STR Dna [PDF]

Citation preview

Tasya Valiana Bambang 1730912320130 XXVIII-M



Perkiraan Efisiensi Forensik dan Analisis Filogenetik pada Kelompok Etnis Kirgistan Tiongkok yang Diungkap oleh Panel 21 Short Tandem Repeat Yuxin Guo, Chong Chen, Tong Xie, Wei Cui, Haotian Meng, Xiaoye Jin, Bofeng Zhu



Abstrak Short tandem repeat (STR) dengan tingkat polimorfisme yang tinggi dan metode deteksi yang sesuai memainkan peran yang sangat penting dalam genetika forensik dan populasi manusia. Akhir-akhir ini, kami mendeteksi 21 lokus sistem indeks DNA non-kombinasi autosomal (non-CODIS) STR dalam kelompok etnis Kirgistan, menghitung parameter forensiknya, dan menganalisis hubungan genetiknya dengan populasi referensi dari Cina. Secara total, 168 alel diamati pada 21 STR non-CODIS dengan frekuensi alelik yang sesuai dari 0,0016 hingga 0,4788. Tidak ada deviasi signifikan dari keseimbangan Hardy-Weinberg yang dapat diamati dari STR ini. Nilai kekuatan diskriminasi dan probabilitas eksklusi kumulatif untuk semua 21 STR non-CODIS masing-masing adalah 0,99999999999999999998835 dan 0,9999994002. Lebih jauh, analisis pohon filogenetik, jarak genetik dan perbedaan antar populasi menunjukkan bahwa kelompok Kirgistan memiliki hubungan genetik yang relatif dekat dengan kelompok Uygur dan Kazak. 21 STR non-CODIS ini ditandai dengan keragaman genetik yang tinggi dalam kelompok Kirgistan dan dapat diterapkan sebagai alat yang baik untuk identifikasi individu dan pengujian kekerabatan dalam ilmu forensik. 1. Pendahuluan Short tandem repeats (STR), sebagai penanda genetik yang paling umum yang tersebar luas dalam genom manusia telah memiliki berbagai aplikasi dalam pembuatan profil DNA kasus rutin (terutama dalam identifikasi individu dan pengujian paternitas) selama beberapa dekade. Meskipun banyak kit komersil STR autosomal telah dikembangkan, sebagian besar mengandung 13 lokus yang tumpang tindih dengan yang diteliti oleh sistem indeks DNA gabungan (CODIS). Dalam praktik forensik untuk menyelesaikan beberapa pengujian hubungan saudara yang disengketakan, seperti analisis duo parentage yang tidak memiliki sampel dari ayah atau ibu, biasanya membutuhkan lebih banyak lokus STR nonCODIS untuk mencapai kriteria identifikasi. Selain itu, tingkat mutasi lokus STR relatif tinggi; untuk alasan ini, hasil pengujian keturunan cenderung menjadi



kompleks bahkan jika satu atau dua ketidakcocokan terjadi antara orang tua dan anak. Akibatnya, lebih banyak lokus STR non-CODIS diperlukan sebagai pelengkap. Namun, kit yang disebutkan di atas tidak cocok untuk digunakan sebagai pelengkap untuk memaksimalkan pembedaan. Oleh karena itu, penting untuk memilih lebih banyak lokus STR tanpa lokus inti CODIS yang tumpang tindih dalam aplikasi forensik, terutama dalam kasus kekerabatan yang rumit dan investigasi orang yang hilang. Kelompok Kirgistan adalah salah satu dari 56 kelompok etnis di Cina dan terdiri dari populasi 186.708 orang, yang sebagian besar tersebar di Prefektur Otonomi Kizilsu Kirghiz Daerah Otonomi Xinjiang Uygur, dengan proporsi kecil tersebar di berbagai wilayah Xinjiang; hanya beberapa yang tersisa di Kabupaten Fuyu, Provinsi Heilongjiang (semua data diambil dari Sensus Penduduk Nasional Keenam Republik Rakyat Tiongkok (http://www.stats.gov.cn/tjsj/ pcsj/rkpc/6rp/ indexch.htm). Bahasa mereka berasal dari keluarga bahasa Altai, dan bahasa tertulis yang mereka gunakan hari ini dibuat berdasarkan abjad Arab. Ada beberapa hasil penelitian tentang Uygur, Kazak dan kelompok etnis lain di Xinjian, tetapi sangat sedikit yang tersedia mengenai etnis Kirgistan dari Tiongkok. Untuk memperkaya pustaka data genetik populasi dan menjelajahi latar belakang genetik Kirgistan, sebuah panel 21 lokus STR non-CODIS digunakan untuk menganalisis individu-individu kelompok Kirgistan Tiongkok dengan membandingkannya dengan 11 populasi yang sebelumnya diterbitkan. 2. Bahan dan Metode 2.1. Pengumpulan sampel dan ekstraksi DNA Darah perifer diambil dari 307 individu sehat yang tidak berkeluarga yang tinggal di Prefektur Otonomi Kizilsu Kirghiz Daerah Otonomi Xinjiang Uygur lebih dari tiga generasi. Informed consent tertulis diperoleh dari setiap peserta. Setelah pengambilan darah perifer, sebagian kecil darah yang disebarkan pada saringan segar dan dibiarkan mengering pada suhu kamar dibuat menjadi noda darah untuk konservasi jangka panjang, dan bagian yang tersisa dibekukan untuk disimpan. Penelitian ini dilakukan sesuai dengan prinsip-prinsip penelitian



manusiawi dan etis yang disetujui oleh komite etika Pusat Ilmu Kesehatan Universitas Xi'an Jiaotong, Tiongkok (no. XJTULAC201). DNA diekstraksi dari noda darah yang disebutkan di atas dengan metode Chelex-100. 2.2. Amplifikasi Polymerase Chain Reaction dan Pengetikan Short Tandem Repeat 21 lokus STR non-CODIS diamplifikasi secara simultan dalam satu sistem Polymerase chain reaction (PCR) oleh reagen amplifikasi fluoresensi AGCU 21+1 (AGCU ScienTech Incorporation, Wuxi, Jiangsu, China) dengan Sistem GeneAmp PCR 9700 Thermal Cycler (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA). Kondisi PCR dapat diperoleh dari validasi perkembangan reagen. Genotyping STR dilakukan pada ABI PRISM 3130 Genetic Analyzer (Applied Biosystems) dan dianalisis oleh perangkat lunak GENEMAPPER ID 3.2 (Applied Biosystems). 2.3. Kontrol Kualitas Penelitian ini sesuai dengan rekomendasi ISFG oleh Schneider tentang analisis polimorfisme DNA. 2.4. Analisis Statistik Lembar kerja POWERSTAT v. 1.2 yang dimodifikasi digunakan untuk menghitung frekuensi alelik dan parameter forensik termasuk probabilitas kesesuaian (MP), kekuatan diskriminasi (PD), probabilitas eksklusi (PE), probabilitas heterozigositas yang diamati (HO), konten informasi polimorfisme (PIC), indeks paternitas tipikal (TPI) dan tes dari Hardy-Weinberg Equilibrium (HWE). Sementara itu, nilai heterozigositas yang diharapkan (HE), kekuatan diskriminasi kumulatif (CPD), dan probabilitas eksklusi kumulatif (CPE) dihitung dengan formula secara langsung. Uji pasti linkage disequilibrium (LD) dari setiap pasangan lokus STR dan nilai Fst berpasangan diestimasi oleh GENEPOP v. 4.0.10 (http://genepop.curtin.edu.au). Analisis struktur populasi dilakukan di antara kelompok etnis Kyrgyzstan yang diteliti dan populasi lain yang sebelumnya diterbitkan menggunakan program STRUCTURE v.2.2 (http://pritch.bsd.



uchicago.edu/structure.html), dan plot K optimal (K=6) ditentukan oleh STRUCTURE HARVESTER v.0.6.94 digambarkan menggunakan DISTRUCT v.1.1 (https://web.stanford.edu/group/rosenberglab /distruct.html). Pohon yang bergabung dibangun berdasarkan nilai DA yang dihitung dengan program DISPAN oleh MEGA v.6.06 (http://megasoftware.net/) dan pohon lain dibangun oleh PHYLIP v.3.69 berdasarkan frekuensi alelik. STATISTIK PASW v.18 (http://www.winwrap.com)



digunakan



untuk



membuat



plot



penskalaan



multidimensi (MDS) berdasarkan nilai Fst berpasangan. Selain itu, nilai Fst lokus demi lokus dan nilai-p antara kelompok Kyrgyzstan dan populasi yang dibandingkan lainnya dihitung oleh perangkat lunak ARLEQUIN v.3.1. 3. Hasil dan Diskusi 3.1. Analisis Polimorfisme Genetik dari 21 Lokus Sistem Indeks DNA yang Tidak Dikombinasikan Frekuensi alelik dan parameter forensik dari 21 lokus STR non-CODIS dicantumkan masing-masing dalam tabel 1 dan 2. Ada 168 alel yang diamati dengan frekuensi alel yang sesuai dari 0,0016 hingga 0,4788 dalam kelompok. Tidak ada penyimpangan yang signifikan (p> 0,05) yang diamati dari HWE di 21 lokus STR ini. Nilai maksimum PD, PE, PIC dan TPI adalah 0,9494, 0,7081, 0,8090 dan 3,4886, yang semuanya diamati di locus D19S433. Sebaliknya, semua nilai minimum yang diamati di lokus D1S1627 adalah 0,7617, 0,2565, 0,51044 dan 1,1629. Selain itu, nilai MP berkisar antara 0,0506 di lokus D19S433 hingga 0,2383 di lokus D1S1627. Nilai HO berada dalam kisaran dari 0,8567 (D19S433) hingga 0,5700 (D1S1627), sedangkan nilai HE berkisar antara 0,8284 (D19S433) hingga 0,5955 (D1S1627). Nilai CPD dan CPE dari semua 21 lokus STR ini adalah 0,99999999999999999998844 dan 0,9999993992. Hasil yang disebutkan di atas menunjukkan bahwa panel 21 lokus STR non-CODIS dapat digunakan sebagai alat yang sensitif dan akurat dalam kasus forensik rutin dari kelompok Kyrgyzstan yang diteliti. 3.2. Analisis Keterkaitan Disekuilibrium pada Lokus STR Berpasangan



Sebuah studi sebelumnya telah memverifikasi bahwa jarak fisik antara 21 STR non-CODIS semua lebih besar dari 10MB, yaitu, lokus ini tidak saling terkait. Juga dalam penelitian ini, analisis keterkaitan disekuilibrium harus dilakukan antara masing-masing pasangan lokus STR sebelum langkah berikutnya dalam analisis genetika populasi dan ilmu forensik. Oleh karena itu, tes LD dalam 210 pasangan dari semua lokus STR dilakukan oleh GENEPOP v. 4.0.10. Setelah koreksi Bonferroni (p=0,05/210=0,00024), tidak ada LD yang diamati pada semua perbandingan berpasangan. Dengan demikian, 21 lokus STR dapat dianggap sebagai lokus independen dalam analisis berikut. 3.3. Analisis STRUCTURE Berdasarkan Data Populasi Mentah Analisis struktur populasi dilakukan berdasarkan data populasi mentah dari 21 lokus STR yang sama antara Kirgistan yang diteliti dan populasi lain yang diterbitkan sebelumnya oleh program STRUCTURE. Semua populasi referensi termasuk sembilan populasi dari Asia Timur (Ningxia Han, Guanzhong Han, Tibet, Bai, Yi, Rusia, Salar, Tujia, dan Mongolia) dan tiga populasi dari Asia Tengah (Kazak Cina, Uygur, dan Kirgistan yang diteliti). Masing-masing K = 2-7 dengan 15 putaran dilakukan; kemudian K optimal dipilih oleh STRUCTURE HARVESTER v.0.6.94 dan hasilnya ditampilkan dalam bahan pelengkap elektronik. Gambar S1, menunjukkan bahwa K = 6 adalah konfigurasi yang paling tepat. Seperti yang ditunjukkan pada Gambar 1, semua populasi yang dianalisis memiliki pola distribusi komponen yang sama pada K = 6, dan proporsi keenam warna hampir sama. Bahkan tiga populasi (Kazak, Uygur, dan kelompok etnik Kirgistan yang diteliti) dari Asia Tengah konsisten dengan sembilan populasi Asia Timur secara kasar. Oleh karena itu, dengan panel 21 lokus STR non-CODIS, tidak ada diferensiasi struktur populasi yang jelas yang diamati antara Kirgistan dan 11 populasi referensi yang disebutkan di atas.



Gambar 1. Analisis struktur populasi dilakukan dengan data mentah etnis Kirgistan dan 11 kelompok referensi (K = 6).



Tabel 2. Parameter statistik untuk 21 lokus STR dalam kelompok Kirgistan (n=307).



3.4. Diferensiasi Antarpopulasi Nilai Fst lokus demi lokus dan nilai p dihitung dengan analisis varian molekul (AMOVA) antara kelompok Kyrgyzstan dan 11 populasi referensi



menggunakan perangkat lunak ARLEQUIN v.3.1. Hasilnya diberikan dalam tabel 3. Perbedaan signifikan (p