Pemeriksaan Defisiensi Besi [PDF]

Citation preview

Pemeriksaan kadar besi dalam serum meliputi pemeriksaan serum iron(SI), Total Iron Binding Capacity (TIBC, ferritin serum, dan hemosiderin dari hapusan sumsum tulang. 1. Standar yang digunakan Mengunakan Standar dari ICSH (International Council for Standardization in Haematology) 2. Metode yang banyak digunakan 



Pemeriksaan



serum



iron



(SI)



banyak



Iron



Binding



menggunakan



metode



Colorimetric-Ferrozine 



Pemeriksaan



Total



Capacity



(TIBC)



banyak



menggunakan metode Saturasi 



Pemeriksaan Ferritin serum banyak menggunakan metode Elisa Double Sandwich dan IRMA (Immunoradiometric Assay)







Hemosiderin banyak menggunakan metode Prussian Blue



B. Prinsip Pemeriksaan 1. Pemeriksaan Serum Iron 



menurut ICSH (International Council for Standardization in Haematology) Besi dilepaskan dari ikatannya dengan transferrin, direduksi dari bentuk Fe3+ menjadi Fe2+ dan serum protein dipresipitasi dengan menggunakan reagen asam campuran (mixed acid reagent). Besi ferro dalam supernatan direaksikan dengan larutan kromogenakan membentuk komplek warna (pink solution)dan dibaca dengan fotometer pada panjang gelombang 562 nm.







Dengan metode Colorimetric-Ferrozine Ikatan antara ferri (Fe3+) dan transferin dilepaskan oleh guanidine dalam suasana pH 4,8. Selanjutnya



asam askorbat akan mereduksi ion ferri



(Fe3+) menjadi ferro (Fe2+), kemudian Fe2+ akan bereaksi dengan ferrozine membentuk komplek berwarna. 2. TotaL Iron Binding Capacity (TIBC) 



menurut ICSH (International Council for Standardization in Haematology)



Pada serum ditambahkan besi yang berlebih (ferri klorid). Besi yang tidak terikat transferin akan diabsorbsi oleh magnesium carbonate, kemudian kadar besi serum diukur. 



Metode Saturasi TIBC dievaluasi setelah saturasi transferin oleh larutan besi, dan kelebihan besi akan diabsorbsi oleh magnesium hydroxide carbonate. Setelah disentrifus, konsentrasi besi dalam supernatan diukur.



3. Ferritin Serum 



Metoda Elisa Double Sandwich Pemeriksaan feritin serum memakai metode ELISA dengan cara double sandwich. Antibodi dengan high affinity terhadap feritin (antiferitin Ig G) akan berikatan dengan feritin serum dan selanjutnya dilabel dengan enzim horseradish peroxidase dan dibaca absorbannya pada panjang gelombang 492 nm.







Metode IRMA (Immunoradiometric Assay) Antibodi yang dilabel dengan radioaktif yang berlebih direaksikan dengan ferritin. Ferritin yang tidak berikatan dengan antibodi akan dihilangkan dengan immunoadsorbent



4. Hemosiderin Reagen Prussian blue akan mewarnai besi menjadi berwarna biru terang atau hijau, sedangkan inti dan eritrosit tercat warna merah atau merah muda oleh neutral red.



C. Bahan Pemeriksaan 1. Utama Bahan utama pemeriksaan yang digunakan untuk pemeriksaan besi adalah serum 2. Pilihan Selain menggunakan bahan pemeriksaan serum, dapat juga menggunakan bahan pemeriksaan berupa plasma heparin dan plasma EDTA.



D. Cara Pemeriksaan a. Reagen 1. Reagen pemeriksaan Serum Iron



a) Menurut ICSH (International Council for Standardization in Haematology) -



Protein precipitant 100 g/L trichloracetic acid (0,61 M) dan 30 ml/L thioglycollic acid dalam 1 mol/L HCl. Larutan ini stabil selama 2 bulan dalam gelap.Karena pertimbangan masalah kesehatan dan keamanan pada penggunaan thioglycollic acid, maka ascorbic acid digunakan sebagai alternatif agen reduktor, meskipun mungkin lebih dipengaruhi oleh adanya copper. Dalam 45 ml HCl 1mol/L ditambahkan 5 ml larutan trichloracetic acid 6,1 mol/L, kemudian ditambahkan lagi dengan 200 mg ascorbic acid kemudian dicampur.



-



Larutan kromogen 25mg ferrozine dilarutkan dalam 100 ml sodium acetate 1,5 mol/L. Larutan ini dapat stabil hingga 4 minggu bila disimpan dalam gelap.



-



Larutan standar besi (80 μmol/l) o Tambahkan 200 μL HCl 2 mol/L dalam 22,1 ml deionized water, dan campur. o Tambahkan 100 μL larutan standar besi (1000 μg Fe/mL dalam 1 % HCl) dan campur. o Stabil hingga 2 bulan pada suhu ruangan



b) Metode Colorimetric-Ferrozine -



Reagen 1 : R1 Acetate buffer, pH 4,8



100 mmol/L



Guanidine hydrochloride Thiourea -



5



mol/L



52,5 mmol/L



Reagen 2 : R2 Ascorbic acid



-



Reagen 3 : R3 Ferrozine



-



41 mmol/L



Standar : Std Iron



100 μg/dL 1mg/L 17,9 μmol/L



2. Reagen pemeriksaan TIBC a) Direkomendasikan ICSH -



Basic magnesium carbonate



-



Saturating solution (100 μmol Fe/L). o Tambahkan 17,7 ml deionized water, 100 μL HCl 1mol/L, 100 μL larutan standar, homogenkan. o Saturating iron solution mengandung 5,6 μg Fe/mL o Stabil dalam 2 bulan pada suhu ruangan.



b) Metode Saturasi -



Reagen 1 : R1 Iron saturating solution



500 μg/dL 5



mg/L



89,5 μmol/L -



Reagen 2 : R2 Magnesium hydroxide carbonate(1 sendok takar = 100 mg)



3. Reagen pemeriksaan Ferritin Serum Metode ELISA Double Sandwich -



Preparat antiferitin Ig G yang dikonjugasi dengan horseradish peroxidase



-



Larutan standar feritin. Dibuat dengan cara o Encerkan human ferritin 200 µg/ml ke dalam air. Encerkan larutan feritin 200 µg/ml ke dalam 10 µl/ml dalam 0,05 mol/l larutan sodium barbitone (yang terdiri dari 0,1 mol/l NaCl, 0,02% NaN dan BSA 5 gr/dl), pH disesuaikan sampai pH 8 dengan menambah HCl 5 mol/l. o Bagi dalam 200 tabung kecil, masing-masing berisi 200 µl, tutup rapat dan tahan sampai 1 tahun pada suhu 40C o Jika akan dipakai, encerkan dengan buffer B sampai 1000 µg/l dan siapkan larutan dalam range 0,2 – 25 µg/l (bandingkan dengan standar WHO untuk uji serum ferritin 94/572)



-



Buffer A : Phosphate-buffered saline pH 7,2



-



Buffer B : 5 gram BSA (Bovine Serum Albumin) dalam 1 liter buffer A



-



Buffer C: Carbonate buffer pH 9,6



-



Buffer D : Citrate phosphate buffer pH 5.



-



Larutan substrat



4. Reagen pemeriksaan Hemosiderin Reagen yang digunakan Prussian blue



b. Prosedur Kerja 1. Pemeriksaan Serum Iron a) Menurut ICSH (International Council for Standardization in Haematology) 1. Masukkan ke dalam tabung, masing-masing 0,5 ml serum, 0,5 ml larutan kerja standar besi, dan 0,5 ml iron-free water sebagai blanko. 2. Tambahkan ke dalam masing-masing tabung 0,5 ml protein precipitant, kemudian campur, selanjutnya diamkan selama 5 menit 3. Sentrifugasi tabung yang berisi serum dengan microfuge pada 13.000 rpm selama 4 menit. untukmengendapkan protein dan mendapatkan supernatan.Ambil 0,5 ml supernatan dan 0,5 ml campuran pada tabung lainnya. Kemudian pada masing-masing tabung ditambahkan 0,5 ml larutan kromogen dan campur dengan baik. 4. Tunggu selama 10 menit 5. Ukur absorbans pada panjang gelombang 562 nm. 6. Penghitungan : Serum iron =



Atest-Ablanko



x 80



Astandar-A blanko Jika tak ada microfuge, gunakan volume dobel untuk reagen dan serum dalam tabung 3 ml dan sentrifus pada 1500 g selama 15 menit



Terbentuknya komplek warna akan terlambat, bila menggunakan plasma EDTA, dan harus ditunggu selama 15 menit sebelum diukur absorbansnya. b) Menggunakan Metode Colorimetric-Ferrozine 1. Larutan kerja (Working reagent) : Larutkan 1 sendok takar R2 dalam 50 ml R1. Tunggu hingga tercampur dengan baik. Larutan ini stabil selama 2 minggu pada suhu 2-8o C, dan 3 hari pada suhu 20-25o C. 2. Kemudian lakukan sesuai tabel dibawah ini : Blanko



Standar



Sampel



Larutan kerja



500 μL



500 μL



500 μL



Akuades



150 μL



-



-



Standar



-



150 μL



-



Sampel



-



-



150



3. Campurkan dan baca absorbans (A) pada panjang gelombang 560 nm setelah 50 detik Blanko



Standar



Sampel



-



A1



A2



4. Kemudian tambahkan :



Reagen 3 (R3)



Blanko



Standar



25 μL



25 μL



Sampel 25 μL



5. Campurkan dan baca absorbance (A) pada panjang gelombang 560 nm setelah 325 detik Blanko



Standar



Sampel



-



A3



A4



6. Penghitungan : A4-A2 A3-A1



X konsentrasi standar



2. Pemeriksaan TIBC a) Direkomendasikan oleh ICSH 1. Masukkan 0,5 ml serum ke dalam tabung 2. Kemudian tambahkan 0,5 ml saturating iron solution, campur dengan hati-hati, dan diamkan selama 15 menit pada suhu ruangan. 3. Tambahkan 100 mg light magnesium carbonate, tutup tabung dan bolak-balik tabung, diamkan selama 30 menit dengan sekali-kali diaduk 4. Sentrifugasi tabung yang berisi serum dengan microfuge pada 13.000 rpm selama 4 menit. untuk mengendapkan protein dan mendapatkan supernatan. 5. Periksa supernatan, jika masih sisa magnesium carbonate harus disentrifus ulang. 6. Ambil supernatannya sebanyak 0,5 ml dan perlakukan seperti pada pemeriksaan serum iron. 7. Hasil akhir dikalikan 2 Jika tak ada microfuge, gunakan volume dobel untuk reagen dan serum dalam tabung 3 ml dan sentrifus pada 1500 g selama 15 menit b) Metode Saturasi 1. Sampel 0,5 ml dicampurkan dengan 1 ml reagen R1, diinkubasi selama 5 menit 2. Kemudian tambahkan 1 sendok takar ( kira-kira 100 mg) reagen R2, dan diinkubasi selama 20 menit, dengan sekali-kali dikocok. 3. Sentrifus selama 10 menit dengan 3000 rpm 4. Ambil supernatannya. 5. Periksa supernatan seperti pada penentuan SI. Dengan 1 bagian supernatan : 3 bagian reagen R1 (pada SI).



3. Pemeriksaan Ferritin Serum Metode ELISA Double Sandwich



1. Lapisi microtitreplate, dengan cara : -



Preparat antiferitin Ig G diencerkan dengan 2 µg/ml buffer C, tambahkan 200 µl ke dalam tiap-tiap sumuran.



-



Tutup dan inkubasi semalam pada suhu 40C. Kosongkan sumuran dengan cara dibalik dan di-tapping pada handuk kering.



-



Tambahkan 200 µl 0,05% BSA dalam buffer C, diamkan 30 menit dalam suhu ruangan.



-



Cuci tiap sumuran dengan buffer A sampai 3x. plate dapat disimpan sampai 1 minggu pada tempat kering dan suhu 40C



2. Encerkan 50 µl serum pasien dengan 1 ml buffer B. 3. Tambahkan 200 µl larutan standard dan serum pasien ke dalam tiap sumuran dalam waktu 20 menit. 4. Tutup dan diamkan selama 20 menit pada suhu kamar dan jauhkan dari sinar matahari 5. Kosongkan sumuran dan cuci 3x dengan buffer A. 6. Tambahkan 200 µl preparat konjugasi antiferitin Ig G dengan horseradish peroxidase yang sudah diencerkan, tutup dan diamkan selama 2 jam pada suhu kamar. 7. Cuci 3x dengan buffer A 8. Tambahkan 200 µl larutan substrat pada tiap-tiap sumuran, inkubasi selama 30 menit. 9. Tambahkan 50 µl asam sulfur 4M pada tiap-tiap sumuran untuk menghentikan reaksi 10. Tunggu 30 menit dan baca absorbannya pada 492 nm dengan microtitre plate reader, atau ambil 200 µl larutan dari tiap sumuran dan masukkan dalam 800 µl air, baca dengan fotometer.



4. Pemeriksaan Hemosiderin Prosedur Kerja : 1) Hapusan darah difiksasi dengan metanol, tunggu 10 – 20 menit 2) Masukkan hapusan dalam larutan potassium ferrocyanide selama 10 menit pada suhu 200C.



3) Cuci dengan air kran selama kira-kira 20 menit, kemudian bilas dengan distilled water. 4) Cat dengan neutral red atau eosin selama 10-15 detik 5) Tuangi dengan HCl 3 mol/l dan cuci dengan air kran.