![Buku Ajar Mikrobiologi - Panduan Mahasiswa Farmasi & Kedokteran - Reaksi-Reaksi Trigliserida [PDF]](https://pdfs.asia/img/200x200/buku-ajar-mikrobiologi-panduan-mahasiswa-farmasi-amp-kedokteran-reaksi-reaksi-trigliserida.jpg)
8 0 62 MB
cu Ajar
MIKROBIOLdGI Panduan Mahasiswa farmasi b Kedokteran
Kutipan Pasal 72: Sanksi Pelanggaran Undang-Undang Hak Cipta (Undang-Undang No. 19 Tahun 2002) 1. B a r a n g s i a p a d e n g a n - s e n g a j a d a n t a n p a h a k m e l a k u k a n p e r b u a t a n sebagaimana d i m a k s u d d a l a m Pasal 2 ayat ( 1 ) dipidana dengan pidana penjara masing-masing paling singkat 1 (satu) bulan dan/atau denda paling sedikit Rp. 1.000.000,00 (satu juta rupiah), atau pidana penjara paling l a m a 7 (tujuh) tahun dan/atau denda paling banyak Rp.5.000.000.000,00 (lima miliar rupiah). 2. B a r a n g s i a p a d e n g a n s e n g a j a m e n y i a r k a n , m e m a m e r k a n , m e n g e d a r k a n , a t a u m e n j u a l kepada u m u m suatu ciptaan atau barang hasil pelanggaran H a k Cipta atau H a k Terkait sebagaimana dimaksud pada ayat ( 1 ) dipidana dengan p i d a n a p e n j a r a p a l i n g l a m a 5 ( l i m a ) t a h u n dan/atau d e n d a p a l i n g b a n y a k R p . 5 0 0 . 0 0 0 . 0 0 0 , 0 0 ( l i m a ratus juta rupiah).
PENTING DIKETAHUI Penerbit a d a l a h r e k a n a n p e n g a r a n g u n t u k m e n e r b i t k a n s e b u a h b u k u . B e r s a m a pengarang, penerbit menciptakan b u k u untuk diterbitkan. Penerbit m e m p u n y a i hak atas p e n e r b i t a n b u k u tersebut serta d i s t r i b u s i n y a , s e d a n g k a n p e n g a r a n g m e m e g a n g h a k p e n u h atas k a r a n g a n n y a d a n b e r h a k m e n d a p a t k a n r o y a l t i atas p e n j u a l a n b u k u nya dari penerbit. Percetakan a d a l a h p e r u s a h a a n y a n g m e m i l i k i m e s i n c e t a k d a n m e n j u a l j a s a p e n cetakan. Percetakan tidak m e m i l i k i hak apa p u n dari b u k u y a n g dicetaknya kecual' upah. P e r c e t a k a n t i d a k b e r t a n g g u n g j a w a b a t a s i s i b u k u y a n g d i c e t a k n y a . Pengarang a d a l a h p e n c i p t a b u k u y a n g m e n y e r a h k a n n a s k a h n y a u n t u k d i t e r b i t k a n d i sebuah penerbit. P e n g a r a n g m e m i l i k i h a k p e n u h atas k a r a n g a n n y a , n a m u n m e n y e rahkan h a k penerbitan d a n distribusi b u k u n y a kepada penerbit yang d i t u n j u k n y a sesuai batas-batas y a n g d i t e n t u k a n d a l a m perjanjian. Pengarang berhak m e n ^ d a p a t k a n r o y a l t i atas k a r y a n y a d a r i penerbit, sesuai d e n g a n k e t e n t u a n d i dala perjanjian Pengarang-Penerbit. Pembajak a d a l a h p i h a k y a n g m e n g a m b i l k e u n t u n g a n d a r i k e p a k a r a n p e n g a r a n g dan kebutuhan belajar masyarakat. Pembajak tidak m e m p u n y a i h a k mencetaktidak m e m i l i k i h a k menggandakan, mendistribusikan, dan menjual b u k u yang d i g a n d a k a n n y a k a r e n a t i d a k d i l i n d u n g i copyright a t a u p u n p e r j a n j i a n p e n g a r a n g p e n e r b i t . P e m b a j a k t i d a k p e d u l i atas j e r i h p a y a h p e n g a r a n g . B u k u p e m b a j a k d a p a t lebih m u r a h karena mereka tidak perlu mempersiapkan naskah mulai dari pem i l i h a n j u d u l , editing sampai persiapan pracetak, tidak m e m b a y a r royalti, d a n tidak terikat perjanjian dengan pihak mana pun. PEMBAJAKAN BUKU ADALAH KRIMINAL! A n d a jangan menggunakan b u k u bajakan, d e m i menghargai jerih payah pengarang y a n g notabene adalah para guru.
para v
PanduanMahasiswafarmasihKedolderan
DR. Maksum Radji, M.Biomed
PENERBIT BUKU KEDOKTERAN
?
EGC
EGC 1955 BUKU AJAR MIKROBIOLOGI: PANDUAN MAHASISWA FARMASI & KEDOKTERAN Oleh: DR. Maksum Radji, M.Biomed Editor: July Manurung, S.Si, Apt Copy editor: Nuraini Septianti Diterbitkan pertama kali oleh Penerbit Buku Kedokteran EGC © 2009 Penerbit Buku Kedokteran EGC PO. Box 4276/Jakarta 10042 Telepon: 6530 6283 Anggota IKAPI Desain kulit muka: Teddy Kurniawan, S.Sn Hak cipta dilindungi Undang-Undang Dilarang mengutip, memperbanyak, dan menerjemahkan sebagian atau seluruh isi buku ini tanpa izin tertulis dari penerbit. Cetakan 2011 Perpustakaan Nasional: Katalog Dalam Terbitan (KDT) Maksum Radji Buku ajar mikrobiologi: panduan mahasiswa farmasi & kedokteran / penulis, Maksum Radji ; editor, July Manurung. —Jakarta : EGC, 2010. xiii,320hlm. ; 15,5 x 24 cm. ISBN 978-979-044-105-7 1. Mikrobiologi. 1. Judul. II. Manurung, July. 616.904 1
Isi di luar t a n g g u n g j a w a b percetakan
KATA
PENGANTAR
Puji syukur saya panjatkan kepada Tuhan Yang Maha Esa atas limpahan petunjuk dan bimbingan-Nya sehingga Buku Ajar Mikrobiologi: Panduan Mahasiswa Farmasi dan Kedokteran ini dapat diterbitkan. Buku ini dibuat dalam rangka membantu proses belajar mengajar mahasiswa program studi farmasi dan kedokteran dalam perkuliahan mikrobiologi. Buku ini tidak saja digunakan di lingkungan Universitas Indonesia, tetapi juga digunakan di beberapa program studi farmasi dan kedokteran lainnya di Indonesia. Kerangka susunan buku ini difokuskan pada pemahaman tentang mikroorganisme khususnya bakteri, baik jenis, bentuk, sifat, peranan, dan patogenisitasnya, sehingga dapat diketahui cara pencegahan infeksi dan cara pengobatan penyakit yang ditimbulkannya.Uraian mekanisme patogenesis bakteri yang dikelompokkan berdasarkan organ tubuh manusia membuat buku ini menjadi lebih menarik dan memudahkan para mahasiwa dalam memahami jenis-jenis bakteri yang dapat menginfeksi organ tubuh manusia. Selain itu, dibahas pengetahuan tentang manfaat mikroorganisme dalam bidang kefarmasian, antara lain peranan mikroorganisme dalam pengembangan sediaan farmasi dan industri makanan, serta analisis keamanan sediaan farmasi dan makanan secara mikrobiologi. Dengan terbitnya buku ini, diharapkan dapat memudahkan mahasiswa untuk memahami dengan baik tentang mikroorganisme, khususnya bakteri-bakteri penyebab penyakit infeksi dan bakteri-bakteri yang bermanfaat dalam bidang farmasi dan kesehatan. Saya berterima kasih atas semua masukan dan saran untuk perbaikan dan penyempurnaan buku ini. Semoga buku ini dapat bermanfaat. Terima kasih. Penulis
DAFTAR
ISI
KATA P E N G A N T A R
V
DAFTAR TABEL
X
DAFTAR G A M B A R
xii
BAB 1
PENDAHULUAN
Latar Belakang Sejarah Mikrobiologi Pengertian dan Peranan Mikroorganisme Klasifikasi Mikroorganisme BAB 2
STRUKTUR DAN MORFOLOGI SEL BAKTERI
Bentuk Sel Bakteri Struktur Utama Makromolekul Bakteri Struktur Sel Bakteri Endospora BAB 3
10 10 11 19
PERTUMBUHAN BAKTERI
Pertumbuhan Bakteri Faktor-Faktor yang Memengaruhi Pertumbuhan Bakteri Media Perbenihan Siklus Pertumbuhan Bakteri Pengukuran Pertumbuhan Bakteri BAB 4
2 2 4 6
21 21 27 33 36
METABOLISME BAKTERI
Metabolisme Jalur Metabolisme Produksi Energi Metabolisme Karbohidrat Metabolisme Lemak dan Protein Identifikasi Jenis Bakteri Berdasarkan Sifat Biokimia
43 44 45 52 53
Daftar Isi
BAB 5
PENGENDALIAN
MIKROORGANISME
Tujuan Pengendalian Mikroorganisme Pengendalian Mikroorganisme secara Fisika Pengendalian Mikroorganisme secara Kimia Pengendalian Mikroorganisme dengan Antibiotik Penggunaan Kemoterapi Golongan Antimetabolit Penggunaan Antiseptik Penggunaan Bahan Pengawet Uji Koefisien Fenol BAB 6
GENETIKA BAKTERI
Genetika Sifat dan Fungsi Materi Genetik Struktur DNA dan RNA Dogma Sentral Kromosom Bakteri Perpindahan Gen pada Bakteri Mutasi Teknologi DNA Rekombinan BAB 7
•
95 96
PATOGENESIS INFEKSI BAKTERI
Infeksi Bakteri Habitat Mikroorganisme Patogenisitas, Virulensi, dan Infeksi Perjalanan Penyakit Infeksi Penularan Penyakit Infeksi BAB 9
107 107 109 111 113
BAKTERI PATOGEN PADA MANUSIA
Bakteri Patogen Kelompok Bakteri Patogen B A B 10
74 74 74 76 81 81 82 85
KLASIFIKASI DAN IDENTIFIKASI B A K T E R I
Klasifikasi Bakteri Identifikasi Bakteri BAB 8
56 56 62 68 69 69 70 71
118 118
B A K T E R I PATOGEN PADA S A L U R A N CERNA
Pendahuluan Escherichia coli Salmonelia typhi Shigelia dysenteriae Vibrio cholerae Vibrio parahaemolyticus
125 ,
125 130 138 141 143
vili
Daftar Isi
Vibrio parahaemolyticus
143
Vibrio vulnificus Clostridium perfrmgens Helicobacter pylori
144 146 148
Bacilius
150
cereus
B A B 11
BAKTERI PATOGEN PADA S A L U R A N NAPAS
Pendahuluan
153
Streptococcus
153
Patogenesis
156
Streptococcus pneumoniae Haemophilus influenzae Corynebacterium diphtheriae Mycobacterium tuberculosis Bordetella pertussis Mycoplasma pneumoniae Legionelia pneumophila
159 160 163 165 173 175 177
B A B 12
,
B A K T E R I PATOGEN PADA KULIT DAN MATA
Pendahuluan
179
Staphyiococcus
aureus
Staphyiococcus
epidermis
179 194
Ctilamydia trachomatis Streptococcus pyogenes
194 199
Pseudomonas aeruginosa Propionibacterium acnes
201 205
B A B 13
B A K T E R I PATOGEN PADA S A L U R A N UROGENITAL
Pendahuluan
208
Neisseria gonorrhoeae Treponema pallidum
208 211
Leptospira Gardnerella
interrogans vaginalis
217 218
B A B 14
B A K T E R I PATOGEN PADA SISTEM S A R A F
Pendahuluan
223
Neisseria meningitidis Listeria monocytogenes Clostridium tetani Clostridium botulinum Mycobacterium leprae
223 225 227 228 229
'
D a f t a r isi
B A B 15
jx
BAKTERI PATOGEN PADA SISTEM K A R D I O V A S K U L A R D A N SISTEM LIMFATIK
Pendahuluan
234
Yersinia Rickettsia Bacilius Borrelia Brucelia
235 238 241 243 244
B A B 16
pestis anthracis burgdorferi melitensis PERANAN MIKROORGANISME D A L A M INDUSTRI M A K A N A N DAN SEDIAAN FARMASI
Pendahuluan Mikroorganisme dalam Bahan Makanan Kerusakan Makanan Pengawetan Bahan Makanan Peranan Mikroorganisme dalam Produksi Bahan Makanan Peranan Mikroorganisme dalam Produksi Sediaan Farmasi B A B 17
247 247 250 251 255 259
ANALISIS KEAMANAN SEDIAAN FARMASI DAN MAKANAN SECARA MIKROBIOLOGI
Pendahuluan Pengujian Cemaran Bakteri Identifikasi Bakteri Patogen Identifikasi Identifikasi Identifikasi Identifikasi Identifikasi Identifikasi Identifikasi Identifikasi
bakteri bakteri bakteri bakteri bakteri bakteri bakteri bakteri
Identifikasi Candida
Escherichia coli Clostridium perfringens Salmonelia typhi Staphyiococcus aureus Pseudomonas aeruginosa Bacilius cereus Vibrio parahaemolyticus Vibrio cholerae albicans
268 269 273 273 278 280 282 282 283 284 285 286
Pengujian Sterilitas Sediaan Farmasi dan Alat Kesehatan Pengujian Potensi Antibiotik Pengujian Potensi Vitamin
287 295 301
DAFTAR PUSTAKA
306
INDEKS
307
DAFTAR
TABEL
Tabel 2.1. Makromolekul Penyusun Materi Sel Bakteri Tabel 2.2. Struktur, Fungsi, dan Makromolekul Penyusun Sel Bakteri Tabel 3.1. Pengaruh Oksigen Terhadap Pertumbuhan Berbagai Tipe Bakteri Tabel 3.2. Daftar Nilai Duga Terdekat (Most Probable ISumber, MPN) Menggunakan Tiga Buah Tabung Tabel 4.1. Produk Akhir Fermentasi Asam Piruvat oleh Beberapa Jenis Mikroorganisme Tabel 5.1. Contoh Hasil Pengamatan Uji Koefisien Fenol Tabel 6.1. Sandi Genetik Tabel 6.2. Beberapa Enzim Endonuklease Restriksi dan Lokasi Pemotongannya Tabel 7.1. Diferensiasi Zat Warna pada Proses Pewarnaan Gram Tabel 7.2. Hasil Uji Sifat Biokimia untuk Identifikasi Bakteri Enterik Tabel 8.1. Perbedaan Eksotoksin dan Endotoksin Mikroorganisme Tabel 8.2. Beberapa Jenis Toksin yang Diproduksi oleh Bakteri Tabel 9.1. Beberapa Jenis Bakteri yang Dapat Menyebabkan Penyakit pada Manusia Tabel 9.2. Target Organ Tubuh dan Penyakit Infeksi yang Disebabkan oleh Bakteri Patogen Tabel 11.1. Beberapa Spesies Streptococcus dan Perbedaannya Tabel 12.1. Infeksi pada Kulit dan Mata yang Disebabkan oleh Bakteri Tabel 16.1. Jenis Bakteri yang Dapat Mencemari Bahan Pangan Tabel 16.2. Jenis Mikroorganisme dan Jenis Kerusakan pada Bahan Makanan X
11 18 28 39 49 72 80 87 99 103 110 111 119 120 154 179 248 251
Daftar Tabel
Tabel 16.3. Beberapa Produk Fermentasi Berbagai Jenis Bahan Baku oleh Mikroorganisme Tabel 16.4. Beberapa Jenis Mikroorganisme Penghasil Antibiotik Tabel 16.5. Beberapa Jenis Asam Amino yang Diproduksi Melalui Proses Fermentasi Tabel 16.6. Beberapa Produk Steroid yang Dihasilkan Melalui Biokonversi Substrat oleh Mikroorganisme Tabel 16.7. Beberapa Produk Farmasi yang Diperoleh Melalui Rekayasa Genetika Tabel 17.1. Jenis Pengujian Mikrobiologi pada Produk Farmasi, Kosmetika, Makanan, Minuman, dan Alat Kesehatan Tabel 17.2. Daftar Nilai Duga Terdekat (Most Probable Number, MPN) Menggunakan 3 tabung Tabel 17.3. Daftar Nilai Duga Terdekat (Most Probable Number, MPN) Menggunakan 5 tabung Tabel 17.3. Jumlah Sampel untuk Pengujian Sterilitas Sediaan Tabel 17.4. Volume Sampel dan Volume Media yang Digunakan untuk Uji Sterilitas Tabel 17.5. Hasil Pengukuran Diameter Zona Hambatan Menurut Farmakope Indonesia Edisi IV Tabel 17.6. Pengolahan Data untuk Penghitungan Potensi Antibiotik Menurut Farmakope Indonesia Edisi IV Tabel 17.7. Mikroba Uji, Media Pengujian, dan Suhu Inkubasi untuk Penentuan Potensi Beberapa Jenis Vitamin
xi
256 260 262 264 266 268 276 278 288 289 300 301 302
DAFTAR
Gambar 2.1 Gambar 2.2 Gambar 2.3 Gambar 2.4 Gambar 2.5 Gambar 3.1 Gambar 3.2 Gambar 3.3 Gambar 3.4 Gambar 3.5 Gambar 3.6 Gambar 4.1 Gambar 4.2 Gambar 4.3 Gambar 4.4 Gambar 4.5 Gambar 4.6 Gambar 4.7 Gambar 4.8
GAMBAR
Struktur sel bakteri Gram-negatif Struktur sel bakteri Gram-positif Struktur dasar flagel bakteri Gram-negatif Dinding sel bakteri Gram-positif Dinding sel bakteri Gram-negatif Graflk pertumbuhan beberapa jenis bakteri Pengaruh tekanan osmotik terhadap sel bakteri Bejana anaerob untuk menginkubasi bakteri anaerob dalam cawan petri Pembelahan biner pada bakteri Siklus pertumbuhan sel bakteri Cara penghitungan jumlah bakteri dengan menggunakan Ruang Penghitung Peranan ATP dalam reaksi anabolik dan reaksi katabolik Bagan sederhana jalur metabolisme pengubahan materi awal A menjadi produk akhir F Proses fermentasi dan respirasi glukosa dalam sel Bagan reaksi glikolisis jalur Embden-Meyerhof Siklus Krebs merupakan rangkaian reaksi oksidasi gugus asetil yang menghasilkan ATP, NADH, dan FADH^ Proses respirasi aerob dapat menghasilkan 38 ATP dari satu molekul glukosa Jalur katabolisme lemak Berbagai jalur katabolisme senyawa organik yang digunakan oleh bakteri dalam proses respirasi untuk menghasilkan energi xii
12 12 13 15 15 22 24 30 34 35 40 44 45 46 48 50 51 53 54
• Daftar G a m b a r '
Gambar 6.1 Struktur paralel DNA untai ganda Gambar 6.2 Dogma sentral biologi Gambar 6.3 Reaksi penambahan nukleotida pada replikasi DNA Gambar 6.4 Salah satu contoh struktur plasmid yang digunakan sebagai wahana kloning atau vektor Gambar 6.5 Peranan enzim endonuklease restriksi dan enzim DNA ligase dalam pembuatan DNA rekombinan Gambar 6.6 Tahapan rekayasa genetika Gambar 6.7 Salah satu teknik untuk menyeleksi koloni bakteri yang mengandung plasmid DNA rekombinan Gambar 7.1 Skema uji sifat biokimia untuk identifikasi genus golongan bakteri enterik Gambar 10.1 Mekanisme diare akibat infeksi Salmonelia Gambar 11.1 Streptococcus pneumoniae terlihat sebagai sepasang diplokokus dengan menggunakan mikroskop elektron Gambar 15.1 Bacilius anthracis dalam pewarnaan Gram (1500 x) Gambar 17.1 Skema pemeriksaan angka lempeng total (ALT) Gambar 17.2 Skema pemeriksaan angka kapang-khamir (AKK) Gambar 17.3 Skema pemeriksaan angka coliform dengan metode Nilai Duga Terdekat menggunakan deretan 3 tabung Gambar 17.4 Skema pemeriksaan angka coliform dengan metode Nilai Duga Terdekat menggunakan deretan 5 tabung Gambar 17.5 Rancangan penetapan potensi antibiotik menurut Farmakope Indonesia edisi III Gambar 17.6 Rancangan penetapan potensi antibiotik menurut Farmakope Indonesia edisi IV
xiil
75 77 78 88 90 91 92 102 134 159 241 270 272 275 277 296 298
B A B 1 PENDAHULUAN • Latar Belabang • Sejarah Mikrobiologi Pengertian dan Peranan Mikroorganisme • Klasifikasi Mikroorganisme
1
2
B u b u Ajar Mikrobiologi: P a n d u a n Mahasiswa Farmasi d a n Kedokteran
LATAR
B E L A K A N G
Mikroorganisme merupakan mahluk hidup yang sangat kecil dan sangat penting dalam memelihara keseimbangan ekologi dan ekosistem di bumi. Beberapa mikroorganisme bersifat menguntungkan dan ada pula yang merugikan, baik terhadap manusia maupun hewan. Sebagai contoh, mikroorganisme yang menguntungkan dapat dimanfaatkan dalam pembuatan makanan yang dapat dikonsumsi oleh manusia maupun hewan. Akan tetapi, tidak sedikit mikroorganisme yang dapat merugikan manusia karena dapat menimbulkan penyakit yang berbahaya bagi tubuh manusia. Oleh karena itu, penting sekali untuk mengetahui segala sesuatu mengenai mikroorganisme, baik jenis, bentuk, sifat, peranan, maupun patogenisitas mikroorganisme untuk menghindari infeksi yang disebabkan oleh mikroorganisme ataupun untuk mengobati penyakit yang ditimbulkannya. Selain itu, pengetahuan tentang mikroorganisme sangat bermanfaat dalam kehidupan kita sehari-hari dalam rangka menjalani * hidup yang bersih dan sehat. SEJARAH
MIKROBIOLOGI
Salah satu penemuan penting dalam sejarah biologi terjadi pada tahun 1665, ketika seorang berkebangsaan Inggris, Robert Hooke, melakukan penelitian terhadap sepotong gabus tipis dan menemukan bahwa struktur paling kecil dari unit kehidupan adalah sel. Temuan Hooke ini menandai awal mulanya teori sel yang berbunyi: ''Semua struktur kehidupan disusun oleh seF', Anthony van Leeuwenhoek adalah orang pertama yang meneliti mikroorganisme hidup menggunakan kaca pembesar. Anthony van Leeuwenhoek menggambar bentuk "hewan" yang terdapat di air hujan, di dalam air yang telah dicelupi dengan jagung, dan di dalam materi yang dikikis dari giginya, yang pada akhirnya, gambar tersebut dikenal sebagai bentuk bakteri dan bentuk protozoa. Sampai pertengahan abad ke-19, banyak ilmuwan dan filsuf yang percaya bahwa bentuk kehidupan dapat timbul secara spontan dari bahan yang tidak hidup; mereka menyebutnya sebagai ''teori generasi spontan". Perlawanan terhadap teori generasi spontan datang dari Francesco Redi, pada tahun 1668, yang membuat suatu pembuktian bahwa belatung tidak timbul secara spontan dari daging mentah. Namun, pernyataan Redi (1668) yang berlawanan dengan teori generasi spontan tidak dapat meyakinkan para ilmuwan lainnya. Mereka menyatakan bahwa air yang segar dibutuhkan dalam proses generasi secara spontan. Oleh karena itu, Redi melakukan percobaan yang kedua. Dari percobaan kedua diketahui bahwa belatung muncul hanya ketika lalat dapat meninggalkan telurnya di dalam daging tersebut. Hasil percobaan Redi merupakan bantahan yang serius atas keyakinan yang sudah sangat lama dipercaya bahwa bentuk kehidupan dapat timbul dari suatu yang tidak hidup. Bagaimanapun juga, banyak ilmuwan yang masih percaya bahwa organisme kecil yang cukup sederhana dapat hidup secara spontan dari materi yang tidak hidup. Pendapat bahwa mikroorganisme dapat hidup secara spontan semakin kuat ketika John Needham pada tahun 1745 menemukan bahwa meskipun cairan nutrisi (air kaldu
Bab 1 - Pendahuluan
3
ayam) telah dipanaskan sebelum dituangkan ke dalam labu atau botol yang tertutup, larutan yang telah dingin segera penuh dengan mikroorganisme. Needham menyatakan bahwa mikroba berkembang secara spontan dari larutan tersebut. Dua puluh tahun kemudian, Lazzaro Spallanzani, seorang ilmuwan Italia percaya bahwa mikroorganisme dari udara kemungkinan masuk ke dalam larutan Needham setelah larutan tersebut dididihkan. Spallanzani menunjukkan bahwa larutan kaldu yang dipanaskan setelah dimasukkan ke dalam sebuah tabung atau botol yang tertutup tidak menunjukkan adanya pertumbuhan mikroorganisme. Needham menanggapi pernyataan tersebut dengan menyatakan bahwa unsur yang sangat penting untuk beregenerasi secara spontan telah dirusak oleh panas dan harus dipertahankan di dalam tabung yang telah ditutup rapat atau disegel. Rudolf Virchow menentang teori generasi spontan dengan sebuah konsep ''biogenesis" yang menyatakan bahwa sel-sel yang hidup dapat timbul hanya dari sel hidup lainnya yang telah ada sebelumnya. Argumentasi tentang generasi spontan terus berlanjut sampai tahun 1861, ketika Louis Pasteur mendemonstrasikan bahwa mikroorganisme ada di udara dan dapat mengontaminasi larutan yang steril, tetapi udara sendiri tidak menciptakan atau menghasilkan mikroba. Pasteur menunjukkan bahwa mikroorganisme dapat ada di dalam bahan yang tidak hidup, misalnya dalam padatan, cairan, dan udara. Selanjutnya, dia mendemonstrasikan secara meyakinkan bahwa kehidupan mikroorganisme dapat dihancurkan oleh panas dan metode tersebut dapat digunakan untuk menghambat kegiatan mikroorganisme di udara. Hasil penemuan ini menjadi dasar telinili aseptili, yaitu teknik untuk mencegah kontaminasi oleh mikroorganisme yang tidak diinginkan. Teknik itu sekarang digunakan sebagai standar praktik di dalam laboratorium dan ruang bedah. Para ilmuwan percaya bahwa generasi spontan mungkin terjadi di bumi yang primitif ketika kehidupan pertama kali ada. Akan tetapi, mereka sepakat bahwa hal ini tidak terjadi dalam lingkungan kehidupan yang sekarang ini. Tahun 1857 sampai 1914 merupakan "masa emas mikrobiologi''. Selama periode ini, beberapa penemuan spektakuler telah dilakukan oleh beberapa peneliti. Louis Pasteur dan Robert Koch merupakan orang-orang yang pertama kali mengungkapkan sebuah pemahaman bahwa mikrobiologi adalah ilmu pengetahuan. Berbagai temuan selama periode ini telah diperkenalkan, termasuk temuan mikroorganisme penyebab berbagai macam penyakit dan peranan kekebalan dalam mencegah dan mengobati penyakit. Selama masa keemasan mikrobiologi, para ahli mikrobiologi mempelajari aktivitas biokimia mikroorganisme, mengembangkan teknik-teknik mikroskopik untuk menunjukkan sifat dan morfologi mikroorganisme, serta mengembangkan vaksin dan teknik pembedahan. Salah satu fenomena yang menggambarkan hubungan antara mikroorganisme dan penyakit yang dapat ditimbulkan ditunjukkan pada saat sekelompok ilmuwan Perancis mempertanyakan proses perubahan yang terjadi pada pembuatan anggur dan bir yang rasanya menjadi masam. Banyak ilmuwan yang percaya bahwa udara yang ada di sekeliling gula yang terdapat di dalam larutan anggur berubah menjadi alkohol. Louis Pasteur menemukan bahwa mikroorganisme yang dimasukkan dalam larutan itu, ragi,
B u k u Ajar Mikrobiologi: P a n d u a n Mahasiswa Farmasi d a n Kedokteran
dapat mengubah gula menjadi alkohol tanpa adanya udara. Proses ini kemudian dikenal sebagai proses fermentasi, yang digunakan untuk membuat anggur dan bir. Louis Pasteur juga menemukan bahwa pemanasan berulang bir dan anggur akan membunuh kebanyakan bakteri yang menyebabkan pembusukan. Proses ini disebut dengan pasteurisasi^ yang sekarang umumnya digunakan untuk membunuh bakteri yang dapat membuat busuk dan bakteri yang berpotensi membahayakan di dalam susu dan minuman beralkohol. Fenomena pembusukan makanan yang disebabkan oleh mikroorganisme ini merupakan landasan untuk menjelaskan hubungan antara penyakit dan mikroorganisme. P Sebuah teori yang mengatakan bahwa mikroorganisme dapat menyebabkan penyakit pada manusia atau hewan disebut dengan ^teori liuman penyebab penyaliit'\ Teori ini awalnya sulit diterima sebab kebanyakan orang percaya bahwa penyakit merupakan hukuman bagi orang-orang yang sering melakukan kejahatan. Kebanyakan orang yang lahir di zaman Pasteur meyakini konsep bahwa mikroba yang tidak terlihat dapat pergi melalui udara untuk menginfeksi tanaman dan hewan dan dapat berpindah dari satu orang ke orang lain. Bukti utama bahwa bakteri dapat menimbulkan penyakit dikemukakan oleh Robert Koch pada tahun 1876. Koch menemukan Bacilius anthracis dalam darah ternak yang mati karena penyakit antraks. Koch kemudian mencampurkan bakteri tersebut dengan media dan disuntikkan ke dalam tubuh hewan yang sehat. Ketika hewan yang sehat ini menjadi sakit dan mati, Koch mengisolasi bakteri yang ada di dalam darah hewan tersebut dan membandingkan bakteri itu dengan bakteri asal yang telah diisolasi. Ia menemukan bahwa kedua darah binatang tersebut mengandung bakteri yang sama. Selanjutnya, Robert Koch melakukan beberapa percobaan yang secara langsung membuktikan bahwa mikroorganisme yang spesifik dapat menimbulkan penyakit yang spesifik pula. Langkah-langkah ini dikenal sebagai "postulat Koch*', PENGERTIAN DAN PERANAN
MIKROORGANISME
Mikroorganisme merupakan mahluk hidup yang sangat kecil dan tidak dapat dilihat dengan mata telanjang, tetapi dapat dilihat dengan bantuan mikroskop. Dalam penyebarannya, mikroorganisme dapat ditemukan hampir di setiap tempat. Mikroorganisme terdiri atas bakteri, fungi, protozoa, alga mikroskopik, dan virus, r: Sebagian besar mikroorganisme mempunyai peranan yang sangat penting bagi ^ kesejahteraan penduduk dunia dengan membantu keseimbangan hidup organisme dan bahan kimia di lingkungan kehidupan. Sebagai contoh, mikroorganisme tanah membantu menghancurkan sampah dan mengubah gas nitrogen dalam udara menjadi senyawa organik yang dapat didaur ulang dengan bahan-bahan kimia di dalam tanah, air, dan udara. Mikroorganisme berperan dalam proses fotosintesis yang sangat penting untuk kehidupan di muka bumi. Manusia dan banyak hewan lain bergantung pada mikroorganisme untuk menyintesis beberapa jenis vitamin yang dibutuhkan untuk' metabolisme tubuh. Mikroorganisme juga mempunyai banyak kegunaan untuk tujuan komersial, misahiya untuk menyintesis produk-produk kimia, seperti aseton, asam organik, enzim, alkohol, dan obat-obatan. Proses biokonversi untuk memproduksi
Bab 1 - P e n d a h u l u a n
aseton dan butanol menggunakan mikroorganisme telah dilakukan pada tahun 1914 oleh Chaim Weizermann, seorang ahli kimia kelahiran Rusia yang tinggal di Inggris. Industri makanan juga menggunakan mikroorganisme untuk memproduksi cuka, acar, minuman beralkohol, minyak zaitun, kecap, susu, keju, yogurt, dan roti. Meskipun jumlah mikroorganisme patogen hanya sedikit, pengetahuan tentang sifat-sifat mikroorganisme patogen sangat penting untuk upaya penemuan obat dan pemeliharaan kesehatan. Beberapa peranan mikroorganisme yang menguntungkan bagi manusia, hewan, dan tumbuhan dijelaskan berikut ini. Daur ulang unsur-unsur penting
Martinus Beijerrinck dan Sergei Winogradsky (1880) adalah orang-orang pertama yang menemukan bahwa bakteri membantu mendaur ulang unsur-unsur penting yang terdapat di tanah dan udara sehingga mikroorganisme diketahui mempunyai hubungan yang sangat penting dengan lingkungan. Sekarang, pengetahuan tentang ekologi mikroorganisme telah berkembang, termasuk dalam mempelajari bagaimana populasi mikroorganisme berinteraksi dengan tanaman, hewan, lingkungan, polusi air, dan bahan-bahan kimia lain. Unsur kimia seperti karbon, nitrogen, oksigen, sulfur, dan fosfor sangat penting dalam kehidupan. Mikroorganisme mempunyai peranan penting dalam mengubah unsur-unsur tersebut menjadi bentuk yang dapat digunakan oleh tumbuhan dan hewan. Mikroorganisme, umumnya bakteri dan fungi, berperan dalam mengembalikan karbon dioksida ke udara, yaitu saat mikroorganisme membusukkan sampah organik, tanaman, dan hewan yang mati. Alga, sianobakteri, dan tumbuhan tingkat tinggi menggunakan karbon dioksida dalam proses fotosintesis untuk menghasilkan karbohidrat yang digunakan oleh hewan, fungi, dan bakteri. Nitrogen di udara yang jumlahnya berlimpah harus diubah menjadi bentuk yang dapat digunakan oleh tumbuhan dan hewan. Perubahan unsur-unsur penting ini hanya dapat terjadi secara alami oleh peranan mikroorganisme. Penanganan polusi dengan metode bioremediasi
Pada tahun 1988, para ilmuwan mulai menggunakan mikroorganisme untuk mengatasi polusi dan membersihkan sampah beracun yang dihasilkan dalam berbagai proses industri. Beberapa bakteri dapat memanfaatkan polusi sebagai sumber energi. Selain itu, bakteri menghasilkan enzim tertentu yang dapat menghancurkan racun menjadi substansi yang kurang berbahaya. Proses mengatasi polusi dan membersihkan bahan beracun menggunakan bakteri disebut dengan bioremediasi. Enzim bakteri juga dapat digunakan untuk menghilangkan sumbatan dalam saluran-saluran pembuangan tanpa menambahkan bahan kimia yang dapat membahayakan lingkungan. Mikroorganisme yang sering digunakan untuk bioremediasi adalah Pseudomonas dan Bacilius. Enzim Bacilius ']\xgdi digunakan sebagai detergen rumah tangga untuk menghilangkan noda pakaian.
6
B u b u Ajar Mikrobiologi: P a n d u a n Mahasiswa Farmasi d a n Kedokteran
Pencegahan serangga dan hama tanaman
Selain dapat menyebarkan penyakit, serangga dapat menyebabkan kerugian pada hasil pertanian. Hama tanaman biasanya diatasi dengan menggunakan pestisida kimia. Akan tetapi, penggunaan bahan kimia tersebut sering kali menimbulkan dampak yangj kurang baik bagi lingkungan. ^ Penggunaan bakteri untuk melindungi hasil pertanian dari serangan hama sudali; banyak dilakukan. Bacilius thuringiensis telah digunakan secara luas untuk membasmi hama tanaman, seperti ulat, cacing, dan serangga. Bakteri Bacilius thuringiensis menghasilkan toksin bagi serangga dan hama tanaman lainnya. Dengan kemajuan teknik rekayasa genetika gen yang menyandi pembentukan toksin Bacilius thuringiensis, toksin tersebut dapat dikloning dalam tanaman yang akan dilindungi dari serangan hama dan serangga sehingga tanaman tersebut dapat menghasilkan toksin Bacilius thuringiensis. Jika bagian tanaman yang mengandung toksin itu dimakan oleh hama atau serangga, hama dan serangga tersebut akan mati. Penggunaan insektisida yang berasal dari bakteri bersifat ramah lingkungan sehingga menghindari pencemaran lingkungan. Peranan penting dalam bioteknologi m o d e r n dan rekayasa genetika
Peranan mikroorganisme dalam bidang bioteknologi telah sejak lama dikenal. Beberapa tahun belakangan ini, bioteknologi telah berkembang pesat melalui sebuah revolusi rekayasa genetika yang memunculkan bioteknologi modem. Teknologi DNA rekombinan, kloning DNA, dan rekayasa genetika telah memperluas peranan bakteri, fungi, virus, dan sel-sel lain dalam berbagai bidang kehidupan. Teknik DNA rekombinan telah digunakan untuk menghasilkan sejumlah protein, vaksin, dan enzim alami yang mempunyai potensi besar dalam bidang kesehatan. Hasil teknik DNA rekombinan yang sangat penting dan menarik perhatian para ilmuwan adalah terapi gen, yaitu suatu cara memasukkan gen untuk menggantikan gen yang cacat/rusak di dalam sel manusia. Teknik ini menggunakan virus yang tidak berbahaya untuk membawa gen baru yang dimasukkan sedemikian rupa ke dalam sel inang sehingga gen tersebut akan dapat disisipkan dan terintegrasi ke dalam kromosom sel inang KLASIFIKASI M I K R O O R G A N I S M E
|
Penamaan dan klasifikasi mikroorganisme sangat penting untuk memudahkan kita; mengenali dan mengetahui sifat-sifat mikroorganisme. Pada tahun 1735, Carolus Linnaeus membuat suatu sistem binomial nomenclature (penamaan binomial) untuk suatu organisme. Dengan sistem ini, suatu organisme diberi nama dengan dua kata, yaitu nama genus dan diikuti dengan nama spesies. Genus merupakan kata pertama yang huruf awalnya adalah huruf kapital, sedangkan nama spesies ditulis dengan huruf kecil. Kedua gabungan kata ini harus diberi garis bawah atau dicetak miring. Nama spesies dapat mengacu pada berbagai hal, misalnya menggambarkan bentuk organisme, penghormatan kepada si penemu, atau identitas dari habitat atau tempat tinggal spesies-
[Bab 1 - Pendahuluan^^
tersebut. Sebagai contoh, Staphyiococcus aureus, bakteri yang umumnya ditemukan di kulit manusia, mempunyai arti berikut: Staphylo menggambarkan susunan dari sel-selnya; coccus mengindikasikan bahwa bakteri ini berbentuk bulat; dan aureus, berasal dari bahasa latin, berarti emas, menunjukkan warna koloni bakteri ini. Jenis-jenis mil1600
^
279
J u m l a h t a b u n g y a n g p o s i t i f p a d a u j i k o n f i r m a s i d i c a t a t . N i l a i D u g a T e r d e k a t coliform p e r 1 0 0 m l s a m p e l k e m u d i a n d i h i t u n g d e n g a n m e n g g u n a k a n D a f t a r N i l a i D u g a Terdekat m e n g g u n a k a n 5 tabung, seperti d i t u n j u k k a n pada T a b e l 17.3.
Identifikasi bakteri Clostridium
perfringens
S a m p e l y a n g a k a n d i p e r i k s a d i h o m o g e n k a n d a n d i e n c e r k a n d e n g a n l a r u t a n peptone dilution fluid ( P D F ) h i n g g a d i d a p a t k a n p e n g e n c e r a n 1 0 ' . L a r u t a n s a m p e l h a s i l p e n g enceran dipipet sebanyak 2 m l dan d i m a s u k k a n k e d a l a m tabung y a n g berisi 18 m l fluid thioglycollate medium, k e m u d i a n d i i n k u b a s i p a d a s u h u 37°C s e l a m a 2 4 j a m .
280
Buku Ajar Mikrobiologi: Panduan Mahasiswa Farmasi dan Kedokteran
Bila terlihat pertumbuhan, biakan diinokulasikan ke dalam cawan petri yang berisi m e d i a s e l e k t i f sulfite polymyxin sulfadiazine agar ( S P S A ) d a n d i i n k u b a s i p a d a s u h u 37°C s e l a m a 2 4 - 4 8 j a m d e n g a n p o s i s i t e r b a l i k p a d a b e j a n a a n a e r o b . B i l a t e r l i h a t p e r t u m b u h a n k o l o n i s p e s i f i k y a n g d i d u g a b a k t e r i Clostridium perfringens, i d e n t i f i k a s i dilanjutkan dengan u j i k o n f i r m a s i , antara lain pewarnaan spora, u j i m o t i l i t a s d a l a m m e d i a s e m i s o l i d , d a n u j i r e d u k s i n i t r a t . B i a k a n d i i n o k u l a s i k a n p a d a m e d i a nitrate broth d a n d i i n k u b a s i p a d a s u h u 37°C s e l a m a 2 4 j a m . S e t e l a h i t u , s e b a n y a k 0 , 5 - 1 m l larutan a - n a f t i l a m i n dan 0,5-1 m l asam sulfanilat ditambahkan k e dalam biakan. W a m a m e r a h m u d a sampai m e r a h akan t i m b u l apabila bakteri mereduksi nitrat m e n jadi nitrit.
Identifikasi bakteri Salmonella
typhi
Sampel yang akan diperiksa terlebih dahulu dihomogenkan dan dilakukan pra-pengay a a n d e n g a n l a m t a n lactose broth ( L B ) , y a i t u d e n g a n m e m i n d a h k a n 2 5 m l s a m p e l s e c a r a a s e p t i s k e d a l a m b o t o l y a n g b e r i s i 2 2 5 m l m e d i a lactose broth ( L B ) , k e m u d i a n d i i n k u b a s i p a d a s u h u 37°C s e l a m a 2 4 j a m . S e b a n y a k 10 m l b i a k a n pra-pengayaan d i p i n d a h k a n k e d a l a m m e d i a p e n g a y a a n y a n g t e r d i r i a t a s 1 0 0 m l m e d i a tetrathionate brilliant green agar ( T B G B ) d a n 1 0 0 m l m e d i a selenite cysteine broth ( S C B ) , k e m u d i a n d i i n k u b a s i p a d a s u h u 2>TC s e l a m a 2 4 jam. B a k t e r i Salmonella typhi d i i d e n t i f i k a s i d e n g a n m e n g i n o k u l a s i k a n 1 s e n g k e l i t b i a k a n p e n g a y a a n p a d a c a w a n p e t r i y a n g b e r i s i m e d i a brilliant green agar ( B G A ) d a n bismuth sulfite agar ( B S A ) a t a u p e r b e n i h a n s e l e k t i f l a i n n y a , s e p e r t i SalmonellaShigella agar ( S S A ) , xylose lysine desoxycholate agar ( X L D A ) , d a n hektoen enteric agar ( H E A ) . P e r b e n i h a n k e m u d i a n d i i n k u b a s i p a d a s u h u 37°C s e l a m a 2 4 j a m . K o l o n i y a n g t u m b u h p a d a m e d i a d i d u g a m e m p a k a n Salmonella typhi ykdi m e n u n j u k k a n c i r i ciri sebagai berikut. • •
• • •
Pada B G A , k o l o n i b e r w a m a merah m u d a hingga merah atau bening hingga buram dengan lingkaran merah m u d a sampai merah. Pada B S A , k o l o n i b e r w a m a cokelat, abu-abu sampai h i t a m , dan kadang-kadang dengan kilap l o g a m . W a m a media di sekitar k o l o n i m u l a - m u l a cokelat, k e m u d i a n menjadi h i t a m j i k a masa inkubasi ditambah. Pada beberapa galur, k o l o n i b e r w a m a hijau dengan daerah d i s e k e l i l i n g n y a b e r w a m a lebih gelap. Pada S S A , k o l o n i tidak b e r w a m a sampai merah muda, bening sampai buram. Pada X L D A , k o l o n i b e r w a m a merah m u d a dengan bintik h i t a m di tengah. Pada H E A , k o l o n i b e r w a m a b i m hijau dengan atau tanpa b i n t i k h i t a m di tengah.
L a n g k a h berikutnya adalah u j i konfirmasi.Pada u j i ini, dipilih 2 - 5 k o l o n i spesifik dari m e d i a s e l e k t i f d a n d i i n o k u l a s i k a n p a d a m e d i a nutrient agar ( N A ) , k e m u d i a n d i i n k u b a s i p a d a s u h u 37°C s e l a m a 2 0 - 2 4 j a m . K o l o n i p a d a nutrient agar k e m u d i a n d i i n o kulasikan dengan metode tusukan dan goresan u n t u k mengerjakan uji-uji berikut.
Bab 17 - Analisis K e a m a n a n Sediaan Farmasi
Penanaman
pada media triple sugar Iron agar
(TSIA)
K o l o n i d u g a a n Salmonella d i p i n d a h k a n k e p e r b e n i h a n m i r i n g T S I A d e n g a n c a r a menggores pada bagian m i r i n g dan m e n u s u k pada bagian tegak perbenihan, k e m u d i a n d i i n k u b a s i p a d a s u h u 3TC s e l a m a 2 4 ^ 8 j a m . P e r u b a h a n y a n g t e r j a d i d i a m a t i . Pada bagian tegak, Salmonella akan: • • •
Memfermentasi glukosa, w a m a media bembah dari ungu menjadi kuning. T i d a k m e m f e r m e n t a s i sakarosa, w a m a m e d i a tetap ungu. M e m b e n t u k H^S, w a m a media bembah dari ungu menjadi hitam. Pada bagian miring, Salmonella akan:
• •
M e m f e r m e n t a s i laktosa atau sakarosa, w a m a m e d i a m e n j a d i k u n i n g . T i d a k m e m f e r m e n t a s i laktosa dan sakarosa, w a m a m e d i a tetap m e r a h atau tidak bembah.
UJI pada urea agar
,
K o l o n i d u g a a n Salmonella d i g o r e s k a n p a d a p e r m u k a a n m e d i a urea agar m i r i n g , k e m u d i a n d i i n k u b a s i p a d a s u h u 37°C s e l a m a 2 4 j a m . T i m b u l n y a w a m a m e r a h m u d a m e n u n j u k k a n reaksi positif, sedangkan tidak ada perubahan w a m a m e n u n j u k k a n reaksi negatif.
UJI dekarboksllasi
llsin
K o l o n i d u g a a n Salmonella d i i n o k u l a s i k a n p a d a p e r b e n i h a n c a i r lysine decarboxylase broth, k e m u d i a n d i i n k u b a s i p a d a s u h u 37°C s e l a m a 4 8 j a m . T i m b u l n y a w a m a u n g u menunjukkan reaksi positif
UJI voges
proskauer
K o l o n i d u g a a n Salmonella d i m a s u k k a n m a s i n g - m a s i n g 1 s e n g k e l i t k e d a l a m 2 t a b u n g r e a k s i y a n g m a s i n g - m a s i n g b e r i s i 0 , 2 m l p e r b e n i h a n voges proskauer ( V P ) . T a b u n g k e - I d i i n k u b a s i p a d a s u h u k a m a r d a n t a b u n g k e - 2 d i i n k u b a s i p a d a s u h u 37°C s e l a m a 2 4 - 4 8 j a m . S e l a n j u t n y a , pada tiap tabung, diteteskan 2 tetes l a m t a n k r e a t i n , 3 tetes l a m t a n a - n a f t o l , dan 2 tetes pereaksi K O H . P e n g o c o k a n d i l a k u k a n tiap k a l i pereaksi d i t a m b a h k a n . P e n g a m a t a n d i l a k u k a n s e l a m a 15 m e n i t , t e r b e n t u k n y a w a m a m e r a h j a m b u sampai m e r a h tua m e n u n j u k k a n reaksi positif, sedangkan j i k a tidak bembah, menunjukkan reaksi negatif
UJI Indol K o l o n i d u g a a n Salmonella d i i n o k u l a s i k a n s e b a n y a k 1 s e n g k e l i t k e d a l a m m e d i a i n d o l d a l a m t a b u n g , k e m u d i a n d i i n k u b a s i p a d a s u h u 37°C s e l a m a 2 4 j a m . S e l a n j u t n y a , ditambahkan 1 m lpereaksi indol. Terbentuknya gelang merah m e n u n j u k k a n reaksi positif, sedangkan bila tidak b e r w a m a atau k u n i n g kecokelatan, m e n u n j u k k a n reaksi negatif
282
Uji
Buku Ajar Mikrobiologi: Panduan Mahasiswa Farmasi dan Kedokteran
serologi
K o l o n i d u g a a n Salmonella d i a m b i l s e b a n y a k 1 s e n g k e l i t d a n d i s u s p e n s i k a n d e n g a n j s a t u t e t e s l a r u t a n N a C l fisiologis p a d a k a c a o b j e k . S e l a n j u t n y a , s u s p e n s i d i t e t e s i d e n g a n a n t i s e r u m Salmonella p o l i v a l e n O d a n d i h o m o g e n k a n d e n g a n m e n g g o y a n g k a n • k a c a o b j e k a t a u m e n g g u n a k a n s e n g k e l i t . P e n g a m a t a n d i l a k u k a n s e l a m a 5 m e n i t . Sal- \ monella p o s i t i f j i k a t e r j a d i a g l u t i n a s i .
I d e n t i f i k a s i b a k t e r i Staphylococcus
aureus
S a m p e l y a n g a k a n d i p e r i k s a d i h o m o g e n k a n d a n d i e n c e r k a n d e n g a n l a r u t a n peptone \ dilution fluid ( P D F ) h i n g g a d i d a p a t k a n p e n g e n c e r a n 1 0 ' . S e b a n y a k 2 , 0 m l l a r u t a n \ sampel hasil pengenceran 1 0 ' diambil dan dimasukkan k e dalam tabung reaksi y a n g \ b e r i s i 1 8 , 0 m l m e d i a ttypticase soy broth ( T S B ) , l a l u d i m k u b a s i p a d a s u h u 37°C ; selama 2 4 - 4 8 j a m . B i a k a n dalam T S B kemudian diinokulasikan dengan menggunakan s e n g k e l i t p a d a l e m p e n g m e d i a Baird Parker agar ( B P A ) . P e r l a k u a n y a n g s a m a d i b e - \ r i k a n j u g a u n t u k k o n t r o l p o s i t i f d e n g a n m e n g g o r e s k a n Staphylococcus aureus p a d a m e d i a y a n g s a m a . S e m u a b i a k a n d i i n k u b a s i p a d a s u h u 37°C s e l a m a 2 4 - 4 8 j a m d e n g a n j p o s i s i c a w a n t e r b a l i k . K o l o n i y a n g d i d u g a m^rwpdkm Staphylococcus aureus a d a l a h ; k o l o n i spesifik y a n g b e r w a m a h i t a m mengkilat dengan lingkaran cerah di sekeliling- ' nya. Selanjutnya, k o l o n i dugaan y a n g spesifik dipiUh dari biakan B P A u n t u k d i l a k u k a n 4 u j i k o n f i r m a s i , y a i t u u j i k o a g u l a s e . K u r a n g - l e b i h 1 0 k o l o n i d u g a a n Staphylococcus :; d i p i l i h d a r i b i a k a n B P A d a n d i i n o k u l a s i k a n k e d a l a m m e d i a brain-heart infusion broth j ( B H I B ) . B i a k a n d i i n k u b a s i p a d a s u h u 3 7 ' ' C s e l a m a 2 0 - 2 4 j a m . S e b a n y a k 0 , 1 m l d a r i 'k setiap b i a k a n d a l a m B H I B dipipet d a n d i p i n d a h k a n k e d a l a m t a b u n g r e a k s i steril. | S e l a n j u t n y a , d i t a m b a h k a n 0,3 m l p l a s m a k e l i n c i p a d a m a s i n g - m a s i n g t a b i m g . T a b u n g ' k e m u d i a n d i i n k u b a s i p a d a s u h u 37°C s e l a m a 4 - 6 j a m . D i a m a t i a d a n y a r e a k s i p e n g - 'i g u m p a l a n p l a s m a . P e n g g u m p a l a n m e n u n j u k k a n k o a g u l a s e Staphylococcus aureus | positif.
i d e n t i f i k a s i b a k t e r i Pseudomonas
aeruginosa
Uji bakteri i n i biasanya dilakukan untuk pemeriksaan kualitas dan j a m i n a n m u i produk kosmetika. D a r i hasil homogenisasi pada penyiapan sampel, dipipet 2,0 m l sampel hasil pengenceran 1 0 ' dan dimasukkan k e dalam tabung reaksi yang berisi 1 8 , 0 m l m e d i a trypticase soy broth ( T S B ) . B i a k a n d i i n k u b a s i p a d a s u h u 37°C s e l a m a 2 4 - 4 8 j a m . D a r i b i a k a n T S B , d i a m b i l satu sengkelit d a n d i i n o k u l a s i k a n pada perm u k a a n m e d i a cetrimide agar, k e m u d i a n d i i n k u b a s i p a d a s u h u 37°C s e l a m a 4 8 - 7 2 j a m . D i a m a t i adanya pertumbuhan k o l o n i b e r w a m a kehijauan. K o l o n i spesifik y a n g I b e r w a m a k e h i j a u a n tersebut d i a m b i l dan d i s u s p e n s i k a n d a l a m 0,5 m l T S B , k e m u d i a n d i i n k u b a s i p a d a s u h u 37°C s e l a m a 2 j a m . S a t u s e n g k e l i t b a k t e r i d i a m b i l d a r i m e d i a i n i d a n d i b i a k k a n p a d a m e d i a Pseudomonas agar P ( P A P ) d a n m e d i a Pseudomonas agar F ( P A F ) p a d a 37°C s e l a m a 7 2 j a m . S e l a n j u t n y a , d i l a k u k a n u j i p i g m e n . S a t u s e n g k e l i t l a i n n y a d i g o r e s k a n p a d a nutrient agar m i r i n g d a n d i i n k u b a s i p a d a s u h u 37°C s e l a m a
Bab 17 - Analisis K e a m a n a n Sediaan Farmasi
283
24 j a m . Selanjutnya, d i l a k u k a n u j i oksidase, uji katalase, uji p e r t u m b u h a n pada 41 "C, . an uji mikroskopis dengan pewarnaan G r a m .
Uji
pigmen
C o l o n i Pseudomonas aeruginosa y a n g t u m b u h p a d a m e d i a Pseudomonas agar F P A F ) b e r w a m a k u n i n g k e h i j a u a n , s e d a n g k a n k o l o n i y a n g t u m b u h p a d a m e d i a Pseuiomonas agar P ( P A P ) b e r w a r n a h i j a u k e b i r u a n .
Uji
oiisidase
S a t u s e n g k e l i t b i a k a n d i a m b i l d a r i b i a k a n nutrient agar m i r i n g d a n d i t o t o l k a n p a d a . ertas s i t o k r o m , y a i t u kertas y a n g telah d i j e n u h k a n dengan yV,A^-dimetil-/7-fenilendiamin dihidroklorida. Pembentukan warna merah yang kemudian berubah menjadi ungu m e n u n j u k k a n uji oksidase positif.
Uji
iiataiase
S a t u s e n g k e l i t b i a k a n d i a m b i l d a r i b i a k a n nutrient agar m i r i n g d a n d i c a m p u r d e n g a n setetes larutan h i d r o g e n p e r o k s i d a 3 % pada kaca objek. P e m b e n t u k a n g e l e m b u n g gas m e n u n j u k k a n u j i katalase p o s i t i f
Uji pertumbuiian
pada suit u 41° C
S a t u s e n g k e l i t b i a k a n d i a m b i l d a r i b i a k a n nutrient agar m i r i n g d a n d i i n o k u l a s i k a n p a d a m e d i a trypticase soy broth, k e m u d i a n d i i n k u b a s i p a d a s u h u 41°C s e l a m a 2 4 - 4 8 j a m . K e k e r u h a n m e n u n j u k k a n p e r t u m b u h a n pada suhu 41''C p o s i t i f H a l i n i m e n u n j u k k a n b a h w a b a k t e r i t a h a n t e r h a d a p s u h u 4 1 °C; b a k t e r i g o l o n g a n Pseudomonas t a h a n terhadap pemanasan.
Pewarnaan
Gram
P a d a p e w a m a a n G r a m , Pseudomonas aeruginosa m e r u p a k a n b a k t e r i G r a m - p o s i t i f berbentuk batang.
I d e n t i f i k a s i b a k t e r i Bacilius
cereus
U j i b a k t e r i Bacilius cereus b i a s a n y a d i l a k u k a n u n t u k p e m e r i k s a a n k u a l i t a s d a n j a m i n a n m u t u produk m a k a n a n dan obat tradisional. D a r i hasil homogenisasi, 1 m l s a m p e l d i p i p e t k e d a l a m c a w a n p e t r i y a n g b e r i s i m e d i a Kim & Goepfert agar a t a u Bacilius cereus agar. B i a k a n k e m u d i a n d i i n k u b a s i p a d a s u h u 37°C s e l a m a 2 4 - 4 8 j a m d e n g a n p o s i s i c a w a n t e r b a l i k . K o l o n i y a n g d i d u g a Bacilius cereus d i i n o k u l a s i k a n p a d a m e d i a nutrient agar m i r i n g d a n d i i n k u b a s i p a d a s u h u 3 7 ' ' C s e l a m a 2 4 j a m . S e l a n j u t n y a , d i lakukan uji konfirmasi, yang m e l i p u t i uji pencairan gelatin, uji reduksi nitrat, dan uji voges proskauer.
Uji pencairan
gelatin
D a r i b i a k a n m u r n i nutrient agar m i r i n g , d i i n o k u l a s i k a n 1 s e n g k e l i t k e d a l a m m e d i a tryptone broth y a n g m e n g a n d u n g 1 2 % g e l a t i n . B i a k a n d i i n k u b a s i p a d a s u h u 3 7 ' ' C
Bubu Ajar Mikrobiologi: Panduan Mahasiswa Farmasi dan Kedokteran
s e l a m a 2 4 j a m , k e m u d i a n d i d i n g i n k a n p a d a s u h u 4°C s e l a m a 3 0 m e n i t . A p a b i l a b i a k a n tetap cair, gelatinase p o s i t i f . B i l a m e d i a d a l a m t a b i m g k e m b a l i m e n j a d i padat, gelat i n a s e n e g a t i f . Bacilius cereus m e m b e r i k a n r e a k s i p o s i t i f
Uji redulisi
nitrat
D a r i b i a k a n m u m i nutrient agar m i r i n g , d i i n o k u l a s i k a n 1 s e n g k e l i t k e d a l a m m e d i a nitrate broth. B i a k a n d i i n k u b a s i p a d a s u h u 3TC s e l a m a 2 4 j a m , k e m u d i a n d i t a m bahkan pereaksi nitrat ( 0 , 5 - 1 m l lamtan a-naftilamm dan 0,5-1 m l asam sulfanilat). Jika timbul w a m a jingga sampai merah, biakan m e n u n j u k k a n reduksi nitrat positif. Bacilius cereus m e m b e r i k a n r e a k s i p o s i t i f
Uji voges
prosliauer
ii
D a r i b i a k a n m u m i nutrient agar m i r i n g , d i i n o k u l a s i k a n 1 s e n g k e l i t k e d a l a m me< voges proskauer. B i a k a n d i i n k u b a s i p a d a s u h u 3TC s e l a m a 2 4 - 4 8 j a m . S e b a n y a k 0 , 6 m l l a m t a n a - n a f t o l dan 0,2 m l l a m t a n k a l i u m hidroksida 4 0 % d i t a m b a h k a n k e d a l a m 1 m l biakan d a n didiamkan selama 2 - 4 j a m . W a m a merah m u d a hingga merah m e n u n j u k k a n r e a k s i p o s i t i f . Bacilius cereus m e m b e r i k a n r e a k s i p o s i t i f .
I d e n t i f i k a s i b a k t e r i Vibrio
parahaentolyticus
U j i b a k t e r i Vibrio parahaemolyticus b i a s a n y a d i l a k u k a n u n t u k p e m e r i k s a a n k u a l i t a s dan j a m i n a n m u t u produk makanan dan m i n u m a n . Sampel yang akan diuji d i h o m o g e n k a n d e n g a n l a m t a n m e d i a alkalinepeptone water d a n d i i n k u b a s i p a d a s u h u 3TC selama 2 4 j a m . P e n a n a m a n d i l a k u k a n dari biakan i n i dengan cara digoreskan pada m e d i a s e l e k t i f thiosulphate citrate bile salt sucrose ( T C B S ) agar, k e m u d i a n d i i n k u - ; b a s i p a d a s u h u 37°C s e l a m a 2 0 - 2 4 j a m . Vibrio parahaemolyticus a k a n t u m b u h s e b a - ; gai k o l o n i bulat berdiameter 2 - 3 m m , dengan w a m a hijau atau b i m di bagian tengah \ koloni. Selanjutnya, dilakukan u j i konfirmasi terhadap k o l o n i dugaan, y a n g m e l i p u t i penanaman pada m e d i a T S I A , u j i fermentasi karbohidrat, u j i motilitas, u j i sifat h a l o p i k , u j i d e k a r b o k s l l a s i l i s i n , u j i p e r t u m b u h a n p a d a s u h u 42°C, d a n p e w a m a a n G r a m .
Penanaman
pada media
triple sugar Iron agar
(TSIA)
K o l o n i d u g a a n d i i n o k u l a s i k a n d e n g a n c a r a d i g o r e s k a n p a d a p e r m u k a a n d a n ditusi3P? k a n hingga dasar tabung y a n g berisi m e d i a T S I A , k e m u d i a n d i i n k u b a s i pada s u h u i 37°C s e l a m a 2 4 j a m . Vibrio parahaemolyticus m e n y e b a b k a n p e r m u k a a n m e d i a m e n - ^ j a d i m e r a h dan bagian dasar m e d i a b e r w a m a k u n i n g (asam), tetapi tidak menghasilk a n gas a t a u H ^ S .
Uji fermentasi
karbohidrat
K o l o n i d u g a a n d i i n o k u l a s i k a n p a d a s e j u m l a h m e d i a peptone sugar broth, y a n g masing-masing ditambahkan sukrosa, maltosa, d a n manitol, k e m u d i a n diinkubasi p a d a s u h u 37**C s e l a m a 2 4 j a m . W a m a k u n i n g m e n u n j u k k a n t e r b e n t u k n y a a s a m , y a n g berarti terjadi proses fermentasi.
B a b 17 - Analisis K e a m a n a n Sediaan Farmasi
285^
Vibrio parahaemolyticus d a p a t m e m f e r m e n t a s i m a l t o s a d a n m a n i t o l , t e t a p i t i d a k memfermentasi sukrosa.
Uji
motilitas
K o l o n i dugaan d i i n o k u l a s i k a n dengan cara d i t u s u k k a n k e d a l a m m e d i a m o t i l i t a s , k e m u d i a n d i i n k u b a s i p a d a s u h u 37°C s e l a m a 2 4 j a m . D i a m a t i a d a n y a d i f u s i p e r t u m b u h a n d i s e k i t a r t u s u k a n . Vibrio parahaemolyticus m e r u p a k a n b a k t e r i y a n g m o t i l (bergerak).
Uji sifat
liaiofiiili
K o l o n i d u g a a n d i i n o k u l a s i k a n k e d a l a m 4 t a b u n g b e r i s i m e d i a salt trypticase broth y a n g masing-masing mengandung 0 % , 6 % , 8%, dan 1 0 % N a C l , k e m u d i a n diinkubasi. Vibrio parahaemolyticus t u m b u h p a d a m e d i a y a n g m e n g a n d u n g 6 % d a n 8 % N a C l , tetapi tidak t u m b u h pada media y a n g mengandung 0 % dan 1 0 % N a C l .
Uji dekarboiisiiasi
lisin
K o l o n i d u g a a n d i i n o k u l a s i k a n p a d a m e d i a lysine decarboxylase broth d a n d i i n k u b a s i pada suhu 37"C s e l a m a 4 hari. Pengamatan d i l a k u k a n setiap h a r i . A p a b i l a terjadi d e k a r b o k s l l a s i , m e d i a a k a n b e r w a r n a u n g u . Vibrio parahaemolyticus m e m b e r i k a n reaksi positif
Uji pertumbulian
pada Suhu 42?C
K o l o n i d u g a a n d i i n o k u l a s i k a n p a d a m e d i a trypticase soy broth d a n d i i n k u b a s i p a d a s u h u 4 2 ' ' C s e l a m a 2 4 j a m . Vibrio parahaemolyticus d a p a t t u m b u h p a d a s u h u t e r sebut.
Pewarnaan
Gram
Vibrio parahaemolyticus m e r u p a k a n b a k t e r i G r a m - n e g a t i f y a n g b e r b e n t u k k o m a a t a u batang.
I d e n t i f i k a s i b a k t e r i Vibrio
cholerae
U j i b a k t e r i Vibrio cholerae b i a s a n y a d i l a k u k a n u n t u k p e m e r i k s a a n k u a l i t a s d a n j a m i n a n m u t u produk makanan dan m i n u m a n . S a m p e l y a n g t e l a h d i h o m o g e n k a n d e n g a n l a r u t a n m e d i a alkaline peptone water d i i n k u b a s i p a d a s u h u 37°C s e l a m a 6 j a m . S a t u s e n g k e l i t ( b e r d i a m e t e r 5 m m ) d i i n o k u l a s i k a n p a d a m e d i a thiosulphate citrate bile salt sucrose ( T C B S ) agar, k e m u d i a n d i i n k u b a s i pada suhu 37"C selama 1 8 - 2 4 j a m . D i a m a t i p e r t u m b u h a n k o l o n i besar d e n g a n d i a m e t e r 2 - 3 m m , halus, b e r w a m a k u n i n g , datar, bagian t e n g a h k e r u h d a n b e n i n g d i s e k e l i l i n g n y a . K o l o n i y a n g d i d u g a Vibrio cholerae d i i n o k u l a s i k a n p a d a m e d i a nutrient agar m i r i n g d a n d i i n k u b a s i p a d a s u h u 37°C s e l a m a 2 4 j a m . Selanjutnya, dilakukan u j i konfirmasi terhadap koloni dugaan, yang meliputi penanaman pada m e d i a T S I A , uji oksidase, uji fermentasi karbohidrat, uji motilitas, dan p e w a m a a n G r a m .
286
Buku Ajar Mikrobiologi: Panduan Mahasiswa Farmasi dan Kedokteran
Penanaman
pada media
tripie sugar iron agar
(TSIA)
S a t u s e n g k e l i t b i a k a n d i a m b i l d a r i b i a k a n nutrient agar m i r i n g d a n d i i n o k u l a s i k a n p a d a m e d i a T S I A , k e m u d i a n d i i n k u b a s i p a d a s u h u 3TC s e l a m a 2 4 j a m . B i a k a n Vibrio cholerae a k a n b e r w a m a k u n i n g d i p e r m u k a a n d a n d i d a s a r t a b u n g t a n p a p e m b e n t u k a n gas H . S .
UJI
oksidase
Kertas saring ( 6 x 6 c m ) disiapkan di dalam cawan petri. Bagian tengah kertas diberi • 3 tetes p e r e a k s i t e t r a m e t i l p a r a f e n i l e n d i a m i n . S e l a n j u t n y a , satu sengkelit b i a k a n d i a m b i l d a r i b i a k a n nutrient agar m i r i n g d a n d i t o t o l k a n p a d a b a g i a n k e r t a s s a r i n g y a n g sudah j e n u h dengan pereaksi sepanjang 3 - 6 m m . Pembentukan w a m a u n g u tua y a n g c e p a t m e n u n j u k k a n r e a k s i p o s i t i f . Vibrio cholerae m e m b e r i k a n r e a k s i o k s i d a s e • positif
Uji fermentasi
karbohidrat
j | |
S a t u s e n g k e l i t b i a k a n d i a m b i l d a r i b i a k a n nutrient agar m i r i n g d a n d i i n o k u l a s i k m T ^ p a d a s e j u m l a h m e d i a peptone sugar broth y a n g m a s i n g - m a s i n g d i t a m b a h k a n g l u k o s a , s u k r o s a , m a n o s a , d a n m a n i t o l . S e l a n j u t n y a , d i i n k u b a s i p a d a s u h u 3TC s e l a m a 4 - 5 hari d a n d i a m a t i setiap hari. M u n c u l n y a w a m a k u n i n g m e n u n j u k k a n t e r b e n t u k n y a a s a m , y a n g b e r a r t i t e r j a d i p r o s e s f e r m e n t a s i . Vibrio cholerae d a p a t m e m f e r m e n t a s i glukosa, sukrosa, manosa, dan manitol.
Uji
motilitas
S a t u s e n g k e l i t b i a k a n d i a m b i l d a r i b i a k a n nutrient agar m i r i n g d a n d i i n o k u l a s i k a n dengan cara ditusukkan k e dalam media motilitas, k e m u d i a n dimkubasi pada suhu 37°C s e l a m a 1 8 - 2 4 j a m . A d a n y a p e r t u m b u h a n m e n y e b a r d i a m a t i d i s e k i t a r t u s u k a n . Vibrio cholerae m e n u n j u k k a n m o t i l i t a s p o s i t i f .
Pewarnaan
Gram
Vibrio cholerae m e m p a k a n b a k t e r i G r a m - n e g a t i f , y a n g b e r b e n t u k b a t a n g b e n g k o k .
I d e n t i f i k a s i Cattdida
albicans
P e m e r i k s a a n Candida albicans b i a s a n y a d i l a k u k a n t e r h a d a p p r o d u k - p r o d u k k o s m e tika. Bahan pemeriksaan yang akan diuji dihomogenkan dan diencerkan dengan penge n c e r a n 1 : 1 0 . D a r i h a s i l p e n g e n c e r a n s a m p e l 1:10 i n i , d i p i p e t s e b a n y a l 1 0 m l , 1 m l , dan 0,1 m l , dan d i m a s u k k a n k e dalam 3 buah wadah y a n g masing-masing berisi 4 0 m l , 1 0 m l , d a n 1 0 m l m e d i a sabouraud dextrose broth ( S D B ) . B i a k a n d i i n k u b a s i p a d a s u h u 20-25°C s e l a m a 4 8 j a m . K o l o n i y a n g t u m b u h d e n g a n c i r i - c i r i p u t i h k e k u n i n g a n dengan tepi y a n g tidak rata d i a m b i l untuk u j i mikroskopis dan pengamatan m o r f o l o g i k o l o n i d a n b e n t u k k l a m i d o s p o r a C . albicans.
B a b 17 - Analisis K e a m a n a n S e d i a a n F a r m a s i
Pengamatan
287
klamidospora
Koloni yang diduga sebagai koloni Candida alhicans pada media sabourauddextrose broth diambil dan diinokulasikan ke dalam cawan petri yang berisi media corn meal agar (CMA). Inokulasi dilakukan dengan membuat 2 goresan pada media perbenihan corn meal agar (CMA), masing-masing sepanjang 3,5 cm dan berjarak 1,2 cm. Goresan melintang terhadap kedua goresan tersebut kemudian dibuat dari koloni yang telah diencerkan dengan NaCl 0,9%. Perpotongan keempat goresan ditutup dengan kaca penutup steril berukuran 22 x 22 mm. Uji kontrol dengan Candida alhicans pembanding dibuat pada salah satu sektor media corn meal agar (CMA) pada cawan petri yang sama. Cawan petri diinkubasi pada suhu 22-25°C selama 48 jam. Tutup cawan petri dibuka, kemudian biakan diamati langsung tanpa membuka kaca penutup dengan menggunakan mikroskop pembesaran 10 dan 40 kali. Ciri-ciri mikroskopis Candida albicans adalah berbentuk bulat telur, berkelompok, satu-satu, atau berderet-deret. Candida albicans dapat membentuk pseudomiselia, yaitu sel yang memanjang, dan membentuk blastospora, yaitu spora bulat pada bagian ujung sel. Candida albicans membentuk klamidospora, yaitu sel yang membesar dan berdinding tebal. Jika dibiakkan pada serum manusia atau hewan dan diinkubasi pada suhu kamar selama 3-5 jam, C albicans akan membentuk germ tube, yaitu tunas menonjol panjang yang keluar dari sel. PENGUJIAN STERILITAS SEDIAAN FARMASI DAN ALAT KESEHATAN
Uji sterilitas adalah suatu pengujian yang dilakukan untuk mengetahui ada tidaknya mikroorganisme hidup atau yang mempunyai daya hidup dalam suatu sediaan yang telah disterilkan. Pengujian sterilitas dilakukan terhadap sediaan farmasi dan alat kesehatan yang pada kemasannya ditandai dengan tulisan STERIL. Sediaan farmasi tersebut antara lain sebagai berikut. • Sediaan yang disuntikkan, misalnya obat suntik dan infus. • Sediaan obat mata steril, misalnya tetes mata dan salep mata. • Sediaan bedak tabur steril. • Sediaan tablet impian. • Sediaan larutan steril. • Alat kesehatan untuk tindakan bedah, misalnya benang bedah, kapas steril, kasa steril, dan peralatan steril lain. Prinsip uji sterilitas adalah menginokulasikan atau membiakkan mikroorganisme yang terdapat di dalam sediaan uji pada media perbenihan yang sesuai. Uji sterilitas sediaan yang sering digunakan adalah sebagai berikut. 1. Pengujian secara langsung Pengujian ini dilakukan dengan menginokulasikan sediaan yang akan diuji ke dalam media perbenihan yang sesuai secara aseptis. Sediaan yang dapat diuji dengan cara ini antara lain sebagai berikut.
C 288
Buku Ajar Mikrobiologi: Panduan Mahasiswa Farmasi dan Kedokteran
a. Sediaan yang bervolume kurang dari 10 ml. b. Sediaan yang tidak mengandung antibiotik atau antimikroba. Apabila sediaan mengandung antimikroba, antimikroba tersebut harus diinaktifkan terlebih dahulu dengan larutan inaktivator. 2. Pengujian dengan penyaringan menggunakan filter yang sesuai Pengujian ini dilakukan dengan menyaring larutan sediaan melalui suatu membran yang sesuai, kemudian meletakkan membran tersebut pada media perbenihan yang sesuai secara aseptis. Sediaan yang dapat diuji dengan cara ini antara lain sebagai berikut. a. Sediaan larutan bervolume besar, misalnya cairan infus. b. Serbuk yang dapat larut. c. Sediaan lemak/minyak. d. Sediaan bervolume lebih dari 10 ml. e. Sediaan yang mengandung antibiotik dan antimikroba. Penyiapan sampel
Berikut ini diuraikan beberapa hal yang sangat perlu diperhatikan dalam penyiapan sampel untuk pengujian sterilitas suatu sediaan. Jumlah
sampel
Jumlah sampel yang diperlukan dalam setiap pengujian disesuaikan dengan yang tertera pada Tabel 17.3. Volume
sampel
yang
diinokulasikan
Volume sampel dari tiap wadah yang harus diinokulasikan ke dalam media disesuaikan dengan yang tertera pada Tabel 17.4. Sediaan
yang
mengandung
bahan
pengawet
Jika sediaan mengandung bahan pengawet, dilakukan percobaan pendahuluan untuk mendapatkan volume media yang sesuai agar daya pengawet tidak menghambat pertumbuhan mikroorganisme. Mikroba uji yang digunakan untuk uji daya pengawet adalah sebagai berikut. • Bacillus subtilis ATCC 6633. • Bacteroides vulgatus ATCC 8482. • Candida albicans ATCC 10231. I j a b e i 17.3. J u m l a h Sampel u n t u k Pengujian Sterilitas Sediaan J u m l a h w a d a h dalam tiap bets
J u m l a h s a m p e l uji
< 100
10% atau 4. diambil yang lebih besar
>100-500
10
>500
2 % atau 20. diambil yang lebih kecil
Tabel 17.4. V o l u m e S a m p e l d a n Volume Media y a n g D i g u n a k a n u n t u k Uji ^Sterilitas Volume sediaan pada t i a p w a d a h < 1 ml
Volume m e d i a cair FTM d a l a m t i a p tabung
Volume s a m p e l yang diinokulasikan Seluruh isi wadah
15 ml
V o l u m e m e d i a cair TSB d a l a m tiap tabung 15 ml
1 - 1 0 ml
1 ml
15 ml
15 ml
1 0 - < 5 0 ml
5 ml
40 ml
40 ml
5 0 - < 1 0 0 ml
10 ml
80 ml
80 ml
Volume sampel dan volume media yang dipakai pada cara penyaringan 5 0 - < 1 0 0 ml
Seluruh isi wadah
100 ml
100 ml
1 0 0 - 5 0 0 ml
Seluruh isi wadah
100 ml
100 ml
> 500 ml
500 ml
100 ml
100 ml
FTM = fluid thioglycollate medium TSB = Trypticase soy broth
Inokulum ketiga mikroba uji tersebut dibuat dengan konsentrasi mikroba 100-1000 sel/ml. Bacillus subtilis ATCC 6633 dan Bacteroides vulgatus ATCC 8482 digunakan untuk fluid thioglycollate medium, sedangkan suspensi Candida albicans ATCC 10231 digunakan untuk media trypticase soy broth. Sediaan yang akan diuji diencerkan dalam sejumlah pengenceran bertingkat, misalnya dengan melakukan pengenceran 2 kali, 4 kali, 8 kali, dan 16 kali, yang disesuaikan dengan dosis pengawet. Setelah itu, setiap hasil pengenceran sampel tersebut dimasukkan ke dalam media trypticase soy broth dan fluid thioglycollate medium yang telah disiapkan. Volume media dapat dilihat pada Tabel 17.4. Jumlah tabung media trypticase soy broth dan fluid thioglycollate medium disesuaikan dengan jumlah tabung hasil pengenceran sampel. Sebanyak 0,1 ml suspensi mikroba uji diinokulasikan ke dalam masing-masing tabung. Seluruh tabung diinkubasi selama 7 hari pada suhu 35°C untuk fluid thioglycollate medium dan 25°C untuk trypticase soy broth. Diamati adanya pertumbuhan mikroba uji dalam tabung percobaan. Pertumbuhan mikroba pada pengenceran sampel yang terendah dicatat. Dengan mengetahui faktor pengenceran sampel, dapat diketahui volume media yang dapat menginaktifkan daya pengawet dalam sampel. Volume inilah yang akan digunakan untuk penetapan sterilitas sediaan selanjutnya. Sediaan
yang
bersifat
bakteriostatili
dan
fungistatik
Pengujian sterilitas sediaan antibiotik yang bersifat sebagai bakteriostatik dan fungistatik tidak dapat dilakukan dengan penyaringan. Karena itu, daya menghambat pertumbuhan bakteri atau jamur harus diinaktifkan terlebih dahulu dengan menggunakan suatu inaktivator, yaitu senyawa kimia atau enzim. Mikroba uji yang digunakan untuk uji inaktivasi bakteriostatik dan fungistatik adalah sebagai berikut.
290
Bubu Ajar Mikrobiologi: Panduan Mahasiswa Farmasi dan Kedokteran
• Bacillus subtilis ATCC 6633. • Candida alhicans ATCC \023\. • Escherichia coli ATCC 10536. • Pseudomonas aeruginosa ATCC 10940. • Staphylococcus aureus ATCC 653S. Inoivulum mikroba-mikroba uji tersebut dibuat dengan konsentrasi 100-1000 sel mikroba/ml. Bacillus subtilis ATCC 6633, Escherichia coli ATCC 10536. Pseudomonas aeruginosa ATCC 10940, dan Staphylococcus aureus ATCC"6538 digunakan untuk fluid thioglycollate medium, sedangkan suspensi Candida albicans ATCC 10231 digunakan untuk media trypticase soy broth. Disiapkan sejumlah tabung yang masingmasing berisi 15 m\ fluid thioglycollate medium (FTM) dan sejumlah tabung yang masing-masing berisi 15 ml trypticase soy broth (TSB). Sampel yang akan diuji diencerkan dengan pengenceran yang disesuaikan dengan dosis bakteriostatik atau fungistatik sampel tersebut. Setelah itu, larutan inaktivator dengan dosis tertentu ditambahkan pada setiap pengenceran sampel, kemudian didiamkan. Sebagai contoh, jika yang akan diuji adalah antibiotik golongan penilisin, larutan inaktivator yang ditambahkan adalah enzim penisilinase. Setelah 15 menit masa inaktivasi, sebanyak 1 ml campuran diambil dari masingmasing tabung dan dimasukkan ke dalam media FTM dan media TSB. Selanjutnya, sebanyak 0,1 ml suspensi mikroba uji diinokulasikan ke dalam tabung percobaan tersebut. Percobaan ini dilakukan beberapa kali, tetapi dengan variasi masa inaktivasi, yaitu 30, 60, 90, dan 120 menit. Seluruh tabung diinkubasi selama 7 hari pada suhu 35"C untuk fluid thioglycollate medium dan 25"C untuk trypticase soy broth. Diamati adanya pertumbuhan pada tabung percobaan dengan dosis yang tertinggi dan masa inkubasi tertentu, yang berarti mikroba masih dapat hidup. Dosis yang didapat merupakan dosis yang digunakan untuk penetapan selanjutnya. Fertilitas
media
yang
digunakan
Uji fertilitas media perlu dilakukan untuk mengetahui apakah media yang digunakan dalam uji sterilitas cukup baik dan layak digunakan. Empat tabung berisi fluid thioglycollate medium (FTM) dan dua tabung berisi trypticase soy broth (TSB) disiapkan. Sebanyak 0,1 ml suspensi inokulum Bacillus subtilis (1000 spora hidup/ml) diinokulasikan ke dalam 2 tabung FTM dan sebanyak 0,1 ml suspensi Bacteroides vulgatus (1000 sel/ml) diinokulasikan ke dalam 2 tabung FTM lainnya. Ke dalam 2 tabung TSB, diinokulasikan suspensi Candida albicans (1000 sel/ml). Seluruh tabung diinkubasi selama 7 hari pada suhu 35"C untuk fluid thioglycollate medium dan 25°C untuk trypticase soy broth. Pengujian ini dilakukan bersamaan dengan pengujian sterilitas sampel. Sterilitas
media
Uji sterilitas media dilakukan untuk menjamin bahwa media yang digunakan benarbenar steril. Sebuah tabung berisi fluid thioglycollate medium dan sebuah tabung
B a b 17 - Analisis K e a m a n a n S e d i a a n F a r m a s i
291
berisi trypticase soy broth dari bets yang sama dengan yang akan digunakan untuk pengujian sterilitas sampel diinkubasi pada suhu dan waktu yang sama dengan media yang digunakan untuk uji sterilitas. Pengujian Pengujian
sterilitas
secara
langsung
Pada dasarnya, pengujian ini dilakukan dengan secara langsung menginokulasikan sediaan yang akan diuji ke dalam fluid thioglycollate medium dan trypticase soy broth. Perlu diperhatikan bahwa setiap sampel membutuhkan penanganan yang berbeda sesuai dengan bentuk dan jenis sampel. Pengujian sterilitas sampel biasanya digolongkan berdasarkan bentuk sampel, sebagaimana akan dibahas berikut ini. Sampel berbentuk
cairan
Sejumlah volume sampel yang akan diuji diambil, sesuai dengan Tabel 17.4, secara aseptis menggunakan pipet steril atau jarum suntik dan diinokulasikan ke dalam tabung yang berisi fluid thioglycollate medium dan tabung yang berisi trypticase soy broth. Campuran dihomogenkan dengan hati-hati. Selanjutnya, inkubasi dilakukan selama 14 hari pada suhu SS^'C untuk fluid thioglycollate medium dan pada suhu 25°C untuk trypticase soy broth. Pengamatan dilakukan setiap hari sesering mungkin secara visual, dimulai pada hari ke-3 sampai hari terakhir. Bila sampel yang diuji menyebabkan media menjadi keruh atau tidak ada pertumbuhan mikroorganisme antara hari ke-3 dan ke-7 sejak pengujian dimulai, sejumlah tertentu dari perbenihan tersebut dipindahkan ke dalam tabung berisi media yang baru. Perbenihan pertama dan perbenihan yang baru diinkubasi selama tidak kurang dari 7 hari sejak dilakukan pemindahan kedua dan selama total waktu tidak kurang dari 14 hari. Sampel berbentuk
padat
Sejumlah tertentu sediaan uji dalam bentuk padat atau yang terlebih dahulu dibuat larutan atau suspensi dalam larutan pengencer atau pendispersi yang sesuai, yaitu tidak kurang dari 300 mg sampel dari setiap wadah atau seluruh isi wadah jika sampel kurang dari 300 mg, disiapkan, kemudian diinokulasikan dalam fluid thioglycollate medium dan trypticase soy broth, yang masing-masing bervolume 40 ml, dan dihomogenkan dengan hati-hati. Selanjutnya, inkubasi dilakukan selama 14 hari pada suhu 35°C untuk fluid thioglycollate medium dan pada suhu 25°C untuk trypticase soy broth. Pengamatan dilakukan seperti pada pengamatan sampel berbentuk cairan. Sampel berbentuk salep, minyak, atau lemak yang tidak larut dalam isopropil
miristat
Sampel dibagi dalam dua kelompok yang masing-masing terdiri atas 10 wadah. Dari kesepuluh wadah tersebut, diambil dan ditimbang masing-masing sebanyak 100 mg.
' 292
B u k u Ajar Mikrobiologi: P a n d u a n Mahasiswa Farmasi d a n Kedokteran
kemudian dimasukkan ke dalam 100 ml larutan pendispersi dan dikocok hingga homogen. Larutan pendispersi disesuaikan dengan sampel dan tidak bersifat antimikroba. Sebanyak 10 ml suspensi dimasukkan ke dalam 80 ml media trypticase soy broth dan 80 ml fluid thioglycollate medium, kemudian dihomogenkan dengan hatihati. Selanjutnya, inkubasi dilakukan selama 14 hari pada suhu 35°C untuk fluid thioglycollate medium dan pada suhu 25°C untuk trypticase soy broth. Pengamatan dilakukan seperti pada pengamatan sampel berbentuk cairan. Kapas, perban, pembalut, benang bedah, dan
sejenisnya
Kira-kira 100-500 mg sampel dari bagian paling luar dan bagian paling dalam dari bahan yang akan diuji atau keseluruhan bahan yang akan diuji jika ukurannya kecil diambil secara aseptis. Sampel kemudian dimasukkan ke dalam fluid thioglycollate medium dan trypticase soy broth, dan dihomogenkan dengan hati-hati. Selanjutnya, inkubasi dilakukan selama 14 hari pada suhu 35°C untuk fluid thioglycollate medium dan pada suhu 25°C untuk trypticase soy broth. Pengamatan dilakukan seperti pada pengamatan sampel berbentuk cairan. Peralatan steril
Apabila bentuk dan ukurannya memungkinkan, alat-alat dimasukkan secara keseluruhan ke dalam media sebanyak tidak lebih dari 1000 ml, kemudian diinkubasi. Untuk alat-alat yang berlubang, seperti alat transfusi dan infus, atau alat-alat yang bentuknya tidak memungkinkan untuk memakai cara perendaman, hanya saluran yang dilalui cairan yang harus steril. Lubang dan saluran alat yang diuji, masing-masing sebanyak 20 alat, dibilas dengan tidak kurang dari 15 ml fluid thioglycollate medium dan trypticase soy broth. Bilasan kemudian diinokulasikan ke dalam 100 ml fluid thioglycollate medium dan 100 ml trypticase soy broth. Biakan dikocok sampai homogen. Selanjutnya, inkubasi dilakukan selama 14 hari pada suhu 35°C untuk fluid thioglycollate medium dan pada suhu 25°C untuk trypticase soy broth. Pengamatan dilakukan seperti pada pengamatan sampel berbentuk cairan. Untuk peralatan yang lubang atau lumen salurannya sangat kecil sehingga larutan fluid thioglycollate medium tidak dapat mengalir, digunakan alternative thioglycollate medium. Selanjutnya, inkubasi dilakukan secara anaerob. A l a t suntik steril a t a u alat suntik siap pakai
Pengujian alat suntik siap pakai yang terpasang jarum steril dilakukan dengan membilas rongga alat dengan media nutrient broth sesuai dengan volume alat suntik. Apabila alat suntik dikemas dengan jarum terpisah, jarum dipasang secara aseptis pada alat suntik, kemudian dibilas dengan nutrient broth. Setelah itu, cairan pembilas dimasukkan ke dalam fluid thioglycollate medium dan trypticase soy broth. Biakan dikocok sampai homogen. Selanjutnya, inkubasi dilakukan selama 14 hari pada suhu 35°C untuk fluid thioglycollate medium dan pada suhu 25°C untuk trypticase soy broth. Pengamatan dilakukan seperti pada pengamatan sampel berbentuk cairan.
B a b 17 - Analisis K e a m a n a n S e d i a a n F a r m a s i
Pengujian
sterilitas
dengan
293j
penyaringan
Pengujian sterilitas dengan cara penyaringan menggunakan membran filter yang mempunyai ukuran pori-pori 0,45 jam dan garis tengah 47 mm. Kecepatan aliran larutan 55 sampai 75 ml/menit pada tekanan 70 cmHg. Ada tiga jenis membran filter, yaitu sebagai berikut. • Membran hidrofilik. • Membran hidrofobik. • Membran hidrofilik-hidrofobik. Untuk beberapa jenis sediaan, biasanya dilakukan pembilasan membran filter setelah penyaringan sediaan. Larutan pembilas yang digunakan untuk membilas membran filter adalah sebagai berikut. • Larutan A, yaitu larutan pepton 0,1%. Larutan ini digunakan untuk larutan air. • Larutan D, yaitu larutan pepton 0,1% dan Tween 80 0,1%. Larutan ini digunakan untuk larutan yang mengandung minyak/lemak. • Larutan K, yaitu larutan pepton 0,5%, ekstrak daging sapi 0,3% {beef extract 0,3%), dan polisorbat 80 1%. Larutan ini digunakan untuk larutan selain lemak/ minyak, contohnya petrolatum. Pengujian sterilitas dengan cara penyaringan pada dasarnya dapat digunakan untuk pengujian sterilitas sediaan yang berbentuk larutan atau serbuk yang dapat larut dalam larutan pengencer. S a m p e l b e r b e n t u k cairan y a n g d a p a t b e r c a m p u r d e n g a n air
Sejumlah volume tertentu sediaan uji berbentuk cairan yang dapat bercampur dengan pembawa air, misalnya larutan infus atau obat suntik, disaring melalui satu atau dua membran terpisah, dibantu dengan pompa vakum. Salah satu membran atau setengah bagian membran, apabila hanya digunakan satu membran, dimasukkan secara aseptis ke dalam 100 ml fluid thioglycollate medium, kemudian diinkubasi pada suhu 35*'C selama tidak kurang dari 7 hari. Membran atau setengah bagian yang satu lagi dimasukkan ke dalam trypticase soy broth, kemudian diinkubasi pada suhu 25"C selama tidak kurang dari 7 hari. Apabila sediaan yang akan diuji bersifat bakteriostatik atau fungistatik, membran dibilas sebanyak tiga kali dengan 100 ml Larutan A setelah penyaringan. Setelah dibilas, membran dimasukkan ke dalam media perbenihan seperti cara di atas. S a m p e l b e r u p a c a i r a n y a n g t i d a k b e r c a m p u r d e n g a n p e m b a w a air
Sejumlah volume tertentu, tidak kurang dari 20 wadah atau 40 wadah jika volume sediaan sedikit, disaring melalui satu atau dua buah membran terpisah. Jika sediaan uji berupa cairan kental yang sulit disaring, larutan pengencer yang steril dapat ditambahkan secukupnya untuk menambah kecepatan aliran penyaringan. Bila sediaan uji bersifat bakteriostatik atau mengandung zat pengawet, membran dibilas sebanyak
294
B u k u Ajar Mikrobiologi: P a n d u a n Mahasiswa Farmasi d a n Kedokteran
tiga kali dengan 100 ml Larutan A setelah penyaringan. Bila sediaan mengandung lesitin atau minyak, cairan pembilas yang dipakai adalah Larutan D. Selanjutnya, membran diperlakukan seperti pada prosedur sediaan cairan yang dapat bercampur dengan pembawa air. Sampel berupa salep dan minyak y a n g larut d a l a m isopropil miristat
Disiapkan 20 wadah sediaan uji atau 40 wadah jika isinya sedikit. Dari masing-masing wadah, diambil paling sedikit 100 mg, kemudian dilarutkan dalam paling sedikit 100 ml larutan isopropil miristat yang telah disterilkan dengan penyaringan menggunakan membran 0,22 |im, pH 6,5. Bila diperlukan, sediaan dihangatkan pada suhu 45°C selama 15 menit, kemudian disaring melalui membran filter dengan bantuan pompa vakum. Setelah penyaringan, membran dicuci dua kali dengan 200 ml Larutan D, kemudian dibilas sekali lagi dengan 100 ml Larutan A. Selanjutnya, membran diperlakukan seperti pada prosedur sediaan cairan yang dapat bercampur dengan pembawa air. Bila sediaan uji mengandung vaselin (petrolatum), cairan pembilas yang digunakan adalah Larutan K. Sebelum penyaringan, membran dibasahi dengan kira-kira 200 ml cairan pembilas. Setelah penyaringan, membran dibilas tiga kali dengan 100 ml cairan pembilas. Selanjutnya, membran diperlakukan seperti pada prosedur sediaan cairan yang dapat bercampur dengan pembawa air. Peralatan yang
berlubang
Sterilitas peralatan yang mempunyai bagian berupa saluran atau lumen steril dapat diuji dengan cara mengalirkan sejumlah tertentu Larutan D ke dalam saluran alat yang akan diuji tersebut, yaitu masing-masing 100 ml untuk paling sedikit 20 alat. Cairan bilasan dikumpulkan dan disaring melalui membran filter menurut prosedur untuk sampel cairan yang dapat bercampur dengan air. Penafsiran hasil uji Tahap
pertama
Setelah interval waktu tertentu dan akhir masa inkubasi, pertumbuhan mikroorganisme diamati pada semua wadah. Pertumbuhan ditandai dengan terjadi kekeruhan atau pertumbuhan pada permukaan media. Jika tidak terjadi pertumbuhan, sampel dinyatakan memenuhi syarat. Apabila ditemukan pertumbuhan mikroorganisme, sediaan uji dinyatakan tidak memenuhi syarat sterilitas, kecuali dapat dibuktikan dengan pengujian ulang atau dengan cara lain bahwa pengujian tidak memenuhi syarat. Sebagai contoh, jika pertumbuhan mikroorganisme terbukti disebabkan oleh penyiapan sampel dan teknik pengujian yang kurang aseptis, pengujian dapat diulang pada tahap kedua. Tahap
kedua
Jumlah sampel yang diambil untuk uji tahap kedua minimal 2 kali jumlah tahap pertama. Volume yang diuji dari sediaan uji dan volume media sama dengan pengujian
Bab 17 - Analisis Keamanan Sediaan Farmasi
295
tahap pertama. Jika tidak terdapat pertumbuhan mikroorganisme, sediaan uji dinyatakan memenuhi syarat sterilitas. Jika ditemukan pertumbuhan mikroorganisme, hasil yang diperoleh membuktikan bahwa sampel uji tidak memenuhi syarat. PENGUJIAN POTENSI ANTIBIOTIK
Antibiotik adalah suatu senyawa yang dihasilkan oleh mikroorganisme yang pada konsentrasi rendah dapat memusnahkan atau menghambat pertumbuhan mikroorganisme lain. Pengujian potensi antibiotik dilakukan untuk memberikan jaminan bahwa kualitas dan mutu antibiotik yang digunakan dalam pengobatan memenuhi persyaratan yang telah ditentukan. Prinsip penetapan potensi antibiotik dalam sediaan obat adalah membandingkan dosis larutan sediaan uji terhadap dosis larutan baku pembanding yang menghasilkan derajat hambatan yang sama pada mikroorganisme uji. Pada umumnya, pengujian potensi antibiotik secara mikrobiologi menggunakan dua metode, yaitu metode tabung atau turbidimetri dan metode lempeng silinder atau difusi agar. Metode turbidimetri
Prinsip metode ini adalah berdasarkan hambatan pertumbuhan biakan mikroorganisme dalam media cair yang mengandung larutan antibiotik. Pada metode ini, mikroorganisme uji yang sesuai diinokulasikan ke dalam media cair yang mengandung antibiotik di dalam tabung. Kemampuan antibiotik menghambat pertumbuhan mikroorganisme uji ditunjukkan dengan kekeruhan media pada tabung uji. Kekeruhan media dalam tabung uji dengan kekeruhan media dalam tabung antibiotik baku pembanding merupakan rasio potensi antibiotik. Metode lempeng silinder
Prinsip metode ini adalah membandingkan zona hambatan pertumbuhan mikroorganisme uji oleh dosis senyawa antibiotik yang diuji terhadap zona hambatan oleh dosis antibiotik baku pembanding pada media lempeng agar. Metode ini dilakukan dengan menginokulasikan mikroorganisme uji yang sesuai dan peka ke dalam media lempeng agar pada cawan petri. Silinder besi tahan karat diletakkan di atas permukaan media lempeng agar. Larutan antibiotik dimasukkan ke dalam silinder besi tahan karat tersebut dan diinkubasi. Larutan antibiotik akan berdifusi ke dalam media dan menghambat pertumbuhan mikroorganisme uji di sekeliling silinder. Rasio potensi antibiotik merupakan perbandingan ukuran garis tengah zona hambatan yang disebabkan larutan antibiotik uji dan antibiotik baku pembanding. Penetapan potensi antibiotik menurut Farmakope Indonesia edisi III
Penetapan potensi antibiotik menurut Farmakope Indonesia edisi 111 memerlukan 6 buah cawan petri untuk satu jenis sediaan uji. Jika akan dilakukan pengujian potensi
296
B u b u Ajar Mikrobiologi: P a n d u a n Mahasiswa Farmasi d a n Kedokteran
antibiotik dalam sediaan uji yang lain yang memiliki baku pembanding yang sama, diperlukan kelipatan 6 cawan petri lagi. Jadi, dibandingkan dengan pengujian menurut Farmakope Indonesia edisi IV, penetapan potensi antibiotik menurut Farmakope Indonesia edisi III memiliki kerugian dari segi praktis dalam hal penyiapan sediaan karena menurut Farmakope Indonesia edisi IV, cukup menambah 3 lempeng, dan masing-masing lempeng berisi 3 silinder untuk S3 dan 3 silinder untuk U3. Gambar 17.5 menunjukkan pola peletakan silinder dalam cawan petri untuk penetapan potensi antibiotik menurut Farmakope Indonesia edisi 111. Penyiapan
larutan
antibiotik
baku
pembanding
Sejumlah tertentu antibiotik baku ditimbang dengan saksama dan dilarutkan dalam pelarut yang sesuai hingga diperoleh konsentrasi larutan induk baku setara dengan 1 mg/ml. Pengenceran selanjutnya dilakukan dengan larutan pengencer yang sesuai hingga diperoleh larutan baku dengan dosis baku tinggi (St), dosis baku menengah (Sm), dan dosis baku rendah (Sr) yang sesuai. Um
Um St
-o Ur
Ut
Ur
Ut
Sm
Sm
Um
Um
S t ^ . ^ ^ ^ ^ ~ ^ - \ S r
o
«o Ur
Ut
St^^
^ S r
Ur
Sm
Um St
Ur
Ut Sm
G a m b a r 17.5 Rancangan penetapan potensi antibiotik menurut Farmakope Indonesia edisi III. Dibutuhkan 6 buah cawan petri dengan pola penempatan silinder pada setiap cawan seperti pada gambar. Semua cawan diinkubasi pada suhu ST^'C selama 24 jam, kemudian zona hambatan yang terbentuk diukur.
B a b 17 - Analisis K e a m a n a n S e d i a a n F a r m a s i
Penyiapan
larutan
antibiotik
297
uji
Larutan induk uji diencerkan dengan pengenceran yang sesuai hingga diperoleh larutan uji dengan dosis uji tinggi (Ut), dosis uji menengah (Um), dan dosis uji rendah (Ur) yang sesuai. Cara
penetapan
Enam buah cawan petri disiapkan untuk penetapan ini. Sejumlah 20 ml media uji yang sesuai (45-50°C) dituangkan ke dalam setiap cawan petri dan dibiarkan memadat (lapisan dasar). Agar inokulum sebanyak 5 ml dituangkan ke permukaan lapisan, kemudian digoyangkan perlahan-lahan hingga membentuk lapisan yang merata dan dibiarkan memadat. Pada permukaan agar inokulum dalam setiap cawan, diletakkan 3 silinder besi tahan karat untuk larutan baku dan 3 silinder besi tahan karat untuk larutan uji, sebagaimana pola peletakan silinder pada Gambar 17.5. Sejumlah 0,250 ml larutan baku dan larutan uji diteteskan ke dalam setiap silinder dan dibiarkan selama kurang lebih 1 jam. Semua cawan diinkubasi pada suhu 37"C selama 18-24 jam. Zona hambatan pertumbuhan yang terbentuk di sekeliling silinder diamati. Diameter zona hambatan pertumbuhan tersebut kemudian diukur. Perhitungan potensi antibiotik menurut Farmakope Indonesia edisi III adalah sebagai berikut. Standar (S)
Uji (U)
Jumlah zona konsentrasi rendah
81
U1
Jumlah zona konsentrasi menengah
82
U2
Jumlah zona konsentrasi tinggi
83
U3
Jumlah sediaan
81 + 8 2 + 8 3 = 8
U1 + U 2 + U3 = U
Kontras linear
8 3 - 8 1 = Ls
U 3 - U 1 =Lu
Ls + Lu b= (d-^)\r^h
U
S Ys = — nd Yu-Ys
nd
Rasio potensi Ru = antilog Mu
Potensi = Ru x 100%
Keterangan: b = d= h = n = /=
Kemiringan (slope) regresi zona log konsentrasi semua sediaan Banyaknya ragam konsentrasi setiap sediaan = 3 Banyaknya sediaan termasuk standar = 2 Banyaknya penggandaan setiap perlakuan = 6 Interval log konsentrasi berdampingan (log 81 - log 82 = log 82 - log 83)
M29S
B u b u Ajdr Mikrobiologi: P a n d u a n Mahasiswa Farmasi d a n Kedobteran
Penetapan potensi antibiotik menurut Farmakope Indonesia edisi IV
Prinsip penetapan potensi antibiotik menurut Farmakope Indonesia edisi IV adalah menginterpolasikan derajat hambatan pertumbuhan mikroorganisme uji yang diperoleh secara difusi agar dari dosis sediaan uji terhadap kurva baku dari dosis-dosis sediaan baku. Penetapan menggunakan rancangan satu tingkat dengan kurva baku menggunakan 5 dosis larutan baku pembanding (SI, S2, S3, S4, S5) dan satu dosis larutan uji dengan konsentrasi yang sama dengan dosis standar (S3), yang disebut U3. S3
S3
S1
S2
3 cawan petri
3 cawan petri
S3
3 cawan petri
3 cawan petri
Gambar 17.6 Rancangan penetapan potensi antibiotik menurut Farmakope Indonesia edisi IV. Dibutuhkan 15 buah cawan petri dengan pola penempatan silinder pada setiap cawan seperti pada gambar.Tiap perlakuan dikerjakan secara triplo. Semua cawan diinkubasi pada suhu 37°C selama 24 jam. Selanjutnya, zona hambatan yang terbentuk diukur.
B a b 17 - Analisis K e a m a n a n S e d i a a n F a r m a s i
299
Penetapan potensi antibiotik sediaan uji memerlukan 15 cawan petri karena penetapan dilakukan secara triplo. Untuk memperoleh kurva baku, keenam silinder pada setiap lempeng diisi selang-seling dengan dosis tengah baku (S3) dan dosis pengenceran baku lainnya (SI, S2, S4, atau S5). Perlakuan ini dikerjakan secara triplo untuk setiap dosis. Jadi, pada setiap 3 lempeng, 9 silinder diisi dengan dosis tengah baku (S3) dan 9 silinder sisa diisi dengan dosis pengenceran baku lainnya (SI, S2, S4, atau S5). Untuk setiap sediaan uji, keenam silinder pada lempeng diisi selang-seling dengan dosis tengah baku (S3) dan enceran larutan uji yang sebanding (U3). Jadi, pada ketiga lempeng untuk sediaan uji, 9 silinder diisi dengan dosis tengah baku (S3) dan 9 silinder sisa diisi dengan U3. Skema rancangan penetapan potensi antibiotik menurut Farmakope Indonesia edisi IV ditunjukkan pada Gambar 17.6. Hal yang penting diperhatikan dalam penetapan potensi antibiotik adalah inokulum, larutan antibiotik pembanding, dan tingkat dosis. Inokulum
Pada pembuatan inokulum mikroorganisme uji dalam media cair, konsentrasi inokulum yang dibutuhkan pada penetapan potensi antibiotik adalah 10^ sampai 10"^ sel/ml. Mikroorganisme uji yang digunakan adalah galur murni berupa galur koleksi laboratorium yang terstandar, peka terhadap antibiotik yang akan diuji, dan selalu dilakukan peremajaan minimal satu minggu sekali. Larutan
antibiotik
pembanding
Penentuan potensi antibiotik memerlukan antibiotik standar sebagai baku pembanding. Baku pembanding terdiri atas baku pembanding internasional, baku pembanding nasional, dan baku pembanding kerja. Baku pembanding yang biasa digunakan untuk penetapan potensi sediaan antibiotik adalah baku pembanding kerja {working Standard). Tingkat
dosis
Perbandingan dosis antibiotik yang akan diuji harus dibuat sedemikian rupa agar tingkat dosisnya selalu tetap. Pada Farmakope Indonesia edisi IV, tingkat dosis adalah 4:5. Terdapat 5 tingkat dosis, yaitu SI, S2, S3, S4, dan S5, dengan S3 sebagai acuan. Contoh: S3 = 1 0 f-ig/ml maka dosis baku lainnya adalah S2 = 4 / 5 x lO^ig/ml = 8 ^g/ml SI = 4 / 5 x 8 ng/m 1 = 6,4 |ig/mI 84 = 5 / 4 x lO^ig/ml = 12,5 ^g/ml 85 = 5/4 X 12,5 Mg/ml = 15,625 [ig/m\ Perhitungan potensi antibiotik menurut Farmakope Indonesia edisi IV menggunakan metode garis lurus, transformasi logaritma dengan prosedur penyesuaian kuadrat terkecil, dan uji linearitas.
, B u b u Ajar Mikrobiologi: P a n d u a n Mahasiswa Farmasi d a n K e d o b t e r a n l " "iiiitfr.niirfrairitiiir'iifiiir-r
Berdasarkan hasil pengukuran zona hambatan yang terbentuk sesuai dengan pola penetapan pada Gambar 17.6, data zona hambatan pertumbuhan yang dihasilkan oleh antibiotik baku pembanding dan antibiotik uji diolah lebih lanjut seperti pada Tabel 17.5. ^^^^ibef^T^sTH y n d o n e s i a Edisi IV
1 Diameter z o n a h a m b a t a n p e r t u m b u h a n ( m m )
No
"s3
S1
i2
Baku pembanding
ii
i4
Sampel S3
iT
3 4 5
"e
7
s"
Jumlah Rerata Korektor Hasil koreksi Rerata 8 3 Korektor 8 1 Korektor 8 2 Hasil koreksi 8 1 Hasil koreksi 8 2
= = = = =
Rerata Rerata Rerata Rerata Rerata
semua baku pembanding 8 3 8 1 - rerata 8 3 8 2 - rerata 8 3 , dan seterusnya. 8 1 + korektor 8 1 8 2 + korektor 8 2 , dan seterusnya.
83
U3
33
B a b 17 - Analisis K e a m a n a n S e d i a a n F a r m a s i
301
Kurva baku dibuat dari data hasil koreksi, dengan log dosis baku (S) sebagai sumbu X dan diameter zona hambatan pertumbuhan sebagai sumbu Y. Kurva baku kemudian dibuat berdasarkan data yang diperoleh pada Tabel 17.6 berikut. Pengolahan Data u n t u k Penghitungan Potensi A n t i b i o t i k Menurut i F a r m a k o p e Indonesia Edisi IV Larutan baku
L o g S =X
Diameter z o n a h a m b a t a n (mm) = Y
Dosis S I Dosis 8 2 Dosis 8 3 Dosis 8 4 Dosis 8 5
Setelah itu, nilai a (intersept) dan b (slope) dicari dari regresi linear sehingga dapat diperoleh persamaan regresi linear Y = a + b X Dengan memasukkan harga log S3 ke dalam variabel X pada persamaan tersebut, nilai Y akan didapat berdasarkan ekstrapolasi terhadap kurva baku. Untuk antibiotik uji (Yu): Vi;
= y + fU3-83;
= a + bXu Dosis uji = antilog X^ Potensi antibiotik uji =
dosis uji 83
x 100%
PENGUJIAN POTENSI VITAMIN
Pengujian potensi vitamin pada dasarnya dilakukan dengan membandingkan dosis larutan sediaan uji terhadap dosis larutan baku pembanding yang menghasilkan derajat pertumbuhan yang sama pada mikroba uji. Uji potensi vitamin merupakan kebalikan dari uji potensi antibiotik, yaitu uji potensi vitamin didasarkan atas peningkatan pertumbuhan mikroba uji. Media perbenihan yang digunakan adalah media yang mengandung semua faktor pertumbuhan, kecuali faktor yang akan diuji. Sebagai contoh, untuk menentukan potensi asam pantotenat digunakan pantothenate assay medium, yaitu suatu media perbenihan yang tidak mengandung asam pantotenat, tetapi mengandung semua nutrisi dan vitamin yang esensial untuk pertumbuhan mikroba uji
" ^ I T i f i r l i r " ^ " Ajar Mibrobiologi: P a n d u a n Mahasiswa Farmasi d a n K e d o b t e i g n i
yang digunakan (yaitu Lactobacillus plantarum). Penambahan vitamin (asam pantotenat) dalam berbagai konsentrasi ke dalam media perbenihan akan meningkatkan derajat pertumbuhan mikroba uji yang dapat diukur secara turbidimetri. Penyiapan inokulum mikroba uji
Mikroba uji yang akan digunakan dalam penetapan potensi vitamin dibiakkan pada perbenihan agar miring dan diinkubasi pada suhu yang sesuai selama 24 jam. Satu sengkelit biakan dari biakan agar miring dipindahkan ke dalam media micro inoculum broth dan diinkubasi pada suhu yang sesuai selama 24 jam. Biakan inokulum dalam media cair ini kemudian disentrifugasi. Cairan supematan dibuang dan endapan dicuci tiga kali dengan 10 ml larutan NaCl 0,9% sambil disentrifugasi. Setelah dicuci, endapan sel disuspensi dengan 10 ml larutan NaCl 0,9%, kemudian diencerkan 1:100 dengan NaCl 0,9%, atau setara dengan 35-40% transmitan (T) jika diukur dengan spektrofotometer pada panjang gelombang 660 nm. Satu tetes inokulum diinokulasikan ke dalam 10 ml media pengujian yang digunakan untuk penetapan potensi vitamin. Pembuatan kurva baku
Larutan standar untuk pembuatan kurva baku senantiasa dibuat baru saat akan dilakukan penetapan potensi vitamin. Pada umumnya, pembuatan kurva baku dilakukan dengan membuat larutan vitamin yang akan diuji dalam berbagai konsentrasi, yaitu konsentrasi 0,1; 0,2; 0,3; 0,4; 0,5; 0,6; 0,7; 0,8; 0,9; dan 1 ^g dalam 10 ml larutan yang mengandung media pengujian yang sesuai untuk masing-masing jenis vitamin yang akan ditetapkan potensinya. Satu tetes atau 20 fil inokulum kemudian diinokulasikan ke dalam deretan tabung ini dan dikocok sampai homogen. Seluruh tabung diinkubasi pada suhu yang sesuai selama 24 jam. Setelah diinkubasi, kerapatan optik masingmasing media di dalam setiap tabung diukur dengan spektrofotometer pada panjang gelombang 540 nm. Selanjutnya, kurva baku dibuat berdasarkan hasil pengukuran kerapatan optik media perbenihan terhadap logaritma dosis larutan vitamin. Jenis mikroba uji dan media penetapan potensi vitamin dapat dilihat pada Tabel 17.7. Pembuatan larutan uji
Tiga dosis larutan baku vitamin dipilih berdasarkan kurva baku, yaitu dosis yang terletak di daerah pusat kurva. Berdasarkan konsentrasi atau dosis larutan baku vitamin tersebut, dibuat 3 jenis konsentrasi larutan vitamin yang akan diuji, dengan konsentrasi yang sama dengan ketiga dosis vitamin baku yang telah dipilih dari kurva baku. Ketiga dosis larutan uji ini digunakan untuk penetapan potensi vitamin.
Bab 17 - Analisis Keamanan Sediaan Farmasi . 303
L l a b e l 17.7. M i k r o b a Uji, Media Pengujian, dan S u h u Inkubasi u n t u k ^Penentuan Potensi Beberapa Jenis Vitamin M i k r o b a uji
Lactobacillus plantarum ATCC 8014
Lactobacillus deibrueckii
Media
Pantothenate assay medium
Vitamin
Suhu inkubasi 37°C
A s a m pantotenat Vitamin B^^
ssp. lactisATCC 4797
Vitamin B^^ assay . medium
Lactobacillus plantarum
Biotin assay medium
37°C
Biotin
Inositol assay medium
25-30°C
Inositol
Folic acid assay medium
37°C
A s a m folat
Niacin assay medium
37°C
Niasin
Riboflavin assay medium
37°C
Riboflavin (vitamin B^)
Thiamine assay medium
37°C
Tiamin (vitamin B^)
ATCC 8014
Saccharomyces
cerevisiae
ATCC 8090
Enterococcus hirae ATCC 8043
Lactobacillus plantarum ATCC 8014
Lactobacillus rhamnosus ATCC 4769
Lactobacillus femientum ATCC 9338
Cara penetapan
Enam buah tabung reaksi steril disiapkan untuk penetapan ini. Sejumlah 0,5 ml larutan dari tiap dosis larutan baku yang dipilih dipipet ke dalam tiga buah tabung. Demikian juga, ketiga dosis larutan vitamin yang akan diuji potensinya dipipet ke dalam tiga buah tabung lainnya. Sebanyak 4,5 ml media uji steril yang sesuai ditambahkan ke dalam setiap tabung dan dikocok sampai homogen. Sebagai blangko, digunakan 0,5 ml air suling steril ditambah dengan 4,5 ml media steril. Selanjutnya, satu tetes atau 20 ^1 inokulum diinokulasikan ke dalam masing-masing tabung dan dikocok sampai homogen. Semua tabung diinkubasi pada suhu yang sesuai selama 24 jam. Setelah masa inkubasi, kerapatan optik media dalam setiap tabung diukur menggunakan spektrofotometer pada panjang gelombang 540 nm. Berdasarkan data yang didapat, potensi vitamin dapat ditentukan secara biometri, yaitu dengan membandingkan dosis larutan sediaan uji terhadap dosis larutan baku vitamin yang menghasilkan derajat pertumbuhan yang sama pada mikroba uji.
DAFTAR PUSTAKA
Batzing, B, L. 2002. Microbiology: An Introduction. USA: Brooks/Cole Thomson Leaming. Brown, T. A. 1995. Gene Cloning: An Introduction. 3'^ Ed. Manchester, United Kingdom: Stanley Thomes Publisher, Ltd. Crueger, W., and Crueger, A. 1988. Biotechnology: TextbookofIndustrial Microbiology. New York: Madison, Inc. Departemen Kesehatan RI. 1979. Farmakope Indonesia, Edisi III. Jakarta: Departemen Kesehatan RI. Departemen Kesehatan RI. 1992. Prosedur Operasional Baku Pengujian Mikrobiologi. Jakarta: Pusat Pemeriksaan Obat dan Makanan, Dirjen POM. Departemen Kesehatan RI. 1995. Farmakope Indonesia. Edisi IV. Jakarta: Departemen Kesehatan RI. Harmitadan Radji, M. 2008. Buku Ajar Analisis Hayati. Edisi 3. Jakarta: EGC Penerbit Buku Kedokteran. Harvey, R. A., Champe, R C , and Fisher, B. D. 2007. Microbiology. 2"^^ Ed. USA: Lippincott Williams & Wilkins. Hidayat, N., Masdiana, C. P, dan Suhartini, S. 2006. Mikrobiologi Industri. Yogyakarta: Penerbit ANDI. Hugo, W. B., and Russel, A. D. 2000. Pharmaceutical Microbiology. 6^ Ed. London: Blackwell Scientific Publication. Jawetz, E., Melnick, J. L., and Adelberg, E. A. 2002. Medical Microbiology. 22"** Ed. USA: Lange Medical Publications, McGraw-Hill. Pelezar, M. J., dan Chan E. C. S. 1986. Dasar-dasar Mikrobiologi. Jakarta: UI Press. Radji, M. 2006. Penuntun Praktikum Mikrobiologi Farmasi. Edisi 2. Depok: Departemen Farmasi FMIPA, UI. Sardjoko. 1991. Bioteknologi: Latar Belakang dan Beberapa Penerapannya. Jakarta: Gramedia Pustaka Utama. Schlegel, H. G. 1993. General Microbiology. Ed. England: Cambridge University Press. Staf Pengajar FKUI. 1994. Buku Ajar Mikrobiologi Kedokteran. Jakarta: Binarupa Aksara. Tortora, G. J., Funke, B. R., and Case, C. L. 2004. Microbiology: An Introduction. 8^ Ed. New York: Pearson Benjamin Cummings. Volk, W. A., and Wheeler, M. F. 1988. Mikrobiologi Dasar. Edisi 5. Jakarta: Penerbit Erlangga. 304
INDEKS
Angka, kapang-khamir, 268t, 269, 271, 272g lempeng total, 71, 268t, 269, 270g Anthony van Leeuwenhoek, 2, 107, 108 Antibiotik, 66, 68-69, 83, 87, 137, 260, 260t, 295-300 Antifungi, 65, 66, 260t Antigen, llOt, 125, 126, 131, 141-142, 153, 154t, 159, 162, 181, 182, 212,240 flagel. Lihat Ai\X\gQr\ H, 125, 127, 131 glikolipid, 176 H. Z./77a/Antigen flagel, 125, 127, 131 H7, 127 K. Lihat An\\gQn kapsul, 125, 127, 174 Kl, 126, 129 kapsul. Lihat AnWgm K, 125, 127, 131 LAM, 170 lipoid,212 lipopolisakarida, 125, 145 O. I/T/a/Antigen somatik, 125, 127, 131, 142, 240 P, 129 permukaan, 126, 174, 182 protein A, 181 Reiter, 216 selubung fraksi I (FI), 236 somatik. L/T/a/antigen O, 127, 131 treponema, 212 tuberkulin, 170 V, 236 Vi, 131
A
Acne, 205 nodular cystic acne, 205 Actinomycetes, 41, 122 Adenilat siklase, 126, 128, 133, 139, 141, 147, 151 Adenosin difosfat, ADP, 44 Adenosin monofosfat, AMP, 128, 147 Adenosin trifosfat, ATP, 43 Aerob, 26, 28t, 130 obligat, 28t, 165,217 Agar, 24, 29 Agrobacterium, 47 A. tumefaciens, 88 AHEC, 128 Air mendidih, 58 Aktivitas metabolik, 41 dL-alanin, 262t L-alanin, 262t Alanin, 80t Alga, 8, 18, 259 Amfitrik, 13 Amfoterisin, 68, 260t Amilase, 261 Amycolatopsis orientalis, 260t Anabolik, 43, 44, 44g Anabolisme, 43 Anaerob, 25 aerotoleran, 27, 28t fakultatif, 25, 28t obligat, 28t l,4-androstadien-3,l7-dion, 264t 4-androsten-3,l 7-dion, 264t
305
virus hepatitis B, 93, 265 W, 236 Antikoagulan, 266t Antiseptik, 69 Antitoksin, 147, 164, 228, 229 Antraks, 4, 12, l l l t , 113, 119t, 122, 241243 kulit, 242 paru, 242 saluran cerna, 242 L-Arginin, 262t Arkea, 7, 95 Armadillo,3\,229, 230 Arthrobacter, A. paraffineus, 262t A. simplex, 264t Artritis, 156, 160, 223 septik, 186, 190,211 Asam amino, 10, llt, 52, 77g, 79, 262t, 263 Asam folat, 303t L-Asam glutamat, 262t Asam klavulanat, 260t Asam nukleat, 8, 1 It, 25,47, 69, 76, 104, 176, 198 Asam organik, 47, 52, 66, 219 Asam pantotenat, 301, 302t Asam piruvat, 46-47, 49, 49t Asam sitrat, 51,263-264 Aseptik, 3, 60 Aseptis, 56, 71, 194, 251, 269, 280, 291 AsetilCoA, 50-51,50g Ashbya gossypii, 262 Asidofil, 23 Aspergillus, foetidus, 261 niger, 70, 263 oryzae, 256t soyae, 256t Aspergillus sp., 255 ATP, 25, 43-44, 47, 49, 44g, 50g Autoklaf, 57-58 ,253 . Azitromisin, 177, 199, 260t Aztreonam, 260t
B Bacillaceae, 150 ^ac/7/w.ssp.,251t, 256t, 257 Bacillus, 96 B. amyloliguefaciens, 87t B anthracis,4, 11, 108, 110, lllt, 119t, 122, 241-243 B cereus, U% 120t, 122,150-151,2481 B. mesentericus, 2511 B. mycoides, 97 B. nigrificans, 2511 B. polymyxa, 260t B. subtilis, 47, 82, 260t /
