Makalah Kromatografi (KCKT) Kelompok 2 [PDF]

Citation preview

MAKALAH KROMATOGRAFI KCKT



KELOMPOK II Shafira Endah Amartya dewi ( F201901115 ) Putri Mutma’innah ( F201901125 ) Nila Sari ( F201901116 ) Fitriyanti Nursidin ( F201901117 ) Hana Nur Faizah Djufri ( F201901118 ) Siti Zuhri Ramdani ( F201901122 ) Ria Angelea ( F201901114 ) Eviyanti Jambilu ( F201901119 ) Desri mawaddayanti ( F201901121 ) Riski Ameliah ( F201901123 ) Sri Sumitra ( F201901124 ) Vira Lusyana ( F201901126 ) Anisa Setya Lestari ( F201901127 ) Anisa Risky La Ogo ( F201901130 ) Regina Aurelia Ratte ( F201901131 ) Griyah Athifa Alfiyyah ( F201901132 )



PROGRAM STUDI S1 FARMASI JURUSAN SAINS DAN TEKNOLOGI UNIVERSITAS MANDALA WALUYA KENDARI



2021 KATA PENGANTAR Segala puji kami panjatkan ke hadirat Allah SWT atas segala rahmat dan karunia yang diberikan, sehingga Makalah Kromatografi KCKT ini bisa terselesaikan dengan baik. Adapun laporan ini kami susun sebagai bagian dari tugas mata kuliah Kromatografi. Dalam penyusunan laporan ini, kami mengucapkan terimakasih sebesar-besarnya kepada semua pihak yang telah membantu terselesaikannya Makalah ini.



Kami selaku penyusun menyadari bahwa Makalah ini belumlah dikatakan sempurna. Untuk itu, kami dengan sangat terbuka menerima kritik dan saran dari pembaca sekalian. Semoga laporan praktikum ini bermanfaat untuk kita semua.



Daftar Isi Halaman Judul.................................................................................................. Lembar Pengesahan.......................................................................................... Kata Pengantar.................................................................................................. Daftar Isi........................................................................................................... Daftar Gambar.................................................................................................. BAB I PENDAHULUAN I.I. Latar Belakan.............................................................................................. I.2. Rumusan Masalah...................................................................................... I.3.Tujuan......................................................................................................... BAB II PEMBAHASAN II.1. Pegertian HPLC...................................................................................... II.2. Jenis-jenis HPLC.................................................................................... II.3. Instrument HPLC................................................................................... II.4.Prinsip Kerja HPLC............................................................................... II.5. Kelebihan dan Kekuranagan Metode Analisis Dengan HPLC............ II.6. Teknik Pengoperasian Alat dan Diagram Alir HPLC......................... II.7. Analisis Kromatogram/Interpretasi Data............................................. II.8. Contoh Analisis/Penerapan HPLC Dalam Analisis Senyawa ( Obat ) Dalam Campuran BAB III. PENUTUP III.1. Kesimpulan........................................................................................ III.2. Saran................................................................................................. Daftar Pustaka.............................................................................................



BAB I PENDAHULUAN I.1 Latar Belakang Kromatografi adalah istilah umum untuk berbagai cara pemisahan berdasarkan partisi cuplikan antara fasa yang bergerak, dapat berupa gas atau zat cair, dan fasa diam, dapat berupa zat cair atau zat padat. Kita biasanya menganggap Tswett sebagai penemu kromatografi, yang pada tahun 1903 menguraikan karyanya mengenai pemakaian kolom kapur untuk memisahkan pigmen dalam daun. Istilah ‘kromatografi’ dipakai oleh Tswett untuk menggambarkan daerah berwarna yang bergerak ke bagian bawah kolom Kromatografi merupakan suatu cara pemisahan unsur-unsur yang akan dipisahkan terdistribusikan antara dua fasa, satu dari fasa-fasa ini membentuk suatu lapisan stasioner dengan luas permukaan yang besar dan yang lainnya merupakan cairan yang merembes lewat atau melalui fase yang stasioner. Fasa stasioner mugkin suatu zat padat atau suatu cairan, dan fasa yang bergerak mungkin suatu cairan atau suatu gas. Maka semua jenis kromatografi yang dikenal, terbagi menjadi empat golongan: cair-padat, gas-padat, cair-cair, dan gas-cair. Pembahasan teknik kromatografi modern, baru lengkap bila disebut kromatografi cairan kinerja tinggi (HPLC). Kromatografi cairan kolom klasik



merupakan prosedur



pemisahan yang sudah mapan dalam mana fase cair yang mobil mengalir lambat-lambat lewat kolom karena gravitasi. Umumnya metode itu dicirikan oleh efisiensi kolom yang rendah dan waktu pemisahan yang lama. Namun sejak kira-kira tahun 1969, perhatian dalam teknik kolom cairan hidup kembali dengan sangat menyolok karena dikembangkannya sistem tekanan tinggi oleh Kirchland dan Huber, yang bekerja pada tekanan sampai 2,07 x 107 Nm2 (3000 p.s.i). Dalam metode ini digunakan kolom berdiameter kecil (1-3 mm) dan eluen dipompakan ke dalamnya dengan laju alir yang tinggi (sekitar 1-5 cm3m-1). Pemisahan dengan metode ini dilakukan jauh lebih cepat (sekitar 100 kali lebih cepat) daripada dengan kromatografi cairan yang biasa. Meskipun peralatan yang tersedia di pasar dewasa ini agak mahal, HPLC telah terbukti luas penggunaannya dalam kimia organik



I.2 Rumusan Masalah 1. Menjelaskan pengertian HPLC dan jenis- jenis HPLC ? 2. Menjelaskan instrument HPLC dan prinsip kerja HPLC ? 3. Menjelaskan aplikasi HPLC dan manfaat penggunaan HPLC ? 4. Menjelaskan kelebihan dan kekurangan HPLC ? 5. Menjelaskan cara penggunaan alat HPLC ? 6. Menjelaskan bagaimana analisa data dan preparasi sampel ? I.3 Tujuan 1. Mengetahui pengertian HPLC dan jenis- jenis HPLC 2. Mengetahui instrument HPLC dan prinsip kerja HPLC 3. Mengetahui aplikasi HPLC dan manfaat Penggunaan HPLC 4. Mengetahui kelebihan dan kekurangan HPLC 5. Mengetahui cara pengoperasian alat dan cara pengolahan data



BAB II PEMBAHASAN II.1 Pengertian HPLC Kromatografi Cair Kinerja Tinggi (KCKT) atau High Performance Liquid Chromatography (HPLC) merupakan salah satu metode fisikokimia berdasarkan pada teknik kromatografi di mana fase geraknya berupa cairan dan fase diam dapat dalam bentuk cair atau padat. Metode ini sangat bermanfaat di bidang farmasi untuk menganalisis secara simultan beberapa analit dalam martiks sederhana maupun kompleks. Pada akhir 1960-an, semakin banyak usaha untuk pengembangan kromatografi cair sebagai suatu teknik untuk mengimbangi kromatografi gas. KCKT adalah kromatografi cair kolom modern, yang dasarnya merupakan pengembangan dari kromatografi kolom menjadi suatu sistem pemisahan yang cepat dan efisien. Peningkatan kecepatan dan efisiensi pemisahannya terkait dengan peningkatan performa kolomnya yang menggunakan kolom dengan ukuran dimensi dan partikel yang jauh lebih kecil dari kolom yang dipakai pada kromatografi kolom, sehingga agar fase gerak dapat mengalir pada kolom, fase gerak dipompa dengan tekanan tinggi. Di samping itu, kinerja tingginya dalam analisis didukung dengan adanya berbagai sistem deteksi dengan kepekaan tinggi yang dapat diintegrasikan dengan sistem kromatografinya. KCKT dapat dipandang sebagai pelengkap Kromatografi gas (KG), keduanya dapat digunakan untuk menghasilkan efek pemisahan yang sama baiknya. Bila derivatisasi diperlukan dalam KG, namun pada KCKT zat-zat yang tidak diderivatisasi dapat dianalisis. Untuk zat-zat yang labil pada pemanasan atau tidak menguap, KCKT adalah pilihan utama. Namun demikian bukan berarti KCKT menggantikan KG, tetapi akan memainkan peranan lebih besar dalam analisis.



KCKT menawarkan beberapa keuntungan dibanding dengan metode kromatografi lainnya, antara lain : a) Cepat : waktu analisis umumnya kurang dari 1 jam. Banyak analisis yang dapat diselesaikan sekitar 15-30 menit. Untuk analisis yang uncomplicated waktu analisis kurang dari 5 menit bisa dicapai. b) Resolusi tinggi : berbeda dengan KG, interaksi selektif dapat terjadi pada KCKT karena pengaruh yang besar dari fase diam dan fase geraknya. c) Sensitivitas detektor : detektor absorbsi UV yang biasa digunakan dalam KCKT dapat mendeteksi kadar dalam jumlah nanogram (10-9 gram) dari bermacam-macam zat. Detektor-detektor fluoresensi dan elektrokimia dapat mendeteksi jumlah sampai picogram (10-12 gram). d) Kolom dapat digunakan kembali : berbeda dengan kolom kromatografi klasik, kolom KCKT dapat digunakan kembali. Banyak analisis yang bisa dilakukan dengan kolom yang sama sehingga satu kolom dapat digunakan berulang kali untuk berbagai jenis sampel. e) Ideal untuk zat termolabil dan volatilitas rendah : zat-zat yang tidak bisa dianalisis dengan KG karena terurai oleh suhu tinggi atau volatilitasnya rendah dan dapat dianalisis secara KCKT. f) Mekanisme pemisahan lebih variatif : banyaknya pilihan fase gerak dan fase diam yang digunakan serta besarnya interaksi analit terhadap fase diam dan fase gerak memungkinkan terjadinya pemisahan dengan berbagai mekanisme. g) Mudah rekoveri sampel : umumnya detektor yang digunakan dalam KCKT tidak menyebabkan kerusakan pada komponen sampel yang diperiksa, sehingga komponen sampel tersebut dapat dengan mudah dikumpulkan setelah melewati detektor. Namun, jika dibandingkan dengan kromatografi lapis tipis kinerja tinggi, KCKT memiliki beberapa kelemahan, yaitu : 1. Tidak dapat menganalisis lebih dari satu jenis sampel sekaligus 2. Kromatogram tidak dapat disimpan sebagai dokumen otentik



Kromatografi cair kinerja tinggi merupakan suatu metode pemisahan canggih dalam analisis farmasi yang dapat digunakan sebagai uji identitas, uji kemurnian dan penetapan kadar. Titik beratnya adalah untuk analisis senyawa-senyawa yang tidak mudah menguap dan



tidak stabil pada suhu tinggi, yang tidak bisa dianalisis dengan metode KG. Banyak senyawa yang dapat dianalisis dengan KCKT mulai dari senyawa ion anorganik sampai senyawa organik makromolekul. Untuk analisis dan pemisahan obat/bahan obat campuran rasemis optis aktif dikembangkan suatu fase pemisahan kiral yang mampu menetukan rasemis dan isomer aktif. Walaupun disadari biaya yang dibutuhkan untuk analisis dengan KCKT sangat mahal, namun metode ini tetap dipilih untuk digunakan menganalisis 277 obat / bahan obat karena hasil analisis yang memiliki akurasi dan presisi yang tinggi dalam waktu analisis yang cepat. Secara umum KCKT digunakan dalam kondisi-kondisi berikut: 1. Pemisahan berbagai senyawa organik maupun anorganik, ataupun spesimen biologis 2. Analisis ketidakmurnian (impurities) 3. Analisis senyawa-senyawa yang tak mudah menguap (non-volatil) 4. Penentuan molekul-molekul netral, ionik maupun zwitter ion 5. Isolasi dan pemurnian senyawa 6. Pemisahan senyawa-senyawa dengan struktur kimia yang mirip 7. Pemisahan senyawa-senyawa dalam jumlah kecil (trace elements)



II.2 Jenis-jenis HPLC Pemisahan dengan HPLC dapat dilakukan dengan fase normal (jika fase diamnya lebih polar dibanding dengan fase geraknya) atau fase terbalik (jika fase diamnya kurang non polar dibanding dengan fase geraknya). Berdasarkan pada kedua pemisahan ini, sering kali HPLC dikelompokkan menjadi HPLC fase normal dan HPLC fase terbalik. Selain klasifikasi di atas, HPLC juga dapat dikelompokkan berdasarkan pada sifat fase diam dan atau berdasarkan pada mekanisme sorpsi solut, dengan jenis-jenis HPLC sebagai berikut: 1. Kromatografi Adsorbsi Prinsip kromatografi adsorpsi telah diketahui sebagaimana dalam kromatografi kolom dan kromatografi lapis tipis. Pemisahan kromatografi adsorbsi biasanya menggunakan fase normal dengan menggunakan fase diam silika gel dan alumina, meskipun demikian sekitar 90% kromatografi ini memakai silika sebagai fase diamnya. Pada silika dan alumina terdapat gugus hidroksi yang akan berinteraksi dengan solut. Gugus silanol pada silika mempunyai reaktifitas



yang berbeda, karenanya solut dapat terikat secara kuat sehingga dapat menyebabkan puncak yang berekor. 2. Kromatografi fase terikat (Kromatografi Partisi) Kebanyakan fase diam kromatografi ini adalah silika yang dimodifikasi secara kimiawi atau fase terikat. Sejauh ini yang digunakan untuk memodifikasi silika adalah hidrokarbon-hidrokarbon non-polar seperti dengan oktadesilsilana, oktasilana, atau dengan fenil. Fase diam yang paling populer digunakan adalah oktadesilsilan (ODS atau C18) dan kebanyakan pemisahannya adalah fase terbalik. Sebagai fase gerak adalah campuran metanol atau asetonitril dengan air atau dengan larutan bufer. Untuk solut yang bersifat asam lemah atau basa lemah, peranan pH sangat krusial karena kalau pH fase gerak tidak diatur maka solut akan mengalami ionisasi atau protonasi. Terbentuknya spesies yang terionisasi ini menyebabkan ikatannya dengan fase diam menjadi lebih lemah dibanding jika solut dalam bentuk spesies yang tidak terionisasi karenanya spesies yang mengalami ionisasi akan terelusi lebih cepat. 3. Kromatografi Penukar Ion HPLC penukar ion menggunakan fase diam yang dapat menukar kation atau anion dengan suatu fase gerak. Ada banyak penukar ion yang beredar di pasaran, meskipun demikian yang paling luas penggunaannya adalah polistiren resin. Kebanyakan pemisahan kromatografi ion dilakukan dengan menggunakan media air karena sifat ionisasinya. Dalam beberapa hal digunakan pelarut campuran misalnya air-alkohol dan juga pelarut organik. Kromatografi penukar ion dengan fase gerak air, retensi puncak dipengaruhi oleh kadar garam total atau kekuatan ionik serta oleh pH fase gerak. Kenaikan kadar garam dalam fase gerak menurunkan retensi solut. Hal ini disebabkan oleh penurunan kemampuan ion sampel bersaing dengan ion fase gerak untuk gugus penukar ion pada resin. 4. Kromatografi Pasangan Ion Kromatografi pasangan ion juga dapat digunakan untuk pemisahan sampel-sampel ionik dan mengatasi masalah-masalah yang melekat pada metode penukaran ion. Sampel ionik ditutup dengan ion yang mempunyai muatan yang berlawanan. 5. Kromatografi Eksklusi Ukuran



Kromatografi ini disebut juga dengan kromatografi permiasi gel dan dapat digunakan untuk memisahkan atau menganalisis senyawa dengan berat molekul > 2000 dalton. Fase diam yang digunakan dapat berupa silika atau polimer yang bersifat porus sehingga solut dapat melewati porus (lewat diantara partikel), atau berdifusi lewat fase diam. Molekul solut yang mempunyai BM yang jauh lebih besar, akan terelusi terlebih dahulu, kemudian molekul-molekul yang ukuran medium, dan terakhir adalah molekul yang jauh lebih kecil. Hal ini disebabkan solut dengan BM yang besar tidak melewati porus, akan tetapi lewat diantara partikel fase diam. Dengan demikian, dalam pemisahan dengan eksklusi ukuran ini tidak terjadi interaksi kimia antara solut dan fase diam seperti tipe kromatografi yang lain. 6. Kromatografi Afinitas Dalam kasus ini, pemisahan terjadi karena interaksi-interaksi biokimiawi yang sangat spesifik. Fase diam mengandung gugus-gugus molekul yang hanya dapat menyerap sampel jika ada kondisi-kondisi yang terkait dengan muatan dan sterik tertentu pada sampel yang sesuai (sebagaimana dalam interaksi antara antigen dan antibodi). Kromatografi jenis ini dapat digunakan untuk mengisolasi protein (enzim) dari campuran yang sangat kompleks.



II.3 Instrument HPLC Instrumentasi HPLC pada dasarnya terdiri atas: wadah fase gerak (Reservoir) , pompa, alat untuk memasukkan sampel (tempat injeksi), kolom, detektor, wadah penampung buangan fase gerak, dan suatu komputer atau integrator atau perekam. Diagram skematik sistem kromatografi cair dapat dilihat pada gambar di bawah ini : 1. Wadah fase gerak (Reservoir) Wadah fase gerak harus bersih dan lembam (inert). Wadah pelarut kosong ataupun labu laboratorium dapat digunakan sebagai wadah fase gerak. Wadah ini biasanya dapat menampung fase gerak antara 1 sampai 2 liter pelarut. Fase gerak sebelum digunakan harus dilakukan deggasing (penghilangan gas) yang ada pada fase gerak. Sebab adanya gas dalam fase gerak akan mengganggu detektor sehingga akan mengacaukan hasil analisis. Fase gerak biasanya terdiri atas campuran pelarut yang dapat bercampur yang secara keseluruhan berperan dalam daya elusi dan resolusi.



Daya elusi dan resolusi ini ditentukan oleh polaritas keseluruhan pelarut, polaritas fase diam, dan sifat komponen-komponen sampel. Untuk fase normal (fase diam lebih polar daripada fase gerak), kemampuan elusi meningkat dengan meningkatnya polaritas pelarut. Sementara untuk fase terbalik (fase diam kurang polar daripada fase gerak), kemampuan elusi menurun dengan meningkatnya polaritas pelarut. 



Fase Gerak Fase gerak dalam HPLC adalah berupa zat cair dan disebut juga eluen atau pelarut. Selain berfungsi sebagai pembawa komponen-komponen campuran campuran menuju detector, fase gerak dapat berinteraksi dengan solut-solut. Oleh karena itu, fase gerak dalam HPLC merupakan salah satu faktor penentu keberhasilan proses pemisahan.







Persyaratan fase gerak HPLC: 1) Zat cair harus bertindak sebagai pelarut yang baik untuk cuplikan yang akan dianalisis. 2) Zat cair harus murni sekali untuk menghindarkan masuknya kotoran yang dapat mengganggu interpretasi kromatografi. 3) Zat air harus jernih sekali untuk menghindarkan penyumbatan pada kolom. 4) Zat cair harus mudah diperoleh, murah, tidak mudah terbakar, dan tidak beracun. 5) Zat air tidak kental. Umumnya kekentalan tidak melebihi 0,5 cP (centi Poise). 6) Sesuai dengan detector.







Jenis HPLC berdasarkan kepolaran fase diam dan fase gerak: 1) HPLC fase normal: HPLC dengan kombinasi antara fase diam polar dan fase gerak non-polar. Fase diam yang digunakan seperti silica, alumina, atau trietilenaglikol yang dilapiskan pada partikel silica. Sedangkan fase gerak yang digunakan adalah heksana atau i-propileter. 2) HPLC fase terbalik: HPLC dengan kombinasi antara fase diam non-polar dan fase gerak polar. Fase gerak yang digunakan seperti air, methanol, atau asetinitril. 3) Fase gerak yang baik memberikan factor kapasitas k’ pada rentang yang sesuai. Untuk cuplikan dengan 2-3 komponen, sebaiknya menggunakan fase gerak yang memberikan k’ antara 2-5



2. Pompa Pompa yang cocok digunakan untuk HPLC adalah pompa yang mempunyai syarat sebagaimana syarat wadah pelarut yakni: pompa harus inert terhadap fase gerak. Bahan yang umum dipakai untuk pompa adalah gelas, baja tahan karat, Teflon, dan batu nilam. Pompa yang digunakan sebaiknya mampu memberikan tekanan sampai 5000 psi dan mampu mengalirkan fase gerak dengan kecepatan alir 3 mL/menit. Untuk tujuan preparatif, pompa yang digunakan harus mampu mengalirkan fase gerak dengan kecepatan 20 mL/menit. Tujuan penggunaan pompa atau sistem penghantaran fase gerak adalah untuk menjamin proses penghantaran fase gerak berlangsung secara tepat, reprodusibel, konstan, dan bebas dari gangguan. Ada 2 jenis pompa dalam HPLC yaitu: pompa dengan tekanan konstan, dan pompa dengan aliran fase gerak yang konstan. Tipe pompa dengan aliran fase gerak yang konstan sejauh ini lebih umum dibandingkan dengan tipe pompa dengan tekanan konstan. 



Tiga jenis pompa yang digunakan dalam HPLC 1) Pompa reciprocating Pompa ini terdiri dari ruangan kecil tempat pelarut yang dipompa dengan cara gerakan piston mundur-maju yang dijalankan oleh motor. Piston berupa gelas dan berkontak langsung dengan pelarut. Ketika piston mundur maka bola gelas bawah terangkat dan pelarut masuk, sebaliknya ketika piston maju maka bola bawah menutup saluran pelarut dan pelarut yang telah berada di ruang pompa didorong masuk ke dalam kolom. 2) Pompa displacement Pompa ini menyerupai syringe (alat suntik) terdiri dari tabung yang dilengkapi pendorong yang digerakkan oleh motor. Pompa ini juga menghasilkan aliran yang cenderung tidak bergantung pada tekanan balik kolom dan viskositas pelarut. 3) Pompa pneumatic Dalam pompa ini pelarut didorong oleh gas bertekanan tinggi. Pompa jenis ini murah dan bebas pulsa. Akan tetapi mempunya keterbatasan kapasitas dan tekanan yang dihasilkan (