Modul Praktikum Fitokimia STIKES [PDF]

Citation preview

STIKES Harapan Bangsa



MODUL PRAKTIKUM FITOKIMIA



STIKES HARAPAN BANGSA 1|Modul Praktikum Fitokimia



STIKES Harapan Bangsa KATA PENGANTAR Praktikum fitokimia merupakan bagian dari paket materi kuliah fitokimia yang diberikan kepada mahasiswa agar mahasiswa mengetahui cara-cara analisis komponen kimia dalam tumbuhan, khususnya tumbuhan obat. Materi praktikum disusun sedemikian rupa sehingga dapat menunjang serta sekaligus memberikan gambaran yang lebih jelas mengenai materi yang diberikan pada perkuliahan. Melalui praktikum yang terarah diharapkan dapat meningkatkan motivasi dan merangsang inovasi baru dari mahasiswa dalam teknis praktis. Buku panduan praktikum analisis fitokimia ini diupayakan dapat memberi gambaran mengenai tahapan analisis fitokimia yang biasa dilakukan oleh para peneliti bahan alam, dimulai dengan tahapan pengenalan metabolit sekunder dalam tanaman obat melalui penapisan fitokimia, metode ekstraksi untuk memisahkan sebagian besar komponen kimia, metode pemisahan metabolit sekunder dengan teknik kromatografi, serta metode pemurniannya, sehingga diperoleh komponen tunggal/isolat. Selain itu, juga dipelajari mengenai isolasi minyak atsiri dengan metode destilasi, enfleurasi, dan ekstraksi dari hasil pemerasan. Teknik yang diberikan dalam buku panduan ini merupakan teknik dasar namun dapat diterapkan di laboratorium dan cukup terandalkan. Harapan kami semoga buku Panduan Praktikum Analisis Fitokimia ini dapat dimanfaatkan sebaik-baiknya untuk proses pembelajaran di Stikes Harapan Bangsa Jember, khususnya dalam mata kuliah Fitokimia.



Jember, Maret 2018 Penyusun



2|Modul Praktikum Fitokimia



STIKES Harapan Bangsa DAFTAR ISI



HALAMAN JUDUL ............................................................................................................................... I KATA PENGANTAR ........................................................................................................................... 1 DAFTAR ISI .......................................................................................................................................... 2 PRAKTIKUM PERTAMA ..................................................................................................................... 3 PRAKTIKUM KEDUA .......................................................................................................................... 7 PRAKTIKUM KETIGA ...................................................................................................................... 16 PRAKTIKUM KEEMPAT .................................................................................................................. 24 PRAKTIKUM KELIMA ..................................................................................................................... 26



3|Modul Praktikum Fitokimia



STIKES Harapan Bangsa PRAKTIKUM PERTAMA PENYIAPAN SAMPEL BAHAN ALAM



TUJUAN PRAKTIKUM Setelah praktikum diharapkan mahasiswa dapat melakukan tahapan mempersiapkan simplisia sebelum melakukan proses ekstraksi dari tumbuhan



dalam



TEORI DASAR Tumbuhan telah digunakan semenjak zaman dahulu untuk mengobati berbagai penyakit. Pada awalnya tumbuhan digunakan dalam proses pengobatan dalam bentuk herbalnya, tetapi seiring dengan perkembangan ilmu pengetahuan dan teknolobgi, saat ini tumbuhan berperan dalam menyediakan senyawa murni yang dapat dimanfaatkan sebagai obat. Proses pencarian senyawa obat dari tumbuhan adalah sebuah proses yang kompleks dan panjang serta melibatkan berbagai bidang ilmu pengetahuan antara lain limia, farmakologi, biokimia, botani, antropologi dan lain-lain. Tumbuhan memberikan peranan yang penting dalam pengobatan penyakit, dapat berada dalam bentuk teh herbal, fitofarmaka dan senyawa murni yang diisolasi dari tumbuhan obat. Secara garis besar, tahapan dalam proses isolasi senyawa kimia dari tumbuhan adalah pertama persiapan sampel atau simplisia yang meliputi (pemilihan sampel, pengambilan dan identifikasi sampel serta sortasi basah, perajangan, pengeringan dan penghalusan), kedua skrining fitokimia, ketiga ekstraksi dan keempat isolasi senyawa murni. 1. Pemilihan sampel, pengambilan dan identifikasi sampel Metode yang digunakan dalam pemilihan, pengumpulan dan identifikasi bahan tanaman secara langsung akan mempengaruhi reproduksibilitas dari suatu penelitian fitokimia. Kecerobohan pada tahap ini akan dapat mengurangi nilai ilmiah dari studi keseluruhan. secara umum, pemilihan sampel dapat dilakukan menggunakan beberapa pendekatan, antara lain a. Pemilihan sampel secara random b. Pendekatan fitokimia : pemilihan sampel berdasarkan kandungan kimianya c. Pendekatan farmakologis : pemilihan sampel berdasarkan bioaktivitasnya d. Pendekatan etnobotani : pemilihan sampel berdasarkan informasi penggunaan tradinational tumbuhan tertentu. Biasanya sumber informasi adalah seorang herbalis ataupun dari masyarakat yang biasa menggunakan tumbuhan obat e. Pendekatan kemotaksonomi : pemilihan berdasarkan kesamaan taksonomi, misalnya dipilih berdasarkan famili tumbuhan tertentu f. Pemilihan sampel berdasarkan laporan atau jurnal ilmiah tentang pengujian bioaktivitas suatu tumbuhan



4|Modul Praktikum Fitokimia



STIKES Harapan Bangsa Kadar aktif suatu senyawa dalam suatu tumbuhan berbeda-beda dan sangat bergantung pada bagian tanaman yang diambil, waktu pengambilan, umur tumbuhan dan lingkungan tempat tumbuh. Identifikasi sampel perlu dilakukan oleh ahlinya, serta sampel harus disimpan dengan nomor kode sampel di herbarium untuk memudahkan penelusuran kembali. 2. Sortasi basah Sortasi basah dilakukan dengan cara pencucian sampel yang bertujuan untuk menghilangkan sampel dari tanah dan kotoran lainnya yang melekat 3. Perajangan Beberapa sampel memerlukan perajangan terlebih dahulu sebelum dikeringkan, yang bertujuan untuk membantu proses pengeringan. Tanaman yang baru diambil, jangan langsung dirajang, tetapi dijemur dalam keadaan utuh selama 1 hari, selanjutnya baru dirajang dengan menggunakan pisau atau alat pemotong lainnya sehingga membentuk irisan tipis atau sesuai dengan bentuk yang diinginkan. 4. Pengeringan Tujuan pengeringan adalah untuk mendapatkan simplisia yang dapat disimpan dalam waktu yang lebih lama. Secara umum simplisia harus dikeringkan pada suhu dibawah 30oC, untuk mengundari terurainya komponen kimia yang terdapat dalam tumbuhan akibat dari pengaruh suhu. Sampel harus dihindari dari sinar matahari langsung karena adanya potensi transformasi kimia akibat dari radiasi sinar UV. 5. Penghalusan Jika sampel yang akan dihaluskan jumlahnya sedikit maka akan digunakan blender. Tetapi jika jumlah sampel banyak, maka dianjurkan untuk menghaluskan dengan menggunakan peralatan penghancur skala industri. ALAT : 1. Pisau 2. Gunting 3. Alas Pemotong 4. Blender 5. Kertas Koran BAHAN : Tumbuhan Obat



5|Modul Praktikum Fitokimia



STIKES Harapan Bangsa PROSEDUR KERJA 1. Pemilihan sampel Pilihlah sampel dari tumbuhan yang akan diisolasi kandungan kimianya dan tentukan pendekatan apa yang akan digunakan dalam pemilihan sampel tersebut 2. Pengambilan sampel Lakukan pengambilan sampel, serta lakukan pencatatan terhadap a. Bagian tanaman yang diambil b. Umur tanaman (jika memungkinkan) c. Waktu pengambilan d. Lokasi pengambilan e. Jumlah (gram) sampel segar yang diambil 3. Identifikasi Lakukan identifikasi organoleptik tumbuhan atau sampel tersebut. Meliputi (bau, rasa, warna dan bentuk) 4. Perajangan Untuk mempermudah dan membantu proses pengeringan, maka sampel yang telah disortasi basah dan dibiarkan selama 1 hari, selanjutnya dirajang dengan menggunakan pisau atau pemotong lainnya sehingga membentuk irisan tipis, jika sampel yang diambil adalah daun, maka proses perajangan tidak diperlukan. 5. Pengeringan Sampel yang telah dirajang selanjutnya dikeringkan dan hindari terkena cahaya matahari langsung 6. Penghalusan Sampel yang telah kering, kemudian dihaluskan dengan menggunakan blender. Sampel yang telah halus selanjutnya ditimbang beratnya.



KESIMPULAN ...................................................................................................................................................... ...................................................................................................................................................... ...................................................................................................................................................... ...................................................................................................................................................... ...................................................................................................................................................... ......................................................................................................................................................



6|Modul Praktikum Fitokimia



STIKES Harapan Bangsa Paraf Asisten Praktikum



Paraf Praktikan



(Hari/Tanggal)



(Hari/ Tanggal)



DAFTAR PUSTAKA 1. Departemen Kesehatan Republik Indonesia. 1985. Cara Pembuatan Simplisia 2. Sarker, SD. Latif, Z. Gray. A.I. 2006. Natural Product Isolation. Humana Press, New Jersey.



7|Modul Praktikum Fitokimia



STIKES Harapan Bangsa PRAKTIKUM KEDUA EKSTRAKSI METABOLIT SEKUNDER DARI SIMPLISIA TUMBUHAN OBAT



TUJUAN PRAKTIKUM Melakukan penyarian metabolit sekunder dari simplisia tumbuhan obat dengan beberapa metode ekstraksi. Setelah melakukan praktikum ini, mahasiswa dapat memahami dan mampu melakukan penyarian metabolit sekunder dari simplisia tumbuhan obat dengan cara sederhana namun terandalkan. TEORI DASAR Pada analisis fitokimia tumbuhan obat idealnya digunakan bahan baku segar yang dididihkan dengan alkohol selama beberapa menit segera setelah dikumpulkan. Hal ini dimaksudkan untuk menonaktifkan enzim, supaya tidak terjadi reaksi enzimatis selama percobaan dilakukan. Kadang-kadang tumbuhan yang akan diteliti tidak dapat diperoleh dengan segera dan bahkan mungkin kolektornya tinggal di daerah atau benua lain, sehingga bahan baku dikeringkan terlebih dahulu sebelum dilakukan ekstraksi. Pengeringan ini harus dilakukan dengan hati-hati dan dijaga jangan sampai terjadi perubahan kimia. Oleh karena itu, tumbuhan sesegera mungkin dikeringkan diudara terbuka tanpa menggunakan panas tinggi. Setelah kering, bahan bisa disimpan lama sebelum dilakukan ekstraksi. Ekstraksi merupakan tahap awal pada jalur isolasi metabolit sekunder dari tumbuhan obat. Ekstraksi dapat dibagi menjadi beberapa golongan tergantung dari beberapa keadaan yang menyertainya. Ditinjau dari suhu, ekstraksi dibagi menjadi dua golongan, yaitu ekstraksi dingin dan ekstraksi panas. Ekstraksi dingin misalnya maserasi dan perkolasi. Ekstraksi dingin dilakukan terhadap bahan tumbuhan yang mengandung senyawa yang bersifat termolabil. Metode ini memerlukan waktu yang relatif lebih lama bila dibandingkan dengan ekstraksi panas. Ekstraksi panas misalnya dengan cara infus, dekok, refluks, dan menggunakan alat soxhlet. Ditinjau dari banyaknya ulangan proses, ekstraksi dibagi menjadi dua golongan pula, yaitu ekstraksi satu kali, misalnya maserasi dan ekstraksi berulang kali, misalnya dengan alat soxhlet. Dalam hal ini efektivitas proses ekstraksi akan ditentukan oleh banyaknya pengulangan proses ekstraksi. Ekstraksi berulang akan lebih efektif dibanding dengan ekstraksi satu kali, sesuai dengan perumusan sebagai berikut :



8|Modul Praktikum Fitokimia



STIKES Harapan Bangsa



Wn =



Jumlah zat yang belum terekstraksi



Wo =



Jumlah zat mula-mula



K



=



Koefisien partisi zat



V



=



Volume awal



S



=



Volume larutan pengekstraksi



N



=



Jumlah pengulangan ekstraksi



Persamaan di atas umumnya digunakan untuk ekstraksi cair-cair, namun untuk ekstraksi padat-cair secara umum persamaan tersebut juga dapat diterapkan. Ditinjau dari penggunaan pelarut, metode ekstraksi terdiri atas metode yang menggunakan pelarut seperti maserasi, perkolasi, soxhlet, refluks, infus, dekok dan digesti dan metode ekstraksi tanpa pelarut misalnya destilasi uap yaitu pemisahan berdasarkan perbedaan titik uap. Terdapat beberapa metode ekstraksi lainnya misalnya ekstraksi dengan karbondioksida superkritik, ekstraksi ultrasonik dan ekstraksi energi listrik. Cara ekstraksi yang tepat tergantung pada jaringan tumbuhan, kadar air dan golongan senyawa yang akan diisolasi. Pada umumnya diperlukan mematikan jaringan tumbuhan terlebih dahulu dengan etanol mendidih supaya tidak terjadi oksidasi enzimatis atau hidrolisis. Etanol merupakan pelarut yang baik untuk ekstraksi tahap awal dan dapat digunakan untuk menghilangkan klorofil yang terdapat pada simplisia, misalnya daun yang berwarna hijau. Pada ekstraksi pertama klorofil akantertarik dan pada ekstraksi selanjutnya dengan etanol diharapkan simplisia telah bebas dari klorofil. Berdasarkan pengertian bahwa ekstraksi adalah metode penarikan metabolit sekunder dari tumbuhan atau bagian tumbuhan dengan pelarut yang sesuai, maka dalam pemilihan pelarut pengekstraksi berlaku prinsip: polar loves polar, nonpolar loves nonpolar, artinya bila kita akan mengekstraksi senyawa polar, harus digunakan pelarut polar dan apabila kita akan mengekstraksi senyawa nonpolar, maka harus digunakan pelarut nonpolar. Namun pada prakteknya ekstraksi dilakukan dengan menggunakan pelarut dalam gradasi kepolaran, mulai dari nonpolar ke polar atau dari polar ke nonpolar. Contoh pelarut polar adalah air, metanol, etanol, pelarut semi polar adalah aseton, etil asetat, kloroform dan pelarut nonpolar adalah nheksana, eter minyak tanah, toluen, benzene. Pelarut-pelarut nonpolar benzena, kloroform dan karbon tetraklorida sekarang jarang digunakan, karena sifatnya hepatotoksik atau karsinogenik. Pelarut metanol merupakan pelarut yang baik daripada etanol tetapi kini dihindari karena memiliki sifat toksik akut dan kronik. Untuk memperoleh ekstrak total, pelarut yang digunakan dipilih yang dapat melarutkan hampir semua metabolit sekunder yang terkandung 9|Modul Praktikum Fitokimia



STIKES Harapan Bangsa dalam simplisia tanaman obat. Campuran pelarut alkohol-air merupakan campuran yang baik untuk ekstraksi awal dan diperbolehkan menurut peraturan . Faktor utama untuk mempertimbangkan pemilihan cairan pernyari adalah selektivitas, kemudahan bekerja/proses dengan cairan tersebut, ekonomis, ramah lingkungan dan keamanan. Ekstrak yang diperoleh dipekatkan dengan penguap vakum putar pada tekanan rendah (rotavapor=rotary evaporator) hingga diperoleh ekstrak kental. Terhadap ekstrak kental dilakukan pemeriksaan kualitas ekstrak yang meliputi parameter kimia dan fisika seperti organoleptik, pola kromatogram (lapis tipis dan dinamolisis), kadar air, dan bobot jenis ekstrak.



PROSEDUR EKSTRAKSI 1. MASERASI Bagian dasar maserator dilapisi dengan kapas sebagai penyaring. Kemudian dimasukkan sebanyak 250 gram serbuk simplisia ke dalam maserator. Tambahkan pelarut etanol 70% atau 95% secukupnya dan biarkan selama kira-kira 10 menit agar terjadi proses pembasahan simplisia, kemudian ditambahkan pelarut etanol sampai seluruh serbuk simplisia terendam. Didiamkan selama 24 jam sambil sesekali diaduk. Ekstrak cair yang diperoleh kemudian. Ekstraksi diulangi sampai ekstrak cair yang diperoleh hampir tidak berwarna. Ukurvolume ekstrak cair yang diperoleh kemudian dipekatkan denganrotavapor pada suhu 30-40 oC sehingga diperoleh ekstrak kental. 2. EKSTRAKSI DENGAN ALAT SOXHLET Tuangkan 250 mL pelarut etanol 95% ke dalam labu alas bulat atau sampai kurang lebih 1/2-2/3 bagian volume labu dan ditambahkan batu didih. Serbuk simplisia sebanyak 50 gram disiapkan dalam kertas saring whatman dan dimasukkan ke dalam tabung Soxhlet. Pasang alat soxhlet sesuai tempatnya dan tambahkan 50 mL pelarut dari bagian atas tabung soxhlet untuk pembasahan simplisia dan nyalakan heating mantle sampai suhu mencapai titik didih pelarut. Ekstraksi simplisia sampai tetesan pelarut hampir tidak berwarna. Kemudian ekstrak yang diperoleh dipekatkan dengan rotavapor sehingga menjadi ekstrak kental. 3. EKSTRAKSI DENGAN CARA REFLUKS Sebanyak 50 gram serbuk simplisia dimasukkan ke dalam labu alas bulat, tambahkan kedalamnya pelarut etanol 95% sebanyak 250 ml. Pasangkan kondensor dengan alat refluks dan nyalakan heating mantle sampai suhu titik didih pelarut. Ekstraksi dilakukan sampai tetesan pelarut hampir tidak berwarna. Kemudian ekstrak yang diperoleh dipekatkan dengan rotavapor sehingga menjadi ekstrak kental. PEMERIKSAAN PARAMETER EKSTRAK: Pemeriksaan parameter ekstrak perlu dilakukan untuk mengetahui kualitas ekstrak dilihat dari sifat fisik dan kandungan kimianya. Parameter yang diperiksa adalah sebagai berikut :



10 | M o d u l P r a k t i k u m F i t o k i m i a



STIKES Harapan Bangsa 1. Organoleptik Ekstrak Pemeriksaan menggunakan panca indera untuk mendiskripsikan bentuk, warna, bau dan rasa dari ekstrak yang diperoleh. 2. Rendemen Ekstrak Rendemen dapat ditetapkan dengan rumus sebagai berikut :



Untuk menetapkan rendemen ekstrak, sejumlah tertentu ekstrak kental dalam cawan penguap ditimbang kemudian diuapkan di atas penangas air dengan temperatur 40-50˚C sampai bobot tetap. Tentukan berat ekstrak setelah penguapan dengan mengurangkan dengan bobot cawan kosong, kemudian hitung rendemen ekstrak (% b/b) sesuai dengan rumus di atas. 3. Bobot Jenis Ekstrak Penetapan bobot jenis ekstrak dapat dilakukan sebagai berikut. Ditimbang piknometer dengan volume tertentu dalam keadaan kosong. Kemudian piknometer diisi penuh dengan air dan ditimbang ulang. Kerapatan air dapat ditetapkan. Kemudian piknometer dikosongkan dan diisi penuh dengan ekstrak, lalu ditimbang. Melalui berat ekstrak yang mempunyai volume tertentu, dapat ditetapkan kerapatan ekstrak. Bobot jenis ekstrak ditetapkan dengan rumus sebagai berikut :



4. Kadar Air Ekstrak Penetapan kadar air ekstrak dapat dilakukan dengan beberapa cara misalnya dengan titrasi langsung atau tidak langsung (pereaksi Karl-Fischer), destilasi atau gravimetri. Pada praktikum ini akan dilakukan penetapan kadar air dengan destilasi menggunakan destilasi toluene. Prosedur : Ke dalam labu bersih dan kering dimasukkan sejumlah ekstrak kental yang telah ditimbang seksama kemudian tambahkan 200 ml toluene, hubungkan alat. Tuangkan toluene ke dalam labu penerima melalui alat pendingin. Panaskan labu hati-hati selama 15 menit. Setelah toluen mendidih, suling dengan kecepatan lebih kurang 2 tetes tiap detik, hingga sebagian air tersuling, kemudian naikkan kecepatan penyulingan hingga 4 tetes tiap detik.



11 | M o d u l P r a k t i k u m F i t o k i m i a



STIKES Harapan Bangsa Setelah semua air tersuling, biarkan tabung penerima mendingin hingga suhu kamar. Setelah air dan toluene memisah sempurna, baca volume air. Hitung kadar air dalam % v/b 5. Pola Kromatogram Lapis Tipis Kromatografi Lapis Tipis (KLT) dilakukan dengan fasa diam silika gel GF 254 dan fasa gerak/pengembang kombinasi pelarut dengan perbandingan yang cocok. Untuk memperoleh perbandingan pengembang yang optimal, dapat diperoleh dari literatur atau datadata penelitian atau mencoba dengan perbandingan pelarut polar, semipolar atau non polar yang umum. Prosedur : Pelat silika gel disiapkan dengan ukuran tertentu kemudian ekstrak cair ditutulkan pada garis awal dengan menggunakan pipa kapiler, biarkan beberapa saat hingga pelarutnya menguap. Pelat silika kemudian dimasukkan ke dalam bejana kromatografi yang sebelumnya telah dijenuhkan dengan cairan pengembang. Proses kromatografi dihentikan sampai cairan pengembang sampai ke garis depan. Amati pola kromatogram dibawah lampu UV 254 dan 366 nm dan hitung Rf setiap bercak yang teramati. Penampak bercak dapat juga menggunakan asam sulfat 10% dalam metanol. 6. Pola Dinamolisis Dinamolisis dapat dilakukan dengan cara sebagai berikut. Kertas saring Whatman diameter 10 cm, titik pusatnya dilubangi, kemudian dipasang sumbu yang terbuat dari kertas saring. Kertas saring bersumbu ini kemudian ditutupkan pada cawan petri yang berisi maserat/ekstrak cair. Biarkan terjadi proses difusi sirkular selama kurang lebih 10 menit. Pola dinamolisis diamati. ALAT 1. Meserator 2. Rotavapor 3. Labu Ukur 4. Cawan Penguap 5. Cawan 6. Kertas Saring Whatman



12 | M o d u l P r a k t i k u m F i t o k i m i a



STIKES Harapan Bangsa BAHAN 1. Simplisia Daun Jambu Biji 2. Etanol 96%



PROSEDUR Sebanyak 100 gram serbuk keringn dimasukkan ke dalam maserator, ditambahkan etanol 96% sebanyak 7.5 kali bobot serbuk dan diaduk. Biarkan termaserasi selama 5 hari dalam maserator tertutup. Setelah itu saring maserat dari ampas dengan corong Buchner. Maserat diendapkan selama 2 hari. Setelah itu pisahkan maserat dari endapan dengan hatihati. Uapkan maserat dengan cawan porselen diatas penangas air sehingga diperoleh ekstrak kental. Ekstrak kental yang diperoleh diendapkan kembali dengan menambahkan etanol berlebih. Dan didiamkan selama 2 hari.



HASIL PERCOBAAN : 1. Organoleptik Ekstrak Bentuk



: ....................



Warna



: ....................



Bau



: ....................



2. Rendemen Ekstrak Volume ekstrak kental



: ................. mL



Berat cawan kosong



: ................. g



Berat cawan + ekstrak



: ................. g



Berat cawan+ekstrak setelah penguapan : ................. g Berat simplisia awal



: ................. g



Rendemen ekstrak



: ................. % b/b



13 | M o d u l P r a k t i k u m F i t o k i m i a



STIKES Harapan Bangsa KEIMPULAN ...................................................................................................................................................... ...................................................................................................................................................... ...................................................................................................................................................... ...................................................................................................................................................... ...................................................................................................................................................... ......................................................................................................................................................



Paraf Asisten Praktikum



Paraf Praktikan



(Hari/Tanggal)



(Hari/ Tanggal)



DAFTAR PUSTAKA 1. Harborne, J.B. 1973. Phytochemical Methods , A Guide to Modern Techniques of Plant Analysis. Chapmann and Hall. London, 1-32. 2. Depkes RI. 2000. Parameter Standar Umum Ekstrak Tumbuhan Obat. Dirjen POM. Direktorat Pengawasan Obat Tradisional. 9-17. 3. Depkes RI. 1980. Materia Medika Indonesia, jilid IV. 154-157



14 | M o d u l P r a k t i k u m F i t o k i m i a



STIKES Harapan Bangsa PRAKTIKUM KETIGA PENAPISAN FITOKIMIA SIMPLISIA TUMBUHAN OBAT



TUJUAN PRAKTIKUM Melakukan pengujian penapisan fitokimia terhadap beberapa simplisia tumbuhan obat sehingga diketahui golongan metabolit sekunder yang terkandung dalam simplisia tersebut. Setelah melakukan praktikum ini, mahasiswa mampu menganalisis kandungan metabolit sekunder suatu simplisia tumbuhan obat atas dasar hasil pengujian penapisan fitokimia. TEORI DASAR Tumbuhan obat adalah tumbuhan atau bagian-bagiannya yang digunakan baik untuk pencegahan ataupun pengobatan penyakit- penyakit tertentu, atas dasar pengggunaan secara empirik ataupun pengujian ilmiah. Pengujian khasiat suatu tanaman obat dilakukan melalui uji pra klinik hingga uji klinik. Pengembangan obat tradisional di Indonesia semakin menunjukkan kemajuan yang mengarah kepada upaya memasuki jalur pelayanan kesehatan formal. Obat tradisional yang akan memasuki jalur pelayanan kesehatan formal dituntut mempunyai kualitas yang memenuhi standar yang telah ditetapkan. Evaluasi kualitas ini diperlukan untuk mendapatkan obat tradisional yang memenuhi persyaratan, memiliki khasiat, dan aman digunakan. Khasiat atau aktivitas farmakologi yang menjadi tumpuan bagi penggunaan suatu tumbuhan sebagai tumbuhan obat ditentukan oleh kandungan senyawa metabolit sekunder dalam tumbuhan atau bagian tumbuhan tersebut. Kandungan senyawa metabolit sekunder yang mempunyai arti penting dalam kaitan dengan khasiat atau aktivitasfarmakologi tumbuhan obat adalah senyawa metabolit sekunder kelompok alkaloid, tanin dan polifenolat, mono dan sesquiterpen, senyawa kuinon, glikosida jantung, flavonoid, triterpenoid dan steroid, serta saponin. Uji fitokimia terhadap kandungan senyawa kimia metabolit sekunder merupakan langkah awal yang penting dalam penelitian mengenai tumbuhan obat atau dalam hal penelusuran senyawa aktif baru yang berasal dari bahan alam yang dapat menjadi prekursor bagi sintesis obat- obat baru atau menjadi prototype senyawa obat dengan aktivitas tertentu. Oleh karenanya, metode uji fitokimia harus merupakan uji sederhana tetapi terandalkan. Metode uji fitokimia yang banyak digunakan adalah metode reaksi warna dan pengendapan yang dapat dilakukan di lapangan atau di laboratorium. Metode evaluasi fitokimia meliputi penapisan fitokimia dan pencarian senyawa identitas melalui analisis kromatografi. I.



Alkaloid



15 | M o d u l P r a k t i k u m F i t o k i m i a



STIKES Harapan Bangsa Alkaloid adalah senyawa metabolit sekunder yang dalam struktur molekulnya terdapat atom Nitrogen (umumnya heterosiklik). Adanya pasangan elektron bebas pada atom Nitrogen ini menyebabkan alkaloid dapat membentuk kompleks yang tidak larut dengan logam-logam berat. Fenomena ini merupakan dasar bagi reaksi pengenalan adanya alkaloid dalam simplisia tumbuhan obat. Alkaloid adalah kelompok atau golongan senyawa kimia metabolit sekunder asal tumbuhan atau hewan dengan struktur yang mempunyai atom Nitrogen (umumnya terikat dalam lingkar heterosiklik), bersifat basa, serta mempunyai aktivitas fisiologis tertentu.Berdasarkan biosintesisnya, alkaloid terbagi atas: 1. True alkaloid (alkaloid sesungguhnya), biosintesisnya berasal dari asam amino, bersifat basa, umumnya mempunyai atom Nitrogen dalam lingkar heterosiklik 2. Proto alkaloid, merupakan amina yang bersifat sederhana dengan atom Nitrogen yang tidak terdapat dalam lingkar heterosiklik. Contoh meskalin dan efedrin. 3. Pseudo alkaloid, biosintesisnya tidak berasal dari asam amino. Contohnya basa purin (antara lain kafein) Umumnya alkaloid bersifat basa karena adanya pasangan elektron bebas pada atom Nitrogennya (Teori Asam-Basa Lewis). Dalam tumbuhan biasanya alkaloid terdapat dalam bentuk garam (tartrat, laktat, sitrat). Sifat kimia alkaloid ini merupakan dasar bagi cara isolasi maupun pengenalannya. Pengenalan alkaloid didasarkan pada kemampuannya membentuk senyawa kompleks tidak larut dengan pereaksi-pereaksi yang mengandung logam berat, misalnya pereaksi Mayer (mengandung kalium ioda dan raksa (II) klorida), pereaksi Dragendorff (mengandung Bismuth subnitrat dan raksa (II) klorida). Alkaloid dengan pereaksi Mayer akan memberikan endapan putih, sedangkan pereaksi Dragendorff akan memberikan endapan jingga coklat. Walaupun reaksi pengenalan alkaloid dengan kedua pereaksi tersebut merupakan reaksi pengenalan umum tetapi beberapa senyawa non alkaloid dapat mengendap dengan pereaksi- pereaksi tersebut di atas, misalnya protein, kumarin, α-piron, hidroksi flavon serta tannin. Reaksi pengenalan palsu tersebut terkenal dengan sebutan reaksi positif palsu (false positive). Perlu menjadi perhatian, selain adanya reaksi positif palsu, dengan metode ini senyawa alkaloid kuarterner dalam simplisia tidak dapat diubah menjadi alkaloid bentuk basa dan akan tetap tinggal dalam sel, sehingga tidak dapat dikenali dengan metode pengendapan oleh reaksi-reaksi tersebut di atas. Keadaan seperti itu disebut sebagaireaksi negatif palsu (false negative). Metode : Simplisia dibasakan dengan ammonia encer, digerus dalam mortir, kemudian ditambahkan beberapa milliliter kloroform sambil terus digerus. Setelah disaring, filtrat dikocok dengan asam klorida 2 N. Lapisan asam dipisahkan kemudian dibagi menjadi tiga bagian dan diperlakukan sebagai berikut : 1. Bagian pertama digunakan sebagai blangko 16 | M o d u l P r a k t i k u m F i t o k i m i a



STIKES Harapan Bangsa 2. Bagian kedua ditetesi dengan larutan pereaksi Mayer, kemudian diamati ada atau tidaknya endapan berwarna putih 3. Bagian ketiga ditetesi dengan larutan pereaksi Dragendorff, kemudian diamati ada atau tidaknya endapan jingga coklat II.



Flavonoid Flavonoid adalah senyawa metabolit sekunder yang memberikan berbagai warna pada tumbuhan. Flavonoid mempunyai struktur yang sangat bervariasi, namun pada umumnya mempunyai struktur dasar:



Gambar. Struktur dasar Flavonoid Pengenalan flavonoid didasarkan pada reaksi reduksi gugusan karbonil pada lingkar dlakton menjadi gugusan alkohol membentuk senyawa hidroksi yang berwarna-warna tergantung pada gugusan fungsional yang terikat pada lingkar A atau B. warna yang terjadi dapat ditarik oleh amil alkohol. Metode:Senyawa dipanaskan dengan campuran logam Magnesium dan asam klorida 5N, kemudian disaring. Adanya flavonoid akan menyebabkan filtrat berwarna merah yang dapat ditarik oleh amilalkohol. Untuk lebih memudahkan pengamatan sebaiknya digunakan percobaan blangko. III.



Tanin dan Polifenol Tanin dan senyawa polifenolat alam mudah dikenali melalui pengenalan gugusan fenol yang dapat memberikan warna biru-hitam dengan pereaksi besi (III) klorida. Untuk membedakan tanin dengan polifenolat alam, digunakan sifat tanin yang dapat mengendapkan larutan gelatin 1%. Metode:Simplisia digerus dan dipanaskan dengan air di atas tangas air, kemudian disaring panas-panas. Sebagian kecil filtrat ditetesi larutan besi (III) klorida. Terbentuknya warna biru-hitam menunjukkan adanya tanin dan polifenol alam. Sebagian kecil filtrat diuji ulang dengan penambahan larutan gelatin 1%. Adanya endapan putih menunjukkan bahwa dalam simplisia terdapat tanin.



17 | M o d u l P r a k t i k u m F i t o k i m i a



STIKES Harapan Bangsa IV.



Saponin Saponin adalah senyawa metabolit sekunder dalam tumbuhan yang bersifat dapat membentuk busa, serta dapat menghemolisis sel darah merah. Struktur kimia umumnya merupakan glikosida, yang bila dihidrolisis akan menghasilkan bagian glikon (senyawa gula) dan aglikon (senyawa non gula). Struktur aglikon tannin umumnya merupakan struktur triterpenoid dan struktur steroid, hingga ditinjau dari strukturnya saponin dapat dipilah menjadi saponin-triterpenoid dan saponin-steroid. Reaksi pengenalan saponin didasarkan pada sifatnya yang mampu memberikan busa pada pengocokan dan persisten pada penambahan sedikit asam atau pada pendiaman. Metode:Di atas tangas air, dalam tabung reaksi, simplisia dicampur dengan air dan dipanaskan beberapa saat, kemudian disaring. Setelah dingin filtrat dalam tabung reaksi dikocok kuat-kuat selamalebih kurang 30 detik. Pembentukan busa sekurang-kurangnya setinggi 1 cm dan persisten selama beberapa menit serta tidak hilang setelah penambahan 1 tetes asam klorida encer menunjukkan bahwa dalam simplisia terdapat saponin.



V.



Monoterpenoid dan Sesquiterpenoid Monoterpenoid dan sesquiterpenoid adalah senyawa-senyawa C10-C15 yang tersusun dari unit isoprene (C5H8). Senyawa monoterpenoid dan sesquiterpenoid ini merupakan komponen- komponen penyusun minyak atsiri. Reaksi pengenalan didasarkan pada kemampuannya membentuk warna-warna dengan pereaksi anisaldehid-asam sulfat atau pereaksi vanillin-sulfat. Metode:Simplisia disari dengan eter, kemudian sari eter diuapkan hingga kering. Pada residu diteteskan pereaksi anisaldehid-asam sulfat atau pereaksi vanillin-sulfat dari pinggir cawan. Terbentuknya warna- warna menunjukkan adanya senyawa monoterpenoid dan sesquiterpenoid.



VI.



Steroid dan Triterpenoid Senyawa kelompok steroid dan triterpenoid adalah senyawa- senyawa kelompok metabolit sekunder yang mempunyai struktur dasar yang hampir sama.



Gambar. (a) Steroid, (b) Triterpenoid



18 | M o d u l P r a k t i k u m F i t o k i m i a



STIKES Harapan Bangsa Pengenalan senyawa triterpenoid dan steroid didasarkan kemampuannya membentuk warna dengan pereaksi Liebermann- Burchard.Pereaksi Liebermann-Burchard dibuat dengan cara mencampurkan 20 bagian asam asetat anhidrat dengan 1 bagian asam sulfat pekat. Pereaksi ini harus digunakan dalam media bebas air. Metode:Simplisia disari dengan eter, kemudian sari eter diuapkan hingga kering. Pada residu diteteskan pereaksi Liebermann-Burchard. Terbentuknya warna ungu menunjukkan bahwa dalam simplisia mengandung senyawa kelompok triterpenoid, sedangkan bila terbentuk warna biru-hijau menunjukkan adanya senyawa kelompok steroid. VII.



Senyawa Kuinon Senyawa kuinon umumnya merupakan turunan p-benzokuinon.



Gambar. p-benzokuinon Pengenalan senyawa ini didasarkan pada kemampuannya membentuk garam berwarna antara hidrokuinon dengan larutan alkali kuat (NaOH atau KOH).



Gambar. Reaksi hidrokuinon dengan larutan alkali kuat Metode: Sebanyak 500 gram serbuk kering dimasukkan ke dalam erlenmeyer yang dilengkapi magnetic strirer. Tambahkan etanol atau metanol 80% sebanyak 4.5 x bobot serbuk. Panaskan selama 2 jam pada suhu 50 – 60 derajat Celcius di atas hot plate. Setelah itu filtrat dipisahkan dari ampas dengan penyaringan. Filtrat yang diperoleh kemudian dipekatkan dengan rotary evaporator atau dipanaskan diatas penangas air sehingga diperoleh ekstrak kental yang siap digunakan untik penapisan fitokimia. 19 | M o d u l P r a k t i k u m F i t o k i m i a



STIKES Harapan Bangsa



ALAT : 1. Mortir 2. Erlemeyer 250 mL 3. Pipet Tetes 4. Tabung Reaksi 5. Penangas air 6. Erlemeyer 50 mL 7. Corong Buchner 8. Kapas BAHAN : 1. Amonia 10% 2. Kloroform 3. HCL 2 N 4. Pereaksi Mayer 5. Pereaksi Dragendorff 6. Pereaksi FeCl3 1% 7. Larutan Gelatin 1% 8. Serbuk Mg 9. HCl 2N 10. Amil Alkohol 11. Larutan Vanilin 10% 12. H2SO4 13. Pereaksi Libermann Burchard 14. Larutan KOH 5% 15. Asam Klorida 16. Etanol atau Metanol 80%



20 | M o d u l P r a k t i k u m F i t o k i m i a



STIKES Harapan Bangsa



PROSEDUR KERJA No



Golongan Senyawa



1



Alkoloid



Prosedur



Hasil (+/-)



1. 1 gram serbuk simplisia dibasakan dengan 10 mL amonia 10%, digerus menggunakan mortir. 2. Tambahkan 5 mL kloroform, gerus kuat. 3. Lapisan kloroform dipipet sambil disaring menggunakan pipet yang disumbat dengan kapas, masukkan ke dalam tabung reaksi. 4. Tambahkan kedalamnya HCl 2N (1:10 v/v). Kocok kuat hingga terbentuk 2 lapisan. 5. Lapisan asam dipipet,kemudian menjadi 3 bagian :



dibagi



a. Filtrat 1 : ditambahkan pereaksi Mayer, terjadinyakekeruhan atau endapan putih menunjukkan adanya alkaloid. b. Filtrat 2 : ditambahkan pereaksi Dragendorff, terjadinya endapan jingga coklat menunjukkan adanya alkaloid. c. Filtrat 3 :digunakan sebagai blanko. 2



Polifenolat



1. 50 mg serbuk simplisia dalam tabung reaksi dididihkan dalam 50 mL air selama 15 menit,kemudian didinginkan dan disaring (Filtrat A). 2. Kedalam filtrat ditambahkan larutan pereaksi FeCl3 1%. Terbentuknya warna biru hitam menunjukkan adanya senyawa polifenola



3



Tanin



3. Kedalam Filtrat ditambahkan larutan gelatin 1%, terbentuknya endapan putih menunjukkan adanya tanin.



21 | M o d u l P r a k t i k u m F i t o k i m i a



Paraf Asisten



STIKES Harapan Bangsa 4



Flavonoid



1. 1 gram serbuk simplisia ditambahkan 50 mL air panas, dididihkan selama 5 menit, lalu disaring. 2. Filtrat yang dihasilkan ditambahkan sedikit serbuk Mg dan 5 mL HCl 2N. 3. Kemudian tambahkan amill alkohol, lalu dikocok kuat kuat dan dibiarkan hingga memisah. Terbentuknya warna kuning hingga merah yang dapat ditarik dengan amil alcohol menunjukkan adanya flavonoid.



5



Steroid Triterpenoid



dan



1. 1 gram simplisia digerus dengan 5 mL eter, kemudian dipipet sambil disaring menggunakan pipet yang disumbat dengan kapas (Filtrat B). 2. Filtrat ditempatkan dalam cawan penguap, kemudian dibiarkan menguap hingga kering. 3. Ke dalam residu diteteskan larutan vanilin 10% dalam H2SO4 pekat melalui pinggir cawan, terbentuknya warna warna menunjukkan adanya mono dan sesquiterpenoid



6



Monoterpenoid dan Sesquiterpenoid



4. Filtrat B ditempatkan dalam cawan penguap, kemudian dibiarkan menguap hingga kering. 5. Ke dalam residu diteteskan 2 hingga 3 tetes pereaksi Liebermann Burchard. Terbentuknya warna ungu menunjukkan adanya golongan triterpenoid, sedangkan terbentuknya warna biru hijau menunjukkan adanya golongan steroid.



8



Saponin



6. Sejumlah 10 ml Filtrat A,dikocok vertikal dalam tabungreaksi selama 10 detik. 7. Terbentuknya busa penambahanasam



22 | M o d u l P r a k t i k u m F i t o k i m i a



yangpersisten klorida



pada atau



STIKES Harapan Bangsa padapendiaman selama 10 menit, menunjukkan adanya golongan saponin. KESIMPULAN Dalam simplisia yang diperiksa, diperkirakan terdapat senyawa metabolit sekunder golongan: 1. ................................................................................ 2. ................................................................................ 3. ................................................................................ 4. ................................................................................ 5. ................................................................................ 6. ................................................................................ Paraf Asisten Praktikum



Paraf Praktikan



(Hari/Tanggal)



(Hari/ Tanggal)



DAFTAR PUSTAKA 1. Farnsworth, N.R. 1966. Biological and Phytochemical Screening ofPlants.J. Pharm. Sci. 55(3): 243-26. 2. Harborne, J.B. 1984. Metode Fitokimia. Terjemahan K. Padmawinata dan I. Sudiro.: Penerbit ITB. Bandung 3. Marini, C.P. 1981. Plant Screening By Chemical And Chromatography. Prosedure in the Field Condition. J. Chromatogr. 213:117-122



23 | M o d u l P r a k t i k u m F i t o k i m i a



STIKES Harapan Bangsa PRAKTIKUM KEEMPAT ANALISA KUANTITATIF MENGGUNAKAN KROMATOGRAFI LAPIS TIPIS ATAU SPEKTROFOTOMETRI UV VIS



TUJUAN PRAKTIKUM Mahasiswa dapat melakukan penentuan parameter analisa kuantitatif menggunakan kromatografi lapis tipis atau Spektrofotometri UV Vis ALAT : 1. Set peralatan Kromatografi Lapis Tipis, terdiri dari plat lempeng fase diam, eluen fase gerak, chamber, pipa kapiler dan lain-lain. 2. Set peralatan Spektrofotometri UV Vis, terdiri dari kuvet, alat spektrometri dan fotometri. BAHAN : 1. Ekstrak blangko dan uji alkaloid PROSEDUR KERJA 1. Buat baku standart dari larutan blanko yang mengandung 0.2 ; 0.4 ; 0.6 ; 0.8 ; 1.0 mg/ml dengan menyediakan 6 labu erlenmeyer 2. Encerkan dengan aquadest sampai tanda batas 3. Masukkan larutan secara bergantian ke dalam kuvet. Dimulai dari blangko lalu larutan 0.2 ppm dan seterusnya. 4. Masukkan ke dalam spektrofotometri untuk di analisa 5. Bandingkan hasil pengukuran. KEIMPULAN ...................................................................................................................................................... ...................................................................................................................................................... ...................................................................................................................................................... ...................................................................................................................................................... ...................................................................................................................................................... ......................................................................................................................................................



Paraf Asisten Praktikum



Paraf Praktikan



(Hari/Tanggal)



(Hari/ Tanggal)



24 | M o d u l P r a k t i k u m F i t o k i m i a



STIKES Harapan Bangsa DAFTAR PUSTAKA 1. Departemen Kesehatan Republik Indonesia. 2000. Parameter Standar Umum Ekstrak Tumbuhan Obat, Edisi I. Direktorat Jendral Pengawasan Obat dan Makanan. Direktorat Pengawasan Obat Tradinasional. Jakarta 2. Departemen Kesehatan Republik Indonesia. 1980. Materia Medika Indonesia , Jilid IV. -



25 | M o d u l P r a k t i k u m F i t o k i m i a