Laprak Pewarnaan [PDF]

Citation preview

LAPORAN PRAKTIKUM MIKROBIOLOGI “ PEWARNAAN BAKTERI”



Disusun oleh Anidya Annisa Khansa (1304618077) Pendidikan Biologi B 2018



Dosen Pengampu Dr. Dalia Sukmawati, M.Si Annisa Wulan Agus Utami, S.Si., M.Si.



UNIVERSITAS NEGERI JAKARTA FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM PROGRAM STUDI PENDIDIKAN BIOLOGI 2020



BAB I PENDAHULUAN



1.1 Latar Belakang Mikrobiologi adalah ilmu yang mempelajari organisme yang berukuran sangat kecil sehingga tidak dapat dilihat dengan mata telanjang melainkan harus menggunakan bantuan mikroskop. Organisme yang sangat kecil ini disebut sebagai mikroorganisme, atau sering disebut mikroba ataupun jasad renik. (Waluyo,2009) Untuk mengamati bentuk atau ciri-ciri suatu mikroba menggunakan mikroskop dapat digunakan dua cara yaitu mengamati sel mikroba yang masih hidup tanpa diwarnai dan mengamati sel mikroba yang telah mati dengan diwarnai. Untuk lebih mudah dilihat sebaiknya bakteri diwarnai dengan zat warna, beberapa zat yang digunakan untuk mewarnai bakteri juga dapat digunakan untuk mengamati struktur bagian dalam sel. Dengan adanya pewarnaan terutama bakteri yang mempunyai sel dengan ukuran yang retif kecil akan lebih mudah terlihat di bawah mikroskop denagn menggunakan lensa objektif minyak imersi yang mempunyai tingkat pembesaran yang relatif tinggi. Melihatadan mengamati bakteri dalam keadaan hidup sangat sulit, kerena selain bakteri itu tidak berwarna juga transparan dan sangat kecil. Selain itu bakteri yang hidup akan kontras dengan air, dimana sel-sel bakteri tersebut disuspensikan. Sedangkan, untuk mengatasi hal tersebut maka dikembangkan suatu teknik pewarnaan sel bakteri, sehingga sel dapat terlihat jelas dan mudah diamati. Oleh karena itu teknik pewarnaan sel bakteri ini merupakan salah satu cara yang paling utama dalam penelitian-penelitian mikrobiologi. Prinsip dasar dari pewarnaan ini adalah adanya ikatan ion antara komponen selular dari bakteri dengan senyawa aktif dari pewarna yang disebut kromogen. Terjadi ikatan ion karena adanya muatan listrik baik pada komponen seluler maupun pada pewarna. Berdasarkan adanya muatan ini maka dapat dibedakan pewarna asam dan pewarna basa. Berbagai macam tipe morfologi bakteri (coccus, bacillus, spiral, dan sebagainya) dapat dibedakan dengan mewarnai menggunakan zat pewarna. Mikroba sulit dilihat dengan cahaya karena tidak mengadsorbsi atau membiaskan cahaya. Alasan inilah yang menyebabkan berkembangnya teknik pewarnaan bakteri. Zat warna akan mengadsorbsi dan membiaskan cahaya sehingga kontras mikroba dengan sekelilingnya dapat ditingkatkan. Penggunaan zat warna memungkinkan pengamatan struktur pada mikroba yang diamati Pada praktikum kali ini, digunakan bakteri Escherichia coli, Bacillus sp., Staphylococcus sp., Clostridium s., dan Vibrio chloreae. untuk pengamatan dengan empat teknik pewarnaan yaitu pewarnaan sederhana, pewarnaan gram, pewarnaan negatif dan pewarnaan spora.



1.2 Tujuan Praktikum Berdasarkan latar belakang, tujuan yang ingin dicapai pada praktikum ini adalah : 1. Mempelajari teknik penyiapan olesan bakteri untuk pengamatan mikroskopik 2. Mempelajari teknik pewarnaan sederhana untuk melihat bentuk sel bakteri 3. Mempelajari teknik pewarnaan gram untuk membedakan kelompok bakteri Gram positif dan negative



4. Mempelajari teknik pewarnaan untuk mengetahui struktur bagian sel vegetatif dan endospora dari bakteri



BAB II TINJAUAN PUSTAKA



2.1 Bakteri Mikroorganisme yang ada di alam ini mempunyai morfologi, struktur dan sifat-sifat yang khas, termasuk bakteri. Bakteri adalah mikroba yang memiliki bentuk bervariasi seperti coccus, bacillus, dan spiral. Dan pada umumnya, bakteri tidak memiliki pigmen sehingga bakteri tidak berwarna. Untuk itu perlu dilakukan pewarnaan agar bakteri tampak jelas bila diamati dengan mikroskop. (Dwidjoseputro, 1994). Bakteri yang hidup hampir tidak berwarna dan kontras dengan air, dimana sel-sel bakteri tersebut disuspensikan. Salah satu cara untuk melihat dan mengamati bentuk sel bakteri dalam keadaan hidup sangat sulit, sehingga untuk diidentifikasi ialah dengan metode pengecatan atau pewarnaan sel bekteri, sehingga sel dapat terlihat jelas dan mudah diamati. Hal tersebut juga berfungsi untuk mengetahui sifat fisiologisnya yaitu mengetahui reaksi dinding sel bakteri melalui serangkaian pengecatan. Oleh karena itu teknik pewarnaan sel bakteri ini merupakan salah satu cara yang paling utama dalam penelitian-penelitian mikrobiologi. 2.2 Pewarnaan Sederhana Pewarnaan sederhana merupakan teknik pewarnaan yang paling banyak digunakan pada praktikum mikrobiologi. Disebut sederhana karena hanya menggunakan satu jenis zat untuk mewarnai mikroba yang akan diamati. Pada umumnya bakteri mudah bereaksi dengan pewarnaan sederhana, karena sitoplasmanya bersifat basofilik atau suka dengan basa. Pewarnaan sederhana biasanya menggunakan pewarna tunggal yaitu metal biru, basic fuchsin dan kristal violet. Pewarnaan sederhana bertujuan untuk memberikan kontras antara bakteri dan latar belakang. Pewarnaan sederhana dilakukan ketika kita ingin mengetahui informasi tentang bentuk dan ukuran sel bakteri. 2.3 Pewarnaan Gram Pewarnaan gram digunakan untuk membedakan bakteri gram positif dan bakteri gram negatif berdasarkan sifat fisik kimia dinding sel bakteri. Pewarnaan menggunakan pewarna utama kristal violet dan pewarna tandingan safranin. Tujuan pewarnaan ini adalah untuk memudahkan melihat bakteri dengan mikroskop, memperjelas ukuran dan bentuk bakteri, untuk melihat struktur luar dan struktur dalam bakteri seperti dinding sel dan vakuola, serta meningkatkan kontras mikroorganisme dengan sekitarnya. Pewarnaan ini dapat membagi bakteri menjadi gram positif dan gram negatif berdasarkan kemampuannya untuk menahan pewarna primer (kristal ungu) atau kehilangan warna primer dan menerima warna tandingan (safranin). Bakteri gram positif mengandung protein dan gram



negatif mengandung lemak dalam presentase lebih tinggi dan dinding selnya tipis. Pemberian alcohol (etanol) pada praktikum pewarnaan bakteri, menyebabkan terekstraksi lipid sehingga memperbesar permeabilitas dinding sel. Pewarnaan safranin masuk kedalam sel dan menyebabkan sel menjadi berwarna merah pada bakteri gram negatif sedangkan pada bakteri gram positif dinding selnya terdehidrasi dengan perlakuan alcohol, pori-pori mengkerut, daya rembes dinding sel dan membran menurun sehingga pewarna safranin tidak dapat masuk sehingga sel menjadi berwarna ungu, yang merupakan warna dari kristal violet. 2.4 Pewarnaan Negatif Pewarnaan negatif adalah pewarnaan yang menggunakan pewarna asam seperti negrosin, eosin, atau tinta cina sebagai pewarna utama. Pewarnaan negatif dilakukan pada bakteri yang sukar diwarnai oleh pewarna sederhana. Pewarnaan negatif bertujuan untuk memberi warna gelap pada latar belakang dan tidak member warna pada sel bakteri. Hal tersebut dapat terjadi karena pada pewarnaan negatif, pewarna yang digunakan adalah pewarna asam dan memiliki komponen kromoforik yang bermuatan negatif. Sehingga pewarna tidak dapat menembus atau berpenetrasi ke dalam sel bakteri karena negative charge pada permukaan sel bakteri. Pada pewarnaan negatif ini, sel bakteri terlihat transparan (tembus pandang).



2.5 Pewarnaan Spora Ada dua genus bakteri yang dapat membentuk endospora, yaitu genus Bacillus dan genus Clostridium. Struktur spora yang terbentuk di dalam tubuh vegetative bakteri disebut sebagai endospora (endo:dalam, spora:spora) yaitu spora yang terbentuk di dalam tubuh. Secara sederhana, dapat dikatakan bahwa endospora merupakan sel yang mengalami dehidrasi dengan dinding yang mengalami penebalan serta memiliki beberapa lapisan tambahan. (Aditya, 2010) Dalam pewarnaan spora bakteri diperlukan pewarnaan tertentu yang dapat menembus dinding tebal spora. Contoh dari pewarnaan yang dimaksud tersebut adalah dengan penggunaan larutan hijau malakit dan untuk memperjelas pengamatan, sel vegetatif juga diwarnai dengan larutan safranin sehingga sel vegetatif ini berwarna merah, sedangkan spora berwarna hijau. Dengan demikian, ada atau tidaknya spora dapat teramati, bahkan posisi spora di dalam tubuh sel vegetatif juga dapat diidentifikasi. (Volk dan Wheeler, 1988)



BAB III BAHAN DAN METODE



3.1 Pewarnaan Sederhana Alat dan bahan yang digunakan pada praktikum pewarnaan sederhana adalah : 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9.



Alat Gelas preparat Jarum ose Labeling Mikroskop Bunsen Pipet Tabung Rak tabung Tissue



1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9.



Bahan Bakteri Escherichia coli Bakteri Bacillus sp. Bakteri Staphylococcus sp. Bakteri Clostridium sp. Bakteri Vibrio cholerae Aquades Methylen blue 0,3 gr Alkohol 95% 30 mL Kristal Violet



Cara kerja : 1. Bersihkan objek glass dengan alkohol hingga bebas lemak, panaskan sekilas di atas nyala lampu spiritus. 2. Ambil secara aseptis 1 ose suspensi bakteri, dan ratakan di atas object glass seluas 1 cm 2, kemudian kering-anginkan preparat apusan tersebut. 3. Setelah kering preparat lalu difiksasi dengan cara memanaskan sekilas di atas nyala api spiritus 6-7 kali dan dinginkan. 4. Teteskan pada apusan larutan pewama bakteri, diamkan 1-2 menit, kemudian cuci dengan air mengalir sampai sisa-sisa pewama bakteri tercuci seluruhnya. 5. Selanjutnya preparat dikering-anginkan. 6. Amati di bawah mikroskop dengan pembesaran kuat. Sel-sel bakteri akan tampak berwarna biru dengan latar belakang terang.



3.2 Pewarnaan Negatif Alat dan bahan yang digunakan pada praktikum pewarnaan negatif adalah :



1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9.



Alat Gelas preparat Jarum ose Labeling Mikroskop Bunsen Pipet Tabung Rak tabung Tissue



1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8.



Bahan Bakteri Escherichia coli Bakteri Bacillus sp. Bakteri Staphylococcus sp. Bakteri Clostridium sp. Bakteri Vibrio cholerae Aquades Nigrosin/tinta India Alkohol 95% 30 mL



Cara Kerja : 1. Bersihkan glass preparat menggunakan tissu dan alkohol 2. Beri label pada glass preparat bagian tepi bawah 3. Tetesi nigrosin pada bagian tepi 4. Letakkan masing – masing bakteri di atas nigrosin dengan cara aseptik 5. Buat apusan satu arah menggunakan glass preparat lain yg telah dibersihkan 6. Keringkan dengan cara fiksasi 7. Amati menggunakan mikroskop 3.3 Pewarnaan Gram Alat dan bahan yang digunakan pada praktikum pewarnaan gram adalah :



1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9.



Alat Gelas preparat Jarum ose Labeling Mikroskop Bunsen Pipet Tabung Rak tabung Kertas serap



Bahan 1. Bakteri Escherichia coli 2. Bakteri Bacillus sp. 3. Bakteri Staphylococcus sp. 4. Bakteri Clostridium sp. 5. Bakteri Vibrio cholerae 6. Aquades 7. Crystal violet 8. Etanol 95% 9. Iodium 10. Safranin



Cara kerja : 1. Buatlan olesan bakteri 2. Tetesi dengan crystal violet selama 1 menit 3. Bilas dengan akuades mengalir 4. Tetesi iodium selama 1 menit 5. Bilas dengan akuades mengalir 6. Teteskan etanol 95% 7. Bilas dengan akuade mengalir 8. Tetesi pewarna tandingan safranin selama 45 detik, lalu bilas dengan akuades mengalir 9. Keringkan dengan kertas serap dan amati dengan menggunakan mikroskop



3.4 Pewarnaan spora Alat dan bahan yang digunakan pada praktikum pewarnaan spora adalah : 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9.



Alat Gelas preparat Jarum ose Labeling Mikroskop Bunsen Pipet Tabung Rak tabung Kertas serap



1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9.



Bahan Bakteri Escherichia coli Bakteri Bacillus sp. Bakteri Clostridium sp. Bakteri Staphylococcus sp. Bakteri Vibrio cholerae Aquades Hijau malakit Safranin Minyak imersi



Cara kerja : 1. Buatlah olesan bakteri dengan teknik aseptik kemuadian kering udaran serta fiksasi dengan panas 2. Tetesi olesan dengan pewarna pertama malakit hijau dan dipanaskan selama 2 - 3 menit. 3. Bilas kaca objek dengan akuades 4. Tetesi olesan dengan pewarna tandingan safranin selama 30 detik 5. Bilas dengan akuades mengalir, keringkan dengan kertas serap dan amati dibawah lensa minyak imersi.



BAB IV HASIL PENGAMATAN



4.1 Pewarnaan Sederhana Hasil pengamatan yang didapat pada praktikum pewarnaan sederhana adalah : Tabel 4.1 Hasil Pengamatan Praktikum Pewarnaan Sederhana No. 1.



Hasil Pengamatan



Gambar



Mikroba : Bacillus sp. Bentuk : batang Pewarna : kristal violet Warna : ungu Sumber : Nadifemeidita, Fadilla Qatrinsalwa. 2016 2. Mikroba : Escherichia coli Bentuk : batang (basil) pendek Pewarna : Methylen blue Warna : ungu



3. Mikroba : Vibrio cholerae Bentuk : batang Pewarna : Methylene blue Warna : merah muda - ungu



Sumber : https://www.academia.edu 4. Mikroba : Staphylococcus sp. Bentuk : coccus Pewarna : Methylen blue Warna : ungu Sumber : https://www.academia.edu



5.



Mikroba : Clostridium sp. Bentuk : basil Pewarna : Methylen blue Warna : biru



Sumber : Fitzgerald, Heather. 2018



4.2 Pewarnaan Negatif Hasil pengamatan yang didapat pada praktikum pewarnaan negatif adalah : Tabel 4.2 Hasil Pengamatan Praktikum Pewarnaan Negatif No. 1.



Hasil Pengamatan



Gambar



Mikroba : Bacillus sp. Bentuk : batang Pewarna : tinta cina



Sumber : Nadifemeidita, Fadilla Qatrinsalwa. 2016 2.



Mikroba : Escherichia coli Bentuk : batang Pewarna : fuchsin



Sumber : jurnal.unpad.ac.id 3.



Mikroba : Staphylococcus sp. Bentuk : coccus Pewarna : tinta india



Sumber : Bottone, 2004



4.



Mikroba : Vibrio chloreae Bentuk : batang



5.



Mikroba : Clostridium sp. Bentuk : batang Pewarna : nigrosin



Sumber : https://jb.asm.org



4.3 Pewarnaan Gram Hasil pengamatan yang didapat pada praktikum pewarnaan gram adalah : Tabel 4.3 Hasil Pengamatan Praktikum Pewarnaan Gram No. 1.



Hasil Pengamatan



Gambar



Mikroba : Bacillus sp. Bentuk : batang Warna : ungu Gram : positif



Sumber : Nadifemeidita, Fadilla Qatrinsalwa. 2016 2. Mikroba : Escherichia coli Bentuk : batang Warna : merah Gram : negatif



3. Mikroba : Vibrio chloreae Bentuk : batang Warna : merah Gram : negatif



4. Mikroba : Staphylococcus sp. Bentuk : coccus Warna : biru Gram : positif



Sumber : Pakpour, Nazzy. 2020 5. Mikroba : Clostridium sp. Bentuk : ovoid bening Warna : biru Gram : positif



Sumber : https://www.asmscience.org



4.4 Pewarnaan Endospora Hasil pengamatan yang didapat pada praktikum pewarnaan endospora adalah : Tabel 4.4 Hasil Pengamatan Praktikum Pewarnaan Endospora No. 1.



Hasil Pengamatan



Gambar



Mikroba : Bacillus sp. Bentuk : batang Letak spora : terminal (di ujung)



Sumber : https://www.asmscience.org



2. Mikroba : Clostridium sp. Bentuk : batang Letak spora : terminal (di ujung)



Sumber : https://www.asmscience.org 3.



Mikroba : Escherichia coli Bentuk : batang



4.



Letak spora : tidak membentuk spora Mikroba : Staphylococcus sp. Bentuk : coccus



5.



Letak spora : tidak membentuk spora Mikroba : Vibrio chloreae Bentuk : batang Letak spora : tidak membentuk spora



BAB V



PEMBAHASAN



5.1 Pewarnaan Sederhana Praktikum kali ini melakukakan pewarnaan sederhana pada 5 bakteri, bakteri yang digunakan antara lain Escherichia coli, Bacillus sp., Staphylococcus sp., Clostridium s., dan Vibrio chloreae. Pewarnaan sederhana merupakan teknik pewarnaan yang paling banyak digunakan. Disebut sederhana karena hanya menggunakan satu jenis zat warna untuk mewarnai organisme tersebut. Kebanyakan bakteri mudah bereaksi dengan pewarnaan pewarnaan sederhana karena sitoplasamanya bersifat basofilik (suka dengan basa). Zat-zat warna yang digunakan untuk pewarnaan sederhana umumnya bersifat alkolin. Dengan pewarnaan sederhana dapat mengetahui bentuk dan rangkaian sel-sel bakteri. Pewarna basa yang biasa digunakan pada praktikum ini adalah methylene blue dan kristal violet. Berbagai macam tipe morfologi bakteri (kokus, basil, spirilum, dan sebagainya) dapat dibedakan dengan menggunakan pewarna sederhana. Langkah pewarnaannya yaitu dengan meneteskan kristal violet atau methylene blue sebagai pewarna tunggal kemudian mencucinya dengan air suling. Mencuci dengan air suling bertujuan untuk melunturkan zat pewarna berlebih yang terletak pada mikroba, karena dalam pengamatannya hanya fokus mengamati bakterinya saja, tidak mengamati daerah sekitar bakteri. Kemudian menambahkan minyak imersi bertujuan untuk membiaskan cahaya dari medium udara dan medium kaca dengan pembiasan yang mendekati garis normal agar bakteri lebih sangat mudah untuk diamati. Pada pewarnaan sederhana untuk bakteri Bacillus sp. Digunakan zat pewarna kristal violet dan didapati bahwa bakteri ini berbentuk batang (bacil), susunan bakterinya adalah berantai ada yang menyerupai rantai putus-putus dan ada pula yang menyerupai rantai bersambung dengan warna terlihat dari hasil penyerapan adalah ungu. Pada pewarnaan sederhana selanjutnya pada bakteri Escherichia coli, Clostridium sp., dan Vibrio chloreae digunakan zat pewarna methylene blue dan didapati bahwa ketiga bakteri ini memiliki bentuk seperti batang (bacil) yang pendek dan susunannya seperti rantai yang memanjang dan ada yang terputus putus dengan warna yang terlihat dari hasil penyerapan adalah ungu untuk Escherichia coli dan Vibrio chloreae sedangkan hasil penyerapan dari Clostridium sp. Menunjukkan warna biru Bakteri yang terakhir untuk pewarnaan sederhana adalah Staphylococcus sp. Pada bakteri ini digunakan zat pewarna methylene blue, dan didapatkan bentuk dari bakteri ini adalah bulat (coccus), tersusun dalam kelompok – kelompok yang tidak teratur seperti buah anggur dengan warna yang terlihat dari hasil penyerapan adalah ungu.



5.2 Pewarnaan Negatif Praktikum kali ini melakukakan pewarnaan negatif pada 5 bakteri, bakteri yang digunakan antara lain Escherichia coli, Bacillus sp., Staphylococcus sp., Clostridium sp., dan Vibrio chloreae. Tujuan pewarnaan negatif adalah untuk mempelajari penggunaan prosedur pewarnaan negatif untuk mengamati morfologi organisme yang sukar diwarnai oleh pewarna sederhana. Pewarnaan ini bukan untuk mewarnai bakteri tetapi mewarnai latar belakangnya menjadi hitam gelap. Pada pewarnaan ini mikroorganisme kelihatan transparan (tembus pandang). Teknik ini berguna untuk menentukan morfologi dan ukuran sel. Metode ini menggunakan cat nigrosin atau tinta cina. Pewarnaan negatif memerlukan pewarna asam seperti eosin atau negrosin.pewarna asam memiliki negatif charge kromogen,tidak akan menembus atau berpenetrasi ke dalam sel karena negative charge pada permukaan bakteri. oleh karena itu, sel tidak berwarna mudah dilihat dengan latar belakang berwarna. Pada percobaan ini, hanya melakukan penetesan tinta cina atau nigrosine pada ujung preparat, kemudian meratakan tinta cina tersebut hingga menutupi bakteri. Saat meratakan tinta cina, tidak boleh terlalu tebal hingga menutupi permukaan bakteri, karena akan mempersulit pengamatan. Tinta cina pada percobaan ini tidak dapat meresap ke dalam sel bakteri, namun hanya digunakan untuk melatar belakangi bakteri sehingga bakteri yang terlihat pada pengamatan berbentuk seperti rantai-rantai panjang tidak berwarna (terlihat seperti bening). Tidak berwarna atau bening tersebut lah yang membuat bakteri ini dinamakan negatif. Pada pewarnaan negatif pada bakteri Bacillus sp. dan Staphylococcus sp. digunakan zat pewarna tinta cina dan didapati bahwa bentuk dari Bacillus sp. adalah batang dan Staphylococcus sp berbentuk bulat (coccus). Pada pewarnaan negatif selanjutnya pada bakteri Escherichia coli



dan Vibrio chloreae



digunakan zat pewarna fuchsin dan didapati bahwa bakteri berbentuk batang (basil). Dan pada bakteri Clostridium sp. digunakan zat perwarna nigrosine dan didapati bahwa bakteri ini berbentuk batang dan bakteri ini tidak berwarna atau bening sedangkan latar belakang dari bakteri berwarna gelap.



5.3 Pewarnaan Gram Praktikum kali ini melakukakan pewarnaan gram pada 5 bakteri, bakteri yang digunakan antara lain Escherichia coli, Bacillus sp., Staphylococcus sp., Clostridium sp., dan Vibrio chloreae. Pewarnaan Gram atau metode Gram adalah suatu metode empiris untuk membedakan spesies bakteri menjadi dua kelompok besar, yakni gram positif dan gram negatif, berdasarkan sifat kimia dan fisik dinding sel mereka terhadap tinta safranin atau Kristal violet. Langkah pertama pada proses pewarnaan ini adalah fiksasi dengan cara melewatkan object glass yang telah terdapat pulasan tipis kultur bakteri diatas nyala api. Proses fiksasi dilakukan supaya



bakteri benar -benar melekat pada kaca obyek sehingga olesan bakteri tidak akan terhapus apabila dilakukan pencucian. Setelah dilakukan fiksasi kemudian ditetesi dengan larutan kristal violet sebanyak 1-2 tetes dan dibiarkan selama 1 menit. Kemudian dicuci dengan air mengalir dan dibiarkan sampai kering. Pencucian dengan air bertujuan untuk mengurangi kelebihan zat warna dari kristal violet. Kemudian ditambahkan larutan iodium yang berfungsi untuk meningkatkan afinitas pengikatan zat warna oleh bakteri sehingga pengikatan zat warna oleh bakteri lebih kuat, memperjelas warna dari zat warna tersebut, mempersulit pelarutan zat warna. Lalu dibiarkan selama 1 menit untuk dibilas kembali dengan aquades. Alkohol 95% ditambahkan atau diteteskan pada biakan bakteri untuk melakukan penetrasi ke dalam dinding sel dan melunturkan pewarnaan dari kristal violet pada gram negatif, karena mengandung lipid sedangkan pada gram positif akan tetap mempertahankan warna ungu karena mengandung peptidoglikan. Larutan ini juga berfungsi untuk melarutkan lipida pada membrane bakteri gram negatif yang akan menyebabkan pori-pori sel membesar sehingga meningkatkan daya larut persenyawaan kristal violet. Setelah itu dilakukan pembilasan dengan aquades dan dikeringkan. Pewarnaan selanjutnya dengan menggunakan safranin sebanyak 2 tetes dan diamkan selama 30 detik.  Safranin tidak akan menyebabkan perubahan warna pada bakteri positif karena persenyawaan kompleks kristal violet tetap terikat pada dinding sel. Pada bakteri gram negatif penambahan safranin akan menyebabkan warna bakteri berubah menjadi merah karena warna yang dihasilkan oleh kristal violet telah luntur dengan lisisnya membran sel sehingga safranin dapat terikat. Oleh sebab itu, safranin atau zat pewarna kedua berfungsi sebagai pembeda terhadap zat warna kristal violet (Lay, 1994).  Kemudian cuci dengan air mengalir dan kering dianginkan. Pemberian kristal violet pada bakteri gram positif akan meninggalkan warna biru. Perbedaan respon terhadap mekanis pewarnaan gram pada bakteri adalah didasarkan pada struktur dan komposisi dinding sel bakteri. Bakteri gram positif mengandung protein dan gram negative mengandung lemak dalam persentasi lebih tinggi dan dinding selnya tipis. Pemberian alkohol (etanol) pada praktikum pewarnaan bakteri, menyebabkan terekstraksi lipid sehingga memperbesar permeabilitas dinding sel. Pewarnaan safranin masuk ke dalam sel dan menyebabkan sel menjadi berwarna merah pada bakteri gram negatif sedangkan pada bakteri gram positif dinding selnya terdehidrasi dengan perlakuan alkohol, pori – pori mengkerut, daya rembes dinding sel dan membran menurun sehingga pewarna safranin tidak dapat masuk sehingga sel berwarna biru. Perbedaan dasar antara bakteri gram positif dan negatif adalah pada komponen dinding selnya. Kompleks zat iodin terperangkap antara dinding sel  dan membran sitoplasma organisme gram positif, sedangkan penyingkiran zat lipida dari dinding sel organisme gram negatif dengan pencucian alkohol memungkinkan hilang dari sel. Bakteri gram positif memiliki membran



tunggal yang dilapisi peptidohlikan yang tebal (25-50nm) sedangkan bakteri negative lapisan peptidoglikogennya tipis (1-3 nm).



Pada pewarnaan gram untuk bakteri Bacillus sp., Staphylococcus sp., dan Clostridium sp. termasuk ke dalam bakteri gram positif karena bakteri tersebut tetap mempertahankan zat warna kristal violet sewaktu proses pewarnaan gram, sehingga koloni bakteri tampak berwarna ungu atau biru. Sedangkan pada pewarnaan gram untuk bakteri Escherichia coli dan Vibrio chloreae termasuk ke dalam bakteri gram negatif karena bakteri ini tidak dapat mempertahankan zat warna kristal violet pada metode pewarnaan Gram. Hal ini disebabkan Bakteri gram negatif memiliki 3 lapisan dinding sel. Lapisan terluar yaitu lipoposakarida (lipid) kemungkinan tercuci oleh alkohol, sehingga pada saat diwarnai dengan safranin akan menyerap warna merah. Sehingga koloni bakteri tampak berwarna merah.



5.4 Pewarnaan Endopora Praktikum kali ini melakukan pewarnaan endospora pada 5 bakteri, bakteri yang digunakan antara lain Escherichia coli, Bacillus sp., Staphylococcus sp., Clostridium sp., dan Vibrio chloreae. Tujuan dari pewarnaan spora yaitu mengenal dasar-dasar kimiawi pada pewarnaan spora dan kinerja dari prosedur untuk membedakan spora bakteri dan bentuk vegetative. Spora bakteri adalah bentuk bakteri yang sedang dalam usaha mengamankan diri terhadap pengaruh buruk dari luar. Segera setelah keadaan luar baik bagi mereka, maka pecahlah bungkus spora dan tumbuhlah bakteri. Spora juga disebut endospora yang masih terletak didalam sel bakteri. Endospora jauh lebih tahan terhadap pengaruh luar yang buruk daripada bakteri biasa yaitu bakteri dalam bentuk vegetatif, Sporulasi (proses pembentukan spora) dapat dicegah apabila selalu diadakan pemindahan biakan ke medium yang baru (Sudjadi 2006).  Letak endospora yang berbeda diantara spesies bakteri dapat digunakan untuk identifikasi. Tipe utama diantara terminal, subterminal dan sentral. Tipe sentral atau tengah merupakan lokasi dari sel vegetatif yang letaknya tepat di tengah. Tipe terminal memiliki pengertian letak sel vegetatif diantara ujung dan pinggir dari sel vegetatif. Tipe subterminal berarti lokasi endosporanya diantara tengah dan pinggir dari sel vegetatif. Pengecatan endospora dengan larutan hijau malasit, bakteri penghasil endospora akan menunjukkan reaksi positif yaitu larutan hijau malasit akan berikatan dengan spora sehingga saat pencucian akan tetap berwarna hijau dan cat penutup atau safranin tidak bisa diikat oleh endospora. (Pearce 2009).



Proses pewarnaan endospora dilakukan setelah fiksasi agar bakteri dapat melekat pada kaca preparat. Kemudian preparat diteteskan malacite green secara merata yang berfungsi sebagai pewarna primer dan setelah itu kaca preparat diletakkan di atas uap air yang bertujuan untuk membantu warna menembus spora karena malacite green sulit untuk masuk ke dalam spora sehingga pori-pori spora dibuka dengan cara pemuaian oleh panas dan dijaga jangan sampai pewarnanya



kering.



Kemudian



dicuci



dengan



akuades



dengan



cara



dialirkan



dan



dikeringudarakan yang bertujuan menghilangkan malacite green dari bagian sel endospora. Pewarnaan dengan safranin bertujuan sebagai counterstain yang digunakan untuk mewarnai bagian sel endopora, sehingga sel bakterinya akan memberikan warna merah atau merah muda. Pada pewarnaan endospore untuk bakteri Bacillus sp. dan Clostridium sp. Didapati spora yang ditunjukkan dengan warna hijau, sedangkan yang berwarna merah merupakan sel vegetative. Letak dari spora kedua bakteri ini ada di ujung (terminal). Sedangkan pada bakteri Escherichia coli, Staphylococcus sp., dan Vibrio chloreae termasuk ke dalam bakteri yang tidak membentuk spora, sehingga tidak ditemukan pengamatan bakteri dengan reaksi pewarna malacite green karena pada bakteri yang tidak menghasilkan endospora larutan malacite green tidak dapat diikat. Hal ini sejalan dengan teori bahwa ada dua genus bakteri yang dapat membentuk endospora, yaitu genus Bacillus dan genus Clostridium. Struktur spora yang terbentuk di dalam tubuh vegetative bakteri disebut sebagai endospora (endo:dalam, spora:spora) yaitu spora yang terbentuk di dalam tubuh. Secara sederhana, dapat dikatakan bahwa endospora merupakan sel yang mengalami dehidrasi dengan dinding yang mengalami penebalan serta memiliki beberapa lapisan tambahan. (Aditya, 2010).



KESIMPULAN Dari praktikum pewarnaan bakteri dapat ditarik kesimpulan : 1. Pewarnaan bakteri dipengaruhi faktor-faktor antara lain fiksasi, pelunturan warna, substrat, intensifikasi pewarnaan dan penggunaan zat warna penutup 2. Pewarnaan sederhana digunakan untuk melihat bentuk dan struktur sel bakteri dengan menggunakan satu jenis pewarna seperti safranin atau kristal violet, sedangkan pewarnaan gram digunakan untuk membedakan antara bakteri gram (+) dan gram (-) dengan lebih dari satu zat warna 3. Perbedaan pada gram negatif dan gram positif terletak pada warnanya pada gram positif berwarna ungu karena dapat mempertahankan zat pewarna kristal violet sedangkan bakteri gram negatif berwarna merah serta perbadaan terjadi pada dinding selnya 4. pewarnaan spora digunakan untuk mengenal dasar-dasar kimiawi pada pewarnaan spora dan kinerja dari prosedur untuk membedakan spora bakteri dan bentuk vegetative. 5. Pewarnaan negative bukan untuk mewarnai bakteri tetapi mewarnai latar belakangnya menjadi hitam gelap. Pada pewarnaan ini mikroorganisme kelihatan transparan (tembus pandang). Teknik ini berguna untuk menentukan morfologi dan ukuran sel. 6. Terdapat dua genus bakteri yang dapat membentuk endospora, yaitu genus Bacillus dan genus Clostridium. 7. Larutan zat warna yang digunakan pada percobaan perwarnaan antara lain : 



Methylen blue







Nigrosin atau tinta cina







Zat warna utama (violet kristal)







Mordan (larutan Iodin)







Pencuci / peluntur zat warna (alcohol / aseton) / safranin







Zat warna kedua / cat penutup (safranin)







malacite green



DAFTAR PUSTAKA



Aditya, Mushoffa. 2010. Teknik Pewarnaan Bakteri. http://mushoffaditya.blogspot.com/2010/01/teknik-pewarnaan-bakteri.html. Diakses pada 25 Oktober 2020 pukul 20.10 WIB Anne Zayaitz, Marise A. Hussey. 2007. Endospore stain. Kutztown: Kutztown University. Dwidjoseputro, D. (1994). Dasar-Dasar Mikrobiologi. Jakarta: Djambatan. Gozali, Amir. 2009. Pewarnaan Gram. Jakarta: PT Raja Grafindo. Kumar, V., Cotran, R.S., dan Robbins S.L., 2007. Buku Ajar Patologi. Edisi 7; ali Bahasa, Brahm U, Pendt ;editor Bahasa Indonesia, Huriawati Hartanto, Nurwany Darmaniah, Nanda Wulandari.-ed.7-Jakarta: EGC Lay,W.B.1994.Analisa Mikroba di Laboratorium.EdisiI.Jakarta : PT.Raja Grafindo Persada Lestari, Rina. 2013. Makalah : Pewarnaan Sederhana, Nehatif, Kapsul, dan Gram. Jakarta : Sekolah Tinggi Ilmu Kesehatan Yogyakarta Nadifemeidita, Fadilla Qatrinsalwa. 2016. Laporan Laboratorium Mikrobiologi Lingkungan: Teknik Pewarnaan Bakteri. Jakarta: Fakultas Teknik dan Ilmu Komputer Universitas Bakrie. Pakpour, Nazzy., dan Horgan, Sharon. 2020. Simple, Negative, and Gram Stain. California : California State University Pearce Evelyn. 2009. Anatomi dan Fisiologi untuk Paramedis. Yuliani Sri, penerjemah; Jakarta: PT Gramedia Pustaka Utama. Terjemahan dari: Anatomy and Physiology for Nurses. Setiabudy, R., Gan, V. H. 2007. Pengantar Antimikroba. Dalam: Farmakologi dan Terapi Edisi 5. Gaya Baru, Jakarta Tracy. 2005. Gram Staining, www.tracy.k12.ca.us/ thsadvbio/ pdfs/ gram%20stain.pdf,  Diakses pada 25 Oktober 2020 pukul 20.22 WIB



Umsl. 2008. Staining Bacteria, www.umsl.edu /~microbes/pdf/ stainingbacteria.pdf, 



Diakses pada 25 Oktober 2020 pukul 20.16 WIB Volk, W.A., dan Wheeler, M.F. 1988. Mikrobiologi Dasar. Jilid II. Terjemahan Soenartomo Adisoemarto. Penerbit Erlangga. Jakarta. Waluyo, L. 2009. Mikrobiologi Lingkungan. Malang: UMM Press. Washington Luis da Silva, Kuei-Ting Yang, Gregg Pettis, Natasha R. Soares, Rebecca Giorno, Christopher Clark. 2019. Flooding-associated soft rot of sweetpotato storage roots caused by distinct Clostridium isolates, Plant Disease. 10.1094/PDIS-03-19-0548RE