Laporan P3 - Zimografi Bagasek [PDF]

Citation preview

Laporan Praktikum KI-3161 Struktur dan Fungsi Biomolekul Percobaan 3 Kajian Struktur Fungsi Protein Pengamatan Denaturasi dan Renaturasi α-Amilase dengan Zimografi Nama



: M. Satria Yudha Bagaskara



NIM



: 10516042



Shift / Kelompok



: Jumat / 04



Tanggal Percobaan



: 05 Oktober 2018



Tanggal Pengumpulan : 12 Oktober 2018 Asisten



: Indah (10513056 )



LABORATORIUM BIOKIMIA PROGRAM STUDI KIMIA FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM INSTITUT TEKNOLOGI BANDUNG 2018



Percobaan 3 Kajian Struktur Fungsi Protein : Pengamatan Denaturasi dan Renaturasi α-Amilase dengan Zimografi



I.



Tujuan Percobaan



1.1.Menentukan aktivitas enzim α-amilase dengan metode SDS PAGE yang disertai dengan visualisasi melalui Teknik Zimografi 1.2.Menentukan pengaruh denaturasi-renaturasi terhadap aktivitas dari enzim α-amilase



II.



Teori Dasar



Protein (asal kata protos dari bahasa Yunani yang berarti "yang paling utama") adalah senyawa organik kompleks berbobot molekul tinggi yang merupakan polimer dari monomer asam amino yang dihubungkan satu sama lain dengan ikatan peptide. Protein memiliki struktur tertentu yaitu struktur primer, sekunder, tersier dan kuarterner. Protein akan bersifat aktif bila membentuk struktur tertingginya. Struktur primer dari protein terbentuk akibat ikatan peptide antar asam amino penyusunnya, struktur sekunder terbentuk dari ikatan hidtogen antara oksigen pada karbonil dan hydrogen pada amida yang berjarak 3 sampai 4 residu asam amino. Struktur tersier dapat distabilkan oleh empat macam ikatan yaitu ikatan hydrogen, kovalen, ionik, dan ikatan hidrofobik. Struktur kuartener protein adalah bagaimana sub unit yang berorientasi dan diatur terhadap satu sama lain. Dalam protein dengan lebih dari satu subunit, interaksi lemah antara subunit membantu menstabilkan struktur keseluruhan. Denaturasi protein dapat terjadi akibat beberapa faktor yaitu suhu, pH, penambahan logam berat, penambahan surfaktan. Pada suhu yang tinggi ikatan pada protein dapat terputus karena molekul semakiin energetic, pH dapat mempengaruhi distribusi muatan dari penyusun protein sehingga akan mengganggu interaksi penstabil dari struktur 3D, logam berat mampu mengganggu jembatan garam pada protein, surfaktan juga dapat menganggu ikatan nonpolar yang ada pada protein sehingga folding pada protein akan rusak dan terjadi denaturasi. Proses pembentukan kembali struktur protein menjadi bentuk aktifnya/ kembali menjadi bentuk native dapat disebut sebagai proses renaturasi. Zimografi dilakukan untuk menentukan aktifitas dari enzim α- amilase.



III.



Data Pengamatan



3.1.Hasil SDS PAGE menggunakan Staining Coomassie



M



Gambar 1. SDS PAGE dari Sampel A,B,C dengan Staining Coomassie Dengan keterangan gambar tertera pada tabel berikut. Tabel 1. Keterangan Pada SDS PAGE Simbol



Keterangan



A



Enzim + SDS + Didiamkan 10 menit



B



Enzim + Buffer Fosfat pH 7.0 + Pemanasan 100℃ + Sentrifugasi



C



Enzim + Buffer Fosfat pH 7.0 + Inkubasi 40℃



M



Marker



3.2.Hasil SDS PAGE dengan Zimogram dan Hasil Renaturasi



Gambar 2. Hasil Zimogram dan Renaturasi dari α-Amilase dengan SDS PAGE Dengan keterangan gambar tertera pada tabel berikut. Tabel 2. Keterangan Pada SDS PAGE



IV.



Simbol



Keterangan



A



Enzim + SDS + Didiamkan 10 menit



B



Enzim + Buffer Fosfat pH 7.0 + Pemanasan 100℃ + Sentrifugasi



C



Enzim + Buffer Fosfat pH 7.0 + Inkubasi 40℃



Pembahasan



Enzim Amilase adalah enzim pencernaan yang berfungsi untuk mengubah / memecah pati / amilum menjadi molekul gula yang lebih sederhana. Ada dua jenis utama: alpha dan beta. Alphaamilase ditemukan dalam air liur manusia, di mana ia memulai proses kimia dalam pencernaan dengan hidrolisis pati. Alpha-amilase juga ditemukan dalam pankreas. Beta-amilase ditemukan dalam biji beberapa tanaman, serta bakteri, ragi, dan jamur. Amilase juga ditemukan pada hewan lain yang menggunakannya untuk membantu proses pencernaan. Enzim ini mulai bekerja di mulut



ketika makanan dikunyah, memecah ikatan polisakarida yang memiliki kaitan sama untuk membuat rantai molekul pati. Pati alami mengandung glukosa, di mana tubuh memisahkannya agar dapat memberikan nutrisi yang tepat ke aliran darah. Dengan memutus dan memisahkan berbagai ikatan dalam pati, amilase dapat mengekstrak gula sehingga dapat disimpan dalam tubuh. Pada percobaan ini akan dianalisis aktivitas dari enzim α-amilase dengan metode SDS PAGE melalui Teknik Zimografi. Elektroforesis merupakan suatu cara untuk memisahkan fraksi-fraksi suatu campuran berdasarkan atas pergerakan partikel koloid yang bermuatan di bawah pengaruh medan listrik. Pertama dibuat terlebih dahulu gel SDS PAGE, pembuatan gel SDS PAGE dimulai dengan pembuatan separating gel terlebih dahulu karena separating gel terletak dibagian bawah dari gel SDS PAGE sehingga akan lebih optimal jika gel tersebut dibuat terlebih dahulu. Separating gel terdiri dari APS 10%, Buffer Tris pH 8.8, TEMED, dH2O, Akrilamida 40%. Gel pada SDS PAGE terbentuk dari reaksi polimerisasi Akrilamida menjadi Poliakrilamid , pada reaksi polimerisasi berjalan secara radikal, ammonium persulfat (APS) berfungsi sebagai sumber radikal



dan inisiator dalam proses



polimerisasi gel akrilamid. N,N,N’,N’-Tetra Metil Etilen Diamin (TEMED) berfungsi sebagai katalisator dalam proses polimerisasi gel akrilamid dan sebagai penstabil dari radikal agar gel dapat terbentuk. Buffer Tris pH 8.8 dapat membantu proses migrasi dari protein. Akrilamida berfungsi sebagai monomer agar terbentuk gel poliakrilamid. Kemudian dibuat stacking gel yang berfungsi sebagai tempat mencetak well (sumur) sebagai tempat dimasukannya sampel , stacking gel juga berfungsi untuk menahan protein sementara agar dapat di run secara bersamaan agar dapat dibandingkan satu sama lain. Penempatan dari separating gel dan stacking gel tidak boleh dibalik, karena kedua gel tersebut memiliki perannya masing masing terhadap protein yang akan di analisis, bila separating gel diletakan diatas maka proses analisis tidak akan berjalan dengan baik karena protein tidak dapat di run secara bersamaan sehingga tidak dapat dibandingkan dan protein akan langsung mengalami pemisahan. Ditunggu beberapa saat sehingga gel mengeras dan siap untuk digunakan, jika gel yang digunakan belum mengeras maka protein tidak dapat terpisah dengan baik dan pita yang dihasilkan juga tidak dapat terlihat dengan baik. Disiapkan 3 sampel enzim yang diberikan perlakuan yang berbeda beda. Sampel A merupakan enzim yang diberikan SDS sehingga enzim pada sampel A mengalami denaturasi. SDS merupakan senyawa surfaktan, SDS dapat mendenaturasi protein, bagian luar dari struktur tersier protein



bersifat hidrofil dan bagian interior dari protein bersifat hidrofobik, dengan adanya SDS folding dari struktur tersier ini akan terbuka akibat dari SDS yang mampu bereaksi dengan gugus non polar pada protein.



Gambar 3. SDS Mendenaturasi Protein (Sumber : https://www.biologyexams4u.com/2014/07/function-of-sds-in-dna-extraction-and.html#.W7yURGgzY2w )



Akibat dari penambahan SDS, protein akan mengalami denaturasi dan protein akan bermuatan negatif. Sampel B diberikan buffer fosfat untuk menstabilkan dan mengoptimalkan enzim αamilase, kemudian dipanaskan 100℃, pada tahap ini enzim akan terdenaturasi secara keseluruhan karena perlakuan dari suhu yang sangat ekstrim, pemanasan secara ekstrim akan melepaskan ikatan pada molekul protein secara keseluruhan. Pada sampel C enzim diberikan busfer fosfat kemudian dilakukan inkubasi 40℃, pada proses ini eznim akan mengalami denaturasi secara parsial namun mayoritas enzim masih ada dalam keadaaan native-nya. Dipipet ketiga sampel ini sebanyak 15µL, banyaknya sampel perlu disamakan agar dapat dibandingkan hasilnya satu sama lain. Ditambahkan loading buffer kedalam ketiga sampel tersebut, loading buffer ini berfungsi sebagai pemberat yang akan membantu protein untuk bermigrasi kebawah/ menuju kutub positif. Dilakukan penambahan SDS-running buffer yang berfungsi sebagai medium agar listrik dapat dihantarkan dan berfungsi pula sebagai penjaga pH sistem. Dimasukan sampel dan marker kedalam well yang telah tersedia pada gel untuk dinalaisis, Elektroforesis ini dilakukan selama 45 menit agar proses pemisahan dari protein berjalan lebih optimal. Gel telah di elektroforesis akan dianalisis lebih lanjut dengan perlakuan yang berbeda, Gel 1 yang berisi marker, sampel A, sampel B dan sampel C di rendam dalam staining Coomassie.



Penambahan zat warna ini bertujuan agar pita yang yang terbentuk dr proses pemisahan protein lebih jelas terlihat sehingga dapat ditentukan dan dibandingkan massa molekulnya terhadap marker, kemudian gel ini rendam dalam air agar warna dari pita yang terbentuk terlihat lebih jelas. Gel 2 dan gel 3 akan dilakukan analisis dengan teknik Zimografi. Analisis zimografi dilakukan untuk menentukan aktifitas dari protein, analisi zimografi ini dilakukan dengan menentukan kemampuan dari enzim dalam menghidrolisis substrat dalam percobaan ini akan ditentukan aktifitas dari enzim menghidrolisis pati oleh α-amilase. Pati dapat berikatan kompleks dengan KI/I2 dan menghasilkan senyawa kompleks pati-𝐼3− berwarna biru. Gel 2 dan gel 3 diberi perlakuan yang berbeda, gel 2 di rendam dalam air sedangkan gel 3 direndam dalam buffer fosfat pH 7.0 selama 5 menit, sehingga dapat diketahui bahwa gel 2 tidak dilakukan proses renaturasi sedangkan pada gel 3 dilakukan renaturasi, gel 3 dapat terenaturasi karena pH optimum dari α-Amilase adalah 7 (Murray RK, 2009), kemudian kedua gel direndam dalam larutan pati dan dituangkan larutan KI/I2 untuk mengetahui aktifitas dari enzim pada gel. Secara teoritis untuk gel 2 akan menghasilkan pita/noda pada gel berwarna biru, untuk sampel A enzim telah terdenaturasi akibat penambahan SDS sehingga enzim tidak mampu menghidrolisis pati, dan akan muncul noda/pita warna biru hasil kompleks antara pati dan KI/I2. Untuk sampel B sama halnya dengan sampel A, noda yang dihasilkan akan brwarna biru gelap akibat enzim sudah tidak aktif untuk menghidrolisis pati akibat pemberian suhu 100℃. Untuk sampel C hasil yang didapatkan akan sama pula yaitu noda biru akibat enzim sudah tidak aktif, pada sampel C diberikan perlakuan pemanasan 40℃ yang menyebabkan enzim terdenaturasi parsial, namun saat dimasukan kedalam gel enzim akan terdenaturasi secara keseluruhan akibat adanya SDS sehingga enzim menjadi tidak aktif dan tidak mampu untuk menghidrolisis pati. Secara teoritis untuk gel 3, sampel A yang diberikan SDS mampu terenaturasi karena seyelah pemberian pH 7.00 maka SDS mampu terlepas dari protein sehingga protein akan menciptakan folding menjadi struktur native-nya sehingga akan memunculkan pita bening karena enzim telah teraktifkan kembali sehingga pati akan terhidrolisis dan tidak akan meberikatan kompleks dengan KI/I2. Untuk sampel B sulit unutuk direnaturasi karena pada suhu 100℃ seluruh ikatan telah putus secar keseluruhan maka diperlukan energi yang cukup besar unutk merenaturasi struktur dari protein tersebutm, sehingga akan memberikan noda biru karena enzim tidak aktif dan pati dapat berikatan kompleks dengan KI/I2. Sampel C akan menghasilkan hasil yang sama seperti sampel A karena dapat terenaturasi kembali akibat SDS akan melepaskan ikatannya. Namun dari hasil yang didapat ternyata kedua gel



menghasilkan visualisasi yang tergolong sama hal ini dapat disebabkan pada proses analisis dilakukan pada tempat yang sama, Saat gel 2 akan ditambahkan larutan KI/I2 , gel 2 dan gel 3 digabung pada tempat yang sama yaitu gel 2 ditempatkan pada wadah gel 3 yang sebelumnya direndam dengan buffer pH fosfat , sehingga ada kemungkinan gel 2 mengalami renaturasi seperti gel 3, namun renaturasinya tidak seoptimal pada gel 3 terlihat dari warna gel yang dihasilkan. Pada analisis SDS PAGE dengan staining Coomassie didapatkan bahwa massa molekul protein dalam sampel A dan C bernilai sama yaitu sekitar 45.0 kDa sedangkan pada B massa molekul protein dalam sampel adalah 66.2 kDa.



V.



Kesimpulan



Pengaruh dari denaturasi adalah enzim tidak mampu untuk menghidrolisis pati sehingga pada SDS PAGE akan memunculkan noda/pita berwarna biru karena pati dapat berikatan kompleks dengan KI/I2 dalam bentuk pati-𝐼3− . Enzim yang dapat direnaturasi akan menghasilkan hasil noda bening pada SDS PAGE karena pati telah terhidrolisis dan tidak dapat berikatan kompleks KI/I2. Enzim yang terenaturasi akan memiliki aktifitasnya dalam menghidrolisis pati sedangkan yang terdenaturasi tidak dapat menghidrolisi pati. VI.



Daftar Pustaka



Anna dan Supriyanti, F.M Titin.2009. Dasar Dasar Biokimia. Jakrta: Erlangga Clark, J. M. 1964. Experimental Biochemistry. W. H. Freeman and Co. hal 52 -54 Kleiner, D.E. dan W.G.S. Stevenson.1997. Quantitative Zymography: Detection of Picogran Quantities of Gelatinases. Anal. Biochem.228 : 325‐329. Leber ,T.M. dan Balkwil, F.R. 1997. Zymography : A single‐step Staining Method for Quantitative of Proteolytic Activity on Substrat Gels. Anal. Biochem. 249:24‐28. Lehninger, Albert L.; Nelson, David L.; and Cox, Michael . (2000). Lehninger Principles of Biochemistry, 5th ed. New York: Worth Publishers. Murray RK, Graner DK, Rodwell VW. 2009. Biokimia Harper edisi 27. Jakarta: EGC Poedjaji. Vandooren, J. ; Geurts, N.; Martens, E.; Van den Steen, P. E.; Opdenakker, G. (2013). Zymography methods for visualizing hydrolytic enxymes. Nat Methods, 10(3): 211-220.