Modul KCKT - Siswa [PDF]

Citation preview

2022 Modul Analisa Instrumen Kelas XIII Semester Genap KROMATOGRAFI CAIR KINERJA TINGGI



Yotie Kurnia Tunika, S.Si. Kompetensi Keahlian Kimia Analisis



Modul Kromatografi Cair Kinerja Tinggi



SMK Negeri 1 Temanggung 1



BAB I. PENDAHULUAN A. Deskripsi Modul Pemisahan



suatu



campuran



menjadi



komponen-komponennya



merupakan hal yang utama dalam ilmu kimia, terutama untuk analisa komponen.



Selain



dalam



bidang



kimia,



pemisahan



komponen



dari



campurannya juga digunakan sebagai pemecahan masalah bidang ilmu lain, misalnya dalam bidang farmasi digunakan untuk penentuan kadar suatu komponen dalam obat. Metode kromatografi merupakan salah satu metode yang dapat digunakan untuk memisahkan komponen-komponen dari campurannya. Pada kromatografi modern yang sudah menggunakan instrumentasi, pemisahan komponen menjadi campurannya dapat berlangsung sangat cepat, efektif, dan efisien. Baik komponen yang volatil maupun non volatil dapat dipisahkan dan dianalisa menggunakan metode kromatografi. Minyak atsiri, protein, zat warna sintesis, bahan tambahan makanan, komponen dalam obat, dan sebagainya dapat dipisahkan dan dianalisa dengan cepat menggunakan metode kromatografi. Kromatografi



Cair



Kinerja



Tinggi



(High



Performance



Liquid



Chromatography/HPLC) merupakan suatu teknik kromatografi dimana proses pemisahan terjadi di dalam suatu kolom dengan fasa gerak berupa zat cair dan pemisahan dilakukan pada tekanan tinggi. Fasa diam ditempatkan di dalam kolom kemudian zat cair (eluen) dialirkan ke dalam kolom bersama-sama dengan komponen yang akan dipisahkan. Komponen terpisah berdasarkan afinitasnya terhadap fasa gerak dan fasa diam di dalam kolom pada tekanan tinggi. Berkebalikan dengan kromatografi gas, KCKT/HPLC ini dapat digunakan untuk memisahkan komponen yang bersifat tidak mudah menguap (non volatil). Sampel yang tidak bisa dipisahkan dan dianalisa dengan kromatografi gas karena tidak stabil dan mudah rusak pada suhu tinggi dapat dipisahkan dan dianalisa menggunakan kromatografi jenis ini. Modul ini memuat materi tentang KCKT/HPLC beserta aplikasinya. Modul ini juga memuat kegiatan pengolahan data hasil analisa dengan KCKT/HPLC. Tujuan dari pengolahan data adalah menganalisis data untuk



Modul Kromatografi Cair Kinerja Tinggi



2



kemudian



diasosiasi



menjadi



suatu



kesimpulan



untuk



menguatkan



pemahaman materi Anda serta untuk mengembangkan ketrampilan dalam melakukan analisa di data dan bekerja sama dalam sebuah kelompok.



B. Prasyarat Guna mempermudah pemahaman materi KCKT/HPLC dengan baik, maka terlebih dahulu Anda harus menguasai materi tentang kromatografi dan kromatografi kolom.



C. Petunjuk Penggunaan Modul Sebelum



mempelajari



modul



KCKT/HPLC



ini,



Anda



harus



memperhatikan petunjuk penggunaan modul berikut untuk memperoleh hasil yang optimal. 1. Modul berisi : Pendahuluan ( Deskripsi, Prasyarat, Petunjuk penggunaan Modul, Garis Besar Isi Modul), Pembelajaran (Tujuan Pembelajaran, Rencana Belajar, Uraian Materi, Rangkuman, Latihan, Kunci Jawaban Latihan dan Umpan Balik), Penutup, Tes Formatif, Kunci Jawaban tes Formatif, Umpan Balik, Glosarium dan Daftar Pustaka. 2. Modul ini terdiri dari 2 Kegiatan Belajar. a. Kegiatan Belajar ke-1 berisi materi KCKT/HPLC b. Kegiatan Belajar ke-2 berisi materi Penerapan dan Pengolahan Data Analisa Menggunakan KCKT/HPLC 3. Memahami petunjuk belajar sehingga memperoleh hasil yang optimal. a. Petunjuk bagi guru Dalam kegiatan pembelajaran menggunakan modul KCKT/HPLC ini, guru mempunyai peran : 1) Membimbing siswa dalam kegiatan pengamatan,dan melatih siswa untuk mengajukan pertanyaan dengan mengajukan terlebih dahulu pertanyaan dalam modul untuk selanjutnya merangsang siswa untuk menjawab sebuah analisa dari sebuah pengamatan. 2) Membimbing siswa dalam melakukan observasi yaitu kegiatan mengumpulkan data, mengasosiasi dan mengkomunikasikan data sesuai dengan kegiatan belajar dalam modul. 3) Membimbing siswa dalam memahami materi, mengerjakan latihan soal dan tes formatif.



Modul Kromatografi Cair Kinerja Tinggi



3



4) Mengorganisasi siswa dalam kegiatan kelompok belajar untuk kegiatan



praktikum,



menganalisis



data,



mengasosiasi



dan



menyajikan



hasil



mengkomunikasikan data. 5) Membimbing



siswa



mempresentasikan



dan



praktikum.



b. Petunjuk bagi Siswa Dalam kegiatan pembelajaran menggunakan modul KCKT/HPLC ini, siswa diharapkan : 1) Memahami tujuan pembelajaran yang akan dicapai. 2) Membaca “Rencana Belajar” yang terdapat dalam setiap “Kegiatan Belajar” sebelum mulai mempelajari materi dalam modul. 3) Memahami dan melakukan bagian-bagian dalam modul 4) Mengerjakan latihan soal yang terdapat pada akhir kegiatan belajar dan tes formatif untuk mengetahui tingkat pemahaman materi terhadap materi yang telah dipelajari dan mencocokkan jawabannya dengan kunci jawaban pada modul tersebut. 5) Mengukur kemampuan memahami materi dengan umpan balik yang ada dalam tiap kegiatan belajar. 6) Mengulangi lagi kegiatan belajar atau bertanya pada guru jika belum menguasai level materi yang diharapkan. 7) Melanjutkan mempelajari kegiatan belajar selanjutnya apabila telah menguasai materi yang dipelajari.



D. Tujuan Akhir Setelah mempelajari modul ini diharapkan Anda dapat menjelaskan teknik preparasi sampel dan standar untuk KCKT/HPLC serta prinsip, konsep, dan prosedur KCKT/HPLC beserta pengolahan data hasil analisa dengan KCKT/HPLC.



E. Cek Kemampuan No. 1.



Pertanyaan



Ya



Tidak



Dapatkah Anda menyebutkan macam-macam KCKT/HPLC?



Modul Kromatografi Cair Kinerja Tinggi



4



No. 2.



Pertanyaan



Ya



Tidak



Dapatkan Anda menjelaskan teknik preparasi sampel dan standar untuk analisa dengan KCKT/HPLC?



3.



Dapatkah Anda menjelaskan prinsip kerja KCKT/HPLC?



4.



Dapatkan Anda menggambarkan rangkaian instrumentasi KCKT/HPLC?



5.



Dapatkah Anda menjelaskan mekanisme kerja KCKT/HPLC?



6.



Dapat Anda mengolah dan menyimpulkan data hasil analisa dengan KCKT/HPLC?



F. Peta Konsep



PRINSIP



PENYIAPAN SAMPEL DAN PEMILIHAN FASA DIAM DAN FASA GERAK DAN ADSORBEN RANGKAIAN/KOMPONEN INSTRUMEN



KCKT/HPLC



MEKANISME PEMISAHAN



IDENTIFIKASI KOMPONEN/ANALISA DATA



Modul Kromatografi Cair Kinerja Tinggi



5



BAB II. PEMBELAJARAN



A. Kompetensi Inti 1. Menghayati dan mengamalkan ajaran agama yang dianutnya. 2. Menghayati dan mengamalkan perilaku jujur, disiplin, tanggung jawab, peduli (gotong-royong, kerjasama, toleran, damai), santun, responsif dan proaktif dan menunjukkan sikap sebagai bagian dari solusi atas berbagai permasalahan dalam berinteraksi secara efektif dengan lingkungan sosial dan alam serta dalam menempatkan diri sebagai cerminan bangsa dalam pergaulan dunia. 3. Memahami,



menerapkan,



menganalisis



dan



mengevaluasi



pengetahuan faktual, konseptual,prosedural, dan metakognitif dalam ilmu pengetahuan, teknologi, seni, budaya, dan humaniora dengan wawasan kemanusiaan, kebangsaan, kenegaraan, dan peradaban terkait penyebab fenomena dan kejadian dalam bidang kerja yang spesifik untuk memecahkan masalah. 4. Mengolah, menalar, dan menyaji, dan mencipta dalam ranah konkret dan ranah abstrak



terkait dengan pengembangan dari yang



dipelajarinya di sekolah secara mandiri, dan mampu melaksanakan tugas spesifik di bawah pengawasan langsung.



B. Kompetensi Dasar Pengetahuan 3.25 Menerapkan prosedur analisis KCKT 3.26 Menerapkan penggunaan alat KCKT 3.27 Menganalisis hasil analisis KCKT



C. Kompetensi Dasar Ketrampilan 4.25



Melaksanakan analisis KCKT



4.26



Mengoperasikan alat KCKT



4.27



Membuat laporan hasil analisis KCKT



Modul Kromatografi Cair Kinerja Tinggi



6



KEGIATAN BELAJAR 1 KROMATOGRAFI CAIR KINERJA TINGGI (HIGH PERFORMANCE LIQUID CHROMATOGRAPHY)



A. Tujuan Pembelajaran Setelah mengkaji materi dalam modul KCKT/HPLC pada Kegiatan Belajar ke-1 ini, diharapkan Anda dapat : 1. Mengidentifikasi jenis sampel untuk analisa KCKT 2. Menerapkan persiapan alat dan bahan untuk analisa dengan KCKT/HPLC 3. Mengidentifikasi komponen dan cara pengoperasian KCKT 4. Menerapkan cara pengoperasian KCKT 5. Menganalisis data spektrum kromatografi cair kinerja tinggi 6. Membuat kesimpulan berdasarkan data spektrum kromatografi cair kinerja tinggi 7. Melaksanakan preparasi sampel untuk analisa KCKT 8. Menyiapkan standar yang dibutuhkan untuk analisa KCKT 9. Memilah kompen KCKT 10. Mengoperasikan KCKT 11. Mengadministrasi data spektrum kromatografi cair kinerja tinggi 12. Melaporkan data spektrum kromatografi cair kinerja tinggi



B. Rencana Belajar 1. Kegiatan Belajar ke-1 dalam modul ini berisi materi tentang Kromatografi Cair Kinerja Tinggi (KCKT) 2. Modul ini harus diselesaikan dalam waktu 24 jam pelajaran, atau 24 x 45 menit dalam proses pembelajaran di kelas atau dua minggu kegiatan belajar mandiri di rumah. 3. Jika Anda sudah selesai mempelajari Kegiatan Belajar ke-1, maka kerjakanlah latihan soal yang terdapat pada “Tugas Mandiri “ kemudian cocokkanlah jawaban Anda dengan “Kunci Jawaban” dan “Umpan Balik” yang terdapat pada akhir modul “Kegiatan Belajar ke-1”. 4. Berdasarkan hasil “Umpan Balik” tersebut, lakukanlah evaluasi diri terhadap pemahaman materi yang sudah Anda pelajari.



Modul Kromatografi Cair Kinerja Tinggi



7



C. Uraian Materi



HPLC/KCKT



(High



Performance



Liquid



Chromatography/



Kromatografi Cair Kinerja Tinggi) merupakan suatu metode pemisahan dengan kromatografi modern dimana fasa gerak yang digunakan adalah zat cair yang dialirkan melalui fasa diam dengan bantuan pompa bertekanan tinggi agar proses analisa dapat berjalan dengan cepat. Solut/komponen yang terikat lemah terhadap fasa diam akan keluar lebih dulu dari kolom dan mencapai detektor lebih cepat. Sebaliknya, komponen yang terikat kuat terhadap fasa diam akan tertahan dan membutuhkan waktu lebih lama untuk keluar dari kolom dan mencapai detektor. Instrumentasi HPLC dapat dilihat pada Gambar 1.



Gambar 1. Instrumentasi HPLC Sumber: http://lansida.blogspot.co.id/2010/07/hplc-kromatografi-cair-kinerjatinggi.html (22-08-2017)



HPLC ini digunakan untuk analisa komponen yang bersifat tidak mudah menguap dan tidak stabil pada suhu tinggi. Hal ini dikarenakan pada HPLC, suhu yang digunakan adalah suhu kamar. Proses analisa yang cepat karena adanya bantuan pompa bertekanan tinggi untuk mengalirkan eluen dan komponen.



Jenis-jenis HPLC 1. Kromatografi Adsorbsi Kromatografi jenis ini digunakan untuk memisahkan komponen dengan prinsip adsorbsi. Menurut Abdul Rohman (2009: 117), fasa diam yang digunakan merupakan zat padat polar, biasanya menggunakan silika atau alumina, sehingga disebut sebagai kromatografi fasa normal.



Modul Kromatografi Cair Kinerja Tinggi



8



Sumar Hendayana (2010: 78) menyebutkan bahwa gugus-gugus polar silanol pada silika dan aluminol pada alumina bertindak sebagai tempat-tempat adsorbsi untuk molekul-molekul polar. Fasa gerak yang digunakan adalah pelarut-pelarut yang bersifat non polar. Pada kromatografi jenis ini, untuk mengontrol retensi solut, biasanya ditambahkan sedikit senyawa polar pada fasa gerak sebagai modifier. Modifier ini akan bersaing dengan molekul-molekul komponen untuk merebut tempat adsorbsi. Waktu retensi dapat diperpendek dengan menaikkan konsentrasi modifier (Sumar Hendayana, 2010: 78).



2. Kromatografi Partisi Kromatografi partisi analog dengan ekstraksi cair-cair. Fasa gerak yang digunakan lebih polar dari pada fasa diam sehingga termasuk ke dalam kromatografi fasa terbalik. Pada kromatografi ini, fasa diam yang berupa zat cair non polar hanya dilapiskan sehingga fasa gerak harus tidak bercampur dengan fasa diam (fasa gerak bersifat bersifat polar). Kekurangan dari kromatografi jenis ini adalah keterbatasan selektivitas sebagai akibat dari ketidakcampuran kedua fasa. Beberapa senyawa dapat terikat sangat kuat dalam salah satu fasa sehingga beberapa senyawa dapat tertahan kuat atau sama sekali tidak tertahan pada fasa diam (Sumar Hendayana, 2010: 79).



3. Kromatografi Fasa Terikat Teknik kromatografi jenis ini menggunakan fasa diam non polar yang terikat secara kimia pada suatu padatan dengan fasa gerak berupa senyawa polar, sehingga disebut sebagai kromatografi fasa terbalik. Menurut Abdul Rohman (2009: 118), fase terikat terdiri dari silika yang dimodifikasi dengan hidrokarbon-hidrokarbon non polar, seperti oktadesilsilana, oktasilana, atau fenil. Fasa diam yang paling populer digunakan adalah oktadesilsilana (ODS atau C18). Menurut Sumar Hendayana (2010: 79), kelebihan kromatografi jenis ini adalah: -



Fasa terikat bersifat stabil dari pada fasa diam yang hanya dilapiskan secara fisik pada kromatografi partisi



-



Kepolaran fasa gerak dapat diubah selama proses pemisahan berlangsung



apabila



keolaran



komponen



yang



dianalisa



bervariasi



Modul Kromatografi Cair Kinerja Tinggi



9



-



Kolom memiliki umur yang relatif lebih panjang dengan keterulangan waktu retensi yang baik



-



Lebih ekonomis



-



Penggunaannya lebih luas



4. Kromatografi Penukar Ion Kromatografi penukar ion merupakan teknik pemisahan campuran ionion atau molekul yang dapat diionkan. Ion-ion cuplikan akan bersaing dengan ion-ion fasa gerak untuk memperebutkan tempat berikatan pada fasa diam. pH fasa gerak dapat divariasikan untuk mengontrol derajat ionisasi (Sumar Hendayana, 2010: 79). Terdapat dua macam kromatografi penukar ion: 1)



Kromatografi Penukar Anion Kromatografi ini digunakan apabila komponen yang dianalisa adalah anion, fasa diam yang digunakan merupakan resin kation



2)



Kromatografi Penukar Kation Sebaliknya, kromatografi ini digunakan apabila komponen yang dianalisa merupakan kation dan fasa diam yang digunakan adalah resin anion



5. Kromatografi Eksklusi Ukuran Kromatografi ini disebut juga dengan kromatografi permeasi gel. Menurut Abdul Rohman (2009: 120), fase diam yang digunakan pada kromatografi jenis ini berupa silika atau polimer yang bersifat porous sehingga komponen dapat melewatinya, atau berdifusi lewat fase diam. Molekul solut yang memiliki BM lebih besar akan terselusi lebih dahulu, kemudian



diikuti



dengan



molekul-molekul



berukuran



medium.



Sementara molekul yang terakhir keluar adalah molekul yang berukuran lebih kecil. Hsl ini disebabkan solut dengan BM yang besar tidak melewati porous, akan tetapi lewat di antara partike fasa diam. Dengan demikian, pada kromatografi jenis ini tidak ada interaksi kimia antara komponen yang dianalisa dengan fasa diam sebagaimana halnya jenis kromatografi yang lain.



Modul Kromatografi Cair Kinerja Tinggi



10



Instrumentasi HPLC Instrumentasi HPLC tidak jauh berbeda dengan kromatografi gas. Yang membedakan adalah terdapatnya pompa bertekanan tinggi yang akan mempercepat laju alir fasa gerak. Gambaran rangkaian instrumentasi HPLC dapat dilihat pada Gambar 2.



Gambar 2. Rangkaian instrumentasi HPLC Sumber: http://pendidikankimia1bkelompok12uinjakarta.blogspot.co.id/ 2015/09/kromatografi.html (20-09-2017)



1. Fasa Gerak Fasa gerak pada HPLC ditempatkan dalam suatu wadah yang bersih dan bersifat inert. Botol reagen kosong atau labu laboratorium bisa digunakan sebagai wadah. Wadah yang digunakan biasanya dapat menampung fasa gerak antara 1-2 liter (Abdul Rohman, 2009: 111).



Menurut Sumar Hendayana (2010: 84), fasa gerak yang digunakan pada HPLC harus memiliki syarat-syarat sebagai berikut: 1)



Dapat bertindak sebagai pelarut yang baik untuk cuplikan yang akan dianalisis (dapat melarutkan komponen cuplikan)



2)



Bersifat murni, terbebas dari pengotor yang dapat mengganggu interpretasi kromatogram.



3)



Dalam keadaan jernih untuk menghindari penyumbatan pada kolom. Biasanya pelarut disaring dengan penyaring nilon berukuran diameter pori 0,4 µm. Pompa vakum biasanya digunakan



untuk



menyaring



partikel



Modul Kromatografi Cair Kinerja Tinggi



kotoran



sekaligus



11



menghilangkan gas dari pelarut karena gas dapat mengganggu base line. 4)



Mudah diperoleh, murah, tidak mudah terbakar, tidak beracun.



5)



Tidak kental, kekentalan tidak melebihi 0,5 cP (centi Poise)



6)



Sesuai dengan detektor. Untuk detektor refractive index pelarut harus memiliki indeks bias yang berbeda dengan cuplikan. Untuk detektor UV, pelarut tidak boleh menyerap cahaya pada panjang gelombang yang dipakai.



Berdasarkan kepolaran fasa diam dan fasa gerak, HPLC digolongkan mejadi: (1)



HPLC Fasa Normal Pada HPLC jenis ini, fasa diam yang digunakan bersifat polar dan fasa gerak yang digunakan bersifat non polar, sementara cuplikan yang akan dipisahkan bersifat non polar. Menurut Sumar Hendayana (2010: 85), fasa diam yang biasa digunakan adalah silika, alumina, atau zat cair polar trietilenaglikol yang dilapiskan pada partikel silika. Sedangkan fasa gerak yang digunakan adalah seperti heksana atau i-propileter.



(2)



HPLC Fasa Terbalik Pada HPLC jenis ini, fasa diam yang digunakan bersifat non polar dan fasa gerak yang digunakan bersifat polar, sementara cuplikan yang akan dianalisa bersifat polar. Sumar Hendayana (2009: 85) menyebutkan bahwa fasa gerak yang biasa digunakan pada HPLC jenis ini adalah campuran metanol atau asetonitril dalam air dengan berbagai perbandingan.



Pemilihan fasa gerak yang akan digunakan pada HPLC biasanya didasarkan atas eksperimen trial and error dengan berbagai jenis dan komposisi pelarut hingga diperoleh kromatogram yang diharapkan.



2. Pompa Pompa yang terdapat pada HPLC ini berfungsi untuk mengalirkan fasa gerak melalui kolom yang berisi serbuk halus fasa diam/penyokong fasa diam. Menurut Sumar Hendayana (2010: 87), pompa yang digunakan dalam HPLC harus memenuhi syarat sebagai berikut:



Modul Kromatografi Cair Kinerja Tinggi



12



1) Menghasilkan tekanan sampi 600 psi (pons/in2) 2) Keluaran bebas pulsa 3) Kecepatan alir berkisar 0,1-10 mL/menit 4) Bahan tahan korosi



Pompa pada HPLC terdapat 3 jenis, yaitu: (1) Pompa Reciprocating Jenis pompa ini paling banyak digunakan, terdiri dari ruangan kecil tempat pelarut yang dipompa dengan cara gerakan piston maju mundur yang dijalankan oleh motor. Piston berupa batang gelas dan berkontak langsung dengan pelarut. Ketika piston mundur, maka bola gelas bawah terangkat dan pelarut masuk. Sebaliknya ketika piston maju, maka bola bawah menutup saluran pelarut dan pelarut yang telah berada di ruang pompa didorong masuk ke dalam kolom. Gerakan piston mundur dan maju terjadi secara terus menerus sehingga memberikan aliran eluen yang konstan. Pompa ini menghasilkan pulsa (sinyal listrik) yang dapat mengganggu base line kromatogram



sehingga



dipasang



peredam



pulsa



untuk



menghilangkan gangguan base line (Sumar Hendayana, 2010: 88).



Gambar 3. Rangkaian pompa reciprocating Sumber: https://tewewe.wordpress.com/2012/09/05/hplc/ (22-082017) (2) Pompa Displacement Pompa ini menyerupai syringe (alat suntik) yang terdiri dari tabung yang dilengkapi dengan pendorong yang digerakkan oleh motor. Pompa ini juga menghasilkan aliran yang cenderung tidak bergantung tekanan balik kolom dan viskositas pelarut. Keluaran



Modul Kromatografi Cair Kinerja Tinggi



13



pompa ini bebas pulas, tetapi pelarutnya terbatas (250 mL) dan tidak mudah melakukan pergantian pelarut (Sumar Hendayana, 2010: 88).



(3) Pompa Pneumatic Pompa ini menggunakan gas bertekanan tinggi untuk mendorong pelarut. Pompa jenis ini murah dan bebas pulsa, akan tetapi mempunyai keterbatasan kapasitas dan tekanan yang dihasilkan. Kecepatan alir bergantung pada viskositas pelarut dan tekanan balik kolom (Sumar Hendayana, 2010: 89).



3. Sistem Injeksi Sampel Pemasukan cuplikan memegang peranan penting pada keberhasilan pengujian dengan HPLC. Hal ini disebabkan keterulangan pemasukan cuplikan ke dalam packing column mempengaruhi ketidaktepatan pengukuran HPLC. Untuk mengatasinya, cuplikan yang dimasukkan harus



sekecil



mungkin



(beberapa



puluh



mikrliter)



dan



saat



memasukkan cuplikan ke dalam fasa gerak tekanannya tidak boleh menurun. Sumar Hendayana (2010: 89) menyebutkan bahwa terdapat beberapa teknik pemasukan cuplikan ke dalam sistem HPLC, yaitu: 1) Injeksi syringe Sistem injeksi ini adalah sistem injeksi yang pertama kali digunakan pada HPLC. Sampel dimasukkan ke dalam aliran fasa gerak menggunakan syringe melalui septum (seal karet). Syringe ini dirancang untuk tahan terhadap tekanan hingga 1500 psi. Akan tetapi keterulangan injeksi syringe ini tidak begitu bagus. 2) Injeksi “stop-flow” Sistem injeksi ini juga menggunakan syringe. Cuplikan dimasukkan dengan cara menghentikan sementara aliran pelarut kemudian sambungan pada ujung kolom dibuka dan cuplikan disuntikkan langsung ke dalam ujung kolom. Setelah itu kolom disambungkan kembali dan aliran pelarut dijalankan kembali.



Modul Kromatografi Cair Kinerja Tinggi



14



3) Kran cuplikan/Loop Valve Sistem pemasukan cuplikan ini paling sering dipakai. Menurut Sumar Hendayana (2010: 90), untuk memasukkan cuplikan ke dalam aliran fasa gerak diperlukan dua tahap, yaitu: a) Sejumlah volume cuplikan disuntikkan ke dalam loop dalam posisi “load”. Pada tahap ini cuplikan masih berada di loop b) Kran diputar untuk mengubah posisi “load” menjadi posisi “injeksi” dan fasa gerak membawa cuplikan ke dalam kolom.



Gambar 4. Sistem injeksi sampel pada HPLC Sumber: https://tewewe.wordpress.com/2012/09/05/hplc/ (23-082017)



Pada sistem injeksi ini loop dapat diganti-ganti dan tersedia dalam berbagai ukuran volume mulai dari 5 µL hingga 500 µL. Loop mikro tersedia dalam ukuran volume 0,5-5 µL. Sistem injeksi ini memungkinkan memasukkan cuplikan pada tekanan 7000 psi dengan ketelitian tinggi.



4. Kolom Kolom HPLC biasanya terbuat dari stainless steel, namun ada juga yang terbuat dari gelas berdinding tebal. Menurut Sumar Hendayana (2010: 91), HPLC menggunakan 2 jenis kolom, yaitu kolom pengaman (guard column) dan kolom utama. 1. Kolom Pengaman (Guard Column) Kolom ini disebut juga sebagai pra-kolom, diletakkan sebelum sistem pemasukan cuplikan. Kolom pengaman lebih pendek dari pada kolom utama, berukuran 5 cm dengan diameter 4,6 mm, dipak



Modul Kromatografi Cair Kinerja Tinggi



15



dengan partikel silika berukuran lebih besar dari ukuran partikel kolom utama. Fungsi kolom pengaman adalah: a) Menyaring kotoran yang terbawa oleh fasa diam b) Menjenuhkan fasa diam untuk menghindari terjadinya erosi fasa diam oleh aliran pelarut.



2. Kolom Utama (Guard Column) Kolom utama HPLC biasanya berukuran panjang, antara 5-30 cm dan diameter dalam berkisar4-10 mm. Kolom utama dikemas dengan partikel berukuran 3-10 µm dan diletakkan setelah sistem pemasukan cuplikan. Pemisahan campuran menjadi komponenkomponennya terjadi di kolom ini. Berdasarkan keperluannya, kolom utama dapat digunakan untuk analisis atau preparatif. Untuk keperluan preparatif, setiap komponen yang keluar dari kolom ditampung pada tabung yang berbeda, dan keluaran HPLC dihubungkan



dengan



fraction



colector



(Sumar



Hendayana,



2010:91).



Fase Diam Abdul Rohman (2009:115) menyebutkan bahwa fase diam pada HPLC berupa silika yang dimodifikasi secara kimiawi, silika yang tidak dimodifikasi, atau polimer-polimer stiren dan divinil benzen. Modifikasi silika dapat dilakukan dengan menggunakan reagen-reagen, seperti klorosilan, yang akan bereaksi dengan gugus silanol dan menggantinya dengan gugus fungsional yang lain. Fase diam yang paling banyak digunakan adalah Oktadesil silika (ODS atau C18) karena mampu memisahkan senyawa-senyawa dengan kepolaran rendah, sedang, maupun tinggi. Oktil atau rantai alkil yang lebih pendek lagi lebih sesuai untuk komponen yang polar. Silika-silika aminopropil dan sianopropil lebih cocok sebagai pengganti silika yang tidak dimodifikasi. Silika yang tidak dimodifikasi akan memberikan waktu retensi yang bervariasi karena adanya kandungan air (Abdul Rohman, 2009: 115).



Modul Kromatografi Cair Kinerja Tinggi



16



5. Detektor Terdapat berbagai detektor yang dapat digunakan untuk analisa dengan HPLC. Sumar Hendayana (2010: 93) menyebutkan bahwa detektor yang digunakan pada HPLC harus memenuhi syarat sebagai berikut: (1) Sensitif (2) Stabilitas dan keterulangan tinggi (3) Respon linear terhadap solut (4) Waktu respon pendek sehingga tidak bergantung pada kecepatan alir (5) Reliabilitas tinggi dan mudah digunakan (6) Tidak merusak cuplikan Abdul Rohman (2009:115) membagi detektor dalam HPLC menjadi 2 golongan, yaitu: a) Detektor universal/detektor umum, merupakan detektor yang mampu mendeteksi zat secara umum, tidak bersifat selektif dan tidak bersifat spesifik b) Detektor spesifik, detektor yang hanya mendeteksi analit secara spesifik dan selektif Skoog,



D.A.



(1985)



dalam



Sumar



Hendayana



(2010:



93)



mendeskripsikan karakter masing-masing detektor pada HPLC dalam Tabel 1. di bawah ini. Tabel 1. Karakteristik Detektor HPLC Dasar Jenis Maksimum Kepekaan Sensitivitas Pendeteksian Sensitivitas terhadap Suhu Kecepatan Alir -16 Absorbsi UV Spesifik 2 x 10 Tidak Rendah -6 Absorbsi IR Spesifik 10 Tidak Rendah Fluorometri Spesifik 10 -11 Tidak Rendah -7 Indeks bias Umum 1 x 10 Tidak + 10-4 oC -8 Konduktometri Spesifik 10 Ya 2% oC Spektrometri massa Umum 10 -10 Tidak Tidak ada Elektrokimia Spesifik 10 -12 Ya 1,5% oC Sumber: Sumar Hendayana (2010: 93)



Modul Kromatografi Cair Kinerja Tinggi



17



6. Recorder/Pengolah Data Recorder pada HPLC prinsipnya sama dengan recorder pada kromatografi gas. Recorder ini berfungsi untuk mengubah sinyal-sinyal listrik dari detektor menjadi puncak-puncak kromatogram yang selanjutnya dapat dicetak.



Mekanisme Kerja HPLC



Gambar 5. Skema kerja HPLC Sumber: http://lansida.blogspot.co.id/2010/07/hplc-kromatografi-cair-kinerjatinggi.html (22-08-2017) Pada HPLC, fasa gerak dialirkan dan didorong dengan tekanan tinggi, sementara sampel diinjeksikan melalui port injeksi. Sampel dan fasa gerak mengalir menuju kolom.



Campuran analit akan terpisah berdasarkan



kepolarannya. Kecepatan komponen untuk sampai ke detektor (disebut waktu retensi) akan berbeda bergantung pada afinitasnya terhadap fasa diam dan fasa gerak, hal ini akan teramati pada spectrum yang puncak-puncaknya terpisah dan terekam oleh detektor. R.A. Day, Jr. dan A.L. Underwood (2001: 557) menyebutkan dalam bukunya bahwa komposisi fasa gerak dalam HPLC memberikan suatu dimensi untuk manipulasi eksperimen yang tidak dijumpai dalam kromatografi gas. Ketika komposisi pelarut (fasa gerak) tidak berubah selama satu analisis, maka proses ini disebut sebagai elusi isokratik. Sebaliknya, apabila komposisi pelarut (fasa gerak) yang digunakan selama proses satu analisis adalah dua atau lebih pelarut yang berbeda dan dialirkan secara berurutan (tidak dialirkan secara bersama-sama) disebut sebagai elusi gradien.



Modul Kromatografi Cair Kinerja Tinggi



18



AYO DISKUSI 1. Jelaskan prinsip kerja HPLC! Jawaban : .......................................................................................... ........................................................................................................... ........................................................................................................... 2. Jelaskan cara memasukkan sampel yang benar ke dalam port injeksi agar tidak mempengaruhi hasil analisa! Jawaban : .......................................................................................... ........................................................................................................... ........................................................................................................... ........................................................................................................... ........................................................................................................... ........................................................................................................... 3. Jelaskan perbedaan kolom utama dan kolom pengaman! Jawaban : .......................................................................................... ........................................................................................................... ........................................................................................................... ........................................................................................................... ........................................................................................................... ........................................................................................................... 4. Jelaskan perbedaan fasa normal dan fasa terbalik! Jawaban : .......................................................................................... ........................................................................................................... ........................................................................................................... ........................................................................................................... ........................................................................................................... ........................................................................................................... ........................................................................................................... 5. Jelaskan mekanisme kerja HPLC! Jawaban : .......................................................................................... ........................................................................................................... ........................................................................................................... ........................................................................................................... ........................................................................................................... ...........................................................................................................



Modul Kromatografi Cair Kinerja Tinggi



19



6. Gambarkan rangkaian instrumentasi HPLC! Jawaban : .......................................................................................... ........................................................................................................... ........................................................................................................... ........................................................................................................... ........................................................................................................... ........................................................................................................... ........................................................................................................... ........................................................................................................... ........................................................................................................... ........................................................................................................... 7. Jelaskan perbedaan elusi gradien dan elusi isokratik! Jawaban : .......................................................................................... ........................................................................................................... ........................................................................................................... ........................................................................................................... ........................................................................................................... ........................................................................................................... ........................................................................................................... ........................................................................................................... 8. Sebutkan fungsi masing-masing komponen pada HPLC! Jawaban : .......................................................................................... ........................................................................................................... ........................................................................................................... ........................................................................................................... ........................................................................................................... ........................................................................................................... ........................................................................................................... ........................................................................................................... ........................................................................................................... ........................................................................................................... ........................................................................................................... ........................................................................................................... ........................................................................................................... ........................................................................................................... ........................................................................................................... ...........................................................................................................



Modul Kromatografi Cair Kinerja Tinggi



20



AYO KERJA KELOMPOK Acara Pembuatan Alat Peraga Rangkaian Instrumentasi HPLC



Tujuan 1. Membuat alat peraga rangkaian instrumentasi HPLC 2. Memahami mekanisme kerja HPLC dengan bantuan alat peraga yang telah dibuat



Alat dan Bahan (ditentukan oleh kelompok): 1. ................................................... 2. ................................................... 3. ................................................... 4. ................................................... 5. ................................................... 6. ................................................... 7. ...................................................



Prosedur



:



1. Siapkan alat dan bahan yang dibutuhkan! 2. Buatlah sketsa rancangan alat peraga! 3. Rangkailah alat peraga sesuai dengan kreativitas kelompok! 4. Peragakan proses kerja HPLC menggunakan alat peraga yang telah dibuat!



Sketsa Alat Peraga ....................................................................................................................... ....................................................................................................................... ....................................................................................................................... ....................................................................................................................... ....................................................................................................................... ....................................................................................................................... ....................................................................................................................... ....................................................................................................................... .......................................................................................................................



Modul Kromatografi Cair Kinerja Tinggi



21



Kesimpulan ....................................................................................................................... ....................................................................................................................... ....................................................................................................................... ....................................................................................................................... ....................................................................................................................... ....................................................................................................................... .......................................................................................................................



D. Rangkuman Kromatografi Cair Kinerja Tinggi (KCKT) merupakan salah satu jenis kromatografi kolom modern (instrumentasi). Kromatografi jenis ini digunakan untuk analisa komponen yang bersifat non volatil. Pemisahan komponen dalam kromatografi gas terjadi karena adanya afinitas komponen terhadap fasa diam yang dapat berupa zat cair maupun zat padat dan fasa gerak yang berupa zat cair. Instrumentasi kromatografi cair kinerja tinggi terdiri dari fasa gerak (berupa zat cair), pompa yang berfungsi untuk mengalirkan fasa gerak dengan kecepatan tinggi hingga sampel dapat terpisah dengan cepat, port injeksi sampel, kolom, detektor, dan recorder. Kromatografi jenis ini dapat digunakan untuk analisa secara kualitatif maupun analisa secara kuantitatif.



E. Uji Mandiri 1. Berikut ini dapat dianalisa menggunakan instrumen KCKT.... a. Minyak curah



d.



Minyak kayu putih



b. Kafein dalam obat



e.



Minyak kelapa sawit



c. Minyak sereh 2. Berikut ini merupakan fungsi HPLC, kecuali.... a. Analisis ketidakmurnian b. Pemisahan senyawa kimia dengan struktur mirip c. Analisis senyawa volatil d. Pemisahan senyawa dalam jumlah kecil e. Analisis senyawa non volatil



Modul Kromatografi Cair Kinerja Tinggi



22



3. Perhatikan gambar berikut! A



B



C



D



E



F



Sampel diinjeksikan pada bagian.... a. A



d.



D



b. B



e.



E



c. C 4. Perhatikan gambar pada soal nomor 3! Detektor terletak pada bagian.... a. B



d.



E



b. C



e.



F



c. D 5. Perhatikan gambar nomor 3! Pompa terletak pada bagian.... a. F



d.



C



b. E



e.



B



c. D 6. Bagian dari instrumen HPLC berikut ini dapat digunakan untuk menampilkan data yang diperoleh.... a. Recorder



d. Kolom



b. Detektor



e.



Injektor



c. Pompa 7. Bagian dari HPLC berikut digunakan sebagai tempat untuk memisahkan senyawa dalam sampel.... a. Recorder



d. Kolom



b. Detektor



e.



Injektor



c. Pompa 8. Data berikut ini dapat digunakan untuk analisa kualitatif pada KCKT.... a. Tinggi Puncak



d.



Konsentrasi



b. Luas area



e.



Waktu retensi



c. Jumlah puncak 9. Data berikut ini paling tepat digunakan untuk analisa kuantitatif pada KCKT.... a. Tinggi Puncak



d.



Konsentrasi



b. Luas area



e.



Waktu retensi



c. Jumlah puncak 10. Data berikut ini tidak digunakan untuk menentukan kadar suatu senyawa dalam sampel.... a. Luas area senyawa dalam sampel



Modul Kromatografi Cair Kinerja Tinggi



23



b. Konsentrasi sampel c. Luas area baku pembanding d. Pengenceran baku pembanding e. Pengenceran sampel



F. Umpan Balik dan Tindak Lanjut Setelah Anda selesai mempelajari bab ini dan mengerjakan Latihan Mandiri, cocokkanlah jawaban Anda dengan kunci jawaban diatas. Selanjutnya evaluasi kemampuan Anda dengan pedoman sebagai berikut : •



Nilai 90 s/d 100, berarti pemahaman Anda terhadap materi KB ke-1 Sangat Baik



•



Nilai 80 s/d 89, berarti pemahaman Anda terhadap materi KB ke-1 Baik



•



Nilai 75 s/d 79, berarti pemahaman Anda terhadap materi KB ke-1 Cukup



•



Nilai 65 s/d 74, berarti pemahaman Anda terhadap materi KB ke-1 Kurang



•



Nilai < 65, berarti pemahaman Anda terhadap materi KB ke-1 Sangat Kurang Apabila Anda mencapai nilai >75, maka Anda telah tuntas menguasai materi pada Kegiatan Belajar (KB) ke-1 dan dapat mempelajari materi pada Kegiatan Belajar 1. Akan tetapi jika nilai Anda 75, maka Anda telah tuntas menguasai materi pada Kegiatan Belajar (KB) ke-2, Akan tetapi jika nilai Anda