Laporan Praktikum I Bacillus SP [PDF]

Citation preview

LAPORAN PRAKTIKUM I Isolasi dan Identifikasi Bacillus sp.



Kelompok : B2 Semester : IV (Empat)



D-IV ANALIS KESEHATAN POLTEKKES KEMENKES MATARAM MATARAM 2015/2016 Nama Anggota Kelompok : 1. 2. 3. 4. 5. 6.



Anisa Noviana Aprilia Prastika Ari Kurniawati Baiq Arum Palawangan Baiq Evianita Putri Diah Ayu Rizki Setyaningtyas



7. Divika Suci 8. Emaliana 9. Fatmawati Riskiantini 10. Hana Fatinah 11. Ida Eliza 12. Indriyani Novia Santika 13. Komang Ari Andryani 14. Lale Nurkhaeratul M 15. Lalu Ahmad Afifi 16. Maulina Dewi Nova Yanti 17. Mustika Dewi 18. Nurul Azmi 19. Petrus Nurman F 20. Putu Anggi Widia Karmany 21. Riadun Nupus 22. Romi Adipranata 23. Siti Nurlia Ramdani 24. Wiwin Safitri



1



ISOLASI DAN IDENTIFIKASI Bacillus sp. I.



Tujuan Untuk dapat mengisolasi dan mengidentifikasi Bacillus sp.



II.



Prinsip Kerja Memisahkan satu spesies mikroorganisme dengan spesies mikroorganisme lainnya untuk mendapatkan koloni murni sehingga dapat dilakukan identifikasi terhadap spesies tersebut.



III.



Landasan Teori Bacillus sp merupakan bakteri berbentuk batang, tergolong bakteri gram positif, motil, menghasilkan spora yang biasanya resisten pada panas, bersifat aerob (beberapa spesies bersifat anaerob fakultatif), katalase positif, dan oksidasi bervariasi. Tiap spesies berbeda dalam penggunaan gula, sebagian melakukan fermentasi dan sebagian tidak (Anon, 1993). Bentuk spora (endospora) Bacillus bervariasi bergantung pada spesiesnya. Endospora ada yang lebih kecil dan ada juga yang lebih besar dari pada diameter sel induknya. Pada umumnya sporulasi terjadi bila keadaan medium memburuk, zat-zat yang timbul sebagai pertukaran zat yang terakumulasi dan faktor luar lainnya yang merugikan (Utara, 1994). Menurut Bergey's Manual of Determinative Bacteriology, 8 th editions dalam Anon (1993) kalsifikasi Bacillus spp. adalah sebagai berikut: Kingdom : Procaryotae Divisi : Bacteria Kelas : Schizomycetes Bangsa : Eubacteriales Suku : Bacillaceae Marga : Bacillus Jenis : Bacillus spp. Sel-sel Bacillus berukuran 1 x 3 – 4 μm, mempunyai ujung yang berbentuk empat persegi dan tersusun dalam rantai panjang; spora terletak di tengah basil yang tidak bergerak. Basil saprofit menggunakan sumber nitrogen dan karbon sederhana untuk energi dan pertumbuhannya. Sporanya resisten terhadap perubahan lingkungan, tahan terhadap panas kering dan disinfektan kimia tertentu selama waktu yang cukup lama, dan dapat bertahan selama bertahun-tahun dalam tanah kering. Produk hewan yang terkontaminasi dengan spora antraks (misalnya kulit, bulu, rambut, tulang, wool) hanya dapat disterilkan dengan autoklaf (Jawetz et al., 1996). Kebanyakan anggota genus ini adalah organisme saprofit yang lazim terdapat dalam tanah, air, udara, dan tumbuh-tumbuhan, seperti Bacillus cereus dan Bacillus 2



subtilis. Beberapa di antaranya patogen bagi insekta. B cereus dapat tumbuh pada makanan dan menghasilkan enterotoksin yang menyebabkan keracunan makanan. Organisme ini kadang-kadang dapat penyakit pada orang dengan fungsi imun yang terganggu (misalnya meningitis, endokarditis, endoftalmitis, konjungtivitis, atau gastro enteritis akut). Bacillus anthracis, penyebab antraks, adalah bakteri patogen utama genus ini (Jawetz et al., 1996). 1. Bacillus anthracis a. Struktur Antigen Bahan simpai B anthracis terdiri atas polipeptida berbobot molekul tinggi yang mengandung asam D-glutamat, adalah suatu hapten. Badan bakteri mengandung protein dan suatu polisakarida somatis, keduanya bersifat antigenik. b. Patogenesis Antraks merupakan penyakit pada biri-biri, sapi, kuda dan hewan lainnya; manusia jarang terserang. Infeksi biasanya didapat dengan masuknya spora melalui luka pada kulit atau selaput lendir, jarang dengan inhalasi spora ke dalam paru-paru. Pada hewan pintu masuknya adalah mulut dan saluran pencernaan. Spora dari tanah yang tercemar mudah masuk bila termakan bersama tumbuhan berduri atau yang merangsang. Pada manusia, goresan pada kulit atau inhalasi menyebabkan timbulnya infeksi. Spora tumbuh pada jaringan di tempat masuk, dan pertumbuhan organisme vegetatif mengakibatkan pembentukan edema gelatinosa dan kongesti. Basil menyebar melalui getah bening ke dalam aliran darah, dan bakteri berkembang biak dengan bebas dalam darah dan jaringan segera sebelum dan dan setelah kematian hewan. Dalam plasma hewan yang mati karena antraks, telah ditemukan suatu faktor toksik. Bila diinokulasikan, zat ini mematikan mencit atau marmot dan secara spesifik dinetralisasi oleh antiserum antraks. c. Patologi Pada hewan yang peka, organisme berkembang biak di tempat masuk. Simpai tetap utuh, dan organisme dikelilingi oleh sejumlah besar cairan seperti protein yang mengandung sedikit leukosit; organisme kemudian dengan cepat menyebar dan mencapai aliran darah. Pada hewan yang resisten, organisme berkembang biak selama beberapa jam, setelah itu terkumpul sejumlah besar leukosit. Simpai lambat laun mengalami disintegrasi dan menghilang. Organisme tetap terlokalisasi. d. Gambaran Klinik Pada manusia, antraks menimbulkan infeksi kulit (pustula ganas). Mula-mula timbul papula dalam 12 – 36 jam setelah masuknya organisme atau spora melalui goresan. Papula ini dengan cepat berubah menjadi vesikel, kemudian pustula, dan akhirnya menjadi ulkus nekrotik; lalu infeksi dapat menyebar, menimbulkan septikemia.



3



Pada antraks pernapasan, gejala dini dapat berbupa mediastinitis, sepsis, meningitis, atau edema paru-paru hemoragik. Pneumonia hemoragik dengan syok merupakan gejala yang terakhir. e. Tes Diagnostik Laboratorium  Bahan: Cairan atau nanah dari lesi lokal; darah, dahak.  Pewarnaan Sediaan: Dari lesi lokal atau darah hewan yang mati; rantai bakteri berbentuk batang besar gram-positif sering terlihat. Antraks dapat diidentifikasi pada sediaan kering dengan teknik pewarnaan imunofuorosensi.  Biakan: Bila dibiakkan pada lempeng agar darah, organisme ini membentuk koloni kelabu non-hemolitik dengan morfologi mikroskopik yang khas. Peragian karbohidrat tidak bermanfaat. Pada perbenihan setengah padat, basil antraks selalu tidak bergerak, sedangkan organisme tidak patogen yang sejenis (misal B cereus) menunjukkan pergerakkan dengan “menyebar”. Biakan antraks virulen mematikan mencit atau marmot bila disuktikkan secara intraperitoneal.  Tes Serologi: Antibodi penyebab preipitasi atau hemaglutinasi dapat diperlihatkan dalam serum orang atau hewan yang telah divaksinasi atau terinfeksi. f. Pengobatan Banyak anntibiotika efektif terhadap antraks pada manusia, tetapi pengobatan harus dimulai sedini mungkin. Penisilin cukup memuaskan, kecuali pada pengobatan antraks pernapasan, di mana mortalitas tetap tinggi. Beberapa basil gram positif lainnya mungkin resisten terhadap penisilin karena membentuk ẞ-laktamase. Tetrasiklin, eritromisin, atau klindamisin mungkin efektif. 2. Bacillus cereus Keracunan makanan karena Bcillus cereus mempunyai dua bentuk berbeda, jenis muntah yang berkaitan dengan nasi yang terkontaminasi, dan jenis diare yang berkaitan dengan daging dan saus. B cereus menghasilkan beberapa enterotoksin, penyebab diare yang lebih bersifat keracunan daripada infeksi lewat makanan. Bentuk emetik bermanifestasi sebagai mual, muntah, kejang otot perut, kadang-kadang diare dan dapat sembuh sendiri, dengan masa penyembuhan yang terjadi dalam 24 jam. Ini dimulai 1 – 5 jam setelah makan nasi dan kadangkadang mie. B cereus adalah organisme tanah yang sering mengkontaminasi nasi. Bila sejumlah besar nasi dimasak dan dibiarkan dingin perlahan-lahan, spora B cereus bertunas dan sel vegetatif menghasilkan toksin selama fase-log pertumbuhan atau selama sporulasi. Bentuk diare memiliki masa inkubasi 1 – 24 jam dan terlihat sebagai diare yang terus menerus disertai nyeri dan kejang perut; jarang terjadi demam dan muntah. Enterotoksin dapat ditemukan dalam makanan atau dibaentuk dalam usus. Adanya B cereus dalam tinja penderita tidak cukup untuk menegakkan diagnosis penyakit B cereus, karena bakteri ini dapat ada di



4



dalam tinja orang normal; kadar 105 atau lebih bakteri per gram makanan dianggap diagnostik. B. cereus adalah penyebab penting dari infeksi mata, keratitis berat, enoftalmitis, dan panoftalmitis. Secara khas, organisme masuk ke dalam mata melalui benda asing yang berhubungan dengan infeksi lokal dan infeksi sistematik, termasuk endokarditis, meningitis, osteomielitis, dan pneumonia; alatalat kedokteran atau penggunaan obat-obat intravena merupakan predisposisi untuk infeksi ini. Secara individu, spesies-spesies Bacillus sp memiliki kemampuan khas masing-masing sehingga dapat dimanfaatkan dalam kegiatan budidaya ikan/ udang, yaitu: 1) B. subtilis dan B. cereus memiliki kemampuan untuk melakukan lysis terhadap cyanobacteria (BGA) pada konsentrasi 103 sel/ml di air kolam. Menghasilkan cyanobacteriocyde sehingga cocok untuk digunakan sebagai kontrol biologi terhadap blooming blue green algae. 2) B. megaterium dan B. polymyxa mampu menghasilkan antibiotik berupa megacin dan polymycin yang efektif untuk menekan pertumbuhbiakan vibrio, Escherchia colli dan Aeromonas. B. Polymyxa memiliki berbagai macam potensi termasuk antibiotik peptida, protease, dan berbagai macam enzim carbohydrateutilizing, seperti P-amilase,,-D-xilanase, pullulanase, glukosa isomerase, dan polygalacturonate liase. 3) B. coagulans dan B. lichenoformis mampu mensintesis secara cepat dan massal lectin dan polyhydroxyalkanoat (PHA) untuk polimerisasi activated sludge/bioflok, sehingga cocok untuk penebalan bioflok di air kolam/tambak jika diperlukan. 4) B. subtilis dan B. coagulans mampu menghentikan diare/mencret pada ikan/udang jika digunakan sebagai aditive pada pakan. B. subtilis memiliki kemampuan memproduksi antibiotik dalam bentuk lipopeptida, salah satunya adalah iturin. Iturin membantu B. subtilis berkompetisi dengan mikroorganisme lain dengan cara membunuh mikroorganisme lain atau menurunkan tingkat pertumbuhannya. Iturin juga memiliki aktivitas fungisida terhadap pathogen. Serta menghasilkan subtilin sebagai antibiotik yang digunakan untuk menekan populasi abkeri pathogen. B. coagulans mampu menghasilkan enzim amilase dan lipase. 5) B. lichenoformis mampu menghasilkan enzim protease yang dapat meningkatkan daya cerna protein dari pakan sehingga mampu meningkatkan protein efficiency ratio pakan (fermented feed). Bakteri ini merupakan species bakteri yang mampu menghasilkan protease dalam jumlah yang relatif tinggi. Jenis protease yang dihasilkan oleh bakteri ini adalah enzim ekstraselular yang tergolong proteinase serin karena mengandung serin pada sisi aktifnya. 6) B. subtilis dan B. lichenoformis dapat menghasilkan biosurfaktan yang mampu memotong gugus peptida dari toksin blue green algae. 5



7) B. subtilis, B. cereus dan B. megaterium mampu mengoksidasi senyawa hidrokarbon seperti minyak bumi dan fenol. B. megaterium merupakan produser utama untuk vitamin B12 dan penicillin. Selain itu, juga dapat memproduksi enzim yang berfungsi untuk sintetik steroid dan stabilitas yang baik dari plasmid rekombinan (Vary, 2007). 8) B. subtilis dan B. lichenoformis penghasil biosurfactan dengan jenis lipoprotein (biosurfactin).



6



IV.



Alat, Bahan, Media dan Reagensia a. Alat 1. Objek glass 2. Ose bundar 3. Ose jarum 4. Spiritus 5. Tabung reaksi + rak 6. Erlenmeyer 7. Gelas ukur 8. Beaker glass 9. Mikroskop 10. Cawan petri 11. Pipet tetes 22.



12. Autoclave 13. Inkubator 14. Rak tabung 15. Batang pengaduk 16. Kompor 17. Hot plate 18. Neraca 19. Lidi swab steril 20. Spuit steril 21. Kantong darah



b. Bahan 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7.



Sampel Tanah Sampel Debu Aquadest Oil imersi Darah domba Agar Indikator BCP (Bromocresol Purple) 23.



c. Media 1. Nutrient Broth - Beef Ekstract 3 gr - Pepton 10 gr - NaCl 5 gr - Aquadest 1 liter - pH 7,0 2. Nutrient Agar - Beef Ekstract 10 gram - Pepton 10 gram - NaCl 5 gram - Agar 15 gram - Aquadest 1.000 ml 3. Media IMVIC MUTSI a. Indol - Pepton 10,0 gram - Natrium Klorida (NaCl) 5,0 gram - Kalium dihidrogen phosphate 1,5 gram - di-Sodium hidrogen phosphate dedocahidrat 9,0 gram - Aquadest 1000 ml b. MR-VP - Pepton 7,0 gram - Glukosa 5,0 gram - Buffer phosphate 5,0 gram - Aquadest 1000 ml c. Simmon Sitrat Agar 7



d. e. f. 4. Gula-gula a. b. c. d.



Ammonium dihidrogen phosphate di-Pottasium hydrogen phosphate Sodium Klorida Sodium Citrate Magnesium sulfat Bromthymol blue Agar Motility Pepton casein Pepton daging Ammonium besi sitrat Natrium thiosulfat Agar Urea Ekstrak Ragi Kalium dihidrogen phosphate di-Sodium hidrogen phosphate Urea Phenol red Aquadest TSI Agar(Triple Sugar Iron Agar) Pepton casein Pepton daging Ekstrak daging Ekstrak ragi Natrium Klorida Laktosa Sukrosa Glukosa Ammonium besi (III) sitrat Natrium Thiosulfat Phenol red Agar – agar Aquadest



1,0 gram 1,0 gram 5,0 gram 2,0 gram 0,2 gram 0,08 gram 13,0 gram 20,0 gram 6,6 gram 0,2 gram 0,2 gram 0,3 gram 0,1 gram 9,1 gram 9,5 gram 20,0 gram 0,01 gram 1000 ml 10,0 gr 10,0 gr 3,0 gram 3,0 gram 5,0 gram 10,0 gram 10,0 gram 1,0 gram 0,5 gram 0,5 gram 0,024 gram 12,0 gram 1000 ml



Glukosa Laktosa Sukrosa Manitol 24.



d. Reagensia 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9.



Kovac’s Methil red KOH 4% α-naftol Kristal Violet (cat gram A) Lugol’s iodine (cat gram B) Etanol 96% (cat gram C) Safranin (cat gram D) Oil Imersi 1



10. Phisiologis Zoic (PZ)



25.



2



Tanam SAMPEL Pada Media NB



Cat Gram



V. Skema Kerja 26. 27. 28. 29. 30. 31. 32. 33. 34. 35. 36. 37. 38. Cat Gram 39. 40. 41. 42. 43. 44. Cat Gram 45. 46. 47. 48. 49. Cat Gram 50. 51. 52. 53. VI. Cara Kerja 







Tanam SAMPEL Pada Media NB pada media NAP Tanam



SAMPEL



Tanam Pada Media NB



Tanam pada media NAP



Tanam pada Media BAP



Tanam pada Media NAS



Cat Gram Tanam pada Media IMVIC MUTSI dan Gula-gula



Uji IMVIC MUTSI dan Gula-gula, serta pembacaan hasil



Pembuatan media NB (Nutrient Broth) 1. Timbang 2 gram media nutrient broth 2. Masukkan ke dalam gelas beaker berisi ± 100 ml aquades kemudian homogenkan 3. Tambahkan aquades sampai 250 ml kemudian homogenkan kembali sambil dididihkan. 4. Masukkan media ke dalam tabung reaksi hingga  setengah tinggi tabung dan tutup dengan kapas. 5. Ikat beberapa tabung menjadi satu, kemudian tutup bagian atasnya dengan kertas. 6. Sterilisasi dalam autoklaf pada suhu 121o c selama 15 menit. 7. Tunggu hingga media dingin sebelum digunakan. 54. Pembuatan media NAP (Nutrient Agar Plate) 3











1. Timbang 5 gram media Nutrient Agar. 2. Dimasukkan ke dalam erlenmeyer berisi ± 100 ml aquades kemudian homogenkan. 3. Tambahkan aquades sampai 250 ml kemudian homogenkan kembali sambil dididihkan. 4. Tutup mulut erlenmeyer dengan kapas dan kertas, kemudian sterilisasi dalam autoklaf pada suhu 121o c selama 15 menit. 5. Tuang media Nutrient Agar ke cawan petri (diameter 9cm) yang telah di steril hingga tinggi media ± 4mm. 6. Tunggu hingga media dingin sebelum digunakan. 55. Pembuatan media BAP (Blood Agar Plate) 1. Timbang 5 gram media Nutrient Agar 2. Masukkan ke dalam erlenmeyer berisi ± 100 ml aquades kemudian homogenkan 3. Tambahkan aquades sampai 250 ml kemudian homogenkan kembali. 4. Bagi media menjadi 3 bagian ke dalam erlenmeyer : bagian pertama volume 100 ml, bagian kedua 100 ml dan bagian ketiga 150 ml. 5. Dididhkan kemudian ditutup dengan kapas dan kertas lalu disterilkan dalam autoklaf pada suhu 121o c selama 15 menit. 6. Ambil 10ml, 10ml, dan 15ml darah dari kantong darah menggunakan spuit steril. 7. Tunggu hingga media bersuhu ± 50ºC 8. Media bagian 1 yang berisi 100 ml media, ditambahkan 10 ml darah kemudian dihomogenkan. 9. Media bagian 2 yang berisi 100 ml media, ditambahkan 10 ml darah kemudian dihomogenkan. 10. Media bagian 3 yang berisi 150 ml media, ditambahkan 15 ml darah kemudian dihomogenkan. 11. Segera tuang media tersebut ke cawan petri (diameter 9cm) steril hingg tinggi media ± 4mm. 12. Tunggu hingga media dingin sebelum digunakan. 56. Pembuatan media NAS (Nutrient Agar Slant) 1. Timbang 5 gram media Nutrient Agar 2. Dimasukkan ke dalam erlenmeyer berisi ± 100 ml aquades kemudian homogenkan 3. Tambahkan aquades sampai 250 ml kemudian homogenkan kembali sambil didihkan. 4. Masukkan media ke dalam tabung reaksi dan tutup dengan kapas. 5. Ikat beberapa tabung menjadi satu, kemudian tutup bagian atasnya dengan kertas. 6. Sterilisasi dalam autoklaf pada suhu 121o c selama 15 menit. 7. Letakkan masing-masing tabung dalam posisi miring hingga jarak antara dasar media dan dasar lereng ±1cm. 8. Tunggu hingga media dingin sebelum digunakan.



57. 58. Pembuatan Media IMVIC MUTSI dan Gula-gula 4



1. Indol a. Timbang 1,275 gram media air pepton. b. Masukkan ke beaker berisi 25ml aquades, kemudian homogenkan. c. Tambahkan aquades hingga 50ml, kemudian homogenkan kembali sambil dididihkan. d. Tuang  2 ml media ke tiap tabung reaksi kecil hingga semua media habis. e. Tutup tabung reaksi dengan kapas. f. Ikat beberapa tabung reaksi menjadi satu dan tutup bagian atas dengan kertas. g. Sterilisasi menggunakan autoclave dengan suhu 121oC selama 15 menit. h. Letakkan media dalam posisi tegak. i. Tunggu hingga media dingin sebelum digunakan untuk penanaman. 59. 2. Metil Red a. Timbang 0,85 gram media MR-VP. b. Masukkan ke beaker berisi 25ml aquades, kemudian homogenkan. c. Tambahkan aquades hingga 50ml, kemudian homogenkan kembali. d. Didihkan e. Tuang  2 ml media ke tiap tabung reaksi kecil hingga semua media habis. f. Tutup tabung reaksi dengan kapas. g. Ikat beberapa tabung reaksi menjadi satu dan tutup bagian atas dengan kertas. h. Sterilisasi menggunakan autoclave dengan suhu 121oC selama 15 menit. i. Letakkan media dalam posisi tegak. j. Tunggu hingga media dingin sebelum digunakan untuk penanaman. 60. 3. VP a. Timbang 0,85 gram media MR-VP. b. Masukkan ke beaker berisi 25ml aquades, kemudian homogenkan. c. Tambahkan aquades hingga 50ml, kemudian homogenkan kembali. d. Didihkan e. Tuang  2 ml media ke tiap tabung reaksi kecil hingga semua media habis. f. Tutup tabung reaksi dengan kapas. g. Ikat beberapa tabung reaksi menjadi satu dan tutup bagian atas dengan kertas. j. Sterilisasi menggunakan autoclave dengan suhu 121oC selama 15 menit. k. Letakkan media dalam posisi tegak. h. Tunggu hingga media dingin sebelum digunakan untuk penanaman. 61. 4. Simmon Sitrat Agar a. Timbang 1,125 gram media Simmon Sitrat. b. Masukkan media ke beaker berisi 25ml aquades, kemudian homogenkan. c. Tambahkan aquades hingga 50ml, kemudian homogenkan kembali. d. Didihkan e. Tuang  2 ml media ke tiap tabung reaksi kecil hingga semua media habis. f. Tutup tabung reaksi dengan kapas. i. Ikat beberapa tabung reaksi menjadi satu dan tutup bagian atas dengan kertas. l. Sterilisasi menggunakan autoclave dengan suhu 121oC selama 15 menit. 5



g. Letakkan tabung dalam posisi miring hingga jarak antara dasar media dan dasar lereng  1 cm. h. Tunggu hingga media dingin sebelum digunakan untuk penanaman. 62. 5. Motility a. Timbang media Motility b. Masukkan media ke beaker berisi 25ml aquades, kemudian homogenkan. c. Tambahkan aquades hingga 50ml, kemudian homogenkan kembali. d. Didihkan e. Tuang  2 ml media ke tiap tabung reaksi kecil hingga semua media habis. f. Tutup tabung reaksi dengan kapas. g. Ikat beberapa tabung reaksi menjadi satu dan tutup bagian atas dengan kertas. h. Sterilisasi menggunakan autoclave dengan suhu 121oC selama 15 menit. i. Letakkan tabung dalam posisi tegak dan tunggu hingga media dingin sebelum digunakan untuk penanaman. 63. 6. Urea Agar a. Siapkan 25 tabung reaksi kecil yang sudah ditutup dengan kapas dan sudah disterilisasi. b. Timbang 1,925 gram media Urea Broth. c. Timbang 1 gram agar-agar. d. Masukkan media Urea Broth dan agar-agar tersebut ke beaker berisi 25ml aquades, kemudian homogenkan. e. Tambahkan aquades hingga 50ml, kemudian homogenkan kembali. f. Didihkan g. Tuang  2 ml media ke tiap tabung reaksi kecil yang steril hingga semua media habis. h. Tutup tabung reaksi dengan kapas. i. Letakkan tabung dalam posisi miring hingga jarak antara dasar media dan dasar lereng  1 cm. j. Tunggu hingga media dingin sebelum digunakan untuk penanaman. 64. 7. TSI Agar a. Timbang 3,25 gram media TSI Agar. b. Masukkan ke beaker berisi 25ml aquades, kemudian homogenkan. c. Tambahkan aquades hingga 50ml, kemudian homogenkan kembali. d. Didihkan e. Tuang  2 ml media ke tiap tabung reaksi kecil hingga semua media habis. f. Tutup tabung reaksi dengan kapas. g. Ikat beberapa tabung reaksi menjadi satu dan tutup bagian atas dengan kertas. h. Sterilisasi menggunakan autoclave dengan suhu 121oC selama 15 menit. i. Letakkan tabung dalam posisi miring hingga jarak antara dasar media dan dasar lereng  1 cm. j. Tunggu hingga media dingin sebelum digunakan untuk penanaman. 65. 8. Glukosa 6



a. b. c. d. e.



Timbang 1,275 gram media air pepton. Masukkan ke beaker berisi 25ml aquades, kemudian homogenkan. Tambahkan aquades hingga 50ml, kemudian homogenkan kembali. Didihkan Timbang 1 gram glukosa, homogenkan dengan air pepton yang telah dididihkan. f. Tuang  2 ml media ke tiap tabung reaksi kecil hingga semua media habis. g. Tutup tabung reaksi dengan kapas. h. Ikat beberapa tabung reaksi menjadi satu dan tutup bagian atas dengan kertas. i. Sterilisasi menggunakan autoclave dengan suhu 121oC selama 15 menit. j. Letakkan media dalam posisi tegak. k. Tunggu hingga media dingin sebelum digunakan untuk penanaman 66. 9. Sukrosa a. Timbang 1,275 gram media air pepton. b. Masukkan ke beaker berisi 25ml aquades, kemudian homogenkan. c. Tambahkan aquades hingga 50ml, kemudian homogenkan kembali. d. Didihkan e. Timbang 1 gram sukrosa, homogenkan dengan air pepton yang telah dididihkan. f. Tuang  2 ml media ke tiap tabung reaksi kecil hingga semua media habis. g. Tutup tabung reaksi dengan kapas. h. Ikat beberapa tabung reaksi menjadi satu dan tutup bagian atas dengan kertas. i. Sterilisasi menggunakan autoclave dengan suhu 121oC selama 15 menit. j. Letakkan media dalam posisi tegak. k. Tunggu hingga media dingin sebelum digunakan untuk penanaman 67. 10. Manitol a. Timbang 1,275 gram media air pepton. b. Masukkan ke beaker berisi 25ml aquades, kemudian homogenkan. c. Tambahkan aquades hingga 50ml, kemudian homogenkan kembali. d. Didihkan e. Timbang 1 gram manitol, homogenkan dengan air pepton yang telah dididihkan. f. Tuang  2 ml media ke tiap tabung reaksi kecil hingga semua media habis. g. Tutup tabung reaksi dengan kapas. h. Ikat beberapa tabung reaksi menjadi satu dan tutup bagian atas dengan kertas. i. Sterilisasi menggunakan autoclave dengan suhu 121oC selama 15 menit. j. Letakkan media dalam posisi tegak. k. Tunggu hingga media dingin sebelum digunakan untuk penanaman 68. 11. Laktosa a. Timbang 1,275 gram media air pepton. b. Masukkan ke beaker berisi 25ml aquades, kemudian homogenkan. c. Tambahkan aquades hingga 50ml, kemudian homogenkan kembali. d. Didihkan 7



e. Timbang 1 gram glukosa, homogenkan dengan air pepton yang telah dididihkan. f. Tuang  2 ml media ke tiap tabung reaksi kecil hingga semua media habis. g. Tutup tabung reaksi dengan kapas. h. Ikat beberapa tabung reaksi menjadi satu dan tutup bagian atas dengan kertas. i. Sterilisasi menggunakan autoclave dengan suhu 121oC selama 15 menit. j. Letakkan media dalam posisi tegak. k. Tunggu hingga media dingin sebelum digunakan untuk penanaman 69.  Cara kerja  Hari pertama - Pengambilan sampel 1. Untuk sampel debu, debu diambil dengan menggunakan swab steril, kemudian masukkan swab tersebut kedalam tabung reaksi yang berisi PZ steril dan ditutupi kapas, kemudian didihkan selama 15 menit. 2. Untuk sampel tanah, tanah diambil dengan mengggunakan beaker glass, kemudian pindahkan kedalam tabung reaksi yang berisi PZ steril dan ditutupi kapas, kemudian didihkan selama 15 menit. 70. - Penanaman di media NB 1. Ambil supernatan dari masing-masing sampel debu dan tanah sebanyak 2 ml menggunakan spuit steril. 2. Pindahkan supernatan tersebut ke media NB, kemudian kocok / homogenkan. 3. Inkubasi dalam inkubator selama 24 jam dengan suhu 37oC. 71.  Hari kedua - Pengecatan gram dan pemeriksaan mikroskopis dari media NB 1. Hilangkan lemak pada kaca objek dengan cara melewatkan kaca objek pada api spiritus. 2. Celupkan ose ke dalam media NB yang sudah ditumbuhi bakteri, kemudian letakkan pada kaca objek dan homogenkan. 3. Tunggu hingga sediaan kering. 4. Genangi sedian dengan cat gram 1 (gentian violet) dan diamkan selama 1 menit, kemudian bilas dengan air mengalir 5. Genangi sediaan dengan cat gram 2 (lugol’s iodine) dan diamkan selama 1 menit, kemudian bilas dengan air mengalir 6. Genangi sediaan dengan cat gram 3 (Etanol 96%) dan diamkan selama 30 detik, kemudian bilas dengan air mengalir 7. Genangi sediaan dengan cat gram 4 (safranin) dan diamkan selama 1 menit, kemudian bilas dengan air mengalir dan tunggu hingga sediaan kering. 8. Beri oil imersi dan periksa sediaan menggunakan mikroskop dengan perbesaran objektif 100x. 9. Amati dan catat ciri-ciri bakteri yang ditemukan 72. 8



-



Penanaman pada media NAP 1. Celupkan ujung ose steril kedalam media NB yang ditumbuhi bakteri, kemudian tanam pada media NAP dengan membuat goresan empat kuadran. 2. Inkubasi dalam inkubator selama 24 jam dengan suhu 37oC. 73.  Hari ketiga - Pengecatan gram dan pemeriksaan mikroskopis dari media NAP 1. Hilangkan lemak pada kaca objek dengan cara melewatkan kaca objek pada api spiritus. 2. Teteskan PZ pada kaca objek 3. Sentuhkan ujung ose steril pada salah satu koloni bakteri yang tumbuh pada media NAP, kemudian letakkan pada kaca objek dan homogenkan. 4. Tunggu hingga sediaan kering. 5. Genangi sedian dengan cat gram 1 (gentian violet) dan diamkan selama 1 menit, kemudian bilas dengan air mengalir 6. Genangi sediaan dengan cat gram 2 (lugol’s iodine) dan diamkan selama 1 menit, kemudian bilas dengan air mengalir 7. Genangi sediaan dengan cat gram 3 (Etanol 96%) dan diamkan selama 30 detik, kemudian bilas dengan air mengalir 8. Genangi sediaan dengan cat gram 4 (safranin) dan diamkan selama 1 menit, kemudian bilas dengan air mengalir dan tunggu hingga sediaan kering. 9. Beri oil imersi dan periksa sediaan menggunakan mikroskop dengan perbesaran objektif 100x. 10. Amati dan catat ciri-ciri bakteri yang ditemukan 74. - Penanaman pada media BAP 1. Sentuhkan ujung ose steril pada salah satu koloni bakteri yang tumbuh pada media NAP. 2. Tanam pada media BAP dengan membuat goresan empat kuadran. 3. Inkubasi dalam inkubator selama 24 jam dengan suhu 37oC 75. - Penanaman pada media NAS 1. Sentuhkan ujung ose steril pada salah satu koloni bakteri yang tumbuh pada media NAP. 2. kemudian tanam pada media dengan cara membuat goresan zig-zag. 3. Inkubasi dalam inkubator selama 24 jam dengan suhu 37oC 76.  Hari keempat - Pengecatan gram dan pemeriksaan mikroskopis dari media BAP dan NAS 1. Hilangkan lemak pada kaca objek dengan cara melewatkan kaca objek pada api spiritus. 2. Teteskan PZ pada kaca objek 3. Sentuhkan ujung ose steril pada salah satu koloni bakteri yang tumbuh pada media BAP, kemudian letakkan pada kaca objek dan homogenkan. 4. Sentuhkan ujung ose steril pada salah satu koloni bakteri yang tumbuh pada media BAP, kemudian letakkan pada kaca objek dan homogenkan. 9



-



5. Tunggu hingga sediaan kering. 6. Genangi sedian dengan cat gram 1 (gentian violet) dan diamkan selama 1 menit, kemudian bilas dengan air mengalir 7. Genangi sediaan dengan cat gram 2 (lugol’s iodine) dan diamkan selama 1 menit, kemudian bilas dengan air mengalir 8. Genangi sediaan dengan cat gram 3 (Etanol 96%) dan diamkan selama 30 detik, kemudian bilas dengan air mengalir 9. Genangi sediaan dengan cat gram 4 (safranin) dan diamkan selama 1 menit, kemudian bilas dengan air mengalir dan tunggu hingga sediaan kering. 10. Beri oil imersi dan periksa sediaan menggunakan mikroskop dengan perbesaran objektif 100x. 11. Amati dan catat ciri-ciri bakteri yang ditemukan 77. Penanaman pada media IMVIC MUTSI dan Gula-gula 1. Sentuhkan ujung ose steril pada koloni bakteri yang tumbuh pada media NAS, kemudian celupkan ke media Indol dan homogenkan. 2. Sentuhkan ujung ose steril pada koloni bakteri yang tumbuh pada media NAS, kemudian celupkan ke media MR dan homogenkan. 3. Sentuhkan ujung ose steril pada koloni bakteri yang tumbuh pada media NAS, kemudian celupkan pada media VP dan homogenkan. 4. Sentuhkan ujung ose jarum steril pada koloni bakteri yang tumbuh pada media NAS, kemudian tusuk ke dasar media dan buat goresan zig-zag pada permukaan media Simmon Sitrat. 5. Sentuhkan ujung ose jarum steril pada koloni bakteri yang tumbuh pada media NAS, kemudian tusukkan pada media Motility. 6. Sentuhkan ujung ose jarum steril pada koloni bakteri yang tumbuh pada media NAS, kemudian tusuk ke dasar media dan buat goresan zig-zag pada permukaan media Urea. 7. Sentuhkan ujung ose jarum steril pada koloni bakteri yang tumbuh pada media NAS, kemudian tusuk ke dasar media dan buat goresan zig-zag pada permukaan media TSI. 8. Sentuhkan ujung ose steril pada koloni bakteri yang tumbuh pada media NAS, kemudian celupkan ke media Glukosa dan homogenkan. 9. Sentuhkan ujung ose steril pada koloni bakteri yang tumbuh pada media NAS, kemudian celupkan ke media Sukrosa dan homogenkan. 10. Sentuhkan ujung ose steril pada koloni bakteri yang tumbuh pada media NAS, kemudian celupkan ke media Laktosa dan homogenkan. 11. Sentuhkan ujung ose steril pada koloni bakteri yang tumbuh pada media NAS, kemudian celupkan ke media Manitol dan homogenkan. 12. Inkubasi dalam inkubator selama 24 jam dengan suhu 37oC



78.  Hari kelima - Pembacaan hasil uji IMVIC MUTSI dan Gula-gula 1. Pada media indol, diberi 3-5 tetes reagen kovac dan dilihat terbentuknya cincin merah. 10



2. Pada media MR, diberi 3-5 tetes reagen Metyl Red kemudian media dikocok dan dilihat perubahan media menjadi merah. 3. Pada media VP, diberi 1 tetes KOH 4% dan 3 tetes -naftol, kemudian dilihat terbentuknya cincin. 4. Pada media Simon Sitrat dilihat perubahan media menjadi biru. 5. Pada media Motility dilihat adanya bekas tusukan. 6. Pada media Urea dilihat perubahan warna media dari ungu tua menjadi ungu muda. 7. Pada media TSI dilihat perubahan warna media dan gas yang terbentuk 8. Pada media gula-gula (glukosa, sukrosa, laktosa, dan manitol) dilihat perubahan warna media dari ungu menjadi coklat. 9. Hasil uji dicatat dan disesuaikan dengan tabel uji Bacillus sp. Untuk menentukan spesies bakteri. 79.



VII.



Interpretasi Hasil 80. 1. Morfologi koloni bacillus sp. pada media NAP 81. 82. Pengamatan 83. Interpretasi Hasil No 84. 85. Bentuk koloni 86. Circular (bulat) 1 87. 88. Warna 89. Putih keruh 2 90. 91. Ukuran 92. Moderate (sedang) 3 93. 94. Elevasi 95. Convex (cembung) 4 96. 97. Konsistensi 98. Lunak 5 99. 100. Permukaan 101. Kasar 6



102. 2. Mikroskopis (pewarnaan gram) 103. 104. Pengamatan No 106. 107. Bentuk 1 109. 110. Warna 2 112. 113. Susunan 3 115. 116. sifat 4



105.



Interpretasi hasil



108.



Batang lurus



111.



Ungu



114. Diplo, mono strepto 117. Gram positif



dan



118. 3. Uji biokimia 119.



120.



Media biokimia



121.



122. 123. 11



indo l 125. m 126. otil Ure ity a 134. B.antrac tis 144. B.subtili s 154. B.cereus 164. B.linche niformis



136. V 145. + 146. /V 156. 155. + V 166. 165. V 135.



-



127. Simo n ci tr at 137. 147. 157. 167. -



130. L 128. 129. ere H2 GA ng 131. S da sar 138. 148. 158. 168. -



139. 149. 159. 169. -



140.



v 141. /v 150. v 151. /v 160. v 161. /v 170. v 171. /v +/-



M



V



132. 133.



142. 143. + 152. 153. V V 162. 163. V V 172. 173.



174. 175. Note : a. Indol 176. Hasil positif (+) : terbentuk cincin merah pada saat ditetesi reagen kovac 177. Hasil negatif (-) : tidak terbentuk merah pada saat ditetesi reagen kovac b. MR 178. Hasil positif (+) : terjadi perubahan warna pada media dari kuning menjadi merah setelah ditetesi indikator metyl red 179. Hasil negatif (-) : tidak terjadi perubahan warna pada media dari kuning menjadi merah setelah ditetesi indikator metyl red c. VP 180. Hasil positif (+) : terbentuk cincin merah pada saat ditetesi KOH dan α-naftol 181. Hasil negatif (-) : tidak terbentuk cincin merah pada saat ditetesi KOH dan α-naftol d. Simon citrat 182. Hasil positif (+): terjadi perubahan pada media dari hijau menjadi biru 183. Hasil negatif (-) : media tetap berwarna hijau e. Motility 184. Hasil positif (+) : terbentuk bekas tusukan pada media 185. Hasil negatif (-) : tidak terbentuk bekas tusukan pada media f. Urea 186. Haasil positif (+) : terjadi perubahan warna pada media dari ungu tua menjadi ungu muda 187. Hasil negatif (-) : media tetap berwarna ungu tua g. TSI 188. Gas (+) : terdapat gelembung gas pada dasar media 189. (-) : tidak terdapat gelembung gas pada dasar media 12



190. 191. 192. 193. 194.



H2S (+) : terbentuk warna hitam pada media (-) : tidak terbentuk warna hitam pada media K/K : merah / merah K/A : merah / kuning A/A : kuning / kuning



195. 4. Uji gula-gula 196. 197. Uji gula-gula 199. glu 200. suk 201. Lak 202. Ma 203. Mal kosa rosa tosa nitol tosa 204. B.antract 205. + 206. 207. 208. + 209. + is 210. B.subtilis 211. + 212. 213. 214. + 215. + 216. B.cereus 217. + 218. 219. 220. + 221. + 222. B.linchen 223. + 224. 225. 226. + 227. + iformis 228. Note : - Hasil positif (+) ; jika media berubah warna dari ungu menjadi kuning / coklat - Hasil negatif (-) : jika media tetap berwarna ungu 229.



13



230.



VIII.



231. Hasil



232. Sampel Debu 1



Cat Gram dari Media NB Morfologi Bakteri



233. 234.



2







Bakteri I : Gram (+); basil lurus; monobasil, diplobasil, dan streptobasil.







Bakteri II : Gram (-); basil panjang langsing; monobasil, diplobasil, dan streptobasil.



Koloni pada NAP Ciri-ciri Koloni : Warna : Tepian : Permukaan Konsistensi Ukuran : Bentuk : Bau :



putih halus : cembung : berlendir besar bulat khas media



235. 236. 3



Cat Gram dari Media NAP Morfologi Bakteri : Basil lurus; Gram (+); monobasil, diplobasil (dominan), dan streptobasil.



237. 4



Koloni pada BAP



14



Ciri-ciri Koloni Warna : Tepian : Permukaan Konsistensi Ukuran : Bentuk : Bau : Hemolisa :



putih keruh halus : cembung : berlendir besar bulat khas media -hemolisa



238. 239. 5



Cat Gram dari Media BAP Morfologi Bakteri : Gram (+); basil lurus; tidak berspora; monobasil, diplobasil, streptobasil.



240. 241. 6



Koloni pada NAS Permukaan



: bergelombang



Warna



: kuning keputihan



Konsistensi



: lembek



Bau



: khas media



242. 7



Cat Gram dari Media NAS Morfologi Koloni : Gram (+); batang lurus; spora terminal; monobasil; diplobasil; streptobasil.



243. 15



8 244.



Uji Biokimia Uji



245.



H asil



246.



Gambar



247.



Keterangan



250. 248. In dol



249.



(



251. Tidak terbentuk cincin merah saat ditetesi reagen kovac



-)



254. 252. M R



253.



(



255. Media tidak berwarna merah setelah diberi reagen MR



-)



258.



256.



VP



257.



259. Tidak terbentuk cincin merah saat ditetesi reagen KOH dan -naftol



( -)



262. 260. Si mon Sitrat



261.



(



263. Media tetap berwarna hijau / tidak menjadi biru



-)



266. 264. M otility



265.



( +)



267.



Terdapat bekas tusukan



16



270. 268. Ur ea



272. TS I



269.



(



271. Media tidak mengalami perubahan warna



-)



273. K /A, 274. g as (-), H2S (-)



275. 276. Lereng merah/kuning, tidak terbentuk gas, dan tidak terbentuk warna hitam.



277. 9



Uji Gula-gula



278.



Uj i 282. Gl ukosa



279.



H asil



283.



280.



Gamba r 284.



( -)



286. Su krosa



281.



Keterangan



285.



Media tidak berubah warna



289.



Media tidak berubah warna



293.



Media tidak berubah warna



288. 287.



( -)



290. La ktosa



292. 291.



( -)



17



294. M anitol



296. 295.



(



297. Media coklat



+)



berubah



menjadi



berwarna



298.



299. Sampel Tanah 1



Cat Gram dari Media NB Morfologi Bakteri 



Bakteri I : Gram (+); basil lurus; monobasil, diplobasil, dan streptobasil.







Bakteri II : Gram (-); basil panjang langsing; monobasil, diplobasil, dan streptobasil.



300. 2



Koloni pada NAP Ciri-ciri Koloni :



301.



a b c d e f g



Bentuk Ukuran Warna Konsistensi Permukaan Tepi Bau



: bulat : besar : kuning keputihan : lembek : cembung : bergerigi : khas media



302. 3



Cat Gram dari Media NAP



18



Morfologi Bakteri : Basil lurus; Gram (+); monobasil, diplobasil (dominan), dan streptobasil.



303. 4



Koloni pada BAP Ciri-ciri Koloni :



304.



a b c d e f g h



Bentuk Ukuran Warna Konsistensi Permukaan Tepi Bau Hemolisa



: bulat : besar : putih : lembek : cembung : bergerigi : khas : -hemolisa



305. 5



Cat Gram dari Media BAP Morfologi Bakteri : Gram (+); basil lurus, berspora, monobasil, diplobasil, streptobasil



306. 307. 6



Koloni pada NAS Permukaan



: bergelombang



Warna



: kuning keputihan



Konsistensi



: lembek



Bau



: khas media



19



308.



309. 7



Cat Gram dari media NAS Morfologi Bakteri : Gram (+); basil pendek gemuk; berspora; monobasil; diplobasil; streptobasil



310. 311. 8



Uji Biokimia



312.



U



313.



ji



H asil



314.



Gambar



315.



Keterangan



318. 316. I ndol



317.



(-)



319. Tidak terbentuk cincin merah saat ditetesi reagen kovac



20



322. 320. M 321. R



(-)



323. Media tidak berwarna merah setelah diberi reagen MR



324. V P



(-)



327. Tidak terbentuk cincin merah saat ditetesi reagen KOH dan -naftol



328. S imo n Sitra t



325.



326. 330.



329.



331. Media tetap berwarna hijau / tidak menjadi biru



(-)



334. 332. M otilit y



333.



(+



335.



)



Terbentuk bekas tusukan



338. 336. U rea



337.



341. 340. T SI



339. Media tidak mengalami perubahan warna



(-)



K/ A, 342. ga s (-), H2S (-)



343. 344. Lereng merah/kuning, tidak terbentuk gas, dan tidak terbentuk warna hitam.



345. 9 346.



Uji Gula-gula U



347.



Ha



348.



Gambar



349.



Keterangan 21



ji 350. G luko sa



sil 352.



351.



(-)



354. S ukro sa



353.



Media tidak berubah warna



357.



Media tidak berubah warna



361.



Media tidak berubah warna



365.



Media tidak berubah warna



356.



355.



358. L aktos a



362. M anito l



(-)



360.



359.



(-)



364.



363.



(+)



366. IX.



Kesimpulan 367. Berdasarkan hasil praktikum isolasi dan identifikasi Bacillus sp. Dengan media NB, NAP, BAP, NAS dan uji IMVIC MUTSI dan Gula-gula, dapat disimpulkan bahwa bakteri yang diisolasi dari sampel debu dan tanah adalah Bacillus cereus.



368. X.



Daftar Pustaka



22