Pembuatan Media [PDF]

Citation preview

1. Pembuatan Media Kultur RPMI dan D-MEM Media kultur RPMI dibuat dengan melarutkan 10,4 g RPMI 1640 Powder (Sigma) dimasukkan ke dalam 800 ml aquades steril, kemudian ditambah 2 g NaHCO3 (Merck). Campuran ditambah dengan aquades steril hingga volumenya 1 liter lalu dihomogenkan. Untuk menjaga keseimbangan larutan agar tetap netral (pH 7,2-7,4) dilakukan dengan menambahan 1 M NaOH atau 1 M HCl. Selanjutnya campuran disterilisasi dengan cara menyaring menggunakan filter Whatman 0,2 µm. Pada campuran ditambahkan Fetal Bovine Serum (Gibco) 10 %, penstrep 2 % (Gibco) dan fungizon 1 % (Gibco). Proses pembuatan medium D-MEM sama seperti membuat medium RPMI, tetapi D-MEM yang digunakan untuk membuat 1 liter media sejumlah 13.88 gram



I.1.3 PBS Komponen PBS merupakan larutan garam seimbang yang terdiri dari 1.5 mM KH 2PO4.H2O, 8.1 mM Na2 HPO4.7 H2O, 140 mM NaCl, 2.7 mM KCl. Fungsi Larutan PBS PBS merupakan sebuah larutan penyangga yang biasa digunakan dalam penelitian biologi. Buffer membantu untuk mempertahankan konstan pH. Osmolaritas dan konsentrasi ion solusi yang sesuai dengan tubuh manusia (isotonik) (Anonim 2, 2009). PBS sering digunakan dalam percobaan biologi sel untuk mempertahankan osmolaritas sel. Garam mengandung ion, yang menyeimbangkan jumlah ion garam di dalam sel. Jika sel yang tenggelam ke dalam solusi yang memiliki terlalu banyak garam ion, air akan bocor keluar dari sel, menyebabkan sel menyusut. Sebaliknya, jika sel terbenam ke dalam solusi yang memiliki ion terlalu sedikit garam, air akan masuk ke dalam sel, menyebabkan sel pecah. Oleh karena itu, sangat penting saat melakukan percobaan biologi sel untuk menjaga sel-sel di osmolaritas tertentu. PBS adalah pada osmolaritas yang benar untuk menjaga sel-sel dalam negara isotonik. PBS sering digunakan sebagai larutan penyangga dalam berbagai eksperimen untuk mempertahankan pH protein. Protein memerlukan kisaran pH tertentu untuk menjaga netralitas pada asam amino tertentu, untuk mempertahankan struktur protein. Jika tidak, struktur protein akan terdenaturasi (Anonim 2, 2009). Cara Sterilisasi PBS PBS yang mengandung glukosa tidak dapat disterilkan dengan cara bersamaan karena glukosa dapat menjadi caramel pada waktu diautoklaf. Larutan glukosa disterilisasi secara terpisah yang akan ditambahkan pada PBS steril setelah disterilisasi. Apabila glukosa sudah dicampurkan sebelum sterilisasi, maka sterilisasi harus dilakukan dengan cara filtrasi



membran. PBS yang digunakan dalam kultur sel ini tidak mengandung gula atau bikarbonat, sehingga dapat disterilisasi dengan cara autoklaf. Cara yang dilakukan adalah dengan menempatkan larutan PBS ke dalam botol tahan panas, ditutup dan disegel, kemudian diautoklaf selama 20 menit dengan suhu 121°C dengan tekanan 100 kpa (Freshney, 2005). Storage dan Stability PBS dapat disimpan pada suhu kamar, tetapi dapat menjamin pendinginan untuk mencegah pertumbuhan bakteri jika solusi yang tidak steril dan disimpan untuk jangka waktu yang lama. Disimpan pada suhu ruang (15-30°C). Namun apabila penyimapanan menggunakan suhu 4°C, PBS yang digunakan menjadi lebih tahan lama (Freshney, 2005). Kondisi penyimpanan yang baik dan benar akan mempengaruhi kestabilan larutan PBS tersebut. I.1.4 Medium Kultur Medium kultur yang digunakan untuk kultur jaringan beragam. Terdapat medium kultur yang mengandung seluruh komponen secara lengkap dalam bentuk bubuk dan siap pakai. Macam medium diberi nama sesuai dengan pembuat medium dan larutan garam seimbang yang digunakan. Medium merupakan campuran nutrisi, serum, antibiotik, hormon, dan faktor tumbuh yang digunakan dalam kultur sel secara in vitro. Medium kultur sel sangat beragam dengan fungsi spesifik masing-masing. Beberapa contoh medium di antaranya Minimal Essential Medium (MEM), Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM), Hams Nutrient Mitures F10 dan F12, Molecular Cellular Developmental Biology (MCDB), F12 CDME, dan Leibovitz L-15 (Marther dan Robert, 1998). Beberapa medium yang digunakan dalam kultur sel di antaranya, yaitu medium yang bekerja sangat kuat (1x konsentrasi), dengan atau tanpa glutamin, medium yang memiliki konsentrasi 10x, biasanya tanpa NaHCO3 dan glutamin yang tersedia dalam konsentrasi terpisah, dan medium berupa serbuk tanpa atau dengan NaHCO 3 dan glutamin, merupakan medium yang paling murah (Freshney, 2005). Medium berperan sebagai mediator pertumbuhan bagi sel yang dikultur dan pemberian nutrisi bagi sel yang akan dikultur. Salah satu faktor yang penting dalam teknik kultur jaringan adalah medium. Teknik kultur jaringan akan berhasil bila pemilihan medium yang digunakan tepat karena dalam medium terdapat kebutuhan dari sel yang dikulturkan. Medium yang digunakan didasarkan pada sel yang akan digunakan dalam kultur sel tersebut (Wetter and Constabel,1991). Salah satu medium kultur yang biasa digunakan adalah DMEM. DMEM merupakan modifikasi dari Basal Medium Eagle (BME) yang berisi empat kali lipat lebih tinggi konsentrasi asam amino dan vitamin, serta tambahan komponen tambahan. DMEM asli formula berisi 1000 mg / L glukosa dan pertama kali dilaporkan untuk kultur sel embrio tikus (Anonim 3, 2009). DMEM yang digunakan dalam kultur sel kali ini adalah DMEM F-12, yang merupakan medium dengan nutrisi terkaya dibandingkan dengan medium lain yang ada.



I.1.5 Fungsi Larutan dalam Medium –



NaHCO3



Merupakan senyawa komponen medium yang berperan dalam menjaga pH dan osmolalitas kultur sel (Marther dan Robert, 1998). Konsentrasi bikarbonat sangat penting dalam mempertahankan keseimbangan dengan CO2 atmosfer. Beberapa medium mengandung konsentrasi bikarbonat yang tinggi dan meningkatkan CO2 di atmosfer, sedangkan medium lain memiliki konsentrasi bikarbonat yang rendah untuk digunakan dengan fase gas udara. Jika medium yang digunakan dirubah, maka akan mengubah konsentrasi bikarbonatnya, sehingga penting untuk memastikan bahwa osmolalitas medium tetap berada dalam kisaran yang ditentukan (Freshney, 2005). –



Penicillin dan Streptomycin dalam Medium Kultur



Fungsi penicillin dan streptomycin dalam medium kultur adalah untuk membantu mencegah kontaminasi yang berupa bakteri. Penicillin menghambat pertumbuhan bakteri dengan menghambat sintesis peptidoglikan. Streptomisin memiliki antibiotik aminoglikosida dan menghambat pertumbuhan bakteri dengan menghambat sintesis protein. –



FBS



Dalam mengkultur sel, diperlukan medium kultur yang biasanya dikombinasikan dengan Fetal Bovine Serum (FBS), yaitu suatu serum (darah tanpa sel dan faktor penggumpal/pembeku). FBS berisi berbagai substansi yang dibutuhkan sel yang dikultur untuk tumbuh dan hidup dengan baik. FBS merupakan serum yang digunakan secara luas dalam kultur sel, jaringan, ataupun organ secara invitro, karena dapat digunakan hampir di semua jenis sel serta karena mengandung banyak faktor pendukung pertumbuhan dan metabolisme embrionik (Jochems, 2009). I.1.6 Cara Sterilisasi Filtrasi Ukuran pori membran yang biasa digunakan adalah 0,22 µm. Ukuran pori tersebut digunakan karena baik digunakan untuk menghilangkan bakteri terkecil dari larutan. Untuk menghilangkan virus sebaiknya digunakan membran dengan ukuran pori 20 nm (Freshney, 2005). I.1.8 Storage dan Stability Medium yang baru saja disterilisasi melalui filtrasi membran diinkubasi pada suhu 37°C selama 1 minggu untuk mengetahui apakah terjadi kontaminasi. Kemudian medium disimpan pada suhu 4°C dan dijaga agar pH tidak berubah. Serum yang belum digunakan harus disimpan pada suhu rendah (dibekukan) secepat mungkin setelah dibuat. Serum sebaiknya digunakan dalam jangka waktu 6-12 bulan dari persiapan jika disimpan pada suhu -20°C, tetapi penyimpanan dapat lebih lama jika disimpan pada suhu -70°C (Freshney, 2005).



Reference Abcam. 2007. T47D (Human ductal breast epithelial tumor cell line) Whole Cell Lysate (ab14899) datasheet. Diakses dari : http://www. abcam.com/index.html?datasheet=14899 Diakses tanggal 3 Desember 2009. Anwar, Yassier. 2008. Isolasi dan Karakterisasi Fragmen cDNA dari Gen Penyandi Metallothionein dari Kedelai Kultivar Slamet. Skripsi IPB : Bogor. A.Toha, 2001. Isolasi RNA. Diakses dari : http://exploratorium.org/tahap_isolasi_DNA/htm. 16 November 2009. Adnan, 2009. Mitokondria. Diakses dari http://www.scribd.com/doc/20536961/MITOKONDRIA-REVISI-pdf-Adnan-UNM



:



Dinas Kesehatan. 2009. Vinblastin. Diakses dari : http://www.diskes.jabarprov.go.id/index.php? mod=pubInformasiObat&idMenuKiri=45&idSelected=1&idObat=203&page=9 Diakses tanggal : 01 Desember 2009 Breslaur, K.J., Frank R., Blocker H., and Marky L.A. 1986. Predicting DNA duplex stability from the base sequence. Proc Natl Acad Sci, 83:3746-3750. Freshney, Ian. 2005. Culture of Animal Cells: A Manual of Basics Technique, Fifth edition. New York: John Willey & Sons Inc. Gupta, Mohit., dan Verma, Mohit. 2009. Sterilization and Disinfection. Diakses dari: http://www.scribd.com/doc/7658723/Sterilization-and-Disinfection. Diakses tanggal: 26 November 2009. Jochems, Carlo. 2009. Fetal Bovine Serum: Are Cell Cultures Cruelty Free?. Diakses dari: http://www.all-creatures.org/clct/ar-fetal.html. Diakses tanggal: 29 November 2009. Jolla, La. 2009. Autoclave Overview. Diakses dari: http://blink2.ucsd.edu/safety/researchlab/biosafety/autoclave/indeks.html. Diakses tanggal: 29 November 2009 Indra. 2008. Sterilisasi. Diakses dari : http//www.ekmon-saurus/bab-3-Sterilisasi/.htm. Diakses pada tanggal 08 maret 2009. Ikuri lab, 2002. Cadherin. Diakses http://calcium.uhnres.utoronto.ca/cadherin/pub_pages/general/intro_cadherins.htm tanggal : 03 Desember 2009



dari Diakses



Karp, Gerald. 2005.Cell and Molecular Biology Concept and Connection edisi 4. United State : John Wiley & Sons, Inc. Lacoma, Tyler. 2009. How Does Sonication Work?. Diakses dari: http://www.ehow.com/howdoes_5171302_sonication-work.html. Diakses tanggal: 29 November 2009. Lichstein H. C., Soule M. H. Studies of the Effect of Sodium Azide on Microbic Growth and Respiration: I. The Action of Sodium Azide on Microbic Growth. Journal of Bacteriology diakses dari : http://servente.area.ge.cnr.it/sds/DbToC/include/file_fr.php?id=2565671&wh=nm Diakses tanggal 2 Desember 2009 Marther, Jennie P., dan Roberts, E. Penelope. 1998. Intoruction to Cell and Tissue Culture: Theory and Technique. New York: Plenum Press. Mustahib, AR. 2007. Mitokondria. Diakses dari : http://biologi.blogsome.com/2007/06/17/mitokondria/ Diakses tanggal : 01 Desember 2009 Ouellet, S., François V., Maryse L., Steeve L., Régen D., Sylvain L.G. 2006. Transcriptional regulation of the cyclin-dependent kinase inhibitor 1A (p21) gene by NFI in proliferating human cells. Université de Sherbrooke Sherbrooke, Québec, Canada Reya, Tannishtha, Morrison, Sean J., Clarke, F., Weissman, Irving L. 2001. Stem Cells, Cancer, and Cancer Stem cells. Nature No. 414. Hal 105-111. Anonim 1, 2009. Alat-alat Laboratorium Mikrobiologi. http://rofix.wordpress.com. Diakses tanggal 01 Desember 2009.



Diakses



dari



:



Anonim 2, 2009. PBS. Diakses dari : http://www.biologicalworld.com. Diakses tanggal 01 Desember 2009. Anonim 3, 2009. Diakses dari : www.sigmaaldrich.com. Diakses tanggal 01 Desember 2009. Anonim 4, 2009. Diakses dari :Cell Culture .http://en.wikipedia.org/wiki. Diakses tanggal 01 Desember 2009. Anonim 5. 2006. Bioprocessing Channel. Genetic Engineering & Biotechnology News vol.26. no. 2. Diakses dari : http://www.genengnews.com/articles/chtitem.aspx? tid=1244&chid=3. Diakses tanggal 01 Desember 2009 Anonim 6, 2006. Diakses dari : http://molgen.uc.edu/node/109. Diakses tanggal 01 Desember 2009.



Anonim 7. 2009. P21 [online]. Diakses dari http://en.wikipedia.org/wiki/P21 Tanggal akses 30 November 2009 Anonim 8. 2009. Design PCR Primers [online]. Diakses dari http://molbiol-tool.ca/PCR.htm Tanggal akses 30 November 2009. Anonim 9. 2008. Primer Design [online]. Diakses dari http://bioweb.uwlax.edu/GenWeb/Molecular/seq_anal/primer_design/primer_design.htm Tanggal akses 30 November 2009. Anonim 10. 2009. PCR Primer Design Guidelines [online]. Diakses dari http://www.premierbiosoft.com tech_notes PCR_Primer_Design.html Tanggal akses 30 November 2009 Anonim 11, 2008. Mitokondria. Diakses dari : http://ilmupedia.com/akademik/23/610mitokondria.html Diakses tanggal : 01 Desember 2009 Anonim 12, 2009. Mitokondris. Diakses dari : http://biologi.blogsome.com/2007/06/17/mitokondria/ Diakses tanggal : 01 Desember 2009 Anonim 13, 2009. Biologi Sel. Diakses dari : http://ini-ano.blogspot.com/2009/04/sel.html Diakses tanggal : 01 Desember 2009 Anonim 14 2009. Siklus Krebs. Diakses dari : http://blacktuke.blogspot.com/2009/06/sikluskrebs-dan-transpor-elektron.html Diakses tanggal : 01 Desember 2009 Anonim 15, 2009. Mitochondria. Diakses dari : http://www.ruf.rice.edu/~bioslabs/studies/mitochondria/oxphos.html Diakses tanggal : 01 Desember 2009 Anonim 16, 2009. DCIP. Diakses dari : http://en.wikipedia.org/wiki/Dichlorophenolindophenol Diakses tanggal : 01 Desember 2009 -Bukan untuk di COPY, hanya untuk dibaca-