Laporan Praktikum Kultur Jaringan Pengenalan Laboratorium, Sterilisasi Dan Pembuatan Preparasi Media Kultur Jaringan Tanaman [PDF]

Citation preview

LAPORAN PRAKTIKUM PENGENALAN LABORATORIUM, STERILISASI DAN PEMBUATAN PREPARASI MEDIA KULTUR JARINGAN TANAMAN



Ditulis untuk Memenuhi Tugas Mata Kuliah Praktikum Kultur Jaringan Tumbuhan Dosen Pengampu Dr. Ixora Sartika Mercuriani, M. Si.



Disusun oleh : Rismawarsi Astuti



16308141027



Hayyu Arumsari



16308141011



Annas Emma A N A 16308141021 Dina Puasari P



16308141015



JURUSAN PENDIDIKAN BIOLOGI FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM UNIVERSITAS NEGERI YOGYAKARTA 2019



BAB I PENDAHULUAN



A. Latar Belakang Kultur jaringan adalah salah satu metode pengembangan



Bioteknologi



Tumbuhan.



Metode



yang digunakan dalam ini



merupakan



prosedur



pemeliharaan dan pertumbuhan jaringan tanaman (sel, kalus, protoplas) serta organ (batang, akar, embrio) pada kultur aseptis (in vitro). Metode kultur jaringan diantaranya digunakan untuk perbanyakan tanaman, modifikasi genotip (plant breeding), produksi metabolit sekunder, pemeliharaan plasma nutfah, penyelamatan embrio (embryo rescue) (Hartmann dkk., 1997). Teknik kultur jaringan mensyaratkan kondisi steril baik ruang, peralatan, bahan maupun seluruh rangkaian kerjanya. Hal ini disebabkan karena pertumbuhan eksplan didalam kultur harus selalu dalam kondisi aseptis agar tidak terjadi kontaminasi. Untuk itu semua tahapan pelaksanaan teknik kultur harus dilaksanakan di dalam laboratorium yang ideal dan harus ditunjang oleh perlengkapan laboratorium yang memadai serta tata cara kerja yang teliti. Laboratorium sebaiknya mempunyai pembagian ruangan yang diatur sedemikian rupa sehingga tiap kegiatan terpisah satu dengan yang lainnya, tetapi masih dapat saling berhubungan dan mudah dicapai. Menurut Moeso Suryowinoto (2000) berhasil tidaknya kultur jaringan sangat bergantung pada keadaan aseptik atau sterilnya komponen-komponen kultur jaringan yang meliputi eksplan, peralatan yang digunakan maupun ruangan yang digunakan untuk kultur jaringan. Sterilisasi alat harus dilakukan dalam percobaan kultur jaringan untuk mencegah terjadinya kontaminasi yang dapat merusak kelangsungan percobaan yang dilakukan di laboratorium. Sterilisasi dapat dilakukan dengan berbagai macam cara, cara tersebut meliputi sterilisasi secara mekanik, kimia, maupun sterilisasi secara fisik. Pengenalan alat laboratorium merupakan langkah pertama sebelum melakukan percobaan atau penelitian di laboratorium. Dengan mengenal alat, praktikan dapat mengetahui fungsi masing-masing bagian dari alat tersebut serta cara pengoprasian atau penggunaan alat-alat yang akan digunakan dalam percobaan atau penelitian yang dilakukan. Selain itu, dengan mengetahui akan fungsi dan cara penggunaan alat-alat



yang akan digunakan dapat memperlancar jalannya suatu percobaan atau penelitian. Sehingga dengan berbekal pengetahuan pemahaman akan fungsi dan cara kerja dari alat yang digunakan kita dapat memperoleh hasil suatu percobaan atau penelitian yang maksimal. Selain pengetahuan dan pemahaman akan alat di laboratorium, praktikan juga dituntut untuk terampil dalam penggunaannya. Hal tersebut harus dibarengi dengan ketelitian dalam melakukan suatu percobaan ataupun penelitian sehingga didapatkan hasil yang maksimal. Dengan pengenalan alat-alat laboratorium. Kita dapat mengetahui berbagai macam alat yang terdapat di Laboratorium. Selain itu kita juga dapat meminimalisir resiko kesalahan kerja pada saat melakukan percobaan mikrobiologi. Alat-alat laboratorium mempunyai cara dan prinsip kerja yang berbeda. Setiap pengguna harus mengikuti hal-hal tersebut agar dalam menggunakan alat-alat laboratorium tidak terjadi kerusakan alat ataupun hal-hal yang berbahaya (Widhy.2009). Selain pengenalan alat laboratorium, sebelum melakukan praktikum atau penelitian kultur jaringan, praktikan diharuskan dapat membuat media. Media merupakan faktor utama dalam perbanyakan dengan kultur jaringan. Keberhasilan perbanyakan dan perkembangbiakan tanaman dengan metode kultur jaringan secara umum sangat bergantung pada jenis media. Media tumbuh pada kultur jaringan sangat besar pengaruhnya terhadap pertumbuhan dan perkembangan eksplan serta bibit yang dihasilkan (Tuhuteru,2012). Menurut Siregar (2013), media yang biasa digunakan adalah Murashige & Skoog (MS), karena media MS digunakan untuk semua macam tanaman terutama tanaman herbasius. Namun, dalam praktikum kali ini tidak hanya menggunakan media MS, tetapi juga menggunakan media New Phaleopnoosis (NP) karena media NP memiliki kemiripan unsur-unsur yang digunakan oleh MS. Oleh karena itu, dalam praktikum kultur jaringan tumbuhan ini setelah mengenal dan memahami mengenai alat dan cara penggunaannya maka dilanjutkan dengan pembuatan media yang akan digunakan untuk tempat tumbuh eksplan.



B. Tujuan 1. Dapat mengenali dan mengetahui alat –alat yang dipakai dalam praktikum kultur jaringan serta dapat mengetahui fungsi-fungsi dari alat di laboratorium kultur jaringan. 2. Dapat mengetahui cara pembuatan media MS dan media NP dalam praktikum kultur jaringan tumbuhan.



BAB II PEMBAHASAN



Kultur jaringan merupakan salah satu cara perbanyakan tanaman secara vegetatif. Kultur jaringan merupakan teknik perbanyakan tanaman dengan cara mengisolasi bagian tanaman seperti daun, mata tunas, serta menumbuhkan bagianbagian tersebut dalam media buatan secara aseptik yang kaya nutrisi dan zat pengatur tumbuh dalam wadah tertutup yang tembus cahaya sehingga bagian tanaman dapat memperbanyak diri dan bergenerasi menjadi tanaman lengkap. Pelaksanaan kerja kultur jaringan tumbuhan memiliki tahapan-tahapan dan urutan kerja yang khusus. Laboratorium harus diatur sedemikian rupa sehingga ada tingkatan sterilitas ruangan sesuai dengan tahapan kerja termasuk alur keluarmasuknya praktikan didalam laboratorium tersebut. Tahapan-tahapan kerja didalam laboratorium kultur jaringan dibagi dalam 4 kelompok yaitu: 1. Persiapan Merupakan tahap awal kerja kultur jaringan, dimulai dari menyiapkan alatalat, botol-botol kultur dan pembuatan medium (meracik, merebus dan membaginya kedalam botol-botol sampai pada sterilisasi). 2. Inokulasi Inokulasi meliputi sterilisasi, pengambilan bagian tanaman (biji anggrek) yang akan dijadikan sebagai eksplan, kemudian menanamnya didalam atau diatas medium buatan yang telah disediakan. Untuk inokulasi eksplan ini diperlukan kondisi yang absolut steril. 3. Pemeliharaan Setelah diinokulasi, botol kultur diletakkan di rak-rak pemeliharaan di ruang inkubator untuk diikuti pertumbuhan dan perkembangannya sampai menjadi plantlet. 4. Aklimatisasi Aklimatisasi merupakan proses penyesuaian/adaptasi plantlet dari kondisi heterotrof di dalam botol kultur menjadi autotrof yang dapat ditanam pada kondisi alamiahnya di tanah. Saat memulai melakukan kegiatan kultur jaringan diperlukan ruang dan peralatan. Ukuran ruang yang diperlukan dapat disesuaikan dengan volume aktivitas kultur jaringan yang akan dilakukan. Ruang yang diperlukan untuk kegiatan kultur jaringan yaitu laboratorium yang ideal yang memiliki: 1.) Ruang persiapan yang di



dalamnya terdapat timbangan analitik, lemari pendingin, hotplate, mikrowave, oven, pH meter/pH stik, alat-alat gelas standar (labu ukur, erlenmeyer, batang pengaduk dari gelas, dan wadah kultur), lemari untuk alat dan bahan kimia 2.) Ruang transfer yang di dalamnya terdapat laminar air flow, dissecting, mikroskop, alat diseksi, lemari tempat penyimpanan alat-alat steril, dan timbangan kecil. 3.) Ruang kultur yang dilengkapi dengan rak kultur dan lampu fluorescent, timer untuk mengatur lama penyinaran, AC untuk mengontrol temperatur, mikroskop binokuler, dan shaker (Barahima, 2011). Tabel 1. Ruang dan alat yang ada di laboratorium kultur jaringan tumbuhan FMIPA UNY No 1



Gambar



Keterangan Ruang persiapan untuk kultur baik alat, bahan maupun media. Tempat penyimpanan alat-alat kultur dan berbagai



media



sebelum



digunakan. 2



Rak Inkubator Tempat pemeliharaan eksplan pada media baik pada tahap induksi, multiplikasi



maupun



tahap



perakaran 3 LAF (Laminar Airflow) Untuk kegiatan isolasi tanaman, sterilisasi dan penanaman eksplan dalam media



Tabel 2. Alat dan bahan sterilisasi No 1



Gambar



Keterangan Botol Jam Tempat pertumbuhan eksplan



2



Petridish Tempat pertumbuhan eksplan



3



Dibungkus kertas payung untuk menghindari kontaminan setelah di autoclave



4



Meletakan botol jam, botol kultur dan alat lain yang akan diautoclave



5



Timbangan Analitik Digunakan untuk komposisi media



6



menimbang



pH Stik digunakan untuk mengukur keasaman pH pada laruatan media



7.



Autoclave Digunakan untuk Sterilisasi alat dan media



8.



Hot plate & Magnetic stirer Digunakan sebagai alat menghomogenkan bahan



untuk



Laboratorium yang ideal untuk melakukan kultur jaringan harus memenuhi kriteria aman, bersih, dan memiliki penataan ruang yang baik. Untuk memenuhi kriteria tersebut, dalam Laboratorium Kultur Jaringan FMIPA UNY agar tetap bersih dan terhindar dari debu maka Laboratorium Kultur Jaringan FMIPA UNY dirancang dengan jendela yang terbuat dari kaca permanen yang tidak dapat dibuka serta tidak ada ventilasi dan tertutup rapat. Di dalam ruangan terdapat AC untuk mempertahankan suhu agar konstan 25-28oC, dan dipasang exhauster untuk menyedot debu yang ada di dalam ruangan. Pencahayaan dalam ruangan menggunakan lampu yang terang untuk membuat ruangan menyerupai kondisi di luar ruangan yang nantinya sebagai lingkungan tempat hidup tanaman yang dikultur, selain itu juga untuk



menjaga



intensitas



cahaya



yang



dibutuhkan



oleh



eksplan



untuk



pertumbuhannya. Laboratorium Kultur Jaringan FMIPA UNY memiliki penataan ruang yang terbagi menjadi tiga ruangan, yaitu ruang preparasi, ruang inkubasi, dan ruang inokulasi. Setiap ruangan dalam laboratorium memiliki fungsi yang berbeda-beda. Ruang preparasi pada Laboratorium Kultur Jaringan FMIPA UNY merupakan ruangan untuk persiapan dan berfungsi untuk mempersiapkan segala kebutuhan dalam melakukan kultur jaringan, membersihkan alat-alat yang digunakan dalam kultur jaringan seperti petridish dan botol jam, membuat media, sterilisasi alat, bahan dan media, untuk mencuci peralatan, serta untuk menyimpan peralatan. Di dalam ruang



preparasi terdapat berbagai alat, diantaranya kompor gas, rak-rak tempat penyimpanan alat, box kontainer untuk menyimpan botol kultur, timbangan analitik untuk menimbang bahan, pH meter/stik, autoclave untuk mensterilkan alat dan bahan, hot plate beserta magnetic stirer sebagai alat untuk menghomogenkan bahan, bak untuk mencuci alat, berbagai alat-alat gelas standar seperti gelas ukur berbagai ukuran, pipet, erlenmeyer berbagai ukuran, gelas piala, pengaduk, petridish, dan botol jam. Ruang yang kedua yaitu ruang inokulasi. Ruang inokulasi ini harus steril karena ruang inokulasi merupakan ruang yang berfungsi untuk isolasi, penanaman, dan subkultur. Dinding ruangan inokulasi terbuat dari bahan porselin atau bahan lain yang mudah dibersihkan dan kedap dengan air. Ruang inokulasi harus terisolasi sedemikian rupa namun masih tetap dapat berhubungan dengan ruangan yang lainnya agar pekerjaannya menjadi mudah. Pintu penghubung pada ruangan ini harus selalu tertutup agar tidak terjadi kontaminasi pada saat penanaman maupun subkultur. Pada saat melakukan isolasi, penanaman, maupun subkultur dalam ruangan ini harus menggunakan jas laboratorium yang bersih sehingga bakteri atau kontaminan lain yang menempel pada tubuh maupun pakaian tidak dapat berpindah kedalam pekerjaan. Pada ruangan inokulasi terdapat alat yaitu Laminar Airflow (LAF) yang merupakan meja kerja untuk proses isolasi, penanaman, dan subkultur. Selama melakukan pekerjaan dalam ruang inokulasi, tangan praktikan dan alat-alat pemotong seperti scalpel, gunting, dan alat pemotong lainnya harus disterilkan menggunakan alkohol 96% dan selanjutnya dipanaskan menggunakan bunsen. Pada ruangan inokulasi terdapat lampu UV ynag berfungsi untuk mensterilkan ruang dan LAF sebelum digunakan. Ruang yang terakhir yang terdapat dalam Laboratorium Kultur Jaringan FMIPA UNY yaitu ruang inkubasi. Ruang inkubasi berfungsi untuk menyimpan hasil kultur dan merupakan ruang untuk pertumbuhan. Pada ruangan ini kebersihannya harus dijaga dan sedapat mungkin dihindari terlalu banyaknya orang yang keluar masuk ruangan inkubasi. Di dalam ruangan inkubasi terdapat rak-rak terbuka yang bertingkat dengan lampu fluorescent atau neon yang biasa digunakan untuk sumber cahaya dalam ruang kultur. Keseimbangan spektrum lampu fluorescent sangat baik dan efisien dalam penggunaan energi diabnding dengan lampu pijar. Bentuk lampu memungkinkan penyebaran cahaya yang baik dengan panas yang dikeluarkan relatif



rendah sehingga cocok untuk pertumbuhan eksplan yang telah ditanam. Selain lampu, AC juga merupakan salah satu alat yang penting dalam ruangan ini. AC berfungsi untuk mengatur suhu sehingga suhu tetap konstan. Selain rak penyimpanan eksplan, pada ruangan ini juga terdapat lemari penyimpanan bahan. Sterilisasi alat dan bahan dilakukan sebelum melakukan kultur jaringan. Barbagai macam alat dan bahan disterilkan menggunakan autoclave. Prinsip kerja dari autoclave yaitu dengan mensterilkan alat dan bahan menggunakan uap panas bertekanan 2 atm dengan suhu 121oC selama 15 menit untuk sterilisasi bahan dan 30 menit untuk sterilisasi alat. Autoclave dapat langsung mematikan sel-sel vegetatif dari suatu mikroba, namun tidak semua bahan dapat disterilisasi menggunakan autoclave, seperti serum, vitamin, antibiotik, dan enzim. Autoklaf terutama ditujukan untuk membunuh endospora, yaitu sel resisten yang diproduksi oleh bakteri, sel ini tahan terhadap pemanasan, kekeringan, dan antibiotik. Untuk menggunakan autoclave, langkah pertama yang dilakukan yaitu memeriksa banyaknya air destilasi. Apabila air kurang dari batas yang ditentukan, maka harus ditambahkan hingga mencapai batas. Air yang digunakan yaitu air destilasi untuk menghindari terjadinya karat. Setelah air diperiksa, alat dan bahan yang sudah disiapkan dan dibungkus menggunakan kertas payung dapat dimasukkan, kemudian autoclave dapat ditutup dengan rapat. Langkah selanjutnya yaitu mengatur timer selama 15 menit untuk sterilisasi media dan 30 menit untuk sterilisasi alat. Atur suhu pada autoclave sebesar 121oC. Tunggu hingga air mendidih sehingga uap memenuhi kompartemen autoclave dan terdesak keluar klep pengaman, kemudian klep pengaman ditutup dan dikencangkan. Jika alarm pada autoclave berbunyi, hal tersebut menunjukkan bahwa sterilisasi telah selesai. Tutup autoclave dapat dibuka ketika tekanan dalam kompartemen turun dan menunjukkan angka nol. Kemudian alat atau bahan yang disterilisasi dapat dikeluarkan dengan hati-hati. Sebelum membuat media, terlebih dahulu dilakukan pembuatan larutan stock. Larutan stock dibuat dengan tujuan untuk memudahkan pengambilan bahan-bahan kimia khususnya yang dibutuhkan dalam jumlah kecil, tak perlu sering menimbang karena hal ini kurang praktis. larutan stock disimpan di dalam lemari pendingin agar tidak mudah rusak dan mencegah terdegradasinya bahan-bahan kimia oleh mikroba penyebab kontaminasi. pembuatan larutan stock harus dilakukan dengan cermat, sebab larutan stock yang terlalu pekat akan mengalami pengendapan di lemari es, dan



larutan stock yang terkontaminasi tidak boleh digunakan lagi (Hendaryono dan Wijayani, 2002). Larutan stok yang dibuat yaitu larutan stok makronutrient dan larutan stok mikronutrient. Larutan stok makronutrient untuk media NP dibuat sebanyak 200 ml untuk 5 kali konsentrasi. Komposisi bahan yang digunakan yaitu 1519,5 mg/l (NH4)2SO4, 2313,5 mg/l KH2PO4, 160 mg/l NH4NO3, 2123 mg/l KNO3, 3188 mg/l Ca(NO3)2.6H2O, dan 1282 mg/l Mg(NO3)2. 6H2O. Semua bahan dimasukkan kedalam 100 ml aquadest satu-persatu secara urut. Ketika semua bahan telah dimasukkan kedalam 100 ml aquadest, langkah selanjutnya adalah menambahkan aquadest lagi sampai volume nya menjadi 200 ml Saat setiap bahan yang dimasukkan kedalam aquadest, harus diaduk agar bahan tidak menggumpal. Bahan dihomogenkan menggunakan stirer. Larutan stok mikronutrient untuk media NP dibuat sebanyak 200 ml untuk 5 kali konsentrasi. Larutan stok mikronutrient dibuat dengan cara sebanyak 55,75 mg/l MnSO4.4H2O dalam 100 ml aquadest steril dan dihomogenkan menggunakan stirer. Kedalam larutan tersebut dimasukkan berturut-turut dengan 21,5 mg/l ZnSO4.7H2O, 15,5 mg/l H3BO3, 2,075 mg/l KI, 0,625 mg/l NO2.MoO4.2H2O, 0,0625 mg/l CoCl2.6H2O dan 0,0625 mg/l CuSO4.5H2O. Saat memasukkan bahan, harus selalu diaduk agar campuran tidak menggumpal. Semua bahan dimasukkan satu persatu dan dihomogenkan menggunakan stirer dalam aquadest hingga volume mencapai 200 ml. Selanjutnya ialah membuat larutan stok untuk media MS. Larutan stok makronutrient untuk media MS dibuat sebanyak 200 ml untuk 5 kali konsentrasi. Larutan stok makronutrient dibuat dengan cara sebanyak 8250 mg/l NH4NO3, 9500 mg/l KNO3, 1850 mg/l MgSO4.7H20, 850 mg/l KH2PO4 dan 2200 mg/l CaCl2.2H2O Semua bahan dimasukkan kedalam 100 ml aquadest satu-persatu secara urut. Ketika semua bahan telah dimasukkan kedalam 100 ml aquadest, langkah selanjutnya adalah menambahkan aquadest lagi sampai volume nya menjadi 200 ml. Saat setiap bahan yang dimasukkan kedalam aquadest, harus diaduk agar bahan tidak menggumpal. Bahan dihomogenkan menggunakan stirer. Larutan stok mikronutrient untuk media MS dibuat sebanyak 200 ml untuk 5 kali konsentrasi. Larutan stok mikronutrient dibuat dengan cara sebanyak 111,5 mg/l MnSO4.4H2O dalam 100 ml aquadest steril dan dihomogenkan menggunakan stirer. Kedalam larutan tersebut dimasukkan berturut-turut dengan 43 mg/l ZnSO4.7H2O, 31 mg/l H3BO3, 4,15 mg/l KI, 1,25 mg/l Na2.MoO4.2H2O, 0,125 mg/l CuSO4.5H2O dan



0,125 mg/l CoCl2.6H2O. Saat memasukkan bahan, harus selalu diaduk agar campuran tidak menggumpal. Semua bahan dimasukkan satu persatu dan dihomogenkan menggunakan stirer dalam aquadest hingga volume mencapai 200 ml. Setelah pembuatan stok selesai dilakukan, langkah selanjutnya adalah melakukan pembuatan media. Media kultur adalah salah satu faktor penentu keberhasilan. Media kultur merupakan komponen faktor lingkungan yang menyediakan unsur pertumbuhan tanaman. Media kultur jaringan tanaman berfungsi sebagai sumber air, menyediakan kebutuhan hara mineral, vitamin, zat pengatur tumbuh. Secara umum media kultur jaringan terdiri dari bahan organik dan anorganik. Bahan organik sebagai sumber karbon, zat pengatur tumbuh dan vitamin sedangkan bahan anorganik seperti hara makro dan unsur hara mikro, memiliki komposisi yang berbeda-beda pada tiap media baik dari segi jumlah maupun bentuknya. Formulasi media Murashige dan Skoog (dikenal dengan Media MS) merupakan formula media yang paling banyak digunakan saat ini, karena media ini bisa diaplikasikan pada berbagai jenis tanaman. pada praktikum ini telah dilakukan pembuatan formulasi media (Campbell, 2012). Pada praktikum pembuatan media MS, dibuat tiga macam formula medium, yaitu MS+AK (600 ml), MS+AK+ 2,4 D (200 ml), dan MS+AK+ BAP (200ml). Alatalat yang digunakan dalam praktikum pembuatan media MS diantaranya adalah Gelas beker, pipet, timbangan, spatula, pH stick, panci, hot plate, stirrer, dan autoklaf. Sedangkan bahan-bahan yang diperlukan adalah bahan baku MS yang terdiri dari larutan stok unsur mikro, unsur makro, besi, vitamin, myoinositol, agar-agar, sukrosa, dan air kelapa, pH stick, botol jam, dan botol UC. Medium pertama adalah MS+AK (600ml), langkah pertama yang dilakukan adalah menyiapkan bahan baku MS dan menyiapkan aquadest 100ml ke dalam gelas beaker. Langkah selanjutnya adalah memasukkan 100ml aquadest yang telah diukur ke dalam labu ukur, kemudian ditambahkan unsur makro sebanyak 24ml, kemudian dipanaskan serta diaduk menggunakan magnet stirrer di atas hot plate. Setelah homogen, ditambahkan unsur mikro sebanyak 3ml, lalu dipanaskan dan dihomogenkan. Vitamin sebanyak 6ml ditambahkan kemudian dipanaskan dan dihomogenkan. Sukrosa sebanyak 12gr ditambahkan, dipanaskan dan dihomogenkan. Setelah homogen, ditambahkan iron



(Fe)



sebanyak 3ml



dipanaskan dan



dihomogenkan. Kemudian myo inositol sebanyak 12ml ditambahkan, lalu dipanaskan



dan dihomogenkan kembali. Selanjutnya adalah penambahan air kelapa (AK) sebanyak 90ml. Setelah itu, dilakukan pengukuran pH menggunakan pH stick hingga pH optimum yaitu 5,6-5,8 atau pada indikator pH stick mendekati indikator nomor 6. Apabila pH sudah optimum, ditambahkan aquadest hingga volume mencapai 600ml, kemudian dipanaskan dan dihomogenkan kembali. Setelah itu, ditambahkan agar-agar sebanyak 4,2 gram lalu larutan tersebut diaduk dan panaskan hingga mendidih. Setelah mendidih, media dituangkan ke dalam botol jam masing-masing + 40ml. Media MS yang ke dua adalah dengan memodifikasi media MS dengan air kelapa dan hormon auksin (1ppm) atau MS+AK+ 2,4 D (200ml). Langkah-langkah yang dilakukan hampir sama yaitu pertama perlu dipersiapkan aquadest sebanyak 100ml, kemudian unsur makro sebanyak 8ml ditambahkan ke dalam labu ukur yang sudah berisi aquadest kemudian dipanaskan dan diaduk menggunakan stirrer di atas hot plate. Kemudian ditambahkan unsur mikro sebanyak 1ml diaduk menggunakan stirrer di atas hot plate, vitamin sebanyak 2ml ditambahkan dan diaduk menggunakan stirrer di atas hot plate, kemudian sukrosa sebanyak 4gr ditambahkan dan diaduk menggunakan stirrer di atas hot plate, kemudian Iron (Fe) sebanyak 1ml ditambahkan dan diaduk menggunakan stirrer di atas hot plate. Selanjutnya ditambahkan myo inositol sebanyak 4ml dan diaduk menggunakan stirrer di atas hot plate. Setelah larutan homogen, air kelapa sebanyak 30ml ditambahkan dalam larutan tersebut lalu diaduk menggunakan stirrer di atas hot plate. Ditambahkan 2,4 D (auksin) yang berasal dari stock yang telah dibuat sebanyak 2ml untuk 200ml formula MS dan diaduk menggunakan stirrer di atas hot plate. Setelah diaduk dengan stirrer di atas hot plate, diukur pH menggunakan pH stick. pH optimum adalah 5,6-5,8, atau pada indikator pH stick mendekati angka 6. Setelah diukur pH, kemudian ditambahkan aquadest hingga volume mencapai 200ml, ditambahkan agar-agar sebanyak 1,4gr, kemudian diaduk dengan stirrer dan dipanaskan di atas hotplate hingga mendidih. Setelah mendidih, larutan didiamkan sejenak lalu dituangkan ke dalam botol UC masing-masing + 15ml. Media MS yang ketiga adalah dengan mengkombinasikan Air kelapa dan BAP (2ppm) atau MS+AK+BAP (200ml). Urutan langkah pembuatan media ini sama dengan media MS yang dikombinasikan dengan air kelapa dan 2,4 D, yaitu dengan menambahkan unsur makro sebanak 8ml, unsur mikro sebanyak 1ml, vitamin sebanyak 2ml, sukrosa sebanyak 4gr, Iron (Fe) sebanyak 1ml, Myo inositol 4ml, AK sebanyak... 30ml, BAP (hormon sitokinin) sebanyak 0,4ml, kemudian dilakukan uji



pH, lalu ditambahkan aquadest hingga volume mencapai 200ml dan ditambahkan agar-agar sebanyak 1,4 serta dididihkan. Tiap-tiap penambahan nutrisi diselingi dengan mengaduk larutan dengan magnet stirrer di atas hotplate. Setelah mendidih, larutan didiamkan sejenak kemudian dituangkan ke dalam botol UC masing-masing + 15ml. Botol jam dan botol UC yang sudah berisi media dan sudah ditutup dengan tutup botolnya atau ditutup menggunakan plastik serta diikat menggunakan karet, selanjutnya disterilisasi dengan menggunakan autoclave. Teknik sterilisasi media dilakukan selama 30 menit dan media siap disimpan dan digunakan untuk praktikum selanjutnya yaitu penanaman explan. Media Murashige & Skoog (media MS) merupakan perbaikan komposisi media Skoog, terutama kebutuhan garam anorganik. Media MS mengandung 40 mm N dalam bentuk NO3- dan 29 mm N dalam bentuk NH4+. Kandungan N ini, lima kali lebih tinggi dari N total yang terdapat pada media Miller, 15 kali lebih tinggi dari media tembakau Hildebrant, dan 19 kali lebih tinggi dari media White. Kalium juga ditingkatkan sampai 20 mM, sedangkan P 1.25 mM. Unsur makro lainnya konsentrasinya dinaikkan sedikit. Pertama kali unsur-unsur makro dalam media MS dibuat untuk kultur kalus tembakau, tetapi komposisi MS ini sudah umum digunakan untuk kultur jaringan jenis tanaman lain. Kebutuhan nutrisi mineral untuk tanaman yang dikulturkan secara in-vitro pada dasarnya sama dengan kebutuhan hara tanaman yang ditumbuhakan di tanah. Unsur-unsur hara yang dibutuhkan tanaman di lapangan merupakan kebutuhan pokok yang harus tersedia dalam media kultur jaringan. Antara lain adalah unsur hara makro dan unsur hara mikro. Unsur-unsur hara tersebut diberikan dalam bentuk garam-garam mineral. Unsur hara makro adalah hara yang dibutuhkan tanaman dalam jumlah yang banyak. Hara makro tersebut meliputi, Nitrogen (N), Fosfor (P), Kalium (K), Kalsium (Ca), Sulfur (S), Magnesium (Mg), dan Besi (Fe). Unsur hara mikro adalah hara yang dibutuhkan dalam jumlah yang sedikit. Unsur hara mikro ini merupakan komponen sel tanaman yang penting dalam proses metabolisme dan proses fisiologi lainnya (Kadhimi, 2014). Kemudian vitamin yang paling sering digunakan dalam media kultur jaringan tanaman adalah thiamine (vitamin B1), nicotinic acid (niacin), pyridoxine (vitamin B6). Thiamine merupakan vitamin yang esensial dalam kultur jaringan tanaman karena thiamine mempengaruhi pertumbuhan dan perkembangan sel. Vitamin C, seperti asam sitrat dan asam askorbat, kadang-kadang digunakan sebagai



antioksidan untuk mencegah atau mengurangi pencoklatan atau penghitaman eksplan (Kadhimi, 2014). Senyawa organik sering ditambahkan ke dalam media sebagai sumber pembentuk asam amino dan vitamin. Dalam praktikum yang telah dilakukan, digunakan air kelapa sebagai komponen senyawa organik. Senyawa organik lain yang sering ditambahkan adalah ekstrak ragi, ekstrak buah, dan casein hydrolisat. Sebagai sumber energi, ditambahkan dari senyawa-senyawa yang merupakan sumber karbohidrat. Dalam praktikum ini digunakan sukrosa yangmana sukrosa merupakan sumber karbohidrat paling baik bagi tanaman. Sumber karbohidrat lain yang dapat ditambahkan yaitu glukosa, fruktosa, dan maltosa. Selain sebagai sumber energi, senyawa ini juga berfungsi sebagai penyeimbang tekanan osmotik media (Laisina, 2013). Fe berfungsi sebagai penyangga (chelatin agent) yang sangat penting untuk menyangga kestabilan pH media selama digunakan untuk menumbuhkan jaringan tanaman.Pada tanaman, Fe berfungsi untuk pernapasan dan pembentukan hijau daun. Sedangkan mio-Inositol sering digunakan sebagai salah satu komponen media yang penting, karena terbukti bersinergis dengan zat pengaturtumbuh merangsang pertumbuhan jaringan yang dikulturkan (Kadhimi, 2014). Pada praktikum pembuatan media MS padat diperlukan agar-agar sebagai salah satu bahan pembuatan media MS, dimana agar-agar berfungsi untuk memadatkan larutan yang telah mengandung berbagai nutrisi tersebut. Keuntungan dari pemakaian agar-agar adalah, agar-agar tidak dicerna oleh enzim tanaman dan tidak bereaksi dengan persenyawaan-persenyawaan penyusun media (Laisina, 2013). Zat-zat organik adalah persenyawaan yang mengandung karbon, ditambahkan pada medium kultur jaringan berupa gula, myo-Inositol, vitamin, asam-asam amino dan zat pengatur tumbuh. Zat-zat organik tersebut biasanya tidak diberikan pada tanaman karena tanaman dapat mensintesis sendiri, tetapi pada kultur in vitro, karena eksplan yang digunakan umumnya berukuran sangat kecil dan tidak marnpu mensintesis sendiri semua zat-zat organik tersebut, maka zat-zat organik harus ditambahkan pada medium (Torres, 1989). Zat pengatur tumbuh (ZPT) adalah senyawa organik ataupun anorganik yang hanya dibutuhkan tanaman dalam konsentrasi yang sedikit. Zat pengatur tumbuh (hormon) yang ditambahkan dalam media tanam kultur jaringan bervariasi, baik jenisnya maupun jumlahnya, tergantung dengan tujuan dari kultur jaringan yang dilakukan. Menutut Paramartha (2012), ZPT yang sering digunakan untuk



menginduksi pertumbuhan pada teknik mikropropagasi adalah golongan auksin dan sitokinin dimana pada praktikum ini juga digunakan kedua hormon tersebut, yaitu 2,4 D dan BAP (Patel, 2013). Hormon adalah bahan organik yang disintesa pada jaringan tanaman. Hormon diperlukan dalam konsentrasi rendah untuk mempengaruhi pertumbuhan dan perkembangan tanaman. Banyak molekul sintetis organik yang telah dikenal memiliki aktivitas serupa hormon. Senyawa sintetis dan hormon yang secara alami ada, dikenal dengan sebutan zat pengatur tumbuh (Heddy, 1991). Penggunaan hormon tersebut harus tepat dalam perhitungan dosis pemakaian, karena jika terlalu banyak maupun terlalu sedikit dari dosis yang diperlukan justru akan menghambat bahkan berdampak negatif terhadap tanaman kultur. Karena interaksi antar hormon dalam suatu media sangat berpengaruh dalam diferensiasi sel (Kadhimi, 2014). Faktor penting lain dalam pembuatan media kultur jaingan adalah pH. PH pada medium tumbuh untuk kultur jaringan harus diperhatikan karena untuk menjamin ketersediaan unsur hara bagi exsplan di dalam botol kultur. Media yang baik harus selalu berada dalam pH optimal yaitu 5,6-5,8. Apabila pH kurang dari 5, media agar akan terlalu lemah, sebaliknya apabila pH di atas 7, maka media agar terlalu padat dan tidak bisa digunakan untuk penanaman eksplan dengan baik. Sehingga pH merupakan faktor penting yang harus diatur sedemikian rupa sehingga tidak mengganggu fungsi membran sel. Apabila ternyata pH < 5,8 maka harus ada penambahan NaOh. Apabila nilai pH > 5,8 maka harus diberi KCl. Selain itu, dalam pembuatan media juga harus dalam keadaan yang steril sehingga dilakukan pembuatan media dalam tempat yang steril, dan juga dilakukan sterilisasi pada media itu sendiri dengan menggunakan autoclave (Mirsadiq, 2013). Media NP (New Phaleopnosis) adalah media yang digunakan untuk tumbuhan Phalaenopsis. Media ini merupakan modifikasi dari MS karena unsur-unsur NP memiliki kemiripan dengan MS. Media ini memiliki ciri ciri bentuknya serbuk berwarna putih hingga berwarna krem, dapat larut di dalam air, memiliki konsentrasi saat digunakan sebesar 25,35 gram per liter. Dalam praktikum kultur jaringan tumbuhan ini langkah awal yang dilakukan adalah pembuatan media NP sebanyak 400 ml dan 600 ml. Dalam pembuatan media NP dibutuhkan bahan-bahan berupa: larutan makro dan mikro, larutan besi, vitamin, myoinositol, air kelapa dan juga sukrosa. Berikut komposisi dan takaran bahan-bahan pembuatan media NP 400 ml dan 600 ml :



No



Larutan



Jumlah untuk NP Jumlah untuk NP 600 ml



400 ml



1.



Larutan makro



24 ml



16 ml



2.



Larutan mikro



0,75 ml



0,5 ml



3.



Besi



3 ml



2 ml



4.



Agar



4,2 g



2,8 g



5.



Vitamin



6 ml



4 ml



6.



Myoinositol



24 ml



16 ml



7.



Air kelapa



90 ml



60 ml



8.



sukrosa



12 g



8g



Untuk mendapatkan jumlah takaran yang diinginkan yang harus dilakukan adalah menyiapkan semua bahan-bahan terlebih dahulu, kemudian melihat keterangan jumlah pada bagian kemasan bahan yang akan digunakan, lalu di dilakukan pengenceran sesuai dengan jumlah yang akan dibutuhkan. Ketika semua bahan telah tersedia, maka langkah selanjutnya adalah menyiapkan gelas bekker yang telah diberi magnetik stirer serta aquades sebanyak 200 ml dan diletakkan di atas hot plate yang memiliki fungsi untuk menghomogenkan dan juga untuk pemanas. Hot plate juga merupakan alat untuk mencampur dan memasak media kultur. Hot plate digunakan untuk memasak segala macam bahan nutrisi dengan melibatkan pengaduk dan pemanas. Setelah itu, bahan yang telah tersedia dimasukkan ke dalam gelas beker satu persatu hingga tercampur semua. Setelah air kelapa sudah dimasukkan langkah selanjutnya adalah mengukur pH. Menurut Gamborg dan Shyluk (1981) pH harus sedemikian rupa di perhatikan agar tidak mengganggu fungsi membran sel dan pH dari sitoplasma. Pengaturan pH selain memperhatikan kepentingan fisiologi sel, juga harus mempertimbangkan faktor-faktor kelarutan dari garam-garam penyusun media, pengambilan dari zat pengatur tumbuh dan garam-garam lain, dan efisiensi pembekuan agar-agar. Sel-sel tanaman membutuhkan pH yang sedikit asam dengan kisaran 5,5 – 5,8. Apabila belum memenuhi maka ditambahkan aquadest sampe larutan menjadi 400 ml untuk media pertama dan 600 ml untuk media kedua. Setelah semua telah selesai, maka larutaan tersebut langsung dipanaskan hingga mendidih dan di diamkan beberapa saat hingga dingin lalu di tuangkan ke dalam cawan petri yang telah di autoklaf.



C. Kesimpulan Berdasarkan praktikum yang telah dilakukan, Laboratorium Kultur Jaringan FMIPA UNY memiliki penataan ruang yang terbagi menjadi tiga ruangan, yaitu ruang preparasi, ruang inkubasi, dan ruang inokulasi. Berdasarkan kegiatan sterilisasi alat, dapat ditarik kesimpulan bahwa sterilisasi alat, bahan seperti aquadest dan media penting dilakukan dan semua alat yang akan digunakan untuk kultur jaringan harus disterilisasi terlebih dahulu karena salah satu syarat dalam melakukan kultur jaringan tumbuhan adalah dalam kondisi yang aseptik supaya tidak terdapat kontaminan dalam alat – alat tersebut.



DAFTAR PUSTAKA Barahima, Abbas. 2011. Prinsip Dasar Teknik Kultur Jaringan. Bandung: Alfabeta Campbell, et al. 2012. Biologi Edisi Kedelapan Jilid 2. Jakarta: Erlangga. Gamborg OL, Shyluk JP. 1981.Nutrion, media and characteristic of plant cell and tissue culture. Di dalam: Thorpe TA (ed). Plant Tissue Culture Methods and Aplication in Agriculture. New York: Academic Pr Heddy, Suwarsono. 1991. Hormon Tumbuhan. Jakarta: Raja Grafindo Persada. Kadhimi, Ahsan, et al. 2014. Tissue Culture and Some of The Factors Affecting Them and The Micropropagation of Strawberry. Life Science Journal. Vol: 11(8). Laisina, Jane K. J. 2010. Perbanyakan Ubi Jalar secara In Vitro dengan Menggunakan Media yang Murah. Ambon: Universitas Pattimur. Vol. 06 No. 02. Hal. 63-67. Mirsadiq, L. 2013. Teknik Budidaya Tanaman Hortikultura. Surakarta: Universitas Sebelas Maret Press. Patel, H., R. Krishnamurthy,. 2013. Elicitors in Plant Tissue Culture. Journal of Pharmacognosy and Phytochemistry.Vol: 2(2). Suryowinoto, Moeso. 2000. Pemulihan Tanaman Secara In Vitro. Kanisius. Yogyakarta. Torres, K. C. 1989. Tissue Culture Techniques for Horticultural Crops. New York: Van Nostrand Reinhold. Tuhuteru,S.,M.I.Hehanussa, dan S.H.T. Raharjo.2012. Perttumbuhan dan Perkembangan Anggrek Dendrobium anosmum pada Media Kultur In Vitro dengan Beberapa Konsentrasi Air Kelapa. Agrologia 1(1):1-12 Widhy.2009. Pengertian Alat dan Bahan di Laboratorium IPA. Yogyakarta. UNY



LAMPIRAN



Larutan stock disiapkan



Aquadest 100ml



Pemanasan larutan di atas hotplate



Penambahan larutan-laritan



Larutan dididihkan



stock



Pengukuran volume media dengan gelas ukur



Media dituang ke dalam



Media disusun dalam



Media disterilisasikan



botol



keranjang



menggunakan autoklaf