Metode Perhitungan Mikroba [PDF]

Citation preview

MAKALAH MIKROBIOLOGI INDUSTRI METODE PERHITUNGAN MIKROORGANISME



Disusun oleh Nama



: Ninis Yudhiana



NIM



: 121170098



PROGRAM STUDI TEKNIK KIMIA S-1 JURUSAN TEKNIK KIMIA FAKULTAS TEKNIK INDUSTRI UNIVERSITAS PEMBANGUNAN NASIONAL “VETERAN” YOGYAKARTA 2018



BAB I PENDAHULUAN



A.



LATAR BELAKANG Mikroorganisme merupakan semua makhluk yang berukuran beberapa



micron atau lebih kecil lagi. Yang termasuk golongan ini adalah bakteri, cendawan atau jamur tingkat rendah, ragi yang menurut sistematik masuk golongan jamur, ganggang, hewan bersel satu atau protozoa, dan virus yang hanya nampak dengan mikroskop electron (Dwidjoseputro, 1990). Pertumbuhan mikroorganisme yang membentuk koloni dapat dianggap bahwa setiap koloni yang tumbuh berasal dari satu sel, maka dengan menghitung jumlah koloni dapat diketahu penyebaran bakteri yang ada pada bahan. Jumlah mikroba pada suatu bahan dapat dihitung dengan berbagai macam cara, tergantung pada bahan dan jenis mikrobanya (Dwidjoseputro, 2005) Cara perhitungan jumlah mikroba/bakteri ada dua cara, yaitu perhitungan secara langsung dan tidak langsung. Perhitungan jumlah mikroba secara langsung yaitu jumlah mikroba dihitung secara keseluruhan, baik yang mati atau yang hidup, sedangkan perhitungan jumlah mikroba secara tidak langsung yaitu jumlah mikroba dihitung secara keseluruhan baik yang mati maupun yang hidup atau hanya untuk menentukan jumlah mikroba yang hidup saja (Volk,1993). B.



RUMUSAN MASALAH Berdasarkan latar belakang diatas, maka rumusan masalah yang menjadi inti



makalah ini adalah bagaimanakah metode yang digunakan untuk menghitung jumlah mikroorganisme. C.



TUJUAN MAKALAH Tujuan dari makalah ini adalah untuk mengetahui metode menghitung



jumlah mikroorganisme.



BAB II PEMBAHASAN



Pertumbuhan dapat didefinisikan secara umum yaitu sebagai pertambahan secara teratur semua komponen di dalam sel hidup. Pada organisme multiseluler dan uniseluler, pertumbuhan adalah pertambahan jumlah sel yang juga berarti penambahan jumlah organisme yang membentuk populasi atau satu biakan. Pada organisme aseluler, selama pertumbuhan ukuran sel menjadi besar, tetapi tidak terjasi pembelahan sel (Dwidjoseputro, 2005). Penentuan jumlah angka mikroorganisme sangat penting dilakukan untuk menetapkan keamanan suatu sediaan farmasi dan makanan. Berbagai metode telah dikembangkan untuk menghitung jumlah mikroorganisme. Metode tersebut menghitung jumlah sel, massa sel atau isi sel yang sesuai dengan jumlah sel (Volk, 1993). Koloni adalah kumpulan dari mikroba yang memiliki sifat – sifat seperti bentuk, susunan, permukaan dan sebagainya. Sifat – sifat yang perlu diperhatikan pada koloni yang tumbuh di permukaan medium adalah (Dwidjoseputro, 2005) 1. Besar kecilnya koloni. Ada koloni yang hanya serupa suatu titik, melebar sampai menutup permukaan medium 2. Bentuk. Ada koloni yang bulat, memanjang, dan lain – lain. 3. Kenaikan permukaan 4. Halus kasarnya permukaan 5. Wajah permukaan. Ada koloni yang permukaannya mengkilat dan ada yang suram 6. Warna 7. Kepekatan Perhitungan mikroba dapat dilakukan dengan dua cara, yaitu perhitungan secara langsung dan perhitungan secara tidak langsung. Perhitungan secara langsung dapat dilakukan dengan beberapa cara, yaitu :



a. Metode Counting chamber Perhitungan secara langsung dapat dilakukan secara mikroskopis yaitu dengan menghitung jumlah bakteri dalam satuan isi yang sangat kecil. Alat yang digunakan adalah Petroff – Hauser Chamber atau Haemocytometer. Dasar perhitungannya ialah dengan menempatkan satu tetes suspensi bahan atau biakan mikroba pada alat tersebut, ditutup dengan gelas penutup kemudian diamati dengan mikroskop yang perbesarannya tergantung pada besar kecilnya mikroba. Dengan menentukan jumlah sel rata – rata tiap petak (ruangan) yang telah diketahui volumenya, dari alat tersebut dapat ditentukan jumlah sel mikroba tiap cc. Prinsip dari perhitungan Petroff – Hauser yaitu melakukan perhitungan dengan pertolongan kotak- kotak skala, dimana dalam setiap ukuran skala seluas 1 mm2 terdapa 25 buak kotak besar dengan luas 0,04 mm2, dan setiap kotak besar terdiri dari 16 kotak kecil. Alat haemocytometer digunakan di bawah mikroskop, sisinya mempunyai ukuran 0,05 mm, sedangkan satu kotak sedang berukuran 0,2 mm, dan tebalnya adalah 0,1 mm. Jumlah sel per ml sampel dapat dihitung sebagai berikut : 1. Jumlah sel dalam 25 kotak besar = jumlah sel perkotak besar × 25 kotak 1



2. Jumlah sel per mm3 sampel = jumlah sel dalam 25 kotak besar × 0,02 3. Jumlah sel per ml sampel = jumlah sel per mm3 sampel × 103 = jumlah sel per kotak besar × 25 kotak × 1 0,02



× 103



Misalnya : didapatkan jumlah mikroba yang akan dihitung 12 sel mikroba, maka jumlah sel per ml sampel adalah 12 × 1,25 ×106 = 1,5 × 107. Haemocytometer adalah metode perhitungan secara mikroskopis. Tuang hitung terdiri dari 9 kotak besar dengan luas 1 mm2. Satu kotak besar di tengah, dibagi menjadi 25 kotak sedang dengan panjang 0,05 mm. satu kotak sedang dibagi lagi menjadi 16 kotak kecil. Dengan demikian satu kotak besar berisi 400 kotak kecil. Tebal dari ruang hitung ini adalah 0,1 mm. sel bakteri yang tersuspensi akan



memenuhi volume ruang hitung tersebut sehingga jumlah bakteri per satuan volume dapat diketahui. Kelebihan perhitungan sel dengan menggunakan Haemocytometer adalah dapat menghitung jumlah sel yang hidup maupun yang mati, tergantung dari pewarna yang digunakan. Bila pewarna trypan blue dicampurkan kedalam larutan sel maka sel yang hidup tidak akan berwarna dan sel yang mati akan berwarna biru. Kelebihan lainnya adalah morfologi sel dapat diamati, dapat mengevaluasi homogenitas dan data mendeteksi.



b. Menggunakan filter membrane Mula – mula disaring sejumlah volume tertentu suatu suspense bahan atau biakan mikroba, kemudian disaring dengan filter membrane yang telah disterilkan terlebih dahulu. Dengan menghitung jumlah sel rata – rata siap saat satuan luas pada filter membrane, dapat dihitung jumlah sel dari volume suspense yang disaring. Jika perhitungan secara biasa susah, perlu dilakukan pengecatan pada filter membrane, kemudian filter membrane dijenuhi dengan minyak imersi supaya tampak



transparan. Keuntungan metode ini adalah pelaksanaannya cepat dan tidak memerlukan banyak peralatan. Kelemahannya adalah : 1. Sel – sel mikroba yang telah mati tidak dapat dibedakan dari sel yang hidup, karena itu keduanya terhitung. 2. Tidak dapat digunakan untuk menghitung sel mikroba di dalam bahan yang banyak mengandung debris atau ekstrak makanan, karena hal tersebut akan mengganggu dapat perhitungan sel.



Gambar : Filter membran



c. Menggunakan cara pengecatan dan pengamatan mikroskopik Pada cara ini, mula – mula dibuat preparat mikroskopik pada gelas benda, suspense bahan atau biakan mikroba yang telah diketahui volumenya diratakan diatas gelas benda pada suatu luas terntentu. Setelah itu preparat dicat dan dihitung jumlah rata – rata sel mikroba tiap bidang pemandangan mikroskopik. Luas bidang pemandangan mikroskopik dihitung dengan mengukur garis tengahnya. Jadi jumlah mikroba yang terdapat pada gelas benda seluruhnya dapat dihitung. Dengan perhitungan ini, dapat diperoleh jumlah mikroba tiap cc bahan/cairan yang diperiksa. Cara yang hampir sama dan biasa dipakai untuk menghitung jumlah bakteri, ialah dengan mencampurkan 1 cc biakan bakteri dengan 1 cc darah manusia. Setelah homogen dibuat preparat mikroskopik. Dari perbandingan jumlah rata-rata jumlah sel bakteri dan jumlah sel darah merah dalam tiap bidang pemandangan, jumlah bakteri tiap cc dapat dihitung, sebab darah manusia yang normal mengandung 5 juta sel darah merah tiap cc. Perbandingan darah dengan bakteri yaitu 1:1.



Perhitungan jumlah mikroba secara tidak langsung dapat dilakukan dengan cara : a. Berdasarkan kekeruhan (turbiditas/turbidimetri) Mikroba dalam suatu bahan cair dapat dideteksi berdasarkan kekeruhannya. Pertumbuhan sel bakteri di dalam suatu medium cair akan meningkatkan kekeruhan media yang akan mempengaruh jumlah sinar yang dapat ditransmisikan menembus medium (Zaraswati, 2004). Beer dan Lambert menemukan hokum yang menerangkan interaksi bahan kimia dengan gelombang cahaya yang disimpulkan dalam hukum Beer – Lambert menyebabkan berkembangnya analisis kimia dengan menggunakan alat instrumentasi yakni spektrofotometer (Lay, 1994). Bakteri menyerap cahaya sebanding dengan volume total sel (ditentukan oleh ukuran dan jumlah). Ketika mikroba bertambah jumlahnya atau semakin besar ukurannya dalam biakan carit, terjadi peningkatan kekeruhan dalam biakan. Kekeruhan dapat disebut optical density (absorpsi cahaya biasanya diukur pada panjang gelombang 520 – 700 nm). Dasar penentuan cara ini adalah jika seberkas sinar dilakukan pada suatu suspensi bakteri, maka semakin pekat suspensi tersebut maka semakin besar intensitas sinar yang diabsorpsi, sehingga intensitas sinar yang diteruskan semakin kecil. Metode pengukuran turbiditas dapat dikelompokkan dalam tiga golongan, yaitu pengukuran perbandingan intensitas cahaya yang dihamburkan terhadap intensitas cahaya yang datang; pengukuran efek ekstingsi, yaitu kedalaman dimana cahaya mulai tidak tampak di dalam lapisan medium yang keruh. Instrumen pengukur perbandingan Tyndall disebut sebagai Tyndallmeter. Dalam instrumen ini intensitas diukur secara langsung, sedangkan pada nefelometer, intensitas cahaya diukur dengan larutan standar. Turbidimeter meliputi pengukuran cahaya yang diteruskan. Turbiditas berbanding lurus terhadap konsentrasi dan ketebalan, tetapi turbiditas tergantung juga pada warna. Untuk partikel yang lebih kecil, rasio



Tyndall sebanding dengan pangkat tiga dari ukuran partikel dan berbanding terbalik terhadap pangkat empat panjang gelombangnya. Dengan mengetahui presentase sinar yang diabsorpsi (sinar yang diteruskan) dan dibandingkan dengan standar mikroba yang telah diketahui jumlahnya tiap cc, maka dapat diketahui jumlah mikroba terhadap tiap ccnya. b. Berdasarkan analisis kimia Cara ini didasarkan atas hasil analisis kimia sel – sel mikroba. Makin banyak sel – sel mikroba, makin besar hasil analisis kimianya secara kuantitatif. Yang digunakan sebagai dasar penentuan umumnya adalah kandungan protein, asam – asam nukleat atau fosfor dari asam nukleat. c. Berdasarkan berat kering Cara ini terutama digunakan untuk penentuan jumlah jamur benang, misalnya dalam industry mikrobiologi. Kenaikan berat kering suatu mikroba berarti kenaikan sintesis dan volume sel – sel yang dipakai untuk menentukan jumlah mikroba. d. Menggunakan pengenceran Cara pengenceran ini dipakai untuk menentukan jumlah mikroba yang hidup saja. Dasar perhitungannya adalah dengan mengencerkan sejumlah volume tertentu suatu suspensi bahan atau biakan mikroba secara bertingkat, setelah diinokulasikan ke dalam medium dan diinkubasikan, dilihat pertumbuhan mikrobanya. e. Menggunakan Most Probable Number (MPN) Most Probable Number dalam bidang kesehatan masyarakat dari mikrobiologi pangan dipergunkan secara luas untuk menghitung jumlah bakteri yang ada dalam bahan pangan. Media ini banyak digunakan untuk menghitung bakteri patogenik dalam jumlah sedikit yang terdapat dalam bahan pangan. Metode ini berdasarkan atas pengenceran. Apabila suatu larutan yang mengandung sel – sel mikroorganisme diencerkan terus – menerus, akhirnya akan diperoleh suatu larutan dimaana tidak dijumpai sel lagi yaitu dikatakan steril (Buckle dkk, 1985).



Metode MPN digunakan medium cair di dalam tabung reaksi, dimana perhitungan dilakukan berdasarkan pada jumlah tabung yang positif yaitu yang ditumbuhi oleh jasad renik setelah inkubasi pada suhu dan waktu tertentu. Pengamatan tabung yang positif dapat dilihat dengan mengamati timbulnya kekeruhan, atau timbulnya gas di dalam tabung kecil (tabung-Durham) yang diletakkan pada posisi terbalik, yaitu untuk jasad renik pembentukan gas. Untuk setiap pengenceran pada umumnya digunakan tiga atau lima seri tabung. Lebih banyak tabung yang digunakan menunjukkan ketelitian yang lebih tinggi, tetapi alat gelas yangdigunakan juga lebih banyak. (Fardiaz, 1992).



f. Menggunakan metode hitungan cawan Metode hitungan cawan ini pengukuran pertumbuhan mikroba difokuskan pada perhitungan jumlah sel yang hidup saja. Metode perhitungan cawan didasarkan pada anggapan bahwa setiap sel yang hidup dapat berkembang menjadi koloni. Jadi jumlah koloni yang muncul pada cawan adalah indeks bagi jumlah mikroorganisme yang terkandung dalam sampel. Teknik yang harus dikuasai dari metode ini adalah mengencerkan sampel dan mencawankan hasil pengenceran tersebut. Setelah inkubasi, jumlah semua koloni diamati untuk memenuhi persyaratan statistik. Cawan yang dipilih untuk menghitung koloni adalah cawan yang mengandung antara 30 sampai 300 koloni. Organisme yang terdapat dalam sampel asal ditentukan dengan mengalikan jumlah koloni yang terbentuk dengan faktor pengenceran pada cawan yang bersangkutan (Waluyo, 2006).



Metode hitungan cawan ada dua cara, yaitu : -



Metode tuang



Tujuan dari metode tuang adalah untuk menentukan perkiraan jumlah bakteri hidup dalam cairan atau specimen. Hasil perhitungan bakteri dinyatakan dalam koloni (Irianto, 2012). Hal-hal yang harus diperhatikan adalah pengenceran sampel dan memasukkan hasil pengenceran tersebut. Pada pembuatan pengenceran, diambil 1 ml larutan uji dan dimasukkan dalam cawan petri kemudian dimasukkan ke media cair steril dengan suhu kira-kira 50oC sebanyak 15 ml (sebaiknya selama penuangan tutup cawan jangan dibuka terlalu lebar untuk menghindari kontaminasi). Cawan petri digerakkan di atas meja dengan gerakan melingkar seperti angka 8, gunanya untuk menyebarkan sel mikroba secara merata. Setelah agar memadat, cawan diinkubasikan dalam inkubator dengan posisi terbalik pada suhu 35oC-37oC selama 24 jam. Koloni yang terbentuk dihitung dengan Quebec Colony Counter. Larutan pengencer yang biasa digunakan adalah NaCl 0,9%, larutan buffer fosfat, atau larutan ringger. -



Metode sebar



Teknik spread plate (lempeng sebar) adalah suatu teknik di dalam menumbuhkan mikroorganisme di dalam media agar dengan cara menuangkan stok kultur bakteri atau mengapuskannya di atas media agar yang telah memadat. Bedanya dengan pour plate adalah pencampuran stok kultur bakteri dilakukan setelah media agar memadat sedangkan pour plate kultur dicampurkan ketika media masih cair (belum memadat). Kelebihan teknik ini adalah mikroorganisme yang tumbuh apat tersebar merata pada bagian permukaan media agar. Spread plate adalah teknik menanam dengan menyebarkan suspensi bakteri di permukaan agar diperoleh kultur murni. Adapun prosedur kerja yang dapat dilakukan pertama kali adalah mengambil suspensi cairan sebanyak 0,1 ml menggunakan pipet ukur kemudian teteskan diatas permukaan agar yang telah memadat. Batang L atau batang drugal diambil kemudian disemprot alkohol dan dibakar diatas bunsen beberapa saat, kemudian didinginkan dan ditunggu beberapa detik.



Kemudian disebarkan dengan menggosokannya pada permukaan agar supaya tetesan suspensi merata, penyebaran akan lebih efektif bila cawan ikut diputar. Hal yang perlu diingat bahwa batang L yang terlalu panas dapat menyebabkan sel – sel mikroorganisme dapat mati karena panas (Dwidjoseputro, 2005).



g. Berdasarkan jumlah koloni Cara ini paling umum digunakan untuk perhitungan jumlah mikroba. Dasarnya adalah membuat suatu seri pengenceran bahan dengan kelipatan 10 dari masing-masing-masing pengenceran diambil 1 cc dan dibuat taburan dalam Petridis (pour plate) dengan medium agar yang macam dan caranya tergantung pada macamnya mikroba. Setelah diinkubasikan dihitung jumlah koloni tiap Petridis dari masing-masing



pengenceran.



Dari



jumlah



koloni



tiap



petridis



dapat



ditentukan jumlah bakteri tiap cc atau gram bahan, yaitu dengan mengalikan jumlah koloninya dengan pengenceran yang dipakai. Misalnya jika pengenceran yg dipakai 103 dan koloni yang didapat 45 koloni bakteri, maka bakteri tiap cc adalah 45 koloni bakteri x 103 = 45.000 bakteri. Untuk membantu menghitung jumlah koloni dalam Petridis dapat digunakan “colony counter” yang biasanya dilengkapi dengan register elektronik (Natsir, 2007).



BAB III PENUTUP A. KESIMPULAN Jumlah mikroba suatu bahan dapat ditentukan dengan bermacam – macam cara, tergantung pada bahan dan jenis mikroba yang ditentukan. Ada dua cara penghitungan jumlah mikroba, yaitu : a. Penghitungan jumlah mikroba secara langsung (direct method) Cara ini dipakai untuk menentukan jumlah mikroba secara keseluruhan baik yang mati maupun yang hidup. Ada beberapa macam cara perhitungan secara langsung, yaitu : -



Metode Counting chamber



-



Menggunakan filter membrane



-



Menggunakan cara pengecatan dan pengamatan mikroskopik



b. Penghitungan jumlah mikroba secara tidak langsung (indirect method) Cara ini dipakai untuk menentukan jumlah mikroba secara keseluruhan baik yang hidup maupun yang mati atau hanya untuk menentukan jumlah mikroba yang hidup saja tergantung cara yang digunakannya. Ada beberapa macam cara perhitungan secara tidak langsung, yaitu : -



Berdasarkan kekeruhan (turbiditas/turbidimetri)



-



Berdasarkan analisis kimia



-



Berdasarkan berat kering



-



Menggunakan pengenceran



-



Menggunakan Most Probable Number (MPN)



-



Menggunakan metode hitungan cawan (Total Plate Count)



-



Berdasarkan jumlah koloni



DAFTAR PUSTAKA



Buckle, dkk. 1985. Ilmu Pangan. Terjemahan oleh H. Purnomo dan Adiono.(Online). Tersedia: https://www.scribd.com/document/168845769/Laporan-PerhitunganMikroba (3 Oktober 2018) Dwidjoseputro, 2005. Dasar – Dasar Mikrobiologi.(Online). Tersedia: https://www.scribd.com/document/168845769/Laporan-Perhitungan-Mikroba (3 Oktober 2018) Fardiaz,



S. 1992. Mikrobiologi Pangan. http://makermelodi.hol.es/?p=43 (3 Oktober 2018)



(Online).



Tersedia:



Irianto, K. 2012. Anatomi dan Fisiologi Untuk Mahasiswa. (Online). Tersedia: http://makermelodi.hol.es/?p=43 (3 Oktober 2018) Lay,



B. 1994. Analisis Mikroba di Laboratorium. (Online). Tersedia: https://www.scribd.com/doc/144401710/Makalah-Laporan-Praktikum-MelihatDan-Menghitung-Koloni (3 Oktober 2018)



Rachmat,



Volk,



Gabriella Velicia. 2013. Laporan Perhitungan Mikroba. https://www.scribd.com/document/168845769/Laporan-Perhitungan-Mikroba (3 Oktober 2018) dkk.



1993.



Mikrobiologi



Dasar



1.



(Online).



Tersedia:



https://www.scribd.com/document/168845769/Laporan-Perhitungan-Mikroba (3 Oktober 2018) Zaraswati, dkk. 2004. Dasar – Dasar Mikrobiologi. (Online). Tersedia: https://www.scribd.com/document/168845769/Laporan-Perhitungan-Mikroba (3 Oktober 2018)