RFLP Biotek [PDF]

Citation preview

TUGAS BIOTEKNOLOGI TANAMAN Metode Restriction Fragment Length Polymorphism (RFLP)



Oleh: KELOMPOK II Sinta Lestari Suci Khairuni Ramot Jevon Silalahi Reza Fahlevi Sihalas Tua Situmorang Irwanto AGROTEKNOLOGI - D



JURUSAN AGROTEKNOLOGI FAKULTAS PERTANIAN UNIVERSITAS RIAU PEKANBARU 2017



Teknologi Analisis Molekular Menggunakan Metode Restriction Fragment Length Polymorphism (RFLP): Aplikasinya Dalam Diagnosis Molekular Spesies Candida Identifikasi secara cepat isolat Candida untuk mengetahui pada tingkat spesies untuk pemilihan terpi antijamur yang efektif dan juga kontrol fasilitas dari rumah sakit infeksi. Metode analisis berdasarkan fenotip untuk mengidentifikasi spesies Candida seringkali sulit dilakukan dan membutuhkan waktu yang lebih panjang. Teknik biologi molekular memberikan teknik alternatif yang dapat digunakan untuk mengidentifikasi spesies Candida secara cepat, murah dan tepat. Dalam makalah ini akan membahas tentang teknologi analisis molekular dengan menggunakan metode restriction fragment length polymorphism (RFLP) dan aplikasinya untuk diagnosis secara cepat pada spesies Candida yaitu C. albicans, C. glabrata, C. parapsilosis, C. tropicalis, C. krusei dan C. guilliermondii. Analisis dilakukan dengan mengamplifikasi daerah polimorfis ITS1-ITS4 menggunakan Polymerase Chain Reaction (PCR). Hasil amplifikasi kemudian dipotong menggunakan enzim restriksi tunggal yaitu MspI. Dengan menggunakan metode PCR-RFLP dengan enzim restriksi tunggal MspI, Spesies Candida dapat diidentifikasi secara sederhana, cepat dan hemat biaya untuk dapat diaplikasikan dalam laboratorium klinik. Pendahuluan Spesies Candida dianggap penyebab terbesar penyakit infeksi yang mempunyai peluang besar terjadi pada manusia. Infeksi penyakit yang disebabkan oleh Candida antara lain adalah jenis infeksi sistemik dan mukosal ( BautisteMunoz et al., 2003; Dendis et al., 2003; Karababa et al., 2004). Ketika sistem imun lemah atau ketika persaingan flora yang dihilangkan dengan pemberian antibiotic, Candida akan membentuk koloni dan menyerang sel jaringan inang (Waren dan Hazen, 1995). Meskipun kebanyakan infeksi Candida disebabkan oleh C. albicans, spesies Candida non-albicans, misalnya seperti C. glabrata dan C. krusei telah dilaporkan dengan frekuensi yang tinggi. Diagnosis awal infeksi jamur penting dilakukan untuk mengurangi tingkat kematian. Dalam kasus lain, identifikasi spesies sangat penting dilakukan untuk menentukan jenis terapi antijamur yang efektif dengan memperhatikan bahaya



resistesi obat antijamur. Genus Candida termasuk kedalam 154 spesies yang menunjukkan tingkat resistensi terhadap antijamur yang berbeda-beda. Sangat penting untuk menentukan tingkat spesies secara benar, karena kesamaan fenotip pada Cadida sangat tinggi antar spesies Candida (Neppelekenbroek et al., 2005). Telah dilaporkan tentang analisis spesies Candida menggunakan metode RAPD (random amplified polymorphic DNA)-PCR, sekuensing DNA, sekuensi urutan gen RNA subunit besar pada ribosomal dll, tetapi metode tersebut memiliki kelemahan yaitu masih membutuhkan waktu yang lebih panjang dan sangat mahal untuk penggunaan secara rutin dilaboratorium kesehatan. Oleh karena itu diperlukan kit diagnostik secara cepat, tepat dan murah untuk dapat mengidentifikasi pada tingkat spesies Candida dalam penentuan terapi antijamur. Kit identifikasi spesies Candida berdasarkan tes asimilasi tersedia secara komersial, tes kit ini membutuhkan 1-5 hari untuk identifikasi Candida pada tingkat spesies. Pada saat ini, teknik molekular memberikan metode alternatif untuk diagnosis dan identifikasi jamur patogen, termasuk spesies Candida ( Reis et al., 1998; Yeo et al., 2002). Teknik molekular menggunakan amplifikasi DNA target memberikan alternatif metode untuk diagnosis dan identifikasi beberapa organisme. Identifikasi spesies Candida dilakukan dengan menggunakan metode RFLP pada rDNA (Cirak et al., 2003). Pada salah satu penelitian di Cina, Sensivitas dan kecepatan teknik telah digunakan untuk mengidentifikasi 3 spesies penting dalam kesehatan yaitu Candida, Aspergillus dan Cryptococus dengan menggunakan PCR-RFLP secara in vitro. Oleh karena itu dalam makalah ini akan dilakukan pembahasan tentang metode analisis molekular menggunakan teknik RFLP dan aplikasinya dalam mengidentifikasi spesies Candida secara cepat, murah dan tepat.



Teknik Analisis RFLP RFLP merupakan perbedaan pada homolog urutan DNA yang dapat dideteksi dengan menggunakan adanya perbedaan fragmen DNA yang telah dipotong dengan menggunakan enzim endonuklease tertentu. RFLP digunakan sebagai marker molekular karena spesifik untuk setiap tunggal atau kombinasi dari enzim restriksi. Aplikasi dari RFLP dapat digunakan untuk pemetaan genom, genome typing, tes paternitas, forensic dan diagnostik hereditas penyakit. Tahapan RFLP meliputi 4 tahapan yaitu, isolasi DNA, pemotangan DNA dengan enzim restriksi endonuklease, elektroforesi hasil pemotangan DNA dan southern blot. Tahapan analisis RFLP dapat diamati pada Gambar 1.



Gambar 1. Tahapan analisis RFLP pada identifikasi penyakit Aplikasi RFLP untuk Diagnosis Molekular secara Cepat pada Spesies Candida Pentingnya mengetahui spesies Candida untuk menentukan jenis terapi yang akan dilakukan sehingga diperlukan teknik identifikasi spesies secara tepat, cepat dan murah yaitu dengan menggunakan teknik RFLP. Mirhendi et al ( 2006)., melaporkan bahwa penggunaan metode ini telah berhasil untuk mengidentifikasi spesies Candida yaitu spesies C. albicans, C. glabrata, C. parapsilosis, C. tropicalis, C. krusei dan C. guilliermondii dari 137 isolat. Tahapan untuk dapat menganalisis spesies Candida menggunakan metode PCR-RFLP yaitu (Mirhendi et al., 2006; Mousavi et al., 2007) : 1. Isolasi DNA dari isolat Candida 2. Amplifikasi PCR dengan menggunakan satu pasang primer pada daerah ITS1-ITS4



3. Pemotongan menggunakan enzim restriksi MspI 4. Elektroforesis gel agarosa Tahapan pertama dalam analisis RFLP adalah isolasi DNA. Pada tahapan ini isolasi DNA menggunakan kombinasi yaitu secara kimia dan fisik yaitu dengan buffer lisis (10mM Tris, 1mM EDTA pH8, 1% SDS, 100mM NaCl, 2% Triton X-100), 300µL phenol-chloroform (1:1) dan 300mg glass bead (dengan deameter 0.5 mm) dengan cara divortex selama 5 menit. Kemudian dilakukan sentrifugasi dengan kecepatan 10.000 rpm selama 5 menit. Kemudian supernatan diambil dan dipindahkan ke ependorf yang baru dan tambahkan chloroform sejumlah yang sama. Kemudian disentrifugasi dan supernatant dipindahkan ke tabung ependorf yang baru. Kemudian dilakukan presipitasi DNA dengan menambahkan 0.1 mL Na-asetat (pH 5.2) dan 2.5 mL etanol absolute dingin, kocok dengan perlahan dan sentrifugasi dengan kecepatan 10.000 rpm selama 5 menit dengan suhu 4οC. Setelah itu pellet dicuci dengan menggunakan alkohol 70% dan disentrifus. Kemudian pellet dilarutkan dengan menambahkan 100µL buffer TE (10mM Tris, 1mM EDTA). Tahapan kedua yaitu amplifikasi daerah ITS1-ITS4 dengan menggunakan sepasang



primer



forward



dan



TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3’)



reverse



yatu



dan



pR



pF



(ITS1, (ITS4,



5’5’-



TCCTCCGCTATTGATATGC-3’). Komposisi dalam tabung ependorf untuk PCR dimasukkan komponen sebagai berikut : 



1µL DNA template







0.2µM primer







0.1mM dNTP







10 µL buffer PCR 10x







2.5 U Taq DNA Polimerase



Tahapan PCR dilakukan dengan 35 siklus : 



Inisiasi denturasi pada suhu 94οC selama 5 menit, kemudian dilanjutkan tahapan denaturasi pada suhu 94 οC selama 30 detik dengan 25 siklus.







Tahapan penempelan primer pada suhu 56οC selama 25 detik.







Tahap perpanjangan pada suhu 72οC selama 1 menit dan tahap perpanjangan terakhir selama 7 menit. Setelah tahapan PCR, kemudian dilakukan analisis produk PCR



(amplikon) dengan melakukan elektroforesis gel agarosa dalam buffer TBE (0.09M Tris, 0.09M asam borat, 20mM EDTA pH 8.3) dengan pewarnaan EtBr (0.5µg/ml). Hasil analis yang dilaporkan oleh Mirhendi et al (2006) menunjukkan bahwa hasil produk PCR menggunakan satu pasang primer ITS1-ITS4 menunjukkan ukuran yang berbeda-beda antara spesies Candida yang digunakan sebagai standar. Ukuran hasil PCR yang berbeda-beda yaitu sekitar 510-870 bp (Gambar 2). Ukuran produk PCR tidak memberikan permasalahan untuk tahap selanjutnya yaitu tahap pemotongan menggunakan enzim restriksi endonuklease MspI.



Gambar 2. Produk PCR dari 6 spesies Candida yaitu C. albicans ATCC 10261 (1), C. glabrata ATCC 90030 (2), C. tropicalis ATCC 0750 (3), C. krusei ATCC 6258 (4), C. guilliermondii ATCC 9058 (5) dan C. parapsilosi ATCC 22019 (6) dan marker (M) (Mirhendi et al., 2006). Setelah dilakukan analisis produk PCR, kemudian dilakukan pemotongan menggunakan enzim restriksi MspI yaitu dengan menginkubasi 20µL aliquot produk PCR, 10U MspI dengan volume total 25 µL pada suhu 37 οC selama 2 jam. Kemudian dianalisis dengan menggunakan elektroforesis gel agaros 1.8% dalam buffer TBE selama 45 menit pada 100V dan pewarnaan menggunakan EtBr. Hasil pemotongan menggunakan MspI pada produk PCR dari masing-masing spesies



menunjukkan pola ukuran fragmen yang berbeda-beda. Selain menggunakan isolat Candida standar, Mirhendi et al., juga menggunakan isolat lain yaitu S. cerevisiae ATCC 9763, T. asahii TIMM 3411, C. neoformans ATCC 90113, C. albicans var. stellatoidea TIMM1309 dan C. dumbliniensis CBS 7987. Tabel 1. Produk PCR ITS1-ITS4 dari spesies Candida sebelum dan sesudah pemotongan menggunakan MspI (Mirhendi et al., 2006). Spesies Candida C. albicans C. glabrata C. tropicalis C. krusei C. guilliermondii C. parapsilosis



Ukuran produk PCR Ukuran produk ITS1-ITS4 restriksi MspI 535 297, 238 871 557, 314 524 340, 184 510 261, 249 608 371, 155, 82 520 520



Kode akses Genbank L47111 AF167993 L47112 L47113 L47110 L47109



Produk PCR yang telah dipotong menggunakan MspI dianalisis menggunakan elektroforesis gel agarosa ditunjukkan pada Gambar 3. Hasil analisis RFLP menunjukkan ukuran fragmen hasil pemotongan yang berbedabeda. Hasil pemotongan MspI menghasilkan 1 pita (C. parapsilosis ATCC 22019), 2 pita (C. albicans ATCC 10261, C. glabrata ATCC 90030, C. tropicalis ATCC 0750, C. krusei ATCC 6258) dan 3 pita (C. guilliermondii ATCC 9058). Pola 1 pita dipastikan tidak terpotong karena ukuran produk PCR dengan produk PCR yang telah dipotong tidak menunjukkan ukuran yang berbeda yaitu kurang lebih 520 bp. Kemudian 2 pita yang dihasilkan oleh C. krusei ATCC 6258 dipastikan terpotong menghasilkan 2 pita ukuran yang berukuran berdekatan sama, sehingga dari hasil analisis elektroforesis hanya muncul 1 pita. Akan tetapi bila dilihat perkiraan ukuran pita hasil pemotongan yaitu kurang lebih 250 bp dengan ukuran pita sebelum dipotong kurang lebih 510 bp, maka apabila ukuran pita hasil pemotongan dikalikan 2 kali maka didapatkan ukuran kurang lebih 500 bp. Sehingga dapat dipastikan bahwa C. krusei ATCC 6258 terpotong oleh enzim restriksi endonuklease MspI. Hasil analisis PCR-RFLP menggunakan enzim restriksi MspI menujukkan pola yang sama dengan hasil prediksi fragmen pemotongan yang menggunakan urutan DNA dari genbank. Prediksi hasil



pemotongan menggunakan program DNASIS menunukkan bahwa terdapat 3 pola pita yaitu 1 pita, 2 pita dan 3 pita (Tabel 1). Sehingga hasil analisis PCR-RFLP menggunakan enzim resktriksi MspI pada 6 strain standar dapat digunakan untuk identifikasi pada isolat klinik yang dimiliki.



Gambar 3. (A) Produk PCR yang telah dipotong menggunakan enzim restriksi MspI. marker (M), C. albicans ATCC 10261 (1), C. glabrata ATCC 90030 (2), C. tropicalis ATCC 0750 (3), C. krusei ATCC 6258 (4), C. guilliermondii ATCC 9058 (5) dan C. parapsilosi ATCC 22019 (6). (B) Produk PCR yang telah dipotong menggunakan enzim restriksi MspI. S. cerevisiae ATCC 9763 (1), T. asahii TIMM 3411 (2), C. neoformans ATCC 90113 (3), C. albicans var. stellatoidea TIMM1309 (4), C. dumbliniensis CBS 7987 (5). marker (M) ( Mirhendi et al., 2006). Pembahasan Analisis PCR-RFLP pada daerah ITS1-ITS4 menggunakan enzim restriksi MspI sebagai standar untuk identifikasi isolat klinis. Isolat yang dianalisis digunakan dari 6 spesies Candida yang telah diketahui jenis spesiesnya. Penggunaan PCR dalam analisis RFLP adalah untuk membatasi daerah yang polimorfis untuk dipotong menggunakan enzim restriksi. Jika tidak menggunakan kombinasi PCR maka diperlukan analisis lebih lanjut untuk mengetahui pita target hasil pemotongan enzim restriksi pada daerah yang polimorfis yaitu dengan analisis southern blot menggunakan probe tertentu. Analisis PCR-RFLP menggunakan sepasang primer universal pada daerah ITS1-ITS4 rDNA dari berbagai strain Candida. Pemilihan daerah ITS1-ITS4 karena mengandung beberapa daerah yang urutannya lestari, dapat digunakan sebagai alignmen urutan secara tepat namun daerah tersebut juga mengandung variabilitas urutan yang cukup sehingga urutan non-homolog dapat digunakan sebagai marker spesifik untuk identifikasi spesies menggunakan PCR-RFLP.



Sebelum memotong hasil produk PCR, maka dilakukan uji restriksi menggunakan program DNASIS untuk memprediksi produk restriksi dengan enzim restriksi tertentu. Urutan DNA didaerah ITS1-ITS4 diperoleh dari genbank yang dapat diakses secara umum, kemudian diprediksi ukuran fragmen jika dipotong menggunakan enzim restriksi tertentu. Analisis ini dapat membantu dalam pemilihan enzim restriksi yang digunakan. Penelitian yang telah dilakukan Mirhendi et al., (2004) menunjukkan pemotongan



produk



PCR



dengan



menggunakan



enzim



restriksi



MspI



menunjukkan fragmen hasil pemotongan yang sama yaitu sekitar 297bp dan 238bp yang dibuktikan dengan hasil elektroforesis produk restriksi pada Gambar 3. Oleh karena itu dalam laporan hasil penelitian yang dilakukan Mirhendi et al., (2004) melaporkan bahwa diperoleh sejumlah 93 isolat (67.9%) telah diidentifikasi sebagai C. albicans atau C. dubliniensi. Padahal kedua spesies ini berbeda. C. dubliniensi merupakan spesies baru yang pertama kali ditemukan pada tahun 1995 oleh Sullivan et al., (1995) yang berhubungan dengan penyakit Candidiasis pada human yang terinfeksi HIV. Sedangkan C. albicans hanya 2% ditemukan dalam kasus candidema. Selain itu C. albicans juga merupakan isolat yang sangat jarang ditemukan pada mikroflora pada human yang sehat. Kedua spesies yaitu C. albicans dan C. dubliniensis menunjukkan kesamaan yang tinggi pada fenotipnya karena keduanya mampu memproduksi germ tubes dan clamdyospore. Namun, identifikasi untuk membedakan keduanya dapat dilakukan dengan aktivitas enzim beta-D-glucosidase intraselular dan karbohidrat asimilasi. Akan tetapi kedua metode ini memerlukan waktu dan biaya yang kurang efektif. Kemudian pada tahun 2005, Mirhendi et al., telah melaporkan dapat mengidentifikasi C. albicans dan C. dubliniensi dengan menggunakan analisis RFLP menggunakan satu enzim restriksi pada daerah ITS1-ITS4 yaitu BlnI. Mirhendi et al (2005) telah mampu menunjukkan atau membedakan isolat yang termasuk kedalam spesies C. albicans dan C. dubliniensi hanya dengan menggunakan enzim restriksi tunggal. Hasil produk PCR dengan menggunakan primer yang didesain untuk mengamplifikasi daerah ITS1-ITS4 menghasilkan produk PCR dengan ukuran pita kurang lebih 540bp. Ukuran ITS1-ITS4 tersebut



sesuai dengan yang telah dilaporkan oleh Mirhendi et al., (2004) dalam penelitian sebelumnya. Hasil restriksi produk PCR menggunakan enzim BlnI menunjukkan pola pita yang terbentuk berbeda antara C. albicans dan C. dubliniensi yaitu pada produk PCR ITS1-ITS4 yang telah dipotong dengan BlnI pada C. albicans terbentuk 2 pita dan C. dubliniensi 1 pita. Hal ini menunjukkan bahwa pada daerah ITS1-ITS4 pada C. albicans dikenali oleh enzim restriksi BlnI dengan hasil pita pemotongan ukurannya kurang lebih 340bp dan 200bp, berbeda halnya dengan C. dubliniensi yang menunjukkan tidak ada sisi yang dikenali dengan enzim restriksi BlnI sehingga hasil analisis produk restriksi ditemukan pita dengan ukuran kurang lebih 540bp. Ukuran 540bp berukuran sama dengan ukuran produk PCR



yaitu



540bp. Sehingga



Marhendi



et



al., (2005)



telah



berhasil



mengembangkan metode PCR-RFLP menggunakan enzim restriksi tunggal untuk identifikasi C. albicans dan C. dubliniensi.



Kesimpulan Metode analisis PCR-RFLP dapat digunakan untuk mendiagnosis spesies Candida yaitu C. albicans, C. glabrata, C. tropicalis, C. krusei, C. guilliermondii dan C. parapsilosi menggunakan enzim restriksi MspI dan C. albicans dengan C. dubliniensis menggunakan enzim restriksi BlnI dengan satu pasang primer ITS1ITS4 untuk dilakukan dilaboratorium kesehatan. Daftar Pustaka Mousavi, S. A. A., Khalesi, E., Bonjar, G. H. S., Aghihhi, S., Sharifi, F., Aram, A. 2007. Rapid Molecular Diagnosis for species Using PCR-RFLP. Biotechnology 6(4):583-587. Mirhendi, H., Makimura, K., Khoramizadeh, M., Yamagushi, H. 2006. A OneEnzyme PCR-RFLP Assay for Identification of Six Medically Important Candida Species. J. Med. Mycol. Vol.47. 225-229.



Reiss, E., Tanak, K., Bruker, G., Chazalet, V., Coleman, D., Debeaupuis, JP., Hanazawa, R., Latge, JP., Lortholary, J., Makimura, K., Morrison, C.J., Murayama, S.Y., Naoe, S., Paris, S., Sarfati, J., Shibuya, K., Sullivan, D., Uchida, K., Yamaguchi, H. 1998. Molecular diagnosis and epidemiology of fungal infection. Med Mycol 36 (Suppl 1):249-257. Yeo, S,F., Wong, B., Current status of nonculture methods for diagnosis of invasive fugal infection. Clin Microbiol Rev. 15:465-484. Mirhendi, H., Makimura, K., Zomorodian, K., Maeda, N., omoko, O., Yamagushi, H. 2005. Differentiation of Candida albicans and Candida dubliniensis Using a Singel-Enzyme PCR-RFLP Method. J. Infect. Dis. 58:235-237. Sullivan, D.J., Westerneng, T.J., Haynes, K.A., Bennet, D.E., Coleman, D.C. 1995. Candida dubliniensis sp. nov.: phenotypic and molecular characterization of a novel species associated with oral candidosis in HIVinfected individuals. Microbiology, 141:1507-1521. Warren, N.G.M., Hazen, R.C. 1995. Candida, Cryptococus and other Yeast of Medical Importance. In: Manual of Clinical Microbiology. Murray, R.P., Baron, M.A.P., Faller, E.J., Tenover, F.C., Yolen, K.H, 6th., Washington DC. ASM. Bautiste-Munoz, C., Boldo, X.M., Tanaka, L.V. 2003. Identification of Candida spp. by randomly amplified polymophic DNA analysis and differentiation between Candida albicans and Candida dubliniensis by direct PCR methods. J. Clin. Microbiol. 41:414-420. Cirak, M. Y., Kalkanci, A., Kustimur, S. 2003. Use of Molecular methods in identification of Candida species and evolution of fluconazole resistance. Mem. Inst. Oswaldo Cruz. 98:1027-1032. Dendis, M., Horvath, R., Michalek, J., Ruzicka, F., Grijalva, M., Bartos, M., Benedik, J. 2003. PCR-RFLP detection and species identification of fungal pathogens in patients with febrile neutropenia. Clin. Microbiol. Infect. 9:11911202. Karababa, M., Coste, A.T., Rognon, B., Bille, J., Sanglard, D. 2004. Comparison of gene expression profile of Candida albicans azole resistant clinical isolates and laboratory strains exposed to drugs indusing multidrug transporters. Antimicrob. Agen. Chemother. 48:3064-3079. Neppelenbroek, N.C., Spolidorio, DMP., Spolidorio, L.C. 2005. Molecular fingerprinting methods for the discrimination between C. albicans and C. dubliniensis. Oral Dis., 12:242-253.