Identifikasi Asam Amino DG Kromatografi Kertas [PDF]

Citation preview

IDENTIFIKASI KANDUNGAN ASAM AMINO PADA SAMPEL DENGAN MENGGUNAKAN TEKNIK KROMATOGRAFI KERTAS Ni Nyoman Trisna Yanti Program Studi Analis Kimia, Jurusan Kimia, Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Universitas Pendidikan Ganesha E-mail : [email protected]



ABSTRAK Praktikum identifikasi kandungan asam amino pada sampel dengan menggunakan teknik kromatografi kertas dilakukan dengan tujuan untuk mengetahui perbandingan koefisien distribusi (Rf) dari berbagai asam amino terutama alanin, glisin, leusin, dan triptofan serta menentukan kandungan asam amino pada sampel melalui kromatografi kertas dengan teknik ascending. Metode yang digunakan adalah metode kualitatif dengan prinsip kerja kromatografi kertas. Hasil percobaan menunjukkan harga Rf dengan eluen n-butanol, aquadest dan asam asetat glasial adalah sebagai berikut; Rf sampel alanin 0.43, Rf sampel glisin 0.33, Rf sampel leusin 0.91 dan Rf sampel triptofan 0.80. Untuk harga Rf dengan eluen fenol dan aquadest adalah sebagai berikut; Rf sampel alanin 0.93, Rf sampel glisin 0.90, Rf sampel leusin 0.94 dan Rf sampel triptofan 0.66. Kata kunci : asam amino, eluen, kromatografi kertas, Rf ABSTRACT Practicum identification of amino acid content in the sample using paper chromatography techniques was carried out in order to determine the ratio of the distribution coefficient (Rf) of various amino acids, especially alanine, glycine, leucine, and tryptophan and determine the amino acid content in the sample via paper chromatography with ascending techniques. The method used is a qualitative method with the working principle of paper chromatography. The results showed that the Rf price with n-butanol, aquadest and glacial acetic acid eluents were as follows: the alanine sample Rf was 0.43, glycine sample Rf was 0.33, 0.91 leucine Rf sample and 0.80 tryptophan sample. The price of Rf with phenol and aquadest eluent was as follows: the Rf of the alanine sample was 0.93, the Rf of the glycine sample was 0.90, the Rf of the leucine sample was 0.94, and the Rf of the tryptophan sample was 0.66. Keywords: amino acids, eluents, paper chromatography, Rf



I. PENDAHULUAN Asam amino adalah senyawa yang mempunyai rumus umum + H3NCH – (R) COO-, bersifat ion dan hidrofil. Asam-asam amino saling berbeda gugus R-nya. Ada sekitar 20 macam asam amino penting yang merupakan pembentuk protein dan disebut asam amino hidrolisat, seperti Alanin (Ala), Arginin (Arg), Sistein (Sis), Glutamin (Gln), Asam glutamat (Glu), Glisin (Gly), Histidin (His), Isoleusin (Leu), Lisin (Lys), Metionin (Met), Fenilalanin (Phe), Prolin (Pro), Serin (Ser), Treonin (Thr), Triptofan (Trp) Tirosin (Tyr), dan Valin (Val). Cara analisis asam amino yang masih lazim digunakan sampai saat ini adalah kromatografi dengan berbagai macam teknik seperti kromatografi kertas, lapis tipis, dan kolom. Kromatografi adalah salah satu metode pemisahan kimia yang didasarkan pada adanya perbedaan partisi zat pada fase diam (stationary phase) dan fase gerak (mobile phase). Fase gerak membawa zat terlarut lainnya yang terelusi lebih awal atau lebih akhir. Fase diam dapat bertindak sebagai penyerap, seperti alumina dan silika gel atau dapat bertindak melarutkan zat terlarut sehingga terjadi partisi antara fase diam dan fase gerak. Dalam proses ini suatu lapisan cairan pada penyangga yang inert berfungsi sebagai fase diam. Dalam kromatografi selalu terdapat salah satu kecenderungan sebagai berikut; (a) kecenderungan



molekul-molekul komponen untuk melarut dalam cairan; (b) kecenderungan molekul-molekul komponen untuk melekat pada permukaan padatan halus; (c) kecenderungan molekul-molekul komponen untuk bereaksi secara kimia (penukar ion); (d) kecenderungan molekul-molekul terelusi pada poripori fasa diam. Pemisahan terjadi berdasarkan perbedaan migrasi zat-zat yang menyusun suatu sampel. Hasil pemisahan dapat digunakan untuk keperluan identifikasi untuk analisis kualitatif, penetapan kadar untuk analisis kuantitatif, pemurnian suatu senyawa (Soebagio, dkk, dalam Tika,2010). Kromatografi kertas dapat digunakan untuk mengidentifikasi asam amino yang terdapat dalam suatu sampel. Hal ini pertama kali dilakukan oleh seorang kimiawan Inggris Richard Laurence Millington Synge (1914-1994). Senyawa kompleks yang tersusun atas asam amino dapat disederhanakan dengan menggunakan metode kromatografi kertas. Saat campuran asam amino menaiki lembaran kertas secara vertical karena ada fenomena kapiler, partisi asam amino antara fasa mobil dan fase diam (air) yang teradsorbsi pada seulosa berlangsung berulang-ulang. Ketika pelarut mencapai ujung atas kertas proses dihentikan. Setiap asam amino bergerak dari titik awal sepanjang jarak tertentu. Dari nilai Rf, masing-



masing asam amino dapat diidentifikasi. Setiap komponen memiliki harga Rf tertentu. Besaran Rf merupakan derajat retensi suatu komponen dalam fasa diam. Karena itu, Rf juga disebut dengan faktor retensi. Harga Rf dapat dihitung dengan jarak yang ditempuh oleh komponen dibagi dengan jarak tempuh eluen (Tika,2010). Rf



250 mL (1 buah) dan statif dan klem (1 buah). Bahan Bahan-bahan yang digunakan dalam praktikum ini adalah kertas kromatografi, larutan n-butanol (100 mL), asam asetat glacial (24 mL), larutan sampel alanin, glisin, leusin, triptofan (masing-masing 2 mL), larutan Ninhidrin, aquadest (200 mL), dan fenol 2,5 % (20 mL).



jarak yang ditempuh komponen dari garis dasar Jarak yang ditempuh eluen dari garis dasar Prosedur kerja



II. METODE Metode yang digunakan adalah dengan melakukan percobaan kualitatif di laboratorium. Percobaan identifikasi kandungan asam amino pada sampel dengan menggunakan teknik kromatografi kertas ini dilakukan di Laboratorium Analis Kimia Program Studi Analis Kimia, Universitas Pendidikan Ganesha Singaraja pada tanggal 21 September 2018. Alat Alat-alat yang digunakan dalam praktikum ini adalah pipa kapiler (4 buah), ruang kromatografi (1 buah), gelas kimia 250 mL (1 buah), gelas kimia 100 mL (1 buah), batang pengaduk (2 buah), spatula (1 buah), penggaris (1 buah), gunting (1 buah), pinset (1 buah), pensil (1 buah), pipet tetes (2 buah), alat pengering (1 buah), money detector (1 buah), corong pisah



a. Pembuatan Larutan Eluen Campuran n-Butanol Sebanyak 100 mL larutan nbutanol ditambahkan 100 mL aquadest dan 24 mL asam asetat glacial. Ketiga larutan tersebut ditempatkan ke dalam corong pisah dan dikocok. Kedua lapisan yang terbentuk kemudian dipisahkan. b. Penyiapan Kertas Kromatografi Kertas kromatografi disiapkan dengan ukuran yang disesuaikan dengan wadah kromatografi. Pada bagian dari tepi bawah kertas ditandai sekitar 1,5 cm dengan menggunakan pensil. c. Proses Kromatografi dengan Menggunakan Eluen Fenol Kertas kromatografi dengan ukuran 8,5 x 10 cm ditotolkan dengan larutan sampel yaitu larutan alanin, glisin, leusin, triptofan dengan menggunakan pipet kapiler. Jarak totolan antara satu dengan yang lain



adalah 1,5 cm. Perlu diperhatikan tiap tetesan harus dikeringkan terlebih dahulu dengan diangin-anginkan sebelum tetesan berikutnya ditotolkan. Besar noda hendaknya jangan melebihi 0,4 cm. Kertas dijaga bersih dan sedapatnya tidak tersentuh jari. Selanjutnya, kertas digantungkan dalam ruang kromatografi yang sudah berisi eluen (fenol: aquadest) yang sudah dijenuhkan selama beberapa jam agar elusi dapat berjalan. Setelah larutan elusi berjalan kurang lebih 10 cm dari batas sampel, elusi dihentikan dan kertas kromatografi dikeluarkan dari ruang kromatografi. Kemudian batas larutan ditandai dengan pensil dan kertas kromatografi dikeringkan menggunakan alat pengering. Setelah itu, kertas yang telah dikeringkan disemprot dengan larutan ninhidrin yang selanjutnya dikeringkan kembali dengan alat pengering. Kemudian dilihat noda-noda yang terbentuk menggunakan alat money detector dan diukur jarak eluen dengan jarak warna yang dibentuk. Sehingga diperoleh nilai Rf. d. Proses Kromatografi dengan Menggunakan Eluen Campuran nButanol, Aquadest dan Asam Asetat Glasial



Kertas kromatografi disiapkan dengan ukuran 8,5 x 10 cm dan ditandai dengan pensil 1,5 cm dari tepi bawah. Kemudian dengan pipa kapiler ditotolkan larutan sampel (larutan alanin, glisin, leusin, triptofan) dengan jarak 1,5 cm. larutan ujung terletak 2 cm dari pinggir kertas. Setiap totolan sampel satu dengan yang lain diberikan jarak yang cukup. Sedangkan besar noda tidak melebihi diameter 0,4 cm. Kemudian kertas bersih dan sedapat mungkin jangan disentuh oleh jari, maka digunakan pinset. Setelah ruang kromatografi telah jenuh oleh uap eluen maka kertas tersebut digantungkan dalam ruang kromatografi dan dicelupkan tepi bawah kertas kromatografi dalam eluen. Elusi sampel kira-kira eluen menempuh jarak 10 cm. setelah itu elusi dihentikan dan ditandai jarak noda yang terbentuk setelah elusi oleh eluen dengan pensil. Kertas kromatografi selanjutnya dikeringkan menggunakan alat penggaris. Lalu kertas disemprotkan dengan larurtan ninhidrin dan dikeringkan kembali menggunakan alat pengering selama 5 menit. Noda-noda asam amino akan terlihat. Selanjutnya dapat dihitung harga Rf nya.



III. HASIL DAN PEMBAHASAN Hasil pengamatan  Eluen ( Fenol 20 mL : Aquadest 8 mL) Jarak tempuh ( cm) No Sampel Eluen Noda



Nilai Rf



Warna noda



1 2 3 4



Larutan Triptofan Larutan Leusin Larutan Alanin Larutan Glisin 



No 1 2 3 4



8,3 8,3 8,3 8,3



5,5 7,8 7,7 7,5



0,66 0,94 0,93 0,90



Violet Violet Violet Violet



Eluen (100 mL n-butanol : 100 mL aquadest : 24 mL asam asetat glasial)



Sampel Larutan Triptofan Larutan Leusin Larutan Alanin Larutan Glisin



Jarak tempuh ( cm) Eluen Noda 8,5 6,8 8,5 7,7 8,5 3,7 8,5 2,8



Pembahasan Percobaan identifikasi kandungan asam amino pada sampel dengan menggunakan teknik kromatografi kertas ini menggunakan dua jenis eluen. Eluen pertama yaitu campuran n-butanol, aquadest dan asam asetat glasial, sedangkan eluen kedua yaitu campuran fenol dan aquadest. Kertas kromatografi disiapkan dua buah sesuai dengan prosedur kerja. Kertas pertama ditotolkan larutan sampel (larutan alanin, glisin, leusin dan triptofan). Jarak antara sampel kurang lebih 1,5 cm yang bertujuan agar sampel yang ada tidak saling tercampur pada saat proses kromatografi dilakukan. Eluen pertama terdiri dari fenol dan aquadest. Fenol bersifat non polar dan aquadest bersifat polar. Sedangkan eluen kedua terdiri atas n-butanol, aquadest dan asam asetat glasial. Ketika larutan dicampurkan terbentuk dua lapisan. Hal ini terjadi karena nbutanol bersifat non polar sedangkan



Nilai Rf 0,80 0,91 0,43 0,33



Warna noda Violet Violet Violet Violet



asam asetat glacial dan air bersifat polar sehingga asam asetat dan air akan saling bercampur. Eluen dimasukkan ke dalam ruang kromatografi yang sebelumnya sudah dijenuhkan. Penjenuhan ini dilakukan untuk mempercepat proses elusi oleh eluen. Kemudian kedua kertas kromatografi yang telah berisi sampel juga dimasukkan ke dalam ruang kromatografi. Mekanisme yang terjadi yaitu komponen polar dari eluen yaitu air akan teradsorpsi pada kertas tersusun atas selulosa. Molekulmolekul air yang bersifat polar akan terdistribusi pada permukaan kertas sebagai fase diam. Pada saat fase diam (polar) ini dilewati oleh eluen yang bersifat nonpolar (n-butanol dan fenol), akan terjadi pemisahan sampel yang disebabkan oleh perbedaan distribusi asam amino yang menyusun campuran asam amino dalam fase gerak dan air (fase diam). Pada saat percobaan, kertas kromatografi tidak boleh disentuh dengan tangan karena tangan manusia



menghasilkan zat organik. Salah satunya adalah asam amino yang dapat mengganggu dalam pengamatan perhitungan Rf. Elusi dihentikan ketika eluen telah menempuh jarak kurang lebih 10 cm dari tempat sampel ditotolkan. Kemudian kertas diambil dari ruang kromatografi. Jarak yang ditempuh oleh sampel dapat dilihat



pada gambar 1. Pada percobaan identifikasi kandungan asam amino pada sampel dengan menggunakan teknik kromatografi ini menggunakan metode ascending. Kromatografi ascending merupakan kromatografi kertas dimana arah fase geraknya menarik, dengan memanfaatkan gaya kapiler.



(a) (b) Gambar 1. (a) kromatogram dengan campuran eluen fenol dan aquadest yang disemprotkan ninhidrin, (b) kromatogram dengan campuran eluen n-butanol dan aquadest dan asam asetat glasial disemprotkan ninhidrin



Asam amino merupakan zat tidak berwarna, sehingga untuk mengetahui letak noda diperlukan pereaksi lokasi yaitu larutan ninhidrin. Kromatogram yang masih basah dikeringkan dengan hot air gun. Hal ini dilakukan agar ninhidrin yang akan disemprotkan dapat bereaksi dengan asam amino. Setelah kromatogram kering, larutan ninhidrin disemprotkan ke kromatogram dan dikeringkan lagi. Hasilnya adalah terbentuk warna violet pada kromatogram yang menunjukkan jarak tempuh sampel. Hal ini



membuktikan bahwa asam amino bereaksi dengan ninhidrin membentuk aldehida dengan satu atom C lebih rendah dan melepaskan molekul NH3 dan CO2. Ninhidrin yang telah bereaksi akan membentuk hidrindantin yang hasil positifnya ditandai dengan terbentuknya kompleks berwarna violet yang disebabkan oleh molekul ninhidrin dan hidrindantin yang bereaksi dengan NH3 setelah asam amino dioksidasi. Reaksi yang terjadi antara asam amino dengan ninhidrin dapat dilihat pada gambar 2.



Gambar 2. Reaksi pembentukan kompleks berwarna violet antara ninhidrin dan asam amino



Dari hasil percobaan kromatografi ini diketahui jarak tempuh masing-masing eluen. Jarak yang ditempuh eluen campuran n-butanol, aquadest dan asam asetat glasial pada sampel adalah 8,5 cm. Sedangkan jarak yang ditempuh oleh eluen campuran fenol dan aquadest adalah 8,3 cm. Nilai Rf masing-masing sampel untuk eluen campuran n-butanol, aquadest dan asam asetat glasial yaitu larutan alanin (0,43), glisin (0,33), leusin (0,91) dan triptofan (0,80). Sedangkan nilai Rf masing-masing sampel dari eluen campuran fenol dan aquadest yaitu larutan alanin (0,93), glisin (0,90), leusin (0,94), dan triptofan (0,66). Perbedaan nilai Rf ini dipengaruhi oleh jarak tempuh sampel yang berbeda-beda. Perbedaan jarak tempuh ini dipengaruhi oleh perbedaan pelarut dan kelarutan dari masing-masing komponen warna penyusunnya. Komponen yang lebih mudah larut (teradsorpsi) akan lebih cepat bergerak naik kea rah atas kertas saring. Sedangkan untuk komponen yang kurang larut dalam fase gerak akan bergerak lambat dan akan tertinggal. Secara literatur, nilai Rf standar yang dimiliki alanin yaitu 0.38, glisin



yaitu 0.26, leusin yaitu 0.66 dan triptofan yaitu 0.68. hal ini berbeda dengan nilai Rf yang diperoleh pada saat percobaan. Hal ini disebabkan oleh beberapa faktor yaitu komposisi eluen yang digunakan, perbedaan ukuran kertas kromatografi, dan keterkaitan analit dengan eluen sehingga hal ini yang membedakan nilai Rf standar dengan nilai Rf yang diperoleh dalam percobaan.



IV. KESIMPULAN Dari hasil percobaan dan pembahasan yang telah dilakukan dapat disimpulkan bahwa nilai Rf yang dihasilkan dari masing-masing sampel asam amino dengan eluen campuran nbutanol, aquadest dan asam asetat glasia yaitu larutan alanin (0,43), glisin (0,33), leusin (0,91) dan triptofan (0,80) l. Sedangkan nilai Rf dari masing-masing asam amino dengan eluen campuran fenol dan aquadest yaitu larutan alanin (0,93), glisin (0,90), leusin (0,94), dan triptofan (0,66).



V. UCAPAN TERIMA KASIH



Ucapan terima kasih penulis sampaikan kepada Dr. I Nyoman Tika, M.Si., sebagai dosen pengampu mata kuliah praktikum biokimia, I Made Wirahadi Kusuma, S.Pd selaku asisten dosen dan Ni Putu Lilik Pratami, S.Si selaku laboran di Prodi Analis Kimia atas masukan dan sarannya selama praktikum sehingga dapat berjalan dengan lancar. VI. DAFTAR PUSTAKA Fessenden & Fessenden. 2010. Fundamentals of Organik Chemistry alih bahasa Dra.Sukmariah Maun, dkk. Jakarta : Binarupa Aksara Publisher Tika , I Nyoman. 2010. Penuntun praktikum Biokimia. Singaraja : Universitas Pendidikan Ganesha Yazid, Estien. 2005. Kimia Fisik untuk Paramedis. ANDI : Yogyakarta.