Uji Antioksidan [PDF]

Citation preview

Laporan Praktikum Teknik Analisis Biokimia



Hari/Tanggal Waktu PJP Asisten



: Rabu/30 Oktober 2019 : 08.00-11.00 WIB : Rini Kurniasih, M.Si : T Muhammad Iqbal



UJI ANTIOKSIDAN DENGAN METODE DPPH Kelompok 5 Winny Syadila Putri Cepty Rohmawati Uswatun Khasanah Ariefkal Umara Amelia Dwi Kusmiarni Hana Savierina Muhammad Rafindra Nirwan Syahra Adzimi Affandi Abyan Yassar Nabrisqi



G84170042 G84170030 G84170041 G84170051 G84170053 G84170057 G84170059 G84170060 G84170083



DEPARTEMEN BIOKIMIA FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM INSTITUT PERTANIAN BOGOR BOGOR 2019



PENDAHULUAN Antioksidan merupakan zat atau senyawa yang berguna untuk mengatasi kerusakan oksidatif akibat reaksi radikal bebas di dalam tubuh sehingga berperan dalam mencegah berbagai macam penyakit. Dalam arti khusus antioksidan adalah zat yang dapat menunda atau mencegah terjadinya reaksi radikal bebas dalam oksidasi lipid. Radikal bebas merupakan atom atau gugus atom yang memiliki satu atau lebih elektron yang tidak berpasangan sehingga bersifat sangat reaktif. Radikal bebas secara terus menerus terbentuk di dalam tubuh dimana jika jumlahnya di dalam tubuh sangat banyak dapat berpotensi menonaktifkan berbagai enzim, mengoksidasikan lemak, dan mengganggu DNA tubuh sehingga terjadi mutasi sel yang merupakan awal timbulnya kanker (Handayani et al. 2014). Berdasarkan sumbernya, antioksidan dapat dibagi menjadi 2 yaitu antioksidan alami dan antioksidan sintetik. Antioksidan alami merupakan senyawa antioksidan yang terdapat secara alami dalam tubuh sebagai mekanisme pertahanan tubuh normal maupun berasal dari asupan luar tubuh. Antioksidan sintetik merupakan senyawa yang disintesis secara kimia. Salah satu sumber senyawa antioksidan adalah tanaman dengan kandungan senyawa polifenol yang tinggi (Tristantini et al. 2016). Senyawa-senyawa yang berpotensi sebagai antioksidan diantaranya adalah flavonoid. Flavonoid merupakan senyawa polifenol yang mempunyai kemampuan untuk menyumbangkan atom hidrogen kepada senyawa radikal bebas. Aktivitas antioksidan senyawa polifenol dapat dihasilkan pada reaksi netralisasi radikal bebas atau pada penghentian reaksi berantai yang terjadi. Senyawa lainnya yaitu saponin yang mampu meredam superoksida melalui pembentukan intermediet hidroperoksida sehingga mencegah kerusakan biomolekular (Handayani et al. 2014). Uji aktivitas antioksidan dapat dilakukan dengan menggunakan beberapa macam metode yaitu DPPH, FRAP, dan FIC. DPPH (2,2-difenil-1-pikrilhidrazil) merupakan radikal sintetik yang larut dalam pelarut polar seperti metanol dan etanol. DPPH merupakan radikal yang stabil yang dapat diukur intensitasnya pada panjang gelombang 515 nm. Pengukuran antioksidan dengan metode DPPH pada prinsipnya adalah mengukur terjadinya pemudaran warna dari radikal bebas stabil yaitu DPPH akibat adanya antioksidan yang dapat menetralkan molekul radikal bebas tersebut. Radikal DPPH yang sebelumnya berwarna ungu akan kehilangan warnanya yaitu berubah menjadi kuning pucat jika ada antioksidan, karena antioksidan akan menyumbangkan elektronnya kepada radikal DPPH. Radikal yang sebelumnya tidak stabil (akibat tidak adanya elektron yang berpasangan) menjadi stabil (elektron di radikal bebas menjadi berpasangan karena mendapat sumbangan elektron dari antioksidan) (Najihudin et al. 2017). Prinsip kerja FRAP (Ferric Reducing Antioxidant Power) yaitu berdasarkan pada reaksi reduksi dalam suasana asam terhadap senyawa kompleks Fe 3+ yang berwarna kuning menjadi senyawa kompleks Fe2+ yang berwarna hijau kebiruan akibat donor elektron dari senyawa antioksidan. FIC (Ferrous Ion Chelating) yaitu reaksi kelat atau uji aktivitas pengkelat ion logam. Proses pengkelat ion logam dapat terjadi apabila ada agen pengkelat seperti senyawa antioksidan. Adanya agen pengkelat menyebabkan pembentukan kompleks ion ferro dengan



orthofenanthrolin akan terganggu sehingga terjadi penurunan serapan warna merah menjadi oranye dari kompleks antara ion ferro dengan orthofenanthrolin. Penurunan serapan warna ini terjadi karena adanya aktivitas kelat logam dari agen pengkelat (Maesaroh et al. 2018). Praktikum ini bertujuan melakukan analisis uji antioksidan dari senyawa tumbuhan dengan metode DPPH.



METODE Tempat dan Waktu Praktikum ini dilakukan di Laboratorium Pendidikan Departemen Biokimia, Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Institut Pertanian Bogor. Praktikum ini dilaksanakan pada hari Rabu, 30 Oktober 2019. Praktikum dimulai pada pukul 08.00-11.00 WIB. Alat dan Bahan Alat yang digunakan dalam percobaan ini adalah neraca analitik, sudip, tabung reaksi, labu Erlenmeyer, batang pengaduk, mikropipet, pelat mikro, dan nanospektrofotometer. Bahan yang digunakan dalam percobaan ini adalah ekstrak bagian tumbuhan kembang telang (Clitoria ternatea), standar asam askorbat (vitamin C), 2,2-difenil-1-pikrilhidrazil (DPPH) 1 mM, larutan etanol 96% dan akuades. Prosedur Percobaan Analisis aktivitas antioksidan kontrol positif. Larutan stok asam askorbat 100 ppm dibuat dalam labu Erlenmeyer, kemudian diencerkan menjadi berbagai konsentrasi yaitu 2, 4, 6, 8, dan 10 ppm. Masing-masing konsentrasi diambil sebanyak 100 µL dengan mikropipet ke dalam pelat mikro, selanjutnya ditambahkan 100 µL DPPH 1 mM ke dalam setiap konsentrasi pada pelat mikro. Blanko dibuat dari etanol 96% yang diambil sebanyak 100 µL ke dalam pelat mikro dan juga ditambahkan dengan 100 µL DPPH 1 mM. Seluruh sampel kemudian diinkubasi selama 30 menit di ruang gelap. Nilai absorbansi kemudian diukur pada panjang gelombang 517 nm. Analisis aktivitas antioksidan sampel. Sebanyak 5 mg ekstrak bunga kembang telang (Clitoria ternatea) dilarutkan dalam 5 mL etanol 96% sehingga konsentrasi menjadi 1000 ppm. Larutan ekstrak tersebut kemudian diencerkan menjadi konsentrasi 100, 200, 400, 600, dan 800 ppm dalam tabung reaksi. Setiap konsentrasi dari pengenceran tersebut diambil sebanyak 100 µL yang dimasukkan ke dalam pelat mikro dan ditambahkan dengan 100 µL DPPH 1 mM. Blanko dibuat dari etanol 96% yang diambil sebanyak 100 µL ke dalam pelat mikro dan ditambahkan pula 100 µL DPPH 1 mM. Seluruh sampel diinkubasi selama 30 menit di ruang gelap. Nilai absorbansi kemudian diukur pada panjang gelombang 517 nm.



HASIL Tabel 1 Aktivitas antioksidan asam askorbat %Aktivitas Antioksidan



Absorbansi [VitaminC]



0 ppm 2 ppm 4 ppm 6 ppm 8 ppm



IC50



Ulangan 1



Ulangan 2



Ulangan 3



1



2



3



1



2



3



0.345 0.304 0.249 0.190 0.134



0.327 0.284 0.248 0.174 0.123



0.297 0.272 0.221 0.184 0.146



12% 28% 45% 61%



13% 24% 47% 62%



8% 26% 38% 51%



6.54



6.49



8.37



Contoh perhitungan: [Vitamin C] 2 ppm ulangan 1 % Aktivitas antioksidan = =



Absorbansi blanko−Absorbansi sampel Absorbansi blanko 0.526−0.032 0.526



x 100%



x 100%



= 93.916% IC50 ulangan 1 y = 0.3467 ln (x) – 0.1513 50 = 0.3467 ln (x) – 0.1513 ln (x) = 1.878569368 x = 6.54 ppm



70%



y = 0.3451ln(x) - 0.1483 y = 0.3525ln(x) - 0.1594 R² = 0.9597 R² = 0.9172



60%



Aktivitas Inhibisi



50% 40% y = 0.2947ln(x) - 0.1284 R² = 0.9828



30% 20% 10% 0% 0



1



2



3



4 5 Konsentrasi Vitamin C 6



Gambar 1 Kurva standar asam askorbat



7



8



9



Tabel 2 Aktivitas antioksidan ekstrak etanol 96% kembang telang Sampel



Batang



Bunga



Daun



Akar



[Sampel]



Absorbansi



Blanko 100 200 400 600 800 Blanko 100 200 400 600 800 Blanko 100 200 400 600 800 Blanko 100 200 400 600 800



0.323 0.294 0.253 0.199 0.166 0.173 0.334 0.278 0.229 0.155 0.154 0.175 0.335 0.323 0.295 0.262 0.190 0.169 0.330 0.177 0.163 0.186 0.230 0.438



%Aktivitas antioksidan 9% 22% 38% 49% 46% 9% 22% 38% 49% 46% 4% 12% 22% 43% 50% 46% 51% 44% 30% -33%



IC50



782.61



561.63



955.79



0.0065



Contoh perhitungan: Sampel bunga konsentrasi 100 ppm % Aktivitas antioksidan = =



Absorbansi blanko−Absorbansi sampel Absorbansi blanko 0.526−(−0.032)



=9% IC50 bunga y = 0.1741 ln (x) – 0.6022 50 = 0.1741 ln (x) – 0.6022 ln (x) = 6.330844342 x = 561.63 ppm



0.526



x 100%



x 100%



60% 50% y = 0.1741ln(x) - 0.6022 R² = 0.8266



40% 30% 20% 10% 0% 0



200



400



600



800



1000



Gambar 2 Kurva sampel ekstrak bunga kembang telang Berdasarkan data pada Tabel 1 tentang aktivitas antioksidan asam askorbat didapatkan nilai absorbansi terbesar diperoleh oleh vitamin C dengan konsentrasi 0 ppm. Persen aktivitas antioksidan terbesar diperoleh oleh vitamin C dengan konsentrasi 8 ppm. Nilai IC50 yang dilakukan sebanyak tiga kali ulangan berturutturut didapatkan sebesar 6.54 ppm, 6.49 ppm, dan 8.37 ppm. Berdasarkan data pada Tabel 2 tentang aktivitas antioksidan ekstrak etanol 96% kembang telang didapatkan nilai absorbansi terbesar diperoleh oleh ekstrak daun, selanjutnya berturut-turut diikuti oleh ekstrak bunga, akar, dan batang. Persen aktivitas antioksidan terbesar diperoleh oleh ekstrak akar, selanjutnya berturut-turut diikuti oleh ekstrak bunga, batang, dan daun. Nilai IC50 terkecil diperoleh oleh ekstrak akar, kemudian diikuti oleh ekstrak bunga, batang dan daun dengan nilai masing-masingnya berturut-turut sebesar 0.0065 ppm, 561.63 ppm, 782.61 ppm, dan 955.79 ppm.



PEMBAHASAN Prinsip uji aktivitas antioksidan dengan menggunakan metode DPPH adalah pengukuran aktivitas antioksidan secara kuantitatif terhadap terjadinya pemudaran warna dari radikal bebas stabil DPPH akibat adanya antioksidan yang dapat menetralkan molekul radikal bebas tersebut. Radikal DPPH yang sebelumnya berwarna ungu akan kehilangan warnanya yaitu berubah menjadi kuning pucat jika ada antioksidan, karena antioksidan akan menyumbangkan elektronnya kepada radikal DPPH. Radikal yang sebelumnya tidak stabil (akibat tidak adanya elektron yang berpasangan) menjadi stabil (elektron di radikal bebas menjadi berpasangan karena mendapat sumbangan elektron dari antioksidan) (Najihudin et al. 2017). Pengukuran aktivitas antioksidan secara kuantitatif tersebut akan berdampak pada diketahuinya nilai aktivitas peredaman radikal bebas yang dinyatakan dengan nilai IC50 (Inhibitory Concentration). Nilai IC50 didefinisikan sebagai besarnya konsentrasi senyawa uji yang dapat meredam radikal bebas sebanyak 50%. Semakin kecil nilai IC50 maka aktivitas peredaman radikal bebas



semakin tinggi (Ridho 2013). Etanol dipilih sebagai pelarut karena untuk menyesuaikan dengan pelarut DPPH dimana DPPH hanya dapat larut dalam pelarut polar (Najihudin et al. 2017). Asam askorbat (vitamin C) merupakan antioksidan yang larut dalam air. Asam askorbat (vitamin C) berperan sebagai larutan standar atau kontrol positif pada percobaan ini. Penggunaan kontrol positif pada percobaan ini adalah untuk mengetahui seberapa kuat potensi antioksidan yang ada pada ekstrak kembang telang jika dibandingkan dengan vitamin C (Rosahdi et al. 2013). Besarnya aktivitas antioksidan dapat diketahui dari nilai IC50. Semakin kecil nilai IC50 maka aktivitas peredaman radikal bebas semakin tinggi (Ridho 2013). Asam askorbat yang berperan sebagai pembanding atau kontrol positif didapatkan rata-rata IC50 dari tiga kali pengulangan yaitu sebesar 7.133 ppm. Ekstrak dari bunga tumbuhan kembang telang (Clitoria ternatea) didapatkan nilai IC50 sebesar 561.63 ppm. Hasil ini menunjukkan bahwa IC50 dari ekstrak bunga tumbuhan kembang telang (Clitoria ternatea) lebih besar daripada IC50 asam askorbat. Besarnya nilai IC50 yang didapatkan tersebut menunjukkan bahwa aktivitas antioksidan dari asam askorbat lebih besar daripada aktivitas antioksidan ekstrak bunga tumbuhan kembang telang (Clitoria ternatea). Radikal bebas merupakan suatu molekul yang relatif tidak stabil dengan atom yang pada orbit terluarnya memiliki satu atau lebih elektron yang tidak berpasangan. Molekul yang kehilangan elektron pasangan akan menjadi tidak stabil dan radikal, sehingga untuk menjadi stabil molekul ini berusaha mencari pasangan elektronnya dengan cara merebut elektron dari molekul lain. Molekul radikal bebas ini dapat dihambat dengan adanya zat antioksidan (Khaira 2010) Zat antioksidan berfungsi sebagai inhibitor yang bekerja menghambat oksidasi dengan cara bereaksi dengan radikal bebas reaktif membentuk radikal bebas tak reaktif sehingga dapat melindungi sel dari efek bahaya radikal bebas oksigen reaktif. Antioksidan cenderung bereaksi dengan radikal bebas terlebih dahulu dibandingkan dengan molekul yang lain. Hal ini dikarenakan antioksidan sangat mudah teroksidasi atau bersifat reduktor kuat dibandingkan dengan molekul lain. Keefektifan antioksidan bergantung pada seberapa kuat daya oksidasinya dibanding dengan molekul lain. Semakin mudah teroksidasi maka semakin efektif antioksidan tersebut (Khaira 2010).



SIMPULAN Ekstrak dari bagian tumbuhan kembang telang yaitu akar, batang, daun, dan bunga terbukti memiliki aktivitas antioksidan yang dibuktikan melalui metode DPPH. Nilai IC50 dari ekstrak bunga kembang telang yaitu 561.63 ppm, sedangkan nilai IC50 dari asam askorbat yaitu 7.133 ppm. Nilai IC50 dari ekstrak bunga tumbuhan kembang telang didapatkan lebih besar daripada IC50 asam askorbat, sehingga aktivitas antioksidan ekstrak bunga didapatkan lebih kecil daripada aktivitas antioksidan asam askorbat.



DAFTAR PUSTAKA Handayani V, Ahmad AR, Sudir M. 2014. Uji aktivitas antioksidan ekstrak metanol bunga dan daun patikala (Etlingera elatior (Jack) R.M.Sm) menggunakan metode DPPH. Pharm Sci Res. 1(2): 86-94. Khaira K. 2010. Menangkal radikal bebas dengan antioksidan. Jurnal Saintek. 2(2): 183-187. Maesaroh K, Kurnia D, Anshori JA. 2018. Perbandingan metode uji aktivitas antioksidan DPPH, FRAP, dan FIC terhadap asam askorbat, asam galat, dan kuersetin. Chimica et Natura Acta. 6(2): 93-100. Najihudin A, Chaerunisaa A, Subarnas A. 2017. Aktivitas antioksidan ekstrak dan fraksi kulit batang trengguli (Cassia fistula L) dengan metode DPPH. Jurnal Sains dan Teknologi Informasi Indonesia. 4(2): 70-79. Ridho EA. 2013. Uji aktivitas antioksidan ekstrak methanol buah lakum (Cayratia trifolia) dengan metode DPPH (2,2-difenil-1-pikrilhidrazil) [skripsi]. Pontianak (ID): Universitas Tanjungpura. Rosahdi TD, Kusmiyati M, Wijayanti FR. 2013. Uji aktivitas daya antioksidan buah rambutan rapiah dengan metode DPPH. Jurnal ISTEK. 7(1): 22-37. Tristantini D, Ismawati A, Pradana BT, Jonathan JG. 2016. Pengujian aktivitas antioksidan menggunakan metode DPPH pada daun tanjung (Mimusops elengi L). Yogyakarta (ID): Universitas Indonesia.



LAMPIRAN Lampiran 1 Kurva sampel ekstrak batang kembang telang 60% 50% 40%



y = 0.1983ln(x) - 0.8212 R² = 0.9693



30% 20% 10%



0% 0



200



400



600



800



1000



Lampiran 2 Kurva sampel ekstrak daun kembang telang 60% 50% 40% y = 0.2248ln(x) - 1.0427 R² = 0.9184



30% 20% 10% 0%



0



200



400



600



800



1000



Lampiran 3 Kurva sampel ekstrak akar kembang telang 80%



y = -0.289ln(x) + 1.9541 R² = 0.5



60% 40%



20% 0% 0 -20% -40%



200



400



600



800



1000