03 Uks & Aplikasi KCKT [PDF]

Citation preview

UKS & Aplikasi KCKT Anfisko 2 Apt.



Winasih Rachmawati, M.Si.,



UKS KCKT  Uji kesesuaian sistem harus dilakukan secara rutin karena untuk memastikan keefektifan sistem operasional akhir (Ditjen POM, 1995).  Suatu sistem dikatakan sesuai jika memenuhi persyaratan presisi, resolusi (daya pisah), faktor ikutan, efisiensi kolom dan faktor kapasitas.



Efisiensi kolom Ukuran efisiensi  kolom adalah jumlah lempeng (plate number, N) yang didasarkan pada konsep lempeng teoritis pada distilasi. Nilai yang baik N>2000    tR       : waktu retensi solut Wb      : lebar dasar puncak



N dipengaruhi oleh: a. lebar pita (W). Makin kecil W, N makin besar, karena itu N mjd ukuran baik/tidaknya kolom b. ukuran butir c. distribusi ukuran butir d. sifat butir (porous penuh/pelikuler)



Kapasitas kolom



k´ = faktor kapasitas tR =  merupakan waktu retensi solut  tM = waktu retensi fase gerak (waktu retensi solut yang tidak tertahan sama sekali)



Resolusi (daya pisah)



 Resolusi didefinisikan sebagai perbedaan antara waktu retensi dua puncak yang saling berdekatan.  Nilai Rs harus mendekati atau lebih dari 1,5 karena akan memberikan pemisahan puncak yang baik (base line resolution). tR = waktu retensi (menit) W = lebar puncak



Ada 3 langkah utk memperoleh Rs tinggi: 1. Harga factor kapasitas (k’), 1-5 dg eluen sesuai 2. Harga faktor selektifitas (α), dg eluen lain, tetapi kekuatan elusi sama/dg eluen ketiga sbg aditif (mengubah buffer, menambah garam, pasangan ion). 3. Harga N, dg cara mengurangi laju alir eluen,menggunakan kolom yg lebih panjang, menggunakan butir kolom lebih kecil.



Faktor ikutan (tailing factor)  Jika puncak yang akan dikuantifikasi asimetri (tidak setangkup), maka suatu perhitungan asimetrisitas merupakan cara yang berguna untuk mengontrol atau mengkarakterisasi sistem kromatografi.



 Peningkatan puncak yang asimetri akan menyebabkan penurunan resolusi, batas deteksi, dan presisi.



TF =1 menunjukkan bahwa kromatogram tersebut bersifat setangkup atau simetris Harga TF lebih dari 2 menunjukkan bahwa kromatogram f2



mengalami



pengekoran



(tailing).  Semakin besar harga TF maka kolom yang dipakai semakin kurang efisien.



 TF =



Penyebab tailing



1. Guard coloum yang sudah mulai rusak. 2. Fase gerak yang mulai rusak. 3. Partikel silika ang dipakai di dalam bahan pendukung bukanlah partikel silika yang baik 4. Adanya komponen lain yang keluar tepat setelah peak  gunakan 2 PG



Aplikasi KCKT



Analisis Kualitatif



 HPLC digunakan untuk analisa kualitatif didasarkan pada waktu retensi untuk identifikasi.  Identifikasi dapat diandalkan apabila waktu retensi sampel dibandingkan dengan larutan standar adalah sama.



Waktu retensi (menit) Laju alir (mL/m enit) 1,10 1,20 1,30



Vit. C 1,38 3 1,27 8 1,17 4



Ruti n 9,56 2 8,85 0 8,65 6



Faktor ikutan



Vit. C 2,30 8 1,20 1 3,18 1



Rutin 1,12 7 0,90 7 1,43 3



Lempeng teoritis (N)



Vit. C 5610,1 8 3335,7 1 8724,5 0



Rutin 108650 ,21 71042, 18 80050, 17



Reso lusi



Fakto r kapa sitas



(k’) 12,3



5,25



4,28



13,34



5,78



15,52



• Larutan baku vitamin C diinjeksikan sebanyak 20 µL • Dilihat waktu retensi munculnya kromatogram vitamin C dimana muncul pada 1,267 menit



Analisis kuantitatif Beberapa hal yang harus diperhatikan agar HPLC dapat dipergunakan untuk penentuan secara kuantitatif adalah:  Parameter percobaan sama antara standar dan sampel  Penentuan berdasarkan waktu retensi sampel dan standar yang sama  Penentuan kadar dilakukan berdasarkan: - hubungan (korelasi) dengan menggunakan larutan standar seri pada waktu retensi tertentu.



- Berdasarkan area kromatogram - Berdasarkan tinggi puncak kromatogram



menggunakan larutan standar seri



C (µg/mL)



Luas Area



5,06



84568



7,08



161379



9,10



231710



11,12



313340



13,15



374144



y = 36161,72x - 96094 r = 0,9992



Penggunaan metode KCKT untuk Analisis Obat (sediaan) Adrenalin (injeksi)



Fase Diam C18



Fase Gerak



Detektor



MeOH:buffer posfat pH 3,8 UV 280 nm (380:620)



Aldosteron (urin)



Silika



Metanol 1,5% dalam CHCl3 UV 254 nm (50% dijenuhi air)



Allopurinol (tablet)



As. Benzoat dan as. salisilat



C18; 4x30



KH2PO4 0,05M; 1,5



cm



mL/men



C18



Metanol-KH2PO4 0,0M pH 6,2 (10:90)



UV 254 nm



UV 254 nm



Penggunaan metode KCKT untuk Analisis Obat (sediaan)



Fase Diam



Fase Gerak



Detektor



Asetaminofen + difenhidramin sitrat (tablet)



C8 (35oC)



H2O-MeOH (3:2)



UV 254 nm



Difenhidramin (tablet)



C8



Asetonitril-1heptansulfonat-as.asetat (70:30:1)



UV 258 nm



Fenitoin (injeksi)



C18



MeOH-Air (55:45)



UV 254 nm



Kafein (serbuk)



Silika



CH2Cl2-MeOH (NH4OH 1%) (98:2)



UV 254 nm



Penggunaan metode KCKT untuk Analisis Obat (sediaan)



Fase Diam



Fase Gerak



Detektor



Kotrimazol (salep)



C18, Nucleosil



MeOH-H2O (9:1); 1 mL/men UV 258 nm



Ketoprofen (gel)



C18, hypersil 5μm



CH3CN-fosfat pH 3,0 (2:3)



Metamfetamin (serbuk)



Silika



CH2Cl2-MeOH (NH4OH 1%) UV 254 nm (4:1)



Pilokarpin (optalmik sol)



Silika



N-heksan-NH4OH 2% dlm isopropilalkohol (3:7)



UV 220 nm



Vitamin B1 (serbuk)



C18, Bondapak



MeOH-asetat 5mM pH 5,0 (28:72); 1,5 mL/men



Fluororesen Eks: 370 nm Em: 430 nm



UV 254 nm



Beberapa aplikasi HPLC dalam kehidupan 1)   HPLC dengan prinsip kromatografi banyak digunakan pada industri farmasi dan pestisida. 2)   Zat- zat dengan kepolaran berbeda yaitu antara sedikit polar sampai polar dapat dipisahkan dengan HPLC berdasarkan partisi cair-cair. 3)   Asam-asam nukleat dapat dipisahkan dengan kolom penukar ion yang dikombinasikan dengan kolom butiran berlapis zat berpori. 4)   Morfin, heroin dan semacamnya telah dapat dipisahkan dengan rezin Zipax-SAX. 5)   Dapat memisahkan vitamin-vitamin yang larut dalam air. 6)   Digunakan untuk menentukan berat molekul polimer dan masalah-masalah biokimia. 7) Digunakan untuk memisahkan golongan-golongan terpenoid, segala jenis senyawa fenol, alkaloid, lipid dan gula. 8) HPLC cocok digunakan untuk memisahkan minyak atsiri. Minyak atsiri terdiri atas campuran yang sangat rumit menjadi golongan-golongan senyawa atau memisahkan golongan senyawa menjadi komponen-komponennya.



Terima kasih