi adalah metode sederhana yang bersifat spesifik dan digunakan untuk mendeteksi bercak pada kromatogram hasil KLT yang memiliki aktivitas sebagai antibakteri, antifungi, dan antiviral, sehingga mendekatkan metode separasi dengan uji biologis (Pratiwi, 2008). Metode ini merupakan alternatif untuk deteksi zat aktif, mencari antibakteri atau anti kapang baru, kontrol kualitas antimikroba, dan mendeteksi golongan senyawa (Kusumaningtyas, 2008). Berdasarkan uraian latar belakang diatas maka peneliti akan melakukan penelitian dengan judul ‘’Aktivitas Antibakteri Fraksi Rimpang Meistera chinensis Terhadap Streptococcus mutans menggunakan KLT Bioautografi ’’.



B. Rumusan Masalsah 1. Apakah fraksi rimpang Meistera chinensis memiliki aktifitas anti bakteri terhadap Streptococcus mutans dengan menggunakan metode KLT bioautografi? 2. Seberapa besar aktivitas antibakteri fraksi rimpang Meistera chinensis terhadap Streptococcus mutans dengan menggunakan metode KLT bioautografi? C. Tujuan Penelitian 1. Untuk mengetahui fraksi rimpang Meistera chinensis memiliki aktivitas anti bakteri Streptococcus mutans dengan menggunakan metode KLT bioautografi. 2. Untuk mengetahui seberapa besar aktivitas antibakteri fraksi rimpang Meistera chinensis terhadap Streptococcus mutans dengan menggunakan metode KLT bioautografi. A. Manfaat Penelitian a. Manfaat teoritis 1. Sebagai referensi bagi penelitian selanjutnya tentang ekstrak rimpang Meistera chinensis untuk dibuat sediaan farmasi lain bagi penelitian selanjutnya.



2. Menambah wawasan dan penelitian teknologi farmasi dan penerapan ilmu yang telah peneliti pelajari dalam masa perkuliahan b. Manfaat praktis 1. Memberikan bahan informasi kepada masyarakat mengenai khasiat rimpang Meistera chinensis sebagai anti bakteri.



BAB II TINJAUAN PUSTAKA A. Rujukan Penelitian 1. Aslah, dkk. 2019, “Aktivitas Antibakteri dan Analisis KLT-Bioautigrafi Dari Fraksi Daun Mengkudu”. Senyawa aktif yang ada di daun mengkudu ( Morinda citrifolia L). dapat berperan sebagai antibakteri pada fraksi methanol diduga positif mengandung senyawa Flavanoid. 2. Paputungan, dkk. 2019, “ Aktivitas Antibakteri dan Analisis KLTBioautografi dari Fraksi Biji Kopi Robusta (Coffea canephora Pierre ex A. Froehner)”. Komponen kimia aktif yang memberikan aktivitas antibakteri secara KLT-Bioautografi pada fraksi terpilih yaitu methanol diduga adalah golongan flavonoid dan alkaloid 3.



Sauki,2019,” Uji Aktivitas Antibakteri Ekstrak Etanol dan Fraksi Rimpang Tiga Varietas Jahe Terhadap Pseudomonas aeruginosa”. Ekstrak etanol dan fraksi rimpang jahe merah. Jahe gajah, dan jahe wmprit memiliki aktivitas antibakteri terhadap bakteri P. aeruginosa ditunjukan dengan adanya zona bening disekitar cakrem.



4. Musdalipah, dkk. 2020. Melakukan penelitian uji antioksidan in vitro dan estimasi fitokimia kualitatif Meistera chinensis dan di peroleh hasil meistara chinensis adalah salah satu spesies yang termasuk yang termasuk dalam family Zingiberaceae. Metabolit sekunder pada Meistera chinensis



adalah senyawa fenolik, flavonoid, steroid, terpenoid, alkaloid, dan saponin. Sebagai kesimpulan, di katakana bahwa Meistera chinensis memiliki kapasitas antioksidan untuk membasmi radikal bebas, dan metabolit dalam M. chinensis mungkin memainkan peran penting dalam aktivitasnya



B. Landasan Teori 1. Deskripsi tanaman Meistera chinensis Tanaman Meistera chinensis merupakan spesies dari kelompok zingiberacea yang memiliki kesamaan bentuk tanaman dengan genus Etlingera. Di Sulawesi Tenggara, populasi Meistera chinensis tersebar dan sangat banyak ditemukan di Kabupaten Konawe. Meistera chinensis dikenal dengan nama wualae.



Gambar 1. Tanaman Meistera chinensis Gambar 2. Rimpang Meistera chinensis



(sumber : Dokumentasi pribadi) a. Klasifikasi Hasil determinasi dari Lembaga Ilmu Pengetahuan Indonesia Pusat Penelitian Biologi Cibinong diidentifikasi sebagai spesies dari genus Meistera (LIPI, 2020). Regnum



: Plantae



Divisi



: Spermatophyta



Kelas



: Monocotyledoneae



Ordo



: Zingiberales



Famili



: Zingiberaceae



Genus



: Meistera



Spesies



: Meistera chinensis



b. Morfologi Menurut



Oktavianus



2015, berikut



morfologi



tanaman



Meistera chinensis (Etilengera elatior Jack). Tanaman Meistera chinensis memiliki akar berbentuk serabut dan bewarna kuning gelap. Tanaman batang Meistera chinensis saling berdekat-dekatan membentuk rumpun jarang keluar dari rimpang yang menjalar di bawah tanah dan batangnya semu tegak berpelepah. Daun Meistera chinensis 15-30 helai tersusun dalam dua baris berseling, daun tunggal lanset ujung dan pangkalnya runcing tepi rata, panjang 20-30 cm dengan lebar 5-15 cm pertulangan menyirip berwarna hijau dengan permukaan daun licin mengkilat. Bunga Meistera chinensis dalam karangan berbentuk gasing bertangkai panjang dengan ukuran 0,5-2,5 cmx 1,5-2,5 cm, bewarna merah jambu hingga merah terang berdaging, ketika bunga mekar maka bunga tersebut akan melengkung dan membalik. Meistera chinensis mempunyai buah berjejalan dalam bongkol hampir bulat berdiameter 10-20 cm, masing –masing butirbesarnya 2-2,5 cm, berambut halus dan pendek di bagian luar, bewarna hijau dan ketika masak warnanya menjadi merah.



c. Kandungan kimia dan Manfaat Berdasarkan penelitian yang dilakukan oleh Musdalipah, dkk. 2020. Dari hasil penapisan fitokimia yang dilakukan secara kualitatif, ekstrak etanol buah Meistera chinensis mengandung fenolat, flavanoid, steroid, terpenoid, alkaloid dan saponin. Manfaat Meistera chinensis Secata tradisional telah di gunakan sebagai rempah-rempah dan imunomodulator. (Musdalipah, dkk. 2020). 2. Uraian tentang ekstraksi a. Ekstraksi Ekstraksi adalah suatu proses penyarian zat aktif dari bagian tanaman obatyang bertujuan untuk menarik komponen kimia yang terdapat dalam bagian tanaman obat tersebut (Marjoni, 2016). Tujuan dari ekstraksi adalah untuk menarik semua zat aktif dan komponen kimia yang terdapat dalam simplisia. Dalam menentukan tujuan dari suatu proses ekstraksi, perlu diperhatikan beberapa kondisi dan pertimbangan (Marjoni 2016) Ekstrak adalah suatu produk hasil pengambilan zat aktif melalui proses ekstraksi menggunakan pelarut, dimana pelarut yang digunakan diuapkan kembali sehingga zat aktif ekstrak menjadi pekat. Bentuk dari ekstrak yang dihasilkan dapat berupa ekstrak kental atau ekstrak kering tergantung jumlah pelarut yang diuapkan (Marjoni, 2016)



b. Maserasi Maserasi adalah proses perendaman sampel untuk menarik komponen yang diinginkan dengan kondisi dingin diskontinyu. Keuntungannya yakni lebih praktis, pelarut yang digunakan lebih sedikit, dan tidak memerlukan pemanasan, tetapi waktu yang dibutuhkan relative lama. (Kristanti, 2008) Keuntungan dan kerugian maserasi 1) Keuntungan maserasi Keuntungannya yakni lebih praktis, pelarut yang digunakan lebih sedikit, dan tidak memerlukan pemanasan, tetapi waktu yang dibutuhkan relative lama. (Kristanti, 2008) 2) Kerugian maserasi Kekurangan



untuk



metode



maserasi



adalah



membutuhkan waktu yang lebih lama dari pada refluksdan sokletasi, serta ekstrak air yang dihasilkan pada metode maserasi akan cepat rusak dan bau (Kristianti, 2008). 3. Fraksinasi Fraksinasi merupakan teknik pemisahan ekstrak hasil maserasi yang telah diuapkan sehingga diperoleh ekstrak kental. Fraksinasi ini menggunakan berbagai pelarut dengan kepolaran yang berbeda-beda, sehingga masingmasing pelarut mengandung senyawa dengan kepolaran yang berbeda pula (Akhsanita, 2012)



Fraksinasi dapat dilakukan dengan metode ekstrak cair-cair dan kromatografi. Analit-analit dalam sampel terdistribusi antara dua fase yaitu fase diam dan fase gerak. Dalam kromatografi KLT fase diamnya berupa lapisan yang seragam (uniform) pada permukaan bidang datar yang didukung oleh lempeng.



a. Ekstrak cair-cair (Corong pisah) Ekstrak cair-cair adalah metode pemisah dengan menggunakan dua cairan pelarut yang tidak saling bercampur sehingga senyawa tertentu terpisahkan menurut kesesuaian sifat cairan pelarut. Kandungan kimia yang bersifat polar akan lebih mudah larut dalam pelarut yang bersifat polar, sedangkan komponen yang bersifat non polar akan lebih larut dalam pelarut non polar juga. Senyawa organic yang memiliki afinitas berbeda terhadap sifat polaritas dari suatu cairan pengekstrak sehingga diperlukan macam pelarut yang berbeda tingkat polaritasnya (Andarwulan dkk., 1996) Jenis-jenis pelarut yang biasanya digunakan untuk melarutkan antara lain: 1) Pelarut polar Kelarutan obat sebagian besar disebabkan oleh polaritas dari pelarut, yaitu momen dipolnya. Pelarut polar melarutkan zat terlarut ionik dan zat polar lain. Selain dengan itu, air



bercampur dengan alcohol dengan segala perbandingan dan melarutkan gula dan senyawa polihidroksi bagian lain. Air melarutkan fenol, aldehid, keton, amina dan senyawa lain yang mengandung oksigen dan nitrogen yang dapat membentuk ikatan hydrogen didalam air.



2) Pelarut non-polar Aksi pelarut dari cairan non-polar seperti hidrokarbon berbeda dengan zat polar. Pelarut non-polar tidak dapat mengurangi gaya tarik menarik antara ion elektrolit kuat dengan lemah, karna tetapan elektrolit pelarut yang rendah. Pelarut juga tidak dapat memecahkan ikatan kovalen dan elektrolit dan berionisasi lemah karena pelarut non-polar tidak dapat membentuk jembatan hydrogen dengan non elektrolit. Oleh karena itu, zat terlarut ionik dan polar tidak dapat larut atau hanya dapat larut sedikit dalam pelarut non-polar. Tetapi senyawa non-polar dapat melarutkan zat terlarut non-polar dengan tekanan yang sama melalui interaksi dipol induksi. Molekul zat terlarut tetap berada dalam larutan dengan adanya sejenis gaya van der waals – London lemah. Maka, minyak dan lemak larut dalam karbon tetraklorida, benzene dan minyak



mineral. Alkaloida basa dan asam lemak larut dalam pelarut non-polar ( Martin dkk, 1993). 3) Pelarut semi polar Pelarut semi polar seperti keton dan alkohol dapat menginduksi suatu derajat plaritas tertentu dalam molekul pelarut non-polar, sehingga menjadi dapat larut dalam alkohol, contohnya



benzana



yang



mudah



dapat



dipolarisasikan



kenyataannya senyawa semi polar dapat bertidak sebagai pelarut perantara yang dapat menyebabkan bercampurnya cairan polar dan non-polar



(Martin dkk 1993).



b. Fraksinasi air (Sarjoni, 2003) Aquadest disebut juga Aqua Purficata (air murni) H2O dengan air murni adalah air yang dimurnikan dari destilasi. Satu molekul air memiliki dua hydrogen atom kovalen terikat untuk satu oksigen. Akuadest merupakan cairan yang jernih, tidak berwarna dan tidak berbau. Akuadest juga memiliki berat molekul sebesar 18,0 g/mold an PH antara 5-7. Rumus kimia dari akuades yaitu H2O. Aquades ini memiliki allotrop berupa es dan uap. Senyawa ini tidak berwarna, tidak berbau dan tidak memiliki rasa. Aquades merupakan elektrolit lemah. Air dihasilkan dari pengoksidasian hydrogen dan banyak digunakan sebagai bahan pelarut bagi kebanyakan senyawa (Sarjoni, 2003).



4. KLT-Bioautografi KLT-bioautografi adalah metode pendeteksian untuk menentukan senyawa yang belum teridentifikasi dengan melokalisir aktivitas antimikroa pada kromatogram. Metode ini didasarkan pada efek biologi (antibakteri, antiprotozoa, antitumor) dan substansi yang diteliti. Ciri khas dari prosedur bioautografi adalah didasarkan atas teknik difusi agar, dimana senyawa antimikrobanya dipisahkan dari lapisan KLT ke medium agar yang telah diinokulasi bakteri uji dengan merata. Dari hasil inkubasi pada suhu dan waktu tertentu akan terlihat zona hambat pada KLT yang ditempelkan pada medium agar, zona hambat ditampakkan oleh aktivitas senyawa aktif yang terdapat didalam bahan yang diperiksa terhadap pertumbuhan mikroorganisme uji. Bioautografi dapat dipertimbangkan paling efisien untuk mendeteksi komponen antimikroba sebab dapat melokalisir aktivitas meskipun dalam senyawa kompleks dan dapat langsung diisolasi dari komponen aktif. KTL-Bioautografi dapat dibagi atas 3 kelompok yaitu: a) Bioautografi Langsung Prinsip kerja dari metode ini adalah suspensi mikroorganisme uji peka dalam medium cair disemprotkan padapermukaan Kromatografi Lapis Tipis (KLT) yang telah dihilangkan sisa-sisa eluen yang menempel pada lempeng kromatogram. Setelah itu dilakukan inkubasi pada suhu dan waktu tertentu.



b) Bioautografi Kontak Metode ini didasarkan atas difusi dari senyawa yang telah dipisahkan dengan kromatografi lapis tipis (KLT) atau kromatografi kertas. Lempeng kromatografi tersebut ditempatkan ditas permukaan medium nutrien agar yang telah di inokulasikaan dengan mikroorganisme yang sensitif terhadap senyawa antimikroba yang dianalisis. Setelah 15–30 menit, lempeng kromatografi tersebut di pindahkan diangkat dari permukaan medium. Senyawa antimikroba yang telah berdifusi dari lempeng kromatogram ke dalam media agar akan menghambat pertumbuhan bakteri setelah diinkubasi pada waktu dan suhu yang tepat sampai noda yang menghambat pertumbuhan mikroorganisme uji tampak pada permukaan membentuk zona yang jernih. c) Bioautografi Pencelupan Pada prakteknya metode ini dilakukan sebagai berikut yaitu bahwa lempeng kromatografi yang telah dielusi, diletakkan dalam cawan petri, sehingga permukaannya tertutup oleh medium agar yang berfungsi sebagai



“base



layer”Setelah



medium



agar



memadat



(base



layernyamemadat), selanjutkan dituangi medium yang telah disuspensikan mikroba uji yang befungsi sebagai seed layer. Kemudian diinkubasikan pada suhu dan waktu yang sesuai(Djide, 2006: 300-302).



5. Bakteri Bakteri adalah mikroorganisme yang bersel satu, berkembang biak dengan cara membelah diri, serta demikian kecilnya sehingga hanya dapat dilihat dengan menggunakan mikroskop (Dwijoseputro, 1988) Bakteri berdasarkan pewarnaan gram, maka bakteri dapat dibedakan menjadi dua bagian (Lay, 1994) yaitu: Bakteri gram positif yaitu bakteri yang dapat mengikat zat warna pertama (kristal violet) akan memberikan warna ungu dan setelah dicuci dengan alkohol, warna ungu tersebut akan tetap kelihatan. Kemudian ditambahkan zat warna kedua (safranin), warna ungu pada bakteri tidak berubah. Contohnya : Stapytococcus epidermidis, Stapylococcus aureus, Stapylococcus saprophyticus, streptococcus mutans dan streptococcus pneumonia. Bakteri gram negatif yaitu bakteri yang kehilangan warna dari kristal violet ketika dicuci denagn alkohol dan setelah diberi zat warna kedua (sadranin), bakteri akan memberikan warna merah muda. Contohnya: Salmonella spesies, Salmonella typhi, Salmonella dysenteriae, Eschericia cili dan Pseudomonas aeruginosa. Streptococcus mutans merupakan bakteri Gram positif (+), bersifat non motil (tidak bergerak), berdiameter 1-2 µm. Memiliki bentuk bulat atau bulat telur, tersusun seperti rantai dan tidak membentuk spora. Streptococcus



mutans termasuk kelompok Streptococcus viridans yang merupakan anggota floral normal rongga mulut yang memiliki sifat α-hemolitik dan komensal oportunistik Bakteri ini tumbuh secara optimal pada suhu sekitar 18 °C-40 °C. Streptococcus mutans merupakan bakteri yang paling penting dalam proses terjadinya karies gigi. Bakteri ini pertama kali diisolasi dari plak gigi oleh Clark pada tahun 1924 yang memiliki kecenderungan berbentuk kokus dengan formasi rantai panjang apabila ditanam pada medium yang diperkaya seperti pada Brain Heart Infusion (BHI) Broth, sedangkan bila ditanam di media agar akan memperlihatkan rantai pendek dengan bentuk sel tidak beraturan. Streptococcus mutans tumbuh dalam suasana fakultatif anaerob (Marsh, 2006). Karies merupakan penyakit gigi dan mulut yang paling banyak diderita oleh lapisan masyarakat di Indonesia yang menyebabkan infeksi ke jaringan lunak sekitar gigi, nyeri, bau mulut, dan dianggap sebagai penyebab utama kehilangan gigi. Kesehatan gigi dan mulut akhir-akhir ini telah mengalami peningkatan, namun prevalensi karies gigi masih tetap tinggi di masyarakat dari berbagai ras, tingkatan ekonomi, dan usia serta merupakan masalah kesehatan yang perlu mendapatkan perhatian (Erlyn, 2016).



Gambar 3. Streptococcus mutans a. Klasifikasi Klasifikasi



: Monera



Divisi



: Firmicutes



Class



: Bacilli



Ordo



: Lactobacilalles



Family



: Streptococcaceae



Genus



: Streptococcus



Spesies



: Streptococcus mutans



b. Patogenitas Patogenitas Streptococcus mutanssebagai penyebab utama karies gigi dipercaya dapat mengganggu biologi rongga mulut. Streptococcus mutans memiliki kemampuan untuk mencerna sukrosa dan mensintesis glukan dengan enzim glukosiltrasferase ekstraseluler. Streptococcus mutans dapat memproduksi asam laktat, sehingga dapat menyebabkan demineralisasi dari permukaan gigi yang merupakan proses terjadinya karies (Anita 2018)



6. Antibakteri Antibakteri merupakan zat atau obat untuk membasmi jasad renik yang diperoleh dari sintesis atau yang berasal dari senyawa non organik. Bakteriostatik yaitu antimikroba yang hanya menghambat pertumbuhan mikroorganisme. Bakterisidal adalah antimikroba yang dapat membunuh mikroorganisme (Pleczar, 1988) Mekanisme kerja antibakteri: 1) Menghambat sintesis dinding sel Struktur diding sel dapat dirusak dengan cara menghambat pembentukannya atau mengubah dinding sel setelah terbentuk (Pleczar, 1988) 2) Menganggu keutuhan membran sel mikroba Membran sitoplasma mempertahankan bahan-bahan tertentu didalam sel serta mengatur aliran keluar-masuknya bahan-bahan lain. Membran memelihara integritas komponen-komponen selular. Kerusakan



pada



membran



ini



akan



mengakibatkan



terhambatnya pertumbuhan sel atau matinya sel (Pleczar, 1988) 3) Menghambat sintesis protein sel mikroba hidupnya suatu sel bergantung pada terpeliharanya molekul-molekul protein dan asam nukleat dalam keadaan alaminya. Suatu kondisi atau substansi yang mengubah keadaan ini, yaitu mendenaturasi protein dan asam-asam nukleat dapat merusak sel tanpa dapat



diperbaiki kembali. Suhu tinggi dan konsentrasi pekat beberapa



zat



kimia



dapat



mengakibatkan



koagulasi



(denaturasi) ireversible (tidak dapat balik) komponenkomponen selular yang vital ini (Pleczar, 1988) 4) Menganggu metabolisme sel mikroba Setiap enzim dari beratus-ratus enzim berbeda-beda ada yang di dalam sel merupakan



sasaran



potensial



bagi



bekerjanya



suatu



penghambat. Banyak zat kimia telah diketahui dapat mengganggu reaksi biokimia. Penghambatan ini dapat mengakibatkan terganggunya metabolisme atau matinya sel (Pleczar, 1988) 5) Penghambatan sintesis asam nukleat dan protein DNA, RNA dan protein memegang peranan penting di dalam proses kehidupan normal sel. Hal itu berarti bahwa gangguan apa pun yang akan terjadi pada pembentukan atau pada fungsi zat-zat tersebut dapat mengakibatkan kerusakan total pada sel (Pleczar, 1988)



BAB III METODE PENELITIAN A. Jenis Penelitian Jenis penelitian yang akan dilakukan adalah penelitian eksperimental dengan menggunakan metode KLT-Bioautografi. B. Desain Penelitian Kelompok perlakuan



Diameter zona hambat Replikasi 1



2



Total



Rata-rata



3



A B C K(+) K(-)



Keterangan : A, B, C yaitu fraksi n-heksan, etil asetat, dan methanol. Kontrol positif yaitu kloramfenikol Kontrol negatif yaitu aquades C. Waktu dan Tempat Pelaksanaan Penelitian ini dilaksanakan pada bulan Maret -Juni 2021 bertempat di Laboratorium Farmakognosi dan Mikrobiologi Politeknik Bina Husada Kendari



D. Populasi dan Sampel 1. Populasi Penelitian Populasi dalam penelitian ini adalah tumbuhan Meistera chinensis yang didapatkan di kabupaten konawe Sulawesi tenggara. 2. Sampel Penelitian Sampel dalam penelitian ini adalah fraksi ekstrak rimpang Meistera chinensis. E. Kerangka Konsep Penelitian



Rimpang Meistera chinensis



Ekstrak rimpang



Fraksi etil asetat



Aktivitas Antibakteri Fraksi Rimpang Meistera chinensis Terhadap Streptococcus mutans menggunakan KLT Bioautografi



Data



F. Variabel Penelitian 1. Variabel bebas Variabel bebas dalam penelitian ini yaitu ekstrak rimpang Meistera sp. 2. Variabel terikat Variabel terikat dari zona ini daya hambat bakteri Streptococus mutans. G. Definisi Oprasional 1. Ekstrak rimpang Meistera sp adalah ekstrak yang dihasilkan dari proses ekstraksi rimpang Meistera sp dengan menggunakan metode maserasi. 2. Fraksinasi



merupakan



prosedur



pemisahan



yang bertujuan



untuk



memisahkan golongan utama kandungan yang satu dari kandungan yang lain. 3. KLT-bioautografi adalah metode pendeteksian untuk menentukan senyawa yang belum teridentifikasi dengan melokalisir aktivitas antimikroa pada kromatogram. 4. Aktivitas Antibakteri merupakan zat atau obat untuk membasmi jasad renik yang diperoleh dari sintesis atau yang berasal dari senyawa non organik. Bakteriostatik yaitu antimikroba yang hanya menghambat pertumbuhan mikroorganisme.



H. Prosedur Penelitian 1) Alat dan Bahan yang digunakan Alat yang digunakan dalam penelitian ini adalah autoklaf, cawan petri (Normax), cawan porselin, chamber, gelas Erlenmeyer (pyrex), gelas kimia (pyrex), gelas ukur (pyrex), tabung reaksi, rak tabung reaksi, corong pisah, pinset, pembakar spritus, inkubator, lemari pendingin, blender, batang pengaduk, oven, lampu spiritus, lampu UV 254 nm dan 366 nm, Laminary Air Flow(N Biotek), aluminium foil, micropipet, pipet tetes, spatula, penangas air, rotary evaporator, vial, jangka sorong, jarum ose, lempeng KLT, pipa kapiler. Bahan yang digunakan adalah ekstrak rimpang Meistera chinensis, aquades, bakteri uji Streptococus mutans (gram positif), Medium Nutrient Agar (NA), Kloramfenikol paper disk, cakram (paper disk), n-heksan, etil asetat, etanol, aluminium foil, kertas saring, larutan H 2S04 1% , Larutan BaCl2 + 2H2O 1,75% , pereaksi AlCl3. 2) Cara Kerja a. Metode pengambilan sampel Pengambilan rimpang Maistera chinensis diperoleh dari kawasan Kabupaten Konawe, Sulawesi Tenggara. Pengambilan sampel dengan menggunakan alat berupa parang kemudian sampel di



kumpulkan dan dimasukan kedalam wadah berupa keranjang. b. Pengolahan simplisia rimpang Meistera chinensis Sampel yang telah dipanen disortasi basah dengan tujuan untuk memisahkan sampel dari kotoran atau bahan asing yang menempel atau dari sampel yang rusak. Setelah itu dicuci dengan baik sampel menggunakan air mengalir, pencucian bertujuan untuk menghilangkan kotoran-kotoran yang melekat pada batang, ditiriskan hingga tidak ada air yang menetes. Dikecilkan ukuran sampel dengan cara dipotong kecil-kecil( dirajang) untuk memudahkan pengeringan, lalu ditimbang. Sampel rimpang kemudian dikeringkan dengan cara dianginanginkan pada tempat yang tidak terkena sinar matahari secara langsung selama kuirang lebih 7 hari hingga kering. Lalu dilakukan sortasi kering dengan tujuan untuk memisahkan sampel dari kotoran atau sampel yang rusak. Kemudian sampel dihaluskan menggunakan blender, lalu sampel ditimbang dan disimpan dalam wadah yang tertutup rapat. c. Pembuatan ekstrak batang Meistera chinensis Pembuatan ekstrak simplisia batang Meistera chinensis diekstraksi dengan metode maserasi menggunakan pelarut etanol 70% Maserasi dilakukan dengan cara: Dimasukan sampel kedalam bejana maserasi kemudian ditambahkan etanol 70% dengan perbandingan sampel dan pelarut



(1:5). Lalu dimaserasi sampel dengan cara didiamkan 3-5 hari atau hingga pelarut jernih. Terlindung dari cahaya sambil sesekali diaduk setelah 3-5 hari dilakukan pemisahan filtrate dan ampas menggunakan kain flannel. Ampas dari penyaringan dimaserasi kembali dengan prosedur yang sama, diulang hingga diperoleh warna fitrate yang sama dengan warna pelarut. Filtrat yang diperoleh selanjutnya diuapkan menggunakan rotavapor dengan suhu 70˚C hingga diperoleh ekstrak kental batang Meistera chinensis. Ekstrak kental batang Meistera chinensis ditimbang dan disimpan dan dihitung rendemenya dengan persamaan:



Rendemen =



berat ekstrak kasar yang diperoleh x 100 berat ekstrak cair yang digunakan



d. Fraksinasi (Aslah dkk, 2019) Fraksinasi sampel dilakukan dengan metode fraksinasi caircair menggunakan corong pisah. Dengan menggunakan tiga pelarut yaitu n-heksan, etil asetat, dan methanol. ekstrak kental dimasukkan kedalam Erlenmeyer dan di larutkan dengan metanol. Setelah sampel larut, sampel dimasukkan ke dalam corong pisah dan ditambahkan pelarut n-heksan sebanyak. Sampel kemudian dikocok berulangkali dalam corong pisah hingga homogen. Sampel dibiarkan hingga membentuk dua lapisan yaitu lapisan metanol dan n-heksan. Masing-



masing



kedua



lapisan metanol dan n- heksan ditampung dalam



wadah yang berbeda. Lapisan n-heksan selanjutnya dipekatkan menggunakan oven hingga kering lalu ditimbang dengan timbangan analitik dan diperoleh fraksinat. Selanjutnya lapisan methanol dimasukkan kedalam corong pisah dan ditambahkan pelarut etil asetat sebanyak 100 mL. Sampel dibiarkan



membentuk dua lapisan yaitu lapisan metanol dan lapisan



etil asetat. Masing-masing kedua lapisan metanol dan etil asetat ditampung dalam wadah yang berbeda. Lapisan etil asetat dan methanol selanjutnya dipekatkan menggunakan oven hingga kering lalu ditimbang dengan timbangan analitik dan diperoleh fraksinat. e. Sterilisasi dan pembuatan media (Aslah dkk, 2019) 1. Sterilisasi alat Alat-alat gelas yang digunakan dalam penelitian ini disterilkan terlebih dahulu dengan menggunakan autoklaf pada suhu 1210C selama 15 menit. Pinset, jarum ose, dan L glass dipijarkan diatas api bunsen dan media disterilkan di autoklaf pada suhu 1210C selama 15 menit. 2. Pembuatan media Nutrient agar Ditimbang sebanyak 10,08 g nutrient agar kemudian



dilarutkan dengan aquades sampai 120 mL, diaduk sampai homogen. Media yang telah homogen kemudian disterilkan dengan menggunakan autoklaf pada suhu1210C selama 15 menit dan dibiarkan media sampai cukup dingin. Selanjutmya media nutrient agar yang masih cair dituang sebanyak 18 mL ke dalam cawan petri dibiarkan hingga memadat. 3. Pembuatan media agar miring Pembuatan agar miring dilakukan dengan memasukkan 10 mL media yang telah disterilkan dalam tabung reaksi kemudian disumbat dengan kapas steril dan dimiringkan sekitar 450. Diidiamkan hingga memadat pada suhu ruangan. Media agar miring digunakan sebagai peremajaan bakteri. f. Pembuatan suspense bakteri uji (Aslah dkk, 2019) Bakteri uji yaitu Streptococus mutans yang telah diinokulasi diambil kurang lebih 1 ose kemudian disuspensikan ke dalam tabung yang berisi 10 mL larutan NaCL 0,9%. g. Kontrol positif (Aslah dkk, 2019) Kontrol Positif untuk pengujian aktivitas antibakteri ini menggunakan Kloramfenikol paper disc. h. Pembuatan larutan uji (Aslah dkk, 2019)



Dibuat larutan stok dengan konsentrasi 100% dengan cara ditimbang 1 g fraksi metanol, fraksi etil asetat dan fraksi n- heksan kemudian masing-masing dilarutkan dengan akuades hingga 1 mL. Larutan uji fraksi metanol, fraksi etil asetat, fraksi n- heksan 20%, 30% dan 40% dibuat dengan cara mengambil masingmasing sebanyak 0,2 mL, 0,3 mL, 0,4 mL untuk setiap konsentrasinya dan dicukupkan volumenya dengan akuades hingga 1 mL. i. Pengujian aktivitas antibakteri (Aslah dkk, 2019) Pada penelitian ini digunakan metode difusi agar (disc diffusion Kriby and Bauer). Aktivitas penghambatan diuji pada bakteri Streptococus mutans 25922. Digunakan kertas cakram yang berukuran 6 mm untuk pengujian aktivitas antibakteri. Suspensi bakteri kemudian diinokulasikan ke dalam media dengan menggunakan L- glass dan dihomogenkan. Sampel yang telah ditentukan konsentrasinya 20%, 30%, dan 40% selanjutnya ditotolkan pada masing- masing kertas cakram. Masing-masing cawan petri diberi label sesuai dengan komponen pengujian. Kertas cakram yang terdiri dari kontrol positif dan kertas cakram yang telah ditotolkan larutan uji diletakkan dalam cawan petri dengan menggunakan pinset lalu diinkubasi selama 1 x 24 jam.



j. Pengamatan dan pengukuran zona bening (Aslah dkk, 2019) Pengamatan dilakukan setelah 1 x 24 jam masa inkubasi. Zona bening yang terbentuk sekitaran cakram menunjukkan kepekaan bakteri terhadap antibiotik atau larutan uji antibakteri sebagai bahan uji. Diameter zona bening diukur dalam satuan milimeter (mm) menggunakan jangka sorong. Kemudian zona bening yang telah diukur dibandingkan berdasarkan pedoman. k. Pengujian fraksi trakhir dengan metode KLT- bioautografi (Aslah dkk, 2019) Fraksi yang memiliki zona hambat yang paling besar dilakukan pemantauan KLT. Kemudian hasil pemantauan KLT dilakukan pengujian aktivitas antibakteri dengan metode KLTBioautografi. l. Persiapan plat KLT (Aslah dkk, 2019) Pemisahan senyawa dari fraksi teraktif dilakukan dengan menggunakan plat silika sebagai fase diam dengan ukuran 1 x 10 cm. Selanjutnya diberi tanda garis pada tepi atas dan bawah plat dengan jarak 1 cm untuk menunjukkan posisi awal totolan dan tepi atas sebagai tanda batas dari proses elusi. Selanjutnya plat



diaktifkan dengan cara dipanaskan pada suhu 1050 C selama 10 menit untuk menghilangkan kadar air yang terdapat pada plat KLT. m. Persiapan fase gerak (Eluen) (Aslah dkk, 2019) Eluen yang digunakan sebagai fase gerak yaitu kloroform : n-heksan (2:1). Eluen yang berada dalam chamber dijenuhkan terlebih dahulu dengan menggunakan kertas saring selama 10 menit, agar menyamakan tekanan uap pada seluruh bagian bejana. n. Penotolan sampel fraksi (Aslah dkk, 2019) Fraksi metanol dengan konsentrasi 30% ditotolkan pada tiga lempeng yang berbeda dengan jarak 1 cm dari tepi bawah plat dengan menggunakan pipa kapiler. Kemudian dikeringkan dengan cara diangin- anginkan. Lempeng pertama diamati dengan lampu UV 254 nm dan lampu UV 366 nm. Lempeng kedua disemprotkan reagen Aluminium Klorida (AlCl3) untuk melihat senyawa flavonoid dan lempeng ke tiga digunakan untuk uji bioautografi. o. Uji bioautografi (Aslah dkk, 2019) Sebanyak 10 ml medium nutrient agar dituangkan ke dalam cawan petri secara aseptis dan dibiarkan sampai media memadat kemudian sebanyak 20 μl mikroba uji diinokulasi ke dalam media.



Kromatogram hasil pemisahan senyawa secara KLT kemudian diletakkan di atas permukaan medium yang memadat. Didiamkan selama



30



menit



dilemari



pendingin,



kemudian



lempeng



(kromatogram) diangkat dan dikeluarkan dari medium. Selanjutnya diinkubasi selama1 x 24 jam pada suhu 370 C untuk pengamatan hasil. I. Analisa Data a. Jenis Data Jenis data dalam penelitian ini yaitu data nominal b. Sumber data 1. Data primer, yaitu data yang diperoleh dari hasil penelitian Laboratorium Mikrobiologi Terpadu Politeknik Bina Husada Kendari. 2. Data skunder, yaitu data yang diperoleh melalui literatur yang dapat digunakan sebagai penunjang ini pada usulan penelitian ini serta mendukung penelitian ini. c. Teknik Pengumpulan Data Teknik yang dipakai dalam pengumpulan data untuk penelitian ini adalah data yang diperoleh setiap tahap pengujian daya hambat bekteri Streptococus mutans secara observasi. d. Pengolahan Data Data yang diperoleh degan uji kursal wallis.



e. Penyaian Data Data yang diperoleh disajikan dalam bentuk tabel dan dijelaskan dalam bentuk narasi.



J. Skema Jalannya Penelitian 1.



Ekstraksi Rimpang meistera sp



Disortasi basah Dicuci Dirajang Dikeringkan Disortasi kering Diserbukkan



Maserasi Ditimbang Dilarutkan dengan metanol Didiamkan selama 3-5 hari sesekali diaduk remserasi Disaring



.



Ekstrak cair Dipekatkan di evaporator suhu 70°C



Ekstrak kental



2. Fraksi



Fraksinasi ekstrak rimpang meistera sp



Metode fraksi cair-cair Corong pisah Pelarut n-heksan, etil asetat dan methanol Dikocok berulang kali hingga homogen



Terbentuk dua lapisan



methanol, n-heksan Dipekatkan Dioven Ditimbang



Diperoleh fraksinat



3.



KLT-Bioautografi



Fraksi yang memiliki zona hambat yang paling KLT-Bioautografi besar dilakukan pemantauan KLT



Persiapan plat KLT



Persiapan fase gerak (Eluen)



Penotolan sampel fraksi



Uji bioautografi



Data