19.teknologi Dna Rekombinan [PDF]

Citation preview

TEKNOLOGI DNA REKOMBINAN



Roga F. Kembaren, M.Si.



Rekombinasi DNA Secara Alami Transformasi



Transduksi



TEKNOLOGI DNA REKOMBINAN Teknologi DNA rekombinan = rekayasa genetika  proses pembentukan kombinasi materi genetik yang baru, biasanya dengan rekombinasi DNA dari organisme berbeda melalui cara buatan dengan bantuan enzim yang dikenal sebagai enzim restriksi, dan produksi salinan DNA rekombinan dalam jumlah banyak di dalam suatu sel organisme lain yang berperan sebagai sel inang melalui proses yang disebut dengan kloning.



TEKNOLOGI DNA REKOMBINAN Proses untuk mendapatkan suatu produk yang diinginkan melalui teknologi DNA rekombinan melibatkan beberapa tahap:  isolasi DNA genomik/kromosom yang akan diklon  pemotongan molekul DNA menjadi sejumlah fragmen dengan berbagai ukuran  pemotongan vector/plasmid  penyisipan fragmen DNA ke dalam vektor untuk menghasilkan molekul DNA rekombinan  transformasi molekul DNA rekombinan ke dalam sel inang,  reisolasi molekul DNA rekombinan dari sel inang dan  analisis DNA rekombinan.



TEKNOLOGI DNA REKOMBINAN Proses untuk mendapatkan suatu produk yang diinginkan melalui teknologi DNA rekombinan melibatkan beberapa tahap:  isolasi DNA genomik/kromosom yang akan diklon  pemotongan molekul DNA menjadi sejumlah fragmen dengan berbagai ukuran  pemotongan vektor/plasmid  penyisipan fragmen DNA ke dalam vektor untuk menghasilkan molekul DNA rekombinan  transformasi molekul DNA rekombinan ke dalam sel inang,  reisolasi molekul DNA rekombinan dari sel inang dan  analisis DNA rekombinan.



Kloning DNA: Proses penyisipan DNA ke dalam suatu vector (plasmid) dan kemudian direplikasi dalam sel inang untuk menghasilkan salinan DNA dalam jumlah banyak



TEKNOLOGI DNA REKOMBINAN Kloning DNA melibatkan lima komponen utama: 1. DNA donor (DNA sisipan atau DNA asing) : DNA sumber atau gen yang diklon 2. Enzim restriksi: enzim yang digunakan untuk memotong DNA donor dan vektor pada lokasi spesifik, sehingga DNA donor dapat disisipkan ke dalam vektor 3. Vektor: plasmid atau bakteriofaga yang digunakan untuk mengintroduksi gen yang diklon ke dalam sel inang yang sesuai. 4. DNA ligase: enzim yang digunakan untuk menggabungkan ujung vektor dan DNA donor untuk menghasilkan DNA rekombinan 5. Sel inang: pada umumnya bakteri atau sel ragi.



TEKNOLOGI DNA REKOMBINAN



Vektor/plasmid yang telah disisipi DNA donor /DNA asing disebut sebagai vektor/plasmid rekombinan. Vektor rekombinan dimasukkan ke dalam sel inang untuk menghasilkan jumlah DNA rekombinan dalam jumlah lebih banyak.



ENZIM RESTRIKSI  Enzim bakteri yang mengenali urutan nukleotida spesifik pada DNA untai ganda dan memotong DNA pada lokasi tersebut.  Enzim restriksi memotong DNA menjadi fragmen-fragmen dengan berbagai ukuran, tergantung pada jumlah situs pengenalan enzim dalam molekul DNA tersebut.  Enzim restriksi tipe II, yang digunakan dalam kloning DNA, mengenali urutan pasangan basa 4 sampai 8 nukleotida dan memotong dalam urutan tersebut. Urutan ini disebut sebagai urutan pengenalan enzim restriksi.  Pada umumnya, enzim restriksi memiliki urutan pengenalan yang disebut dengan palindrom. Palindrom adalah urutan 4 sampai 6 pasangan basa yang sama pada kedua untai jika dibaca pada arah yang sama (5’  3’).  Tergantung pada lokasi pemotongan pada urutan pengenalan, hasil pemotongan oleh enzim restriksi dapat memberikan ujung runcing (sticky end) (baik ujung 5’ atau ujung 3’ menonjol) dan ujung tumpul (blunt end)



ENZIM RESTRIKSI Ada 3 tipe enzim restriksi:  Tipe I dan III memotong DNA tapi kurang presisi, tidak digunakan untuk manipulasi DNA.  Tipe II – Mengenali urutan spesifk pada DNA – Memotong DNA pada urutan spesifik. – Dapat meghasilkan DNA dengan “sticky ends”



ENZIM RESTRIKSI Pada umumnya urutan DNA yang dikenali oleh enzim restriksi adalah urutan DNA palindrom, yaitu urutan DNA yang sama bila dibaca arah 5’→ 3’ atau 3’→ 5’ Contoh enzim restriksi:



ENZIM RESTRIKSI



Pemotongan DNA dengan enzim restriksi dapat menghasilkan fragmen DNA dengan: Sticky end atau Blunt end Contoh sticky end



Sticky end: fragmen DNA hasil pemotongan enzim restriksi dengan ujung menggantung (ada basa yang tidak berpasangan)



ENZIM RESTRIKSI



Blunt end : fragmen DNA hasil pemotongan enzim restriksi yang ujungnya tidak menggantung (tidak ada basa yang tidak berpasangan). Contoh blunt end: SmaI



5’-CCCGGG-3’ 3’-GGGCCC-5



5’-CCC-3’ 3-’GGG-5’



blunt ends



5’-GGG-3’ 3’-CCC-5



CONTOH PETA RESTRIKSI SUATU GEN BamHI



VEKTOR (PLASMID)  Plasmid Kloning (Cloning Plasmid) Plasmid kloning berfungsi hanya sebagai pembawa gen asing tapi tidak memiliki perangkat untuk mengekspresikan gen sisipan tersebut menjadi protein.  Plasmid Ekspresi (Expression Plasmid) Plasmid ekspresi dapat berfungsi sebagai plasmid kloning sekaligus dapat mengekspresikan gen sisipan, karena memiliki perangkat untuk ekspresi gen.



PLASMID



Contoh plasmid kloning:



PLASMID Plasmid/vektor ekspresi: • Plasmid ekspresi juga adalah plasmid kloning. • Selain alat-alat untuk kloning gen, juga memiliki alat-alat untuk ekspresi gen. (promotor, ribosom binding site(rbs) dan terminator).



• Gen (coding gene) yang disisipkan (diklon) pada plasmid ekspresi dapat diekspresikan menjadi protein/enzim.



PLASMID Contoh plasmid ekspresi



DNA LIGASE DNA ligase • Menggabungkan dua fragmen DNA. • Mengkatalisis pembentukan ikatan fosfodiester antara gugus fosfat dan gugus hidroksil pada DNA. • Enzim yang sama yang menggabungkan fragmen Okazaki pada lagging strand pada proses replikasi DNA.



LIGASI Ligasi: proses penggabungan dua fragmen DNA oleh enzim ligase.



TRANSFORMASI Transformasi adalah proses transfer DNA rekombinan ke dalam sel. Ada dua metoda yang umum utuk transformasi: 1. Metoda kimia menggunakan CaCl2 dan heat shock. 2. Elektroporasi berdasarkan kejutan pendek arus listrik yang memfasilitasi masuknya DNA ke dalam sel.



TRANSFORMASI CaCl2 dan heat shock



•



•



Penambahan CaCl2 (dalam keadaan dingin, hanya menyebabkan DNA menempel (mengendap) pada dinding sel, di luar sel. Dengan menaikkan suhu sampai 42C, menstimulasi DNA masuk ke dalam sel.



Menumbuhkan sel pada media seleksi: • Setelah ditransformasi, sel ditumbuhkan pada media seleksi yang mengandung bahan yang merupakan marker. • Gen pengkode marker dibawa oleh plasmid, misalnya gen pengkode resisten antibiotik, yang menandakan bahwa sel telah membawa plasmid. • Media seleksi juga dapat ditambahkan bahan lain yang dapat mengindikasikan bahwa plasmid rekombinan yang ditransformasikan ke dalam sel telah berhasil disisipi oleh DNA asing.



Contoh: blue white screening



Untuk konfirmasi apakah plasmid rekombinan yang dibawa oleh transforman benar-benar telah mengandung gen (DNA) target, dapat dilakukan karakterisasi plasmid terhadap plasmid rekombinan tersebut. • Isolasi plasmid rekombinan dari sel rekombinan. • Elektroforesis bersamaan dengan plasmid asal atau plasmid tanpa DNA sisipan. Bandingkan jarak migrasi: plasmid yang telah membawa DNA sisipan akan bermigrasi lebih lambat.



• Potong plasmid tanpa DNA sisipan dan plasmid rekombinan masing-masing dengan enzim restriksi yang sama digunakan saat kloning. • Elektroforesis hasil pemotongan: - pada plasmid asal akan ada hanya satu pita sedangkan - pada plasmid rekombinan akan ada dua pita DNA: yang berukuran lebih besar merupakan plasmid asal dan yang berukuran lebih kecil merupakan DNA sisipan.



Plasmid asal



DNA sisipan



Istilah-istilah dalam kloning: • DNA rekombinan: fragmen DNA yang disisipkan ke dalam vektor (plasmid). • Plasmid rekombinan: plasmid yang telah disisipi gen (DNA) asing. • Sel kompeten: sel yang telah siap dimasuki oleh DNA asing /plasmid rekombinan. • Transformasi: proses masuknya DNA rekombinan ke dalam sel.



Istilah-istilah dalam kloning (cont’d) •



Transforman: sel kompeten yang telah dimasuki DNA rekombinan dan yang tumbuh pada media seleksi.



•



Media seleksi: media yang digunakan untuk menumbuhkan sel yang telah ditransformasi, pada umumnya mengandung bahan yang berfungsi sebagai marker seleksi, contohnya: antibiotik.



•



Sel rekombinan: sel yang telah megandung plasmid rekombinan.



TEHNIK-TEHNIK YANG DIGUNAKAN PADA KLONING DNA



Polymerase Chain Reaction (PCR) Amplifikasi DNA secara in vitro. Pertama kali dikembangkan oleh Dr. Kary Mullis pada tahun 1983 dan meraih Nobel pada tahun 1993. PCR menggunakan enzim DNA polimerase yang stabil pada suhu tinggi (thermostable enzyme) seperti Taq DNA polymerase yang diisolasi dari bakteri Thermus aquaticus. Pada PCR, DNA dipolimerisasi dalam siklus berulang dari pemanasan dan pendinginan untuk mencapai akumulasi logaritmik dari produk DNA. Pada kloning PCR digunakan untuk isolasi dan memperbanyak fragmen DNA atau gen yang akan diklon. Syarat untuk dapat melakukan isolasi DNA dan memperbanyak gen dengan PCR; harus tahu urutan DNA-nya, setidaknya pada daerah ujung 5’ dan 3’.



PCR



Isolasi fragmen DNA spesifik dari genomik DNA secara langsung → menggunakan PCR  Urutan fragmen DNA spesifik tersebut telah diketahui  Fragmen DNA yang teah diisolasi dengan tehnik PCR dapat diinsersi (diklon) ke dalam plasmid dengan terlebih dahulu memotong plasmid dan fragmen DNA dengan enzim restriksi yang sama.



ELEKTROFORESIS DNA • Menggunakan gel gel agarosa atau gel poliakrilamid. • Memisahkan fragmen DNA berdasarkan ukuran. • Menggunakan buffer yang dapat mengalirkan arus. • Membutuhkan aliran listrik. • DNA yang bermuatan negatif bemigrasi ke arah kutub positif. • Fragmen DNA yang lebih besar bermigrasi lebih lambat, fragmen DNA yang lebih kecil bermigrasi lebih cepat. • DNA divisualisasi dengan pewarna fluorescent.



Elektroforesis DNA



HIBRIDISASI KOLONI (COLONY BLOT HIBRIDIZATION)



SKRINING DENGAN AKTIVITAS ANTIBODI



SOUTHERN BLOTTING 



Fragmen DNA yang diperoleh dari hasil pemotongan oleh enzim restriksi dan dipisahkan pada gel elektroforesis DNA.







Untai ganda DNA didenaturasi menjadi untai tunggal secara in situ (pada gel agarosa)







Gel “blotted” dengan membran tertentu untuk transfer DNA (DNA ditransfer ke membran).







Membran diinkubsi dengan suatu labeled probe yang mengandung untai tunggal DNA murni yang mengkode gen spesifik.



SHOUTERN BLOTTING • Hibridisasi DNA



Labeled Nucleic Acid



SHOUTERN BLOTTING



Hibridisasi DNA



Northern blotting (hibridisasi RNA) (prinsip sama dengan hibridisasi DNA)



 target dan probe adalah RNA (mRNA)  mRNA dipisahkan dengan elektroforesis  blotted pada membrane (seperti pada Southern-Blot)  dihibridisasi 40



SEKUENSING DNA  Menentukan urutan basa DNA  Metoda sekuensing DNA yang modern menggunakan metoda Sanger  Metode Sanger menggunakan 2’,3’dideoxynucleotide triphosphates (ddNTPs) yang memiliki sebuah H pada karbon-3 dari gula ribosa.  Inkorporasi ddNTP pada rantai DNA menghentikan elongasi (perpanjangan) rantai.



PROTEIN FUSI • Yang difusikan adalah gen pengkode proteinnya. • Gen pengkode protein yang difusikan dapat ditambahkan pada urutan gen target pada saat amplifikasi DNA dengan PCR (ditambahkan pada urutan primer) atau gen pengkode protein fusi sudah ada pada plasmid yang digunakan untuk kloning. • Tujuan membuat protein fusi adalah untuk memudahkan dalam melakukan pemurnian protein → pemurnian satu tahap (kromatografi affinitas)



PROTEIN FUSI Contoh: His-tagged protein His-tag terdiri dari 6 histidin yang berfusi dengan protein (ditambahkan pada N-terminal atau pada C-terminal protein)



Interaksi protein-His-tag dan kolom Nikel



PROTEIN FUSI Contoh plasmid kloning yang mengandung polihisitidin (6xHis) untuk fusi protein: pET-15b - Polihistidin akan ditambahkan N-terminal protein target.



Contoh plasmid kloning yang mengandung polihisitidin (6xHis) untuk fusi protein: pBAD/Myc-His - Protein yang diekspresikan dengan sistem ini, akan mengandung polihistidin pada C-terminal.



Aplikasi Teknologi DNA Rekombinan di Industri



Suliman Khan et al, 2016, Role of Recombinant DNA Technology to Improve Life.Int J Genomics



Contoh Aplikasi Teknologi DNA Rekombinan



Contoh Aplikasi Teknologi DNA Rekombinan



P. SobanaPiriya et al., Cellulosic Ethanol Production byRecombinant Cellulolytic Bacteria Harbouring pdc and adh II Genes of Zymomonasmobilis, Biotechnology Research Internationa, Vol 2012