Buku Penuntun Praktikum Hematologi Smk-Uh Ed3 [PDF]

Citation preview

BUKU PENUNTUN PRAKTIKUM



HEMATOLOGI UNTUK KELAS X, XI DAN XII ANALIS KESEHATAN



DI SUSUN OLEH : Ahmad Ripani, S.Si Ahli Teknologi Laboratorium Kesehatan



EDISI 3 HANYA DIGUNAKAN UNTUK KALANGAN SENDIRI



SEKOLAH MENENGAH KEJURUAN UNGGULAN HUSADA



PROGRAM STUDI ANALIS KESEHATAN 2011



BUKU PENUNTUN PRAKTIKUM



HEMATOLOGI UNTUK KELAS X, XI DAN XII ANALIS KESEHATAN



DI SUSUN OLEH : Ahmad Ripani, S.Si Ahli Teknologi Laboratorium Kesehatan EDISI 3 HANYA DIGUNAKAN UNTUK KALANGAN SENDIRI



SEKOLAH MENENGAH KEJURUAN UNGGULAN HUSADA



PROGRAM STUDI ANALIS KESEHATAN 2011 2



KATA PENGANTAR



Alhamdulillah diucapkan kepada Allah SWT atas berkat dan karunia-Nya akhirnya dapat diselesaikan juga buku Modul Praktikum Hematologi ini. Shalawat dan Salam selalu tercurah pada Sang Pemimpin Besar Umat Manusia Nabi Besar Muhammad SAW beserta para sahabat beliau hingga akhir nanti. Buku Modul Praktikum Hematologi ini merupakan disusun diperuntukkan bagi siswa-siswi kelas X, XI dan XII SMK Unggulan Husada Program Studi Analis Kesehatan yang belajar hematologi. Buku ini diterbitkan dalam rangka memenuhi kebutuhan intensif dan kompetensi penuh seorang analis kesehatan bagi siswa-siswi sebagai bahan acuan pembelajaran. Seperti kita ketahui bahwa hematologi merupakan salah satu inti dalam diri seorang profesi analis kesehatan, oleh sebab itu perlu penjabaran dalam bentuk belajar yang lebih fokus dan intensif berupa kelas berbasis laboratorium, suatu teknik penggabungan teori dan praktek yang dikembangkan di SMK Unggulan Husada Banjarmasin. Dalam buku ini di bahas tentang dasar hematologi, parameter anemia, pemeriksaan hematologi khusus, morfologi sel, faal hemostasis, Imunohematologi, Transfusi darah dan Bank Darah. Dalam tulisan ini penulis menuangkan antara kemampuan teori penulis yang diambil dari beberapa pustaka, pengalaman belajar sebagai siswa SMAK, pelatihan khusus bidang Hematologi Transfusi Darah, kuliah DIII Analis Kesehatan, Kuliah S1 Teknologi Laboratorium Kesehatan serta pengalaman penulis selama bekerja di laboratorium RSUD. dr. H. Moch. Ansari Saleh Banjarmasin di Banjarmasin. Dalam kesempatan ini pula penulis juga mengucapkan terima kasih kepada Kepala Sekolah SMK Unggulan Husada Banjarmasin beserta dewan guru yang telah memberikan kesempatan penulis untuk bereksplorasi, berpendapat, membahas, studi pustaka hingga proses editing sehingga buku modul praktikum hematologi ini dapat selesai dan berguna bagi siapa saja yang ingin mempelajarinya. Akhir kata penulis, hanya berharap semoga Buku Modul Praktikum Hematologi ini bermanfaat bagi kita semua dalam pemanfaatan keilmuan bidang hematologi di laboratorium kesehatan sehari-hari.



Penulis



Ahmad Ripani, S.Si Teknologi LabKes



3



PERATURAN LABORATORIUM HEMATOLOGI



1. Setiap Siswa wajib menggunakan alat pelindung diri (APD) seperti jas laboratorium, sepatu, masker, sarung tangan karet dan lainnya selama melakukan praktikum di laboratorium. Apabila tidak menggunakan akan dikeluarkan dari laboratorium. 2. Setiap siswa wajib mempersiapkan peralatan dan kotak praktek sebelum memasuki laboratorium. 3. Setiap siswa wajib membaca dan mempelajari materi praktikum yang akan dilakukan. 4. Sebelum praktikum dilakukan akan diberikan penjelasan oleh guru praktek dan akan dilakukan responsi berupa pre test dan atau post. 5. Setiap siswa membuat laporan setelah melakukan praktikum dan dikumpul paling lambat 4 hari setelahnya. 6. Setiap siswa wajib membersihkan dan merawat laboratorium hematologi baik peralatan, meja, kursi, reagensia dan lantai ruangan. 7. Setiap siswa wajib mengerti dan menerapkan kewaspadaan universal terhadap bahaya dan kecelakaan selama praktikum di laboratorium. Menganggap semua bahan spesimen darah adalah infeksius. 8. Setiap siswa yang mengalami kecelakaan di laboratorium wajib lapor dengan guru pembimbing. 9. Siswa yang tidak mengikuti praktikum satu kali, wajib mengganti di hari lain dan tidak diperkenankan mengikuti ujian akhir apabila tidak mengikuti praktikum secara keseluruhan. 10. Tidak diperkenankan makan dan minum di laboratorium. Dilarang keras merokok dan minuman keras. 11. Sebelum dan sesudah bekerja wajib mencuci tangan dengan sabun dan air kran mengalir.



4



SILABUS UMUM MATERI PRAKTIKUM HEMATOLOGI KELAS X 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. 10. 11. 12. 13. 14. 15.



KELAS XI



SEMESTER II Perkenalan Alat dan Reagensia Laboratorium Hematologi Pengambilan darah vena dan kapiler Hemoglobin Sahli Hitung leukosit Hitung eritrosit Hitung eosinofil LED (Na.Citrat 3,8%) dan NaCl 0,9% Diff. Count (Giemsa) - mengenal sel Diff. Count (Giemsa) – menghitung sel Hematokrit makro dan mikro Pengambilan darah tabung vakum Review Praktikum I Review Praktikum II Review Praktikum III Review Praktikum IV



SEMESTER III 1. Retikulosit dan Eritrosit (Hapusan) 2. Retikulosit dan Eritrosit II (Direk) 3. Parameter Anemia (Hemoglobin Cyanmet, Eritrosit, Hematokrit, MCV, MCH, MCHC, Retikulosit, CI, VI, SI) 4. Osmotik Fragility Dacie 5. Osmotik Fragility Spektrofometer 6. Pembuatan Kurva Standar Hemoglobin 7. Parameter Anemia (Hb Cyanmet, Eritrosit, Hematokrit, MCV, MCH, MCHC) 8. Darah Rutin I 9. Darah Rutin II 10. Review Praktikum I 11. Review Praktikum II 12. Review Praktikum III 13. Review Praktikum IV



KELAS XI 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. 10. 11. 12. 13.



KELAS XII



SEMESTER IV Rumple Leede dan Trombosit Rees Ecker Parameter Hemostasis (BT, CT, Trombosit Amonium Oxalat 1%) BT, CT dan Rumple Leede Trombosit Fonio dan Rees Ecker Protrombine Time dan aPTT (RS) Hematology Analyzer (di RS) Diff. Count (Pulas Tanding Wright-Giemsa) dan Leukosit (Tabung) Darah Rutin Parameter Anemia Morfologi Sel-sel Darah Review Praktikum I Review Praktikum II Review Praktikum III



7. 8. 9. 10. 11. 12. 13.



SEMESTER V Morfologi Sel-Sel Eritrosit Morfologi Sel-Sel Eritrosit II Sel-Sel Muda Sel-sel Muda Golongan darah ABO dan Reverse Group (Slide dan Tabung) Rhesus dan Antiglobulin (Slide dan tabung) Cross Match (Slide dan tabung) Cross Match (Slide dan Tabung) Cross Match (Slide dan Tabung) Review Praktikum I Review Praktikum II Praktikum di UTD PMI Banjarmasin Praktikum di BDRS RSUD Ulin



1. 2. 3. 4. 5. 6.



TAMBAHAN Praktek di Laboratorium Rumah Sakit Praktek di BDRS Praktek di UDD PMI Kunjungan Ilmiah Praktek Kerja Industri Kegiatan Lainnya.



1. 2. 3. 4. 5. 6.



KELAS XII SEMESTER VI 1. Darah Rutin (Hemoglobin Cyanmet, Hitung leukosit, LED, Diff. Count, Hematokrit) 2. Parameter Anemia (Hemoglobin, Eritrosit, hematokrit, Retikulosit) 3. Hemostasis (Bleeding Time, Clotting Time, Trombosit) 4. Osmotik Fragility 5. Eosinofil dan Diff. Count 6. Diff. Count dan Hapusan Darah 7. Review Praktikum I 8. Review Praktikum II 9. Review Praktikum III 10. Review Praktikum IV 11. Review Praktikum V 12. Ujian Akhir



5



DAFTAR ISI halaman SAMPUL .................................................................................................................. KATA PENGANTAR ......... ...................................................................................... PERATURAN LABORATORIUM HEMATOLOGI ..................................................... SILABUS UMUM PRAKTIKUM HEMATOLOGI ....................................................... DAFTAR ISI ............................................................................................................ BAB I PENDAHULUAN ................................................................................ BAB II DARAH DAN KOMPONENNYA ......................................................... BAB III PENGAMBILAN DARAH .................................................................... BAB IV ANTIKOAGULAN ................................................................................ BAB V HEMOGLOBIN ................................................................................... BAB VI HITUNG LEUKOSIT ........................................................................... BAB VII HITUNG ERITROSIT .......................................................................... BAB VIII HITUNG JENIS LEUKOSIT ................................................................ BAB IX LAJU ENDAP DARAH (LED)............................................................... BAB X HITUNG EOSINOFIL .......................................................................... BAB XI HEMATOKRIT ..................................................................................... BAB XII INDEKS ERITROSIT .......................................................................... BAB XIII RETIKULOSIT .................................................................................... BAB XIV FRAGILITAS OSMOTIK ...................................................................... BAB XV HITUNG TROMBOSIT ........................................................................ BAB XVI PARAMETER FAAL HEMOSTASIS .................................................... BAB XVII BLEEDING TIME................................................................................. BAB XVIII CLOTTING TIME................................................................................. BAB XIX APTT ................................................................................................... BAB XX PPT ..................................................................................................... BAB XXI TROMBINE TIME ................................................................................ BAB XXII RECALCIFIKASI TEST ....................................................................... BAB XXIII CLOT RETRACTION, KONSISTENSI & VOLUME CAIRAN BEKUAN BAB XXIV HEMATOLOGY ANALYZER ............................................................... BAB XXV PEWARNAAN SITOKIMIA HEMATOLOGI .......................................... BAB XXVI SEL LUPUS ERITHEMATOSUS ......................................................... BAB XXVII EVALUASI HAPUSAN DARAH ........................................................... BAB XXVIII KELAINAN ERITROSIT....................................................................... BAB XXIX KELAINAN LEUKOSIT ........................................................................ BAB XXX GOLONGAN DARAH ABO .................................................................. BAB XXXI RHESUS ............................................................................................. BAB XXXII PEMERIKSAAN GOLONGAN DARAH STANDAR UDD PMI .............. BAB XXXIII REAKSI SILANG SERASI (CROSSMATCH) ....................................... BAB XXXIV UJI COOMBS ...................................................................................... BAB XXXV VALIDASI REAGENSIA BDRS/UTDRS .............................................. BAB XXXVI PEMELIHARAAN PERALATAN HEMATOLOGI .................................. BAB XXXVII PENUTUP ........................................................................................... LAMPIRAN ............................................................................................................ DAFTAR PUSTAKA ................................................................................................



6



1 3 4 5 6 7 9 12 19 22 25 30 35 44 46 49 51 53 57 61 70 72 74 76 78 79 80 81 82 84 87 89 91 95 98 101 103 113 119 121 125 126 127 132



BAB I PENDAHULUAN I.1. HEMATOLOGI I.1. 1 Definisi Hematologi berasal dari kata “Hema atau Hematos atau Heme atau Hemos” yang berarti darah, “Logos” yang berarti ilmu pengetahuan. Jadi Hematologi adalah ilmu yang mempelajari tentang darah dan komponen sel-sel darah dan komponen plasma yang terkandung didalamnya. Hematologi yang akan dipelajari meliputi : Hematologi dasar, Hematologi II (anemia dan hemostasis), Hematologi III (leukemia dan sel-sel muda) dan Hematologi Transfusi Darah. Umumnya Hematologi transfusi darah telah dipisahkan menjadi sebuah ilmu tersendiri yaitu Ilmu Transfusi Darah. Sejak dahulu para ilmuan sudah mempelajari tentang darah, baik memeriksa langsung darah dengan mikroskop, maupun menambahkan suatu larutan pereaksi tertentu kemudian akan terjadi hasil reaksi atau memisahkan sel-sel darah. Perkembangan ilmu hematologi sejak dahulu berkembang pesat, mulai dari teknik manual, konvensional, hematologi sitokimia, penghitungan sel menggunakan alat canggih, hingga teknik molekuler sel-sel darah. Hingga saat ini hematologi merupakan bagian ilmu laboratorium klinik yang paling berperan dalam mengetahui penyakit-penyakit akibat kelainan darah dan merupakan pemeriksaan penyaring utama pada setiap pasien yang akan menjalani general check up. I.1.2 Fungsi Pemeriksaan Hematologi Hematologi dalam laboratorium klinik di rumah sakit mempunyai fungsi dan peranan sebagai berikut : 1. Sebagai penyaring (screening test) suatu penyakit. 2. Sebagai penunjang diagnosis suatu penyakit. 3. Sebagai pelengkap diagnosis suatu penyakit. 4. Sebagai penegak diagnosis suatu penyakit. 5. Sebagai differensial diagnosis suatu penyakit. 6. Sebagai follow up suatu penyakit. 7. Sebagai prognosis suatu penyakit. Pemeriksaan penyaring tunggal misalnya hemoglobin, sedangkan penyaring ganda misal hematology Analyzer. Pemeriksaan hematologi merupakan pintu gerbang pertama seorang klinisi dalam mendiagnosis suatu penyakit pada seseorang, yang akan dilanjutkan dengan parameter laboratorium lainnya. Kadang suatu diagnosis baru dapat ditegakkan apabila telah dilakukan pemeriksaan hematologi, namun juga pemeriksaan hematologi akan berfungsi sebagai diagnosis banding apabila terdapat keyakinan klinisi bahwa terdapat kesamaan penyakit yang perlu bantuan pemeriksaan hematologi untuk membedakannya. Hal lain yang terakhir, bahwa pemeriksaan hematologi dapat digunakan untuk mengetahui evaluasi hasil pengobatan dan perjalanan penyakit yang diderita oleh seseorang. I.1.3 Parameter Hematologi Secara umum panel parameter pemeriksan hematologi dapat dikelompokkan menjadi beberapa kelompok sebagai berikut : 1. Darah Rutin. Pemeriksaan meliputi : hemoglobin, hitung eritrosit, hitung leukosit, LED, hitung jenis leukosit dan beberapa literatur menambahkan hitung trombosit dan hematokrit. Ada beberapa literatur mengatakan bahwa LED bukan termasuk kelompok darah rutin, namun pemeriksaan hematologi indikasi. 2. Parameter Anemia. Pemeriksaan meliputi : hemoglobin, hitung eritrosit, hitung leukosit, hematokrit (PCV), MCV, MCH, MCHC, hitung retikulosit, kadar besi, TIBC, Osmotik fraglity, gambaran darah tepi. 7



3. Parameter Leukemia Pemeriksaan meliputi : hemoglobin, hitung leukosit, hitung jenis leukosit, hitung eosinofil, pewarnaan peroksidase, pewarnaan PAS, pewarnaan Sudan Black dan gambaran darah tepi. 4. Faal Hemostasis. Pemeriksaan meliputi : hitung trombosit, rumple leede, bleeding time, clotting time, plasma protrombin time, serum protrombin time, aPTT/kPTT, clot retraction test, trombin time, titer fibrinogen, rekalsifikasi, D-dimer dan lainnya. 5. Hematologi Khusus. Pemeriksaan khusus dan tidak lazim dikerjakan dalam sehari-hari. Pemeriksaan meliputi : sel LE, Pulasan Hemosiderin, pemeriksaan sumsum tulang (oleh tenaga ahli), hitung CD4+ dan lainnya. I.1.4 Teknik Pemeriksaan Hematologi Pemeriksaan hematologi dalam perkembangannya dilakukan dengan 3 teknik pemeriksaan yaitu : 1. Manual Pemeriksaan hematologi menggunakan peralatan yang manual, sederhana, konvensional dan pembacaan secara visual atau menggunakan alat bantu. Contohnya : pemeriksaan hemoglobin cara sahli dan cara tallquist. 2. Semiotomatis Pemeriksaan hematologi menggunakan peralatan yang manual, peralatan agak canggih dan teknik pembacaan sudah menggunakan peralatan pengukuran. Contohnya : pemeriksaan hemoglobin cara cyanmethemoglobin menggunakan fotometer. 3. Otomatis Pemeriksan hematologi yang telah menggunakan peralatan otomatis sehingga darah yang diperiksa langsung dianalisa suatu alat dan hasil telah dapat dibaca setelah beberapa menit. Contohnya : pemeriksaan menggunakan alat hematology analyzer. I.1.5 Spesimen Pemeriksaan Hematologi Spesimen yang digunakan dalam pemeriksaan hematologi umumnya adalah darah penuh (whole blood), namun juga digunakan hanya komponen sel-sel, plasma atau serum dan cairan sumsum tulang. Spesimen diperoleh dengan melakukan pengambilan darah (flebotomi) umumnya pada vena dan kapiler, serta punksi/aspirasi pada cairan sumsum tulang belakang. Darah yang diperoleh ditampung dan diawetkan menggunakan antikoagulan agar tidak membeku atau dibiarkan membeku untuk memperoleh serum. Analis kesehatan hanya diberikan tentang tata cara pemeriksaan spesimen dari darah vena dan kapiler.



8



BAB II DARAH DAN KOMPONENNYA II.1 DARAH II.1.1 Pengertian Darah adalah jaringan tubuh yang berbeda dengan jaringan tubuh lain karena berada dalam konsistensi cair, beredar dalam pembuluh darah untuk menjalankan fungsi transport berbagai bahan didalam tubuh manusia. Darah merupakan jaringan yang unik, karena merupakan suatu jaringan yang bersentuhan dengan hampir seluruh jaringan tubuh. Volume darah manusia sekitar 7%-10% berat badan normal dan berjumlah sekitar 5 liter, darah terdiri atas sel-sel, pecahan-pecahan sel dan suatu larutan bersifat cair yaitu plasma. Sekitar 55% adalah cairan, sedangkan 45% sisanya terdiri atas sel-sel darah. Darah terdiri atas 2 komponen utama yaitu : 1. Plasma darah, bagian cairan darah yang sebagian besar terdiri atas air, elektrolit, protein darah dan sebagian kecil glukosa dan sisa metabolisme protein. 2. Butir-butir darah (blood corpuscles) yang terdiri atas sel darah merah (erythrocyte), sel darah putih (leukocyte), serta sel pembeku darah (thrombocyte/platelet). Eritrosit merupakan sel terbanyak dalam darah. Leukosit dan trombosit walaupun secara fungsional sangat esensial, tapi hanya merupakan sebagian kecil saja dari darah secara keseluruhan. Komponen utama plasma darah adalah air, elektrolit dan protein. Protein yang terlarut meliputi : Albumin, globulin (alfa globulin, beta globulin dan gamma globulin), fibrinogen, protrombin, asam amino dan polipeptida lainnya. Darah yang beredar dalam sirkulasi tubuh merupakan gambaran kondisi tubuh dan metabolisme tubuh, misal : meningkatnya jumlah leukosit menandakan adanya radang atau infeksi, perdarahan yang tidak berhenti menandakan adanya defisiensi faktor pembekuan darah dan menurunnya kadar hemoglobin menandakan anemia. Dalam darah dapat di analisis zat-zat terlarut sebagai penanda kelainan tubuh. II.1.2 Sifat Fisika Darah Darah normal bersifat sedikit alkali dengan rata-rata pH 7,4 atau berkisar antara 7,35 - 7,45. Berat jenis (BJ) darah berkisar antara 1.045 – 1.075 (air murni BJ = 1.000) tergantung kandungan dan komposisi protein dalam darah. Jumlah darah total dalam tubuh bervariasi dari 1/12 sampai 1/14 dari berat badan dengan rata-rata 1/13,5 dari berat badan. Darah berwarna merah karena kandungan hemoglobin pada setiap sel eritrosit, namun apabila dibiarkan mengendap maka akan terpisah menjadi dua bagian yaitu : bagian padata berupa sel yang berwarna merah dibagian bawah dan cairan plasma bening berwarna kuning. II.1.3 Fungsi Darah Darah mempunyai berbagai fungsi di dalam tubuh yaitu : 1. Respirasi, sebagai media transportasi dengan membawa oksigen (O2) dari paru ke jaringan dan membawa CO2 dari jaringan ke paru. 2. Nutrisi, membawa sari makanan. 3. Ekskresi, mengangkut zat sisa-sisa metabolit menuju ginjal dan paru-paru untuk dikeluarkan dari tubuh. 4. Pengaturan suhu tubuh melalui distribusi panas. 5. Pemeliharaan keseimbangan cairan tubuh dan elektrolit. 6. Pengaturan asam basa / pH darah. 7. Mekanisme pertahanan tubuh terhadap infeksi 8. Mekanisme sistem antibodi dan penolakan jaringan asing. 9. Mekanisme faal hemostasis. 10. Darah mentransfer hormon dan vitamin ke sel untuk mengatur proses metabolisme di dalam sel.



9



II.2 KOMPONEN DARAH II.2.1 Plasma dan Serum Plasma adalah bagian darah yang cair tanpa sel-sel darah yang mengandung substansi dengan berat molekul kecil dan besar terlarut, warnanya bening kekuningkuningan. Hampir 90% dari plasma darah terdiri atas air. Plasma diperoleh dengan memutar sel darah, plasma diberikan secara intravena untuk mengembalikan volume darah. Di luar sistem vaskuler darah dapat tetap cair bila fibrinogen dikeluarkan atau bila darah dibubuhi antikoagulan yang mencegah pembekuan dengan cara mengikat kalsium atau menghambat trombin dan mencegah perubahan fibrinogen menjadi fibrin. Plasma segar mengandung semua jenis protein yang ada di dalam sirkulasi. Apabila darah dikeluarkan dari tubuh maka segera terjadi bekuan yang terdiri atas unsur terbentuk dan cairan kuning jernih yang disebut serum. Serum sebenarnya merupakan plasma tanpa fibrinogen dan protrombin (protein). Apabila pembekuan dicegah maka perbandingan antara unsur terbentuk yang sebagian besar merupakan sel-sel darah merah, dan plasma adalah sekitar 40-50%. Pada laki-laki dewasa perbandingan ini tergantung pada jenis kelamin dan umur individu. Tabel 1. Perbedaan cairan darah plasma dan serum



Ciri Warna Kekentalan Antikoagulan Fibrinogen Protrombin Serat fibrin Pemisahan sel Sel terkumpul dalam Suspensi kembali sel Trombosit Antikoagulan



Plasma Agak kuning, jernih Lebih kental dari air Perlu Masih ada Masih ada Tidak ada Pemusingan Endapan (sedimen) Dapat Banyak Ya



Serum Agak kuning, jernih Lebih kental dari air Tidak perlu Tidak ada lagi Tidak ada lagi Ada dalam gumpalan Penggumpalan spontan Gumpalan Tidak dapat Sedikit sekali Tidak



Dari tabel ini, tampak jelas bahwa plasma tidak dapat dibedakan dengan serum secara kasat mata saja, selain itu sel-sel yang terpisah dalam proses pembuatan plasma atau serum berada dalam keadaan yang berbeda. Plasma memisakan sel darah dalam bentuk endapan sel utuh. Bagian cairan yang merupakan plasma atau serum mengandung bermacammacam zat yang dapat dikategorikan dalam beberapa golongan yaitu : 1. Golongan lemak atau lipid (kolesterol, trigliserida). 2. Golongan karbohidrat (glukosa). 3. Golongan protein (albumin, globulin, fibrinogen). 4. Golongan enzim (amilase, transaminase, LDH, CPK). 5. Golongan hormon (insulin, adrenalin, estrogen). 6. Golongan vitamin (vitamin A, vitamin K, vitamin B). 7. Golongan mineral (zat besi, kalium, Natrium, chlorida). 8. Golongan zat warna (bilirubin). 9. Golongan ampas metabolik (urea, kreatinin, asam urat). Sedangkan protein plasma merupakan protein yang banyak mengandung albumin, globulin dan fibrinogen. Protein darah memegang peranan penting dalam hampir semua proses fisiologis yaitu : 1. Sebagai proses enzimatik 2. Sebagai proses transport dan penyimpanan 3. Sebagai proses pergerakan 10



4. Pencetus dan penghantar impuls pada sel saraf 5. Proses immunologis 6. Fungsi mekanik 7. Mengatur proses pertumbuhan dan diferensiasi. II.2.2 Eritrosit Sel darah merah (eritrosit) merupakan salah satu sel yang paling sederhana pada tubuh, berupa cakram kecil bikonkaf, cekung pada kedua sisinya, sehingga dilihat dari samping tampak seperti dua buah bulan sabit yang saling bertolak belakang. Bikonkafitas memungkinkan gerakan oksigen masuk keluar sel secara cepat dengan jarak yang pendek antara membran dan inti sel. Eritrosit berwarna kuning kemerah-merahan, karena di dalamnya mengandung suatu zat yang disebut hemoglobin. Eritrosit merupakan sel dengan struktur yang tidak lengkap, sel ini hanya terdiri atas membran dan sitoplasma tanpa inti sel. Komponen eritrosit terdiri atas membran eritrosit, sistem enzim, hemoglobin. Sel darah merah mampunyai fungsi sebagai transpor hemoglobin, yang selanjutnya membawa oksigen dari paru-paru ke jaringan. Rata-rata panjang hidup eritrosit kira-kira 115 - 120 hari. Dalam keadaan normal, bentuk sel darah merah dapat berubah-ubah, sifat ini memungkinkan sel tersebut masuk ke mikrosirkulasi kapiler tanpa kerusakan. Apabila sel darah merah sulit berubah bentuknya, maka sel tersebut tidak dapat bertahan selama peredarannya dalam sirkulasi. Nilai normal eritrosit laki-laki : 4,6 - 6,2 juta/mm3 dan perempuan : 4,2 - 5,4 juta/mm3. II.2.3 Leukosit Sel darah putih (leukosit) bening dan tidak berwarna, bentuknya lebih besar daripada eritrosit, tetapi jumlah lebih sedikit. Dalam milimeter kubik darah terdapat 6.000 10.000 sel. Berperan dalam sistem pertahanan tubuh, lekosit dibentuk sebagian dalam sumsum tulang (granulosit dan monosit), sebagian dalam limfe (limfosit dan sel plasma). Fungsi umum leukosit dalam mempertahankan tubuh terhadap penyusupan benda asing yang selalu dipandang mempunyai kemungkinan untuk mendatangkan bahaya bagi kelangsungan hidup individu. Fungsi granulosit dan monosit untuk melakukan fagositosis benda asing yang masuk ke dalam tubuh. Fungsi limfosit bertanggung jawab dalam respon imunitas seluler dan respons imunitas humoral. II.2.1 Trombosit Trombosit berupa sel keping darah yang berukuran 3 - 4 mikron yang berasal dari pecahan sitoplasma Megakariosit. Trombosit mempunyai peranan penting dalam hemostasis yaitu pembentukan dan stabilisasi sumbat trombosit, pembentukan sumbat trombosit terjadi melalui beberapa tahap yaitu adhesi trombosit, agregasi trombosit dan reaksi pelepasan. Trombosit berfungsi penting dalam usaha tubuh untuk mempertahankan keutuhan jaringan bila terjadi luka, sehingga tidak kehilangan darah dan terlindungi dari penyusupan sel asing. Nilai normal trombosit adalah 150.000 - 450.000 per milimeter kubik darah.



11



BAB III PENGAMBILAN DARAH III.1 PENDAHULUAN III.1.1 Pengertian Pengambilan darah di laboratorium sering diasumsikan dengan nama flebotomi. Flebotomi (bahasa inggris : phlebotomy) berasal dari kata Yunani phleb dan tomia. Phleb berarti pembuluh darah vena dan tomia berarti mengiris/memotong (“cutting”). Dahulu dikenal istilah venasectie (Belanda), venesection atau venisection (Inggris). Jadi tidaklah tepat karena flebotomi sebenarnya diarahkan pengambilan darah dengan cara vena seksi (vena section) dan tidak sempit maknanya juga karena mencakup darah vena, kapiler dan darah arteri. Pengambilan darah umumnya yang diberikan kepada analis kesehatan hanya untuk memperoleh spesimen darah yang berasal dari vena dan kapiler, namun tidak masuk dalam kurikulum mata pelajaran khusus yang mandiri, tetapi melekat pada hematologi. Hal ini memberikan sinyal bahwa pengambilan darah hanya untuk membantu analis kesehatan untuk memperoleh darah, bukan menjadi suatu keahlian profesional. Umumnya praktek awal pengambilan darah menggunakan suatu alat peraga phantom (suatu alat peraga yang dikondisikan mirip dengan vena manusia) dan setiap orang dapat mencobanya. Pengambilan darah selain bertujuan mengambil darah secara aman, juga harus memperhatikan etika dalam berkomunikasi dengan pasien, oleh sebab itu perlunya penjelasan petugas kepada pasien agar pasien merasa tenang saat akan dilakukan pengambilan darah. Petugas pengambilan darah pun harus menggunakan alat pelindung diri, agar terlindung dari resiko penularan penyakit infeksi melalui darah. III.1.2 Pengambilan Darah Kapiler Cara ini digunakan bila jumlah darah yang digunakan atau dibutuhkan sedikit yaitu kurang dari 0,5 ml darah. Biasanya digunakan hanya untuk satu atau dua macam pemeriksaan saja. Misalnya hanya untuk hemoglobin, hapusan darah, eritrosit atau hitung leukosit. Secara umum tidak ada perbedaan yang bermakna antara darah kapiler dan darah vena sebagai spesimen pemeriksaan hematologi, asalkan proses pengambilannya mengikuti ketentuan yang baku dan tidak tercampur cairan jaringan atau alkohol 70% antiseptik. Pengambilan darah kapiler diindikasikan pada pada keadaan tertentu, seperti : neonatus, bayi prematur, luka bakar luas, gemuk, pasien dengan kecenderungan trombosis dan pasien dengan gangguan darah perifer. Gambar 1. Pengambilan darah kapiler menggunakan autoclix pada jari tangan.



III.1.2.1 Alat dan Reagensia 1. Blood lancet atau Autoclix dan sebaiknya disposable pemakaiannya (single use only) untuk menghindari penularan penyakit dan ketajaman mata lancet tetap baik dan tajam. Kedua jenis alat ini cukup untuk menembus kulit dengan kedalaman antara 1 – 3 mm. 2. Kapas atau tissue kering 3. Kapas Alkohol 70%



12



III.1.2.2 Lokalisasi Tempat penusukan bisa dipilih dari ujung jari tangan, cuping telinga, dan untuk bayi biasanya dari ujung jari kaki atau sisi lateral tumit. Jangan menusuk pada bagian tangan bayi karena akan tertusuk tembus hingga ke tulang sehingga akan menyebabkan kerusakan jaringan tulang pada bayi. Dalamnya tusukkan maksimal 2,5 mm, karena bila melebihi pada bayi akan terkena tulang kalkaneus. Tempat yang dipilih tidak boleh terlihat adanya gangguan peredaran darah seperti cyanosis (kebiruan) atau pucat. III.1.2.3 Teknik kerja 1. Tempat yang akan ditusuk harus diberi dengan antiseptik Alkohol 70%, lalu dibiarkan kering. Dapat juga menggunakan antiseptik Tincture Iodium 1% 2. Kulit setempat ditegangkan dengan memijat antara dua jari 3. Penusukkan dilakukan dengan gerakkan yang cepat dan tepat sehingga terjadi luka yang dalamnya 3 mm. Pada jari tusuklah dengan arah tegak lurus pada garis – garis sidik jari kulit dan jangan sejajar. Bila memakai anak daun telinga (cuping telinga), tusuklah pinggirnya, bukan sisinya. Tusukkan harus cukup dalam supaya darah mengalir keluar dengan mudah. 4. Tetesan darah pertama harus dihapus dengan kapas atau tissue bersih dan kering karena ini mungkin tercampur dengan alkohol. 5. Tetesan darah yang keluar selanjutnya dapat digunakan untuk pemeriksaan hematologi. III.1.2.4 Hal-hal yang perlu diperhatikan  Sebelum dilakukan penusukan harus diperhatikan tempat-tempat yang tidak boleh diambil yaitu adanya peradangan, bekas luka dermatitis, oedema. Pada penderita yang pucat atau Cyanosis perlu dipijat-pijat dan digosok-gosok atau direndam dalam air hangat dulu supaya peredaran darah setempat mejadi lebih baik.  Penusukan pada ujung jari sebaiknya dilakukan pada sisi karena rasa nyeri berkurang.  Jangan menekan atau memeras jari atau cuping telinga untuk mendapatkan darah yang cukup, darah yang diperas semacam ini bercampur dengan cairan jaringan dan menyebabkan kesalahan dalam pemeriksaan.  Pada cuping telinga yang tidak boleh diambil yaitu daerah yang dekat dengan anting, pada pengambilan darah pada cuping telinga tidak terlalu nyeri,  Perlu diperhatikan kalau terjadi pendarahan pada cuping ini sukar untuk dihentikan oleh karena itu bagi penderita tersangka pendarahan tidak boleh dilakukan penusukan dicuping telinga. III.1.2.5 Kesulitan Bila kulit sekitar luka tak kering karena alkohol atau keringat, maka tetesan darah yang keluar tak dapat mengumpul pada tempat itu, melainkan segera menyebar disekitarnya, sehingga darah tidak dapat diperoleh secara sempurna. III.1.3 Pengambilan darah vena Darah vena diperoleh dengan jalan punksi vena. Jarum yang digunakan untuk menembus vena itu hendaknya cukup besar, sedangkan ujungnya harus runcing , tajam dan lurus. Dianjurkan untuk memakai jarum dan semprit yang disposable; semprit semacam itu biasanya dibuat dari semacam plastik. Baik semprit maupun jarum hendaknya dibuang setelah dipakai, janganlah disterilkan lagi guna pemakaian berulang. Semprit yang banyak dipakai untuk pemeriksaan hematologi ialah yang mempunyai volume 2 dan 5 ml. Dianjurkan pula menggunakan “jarum – jarum steril“. Teknik pengambilan menggunakan tabung hampa (vacutainer, venoject) yakni jarum yang diperlengkapi dengan tabung gelas hampa udara; pada waktu melakukan pungsi vena, 13



darah terisap ke dalam tabung itu. Alat ini dapat digunakan 1 kali saja. Memakai jarum – tabung ini ada keuntungan tambahan karena darah yang diperoleh dalam keadaan tidak terkontaminasi. III.1.3.1 Alat dan Reagensia : 1. Jarum dan semprit atau tabung vakum dilengkapi jarum dan holder. Jarum harus cukup besar, ujungnya runcing, tajam dan lurus dan hendaknya dibuang setelah dipakai (dispossible). 2. Tourniquet Bila tidak ada tourniquet dapat digunakan pembalut dari tensimeter atau selang karet yang lunak (lebar ± 5 cm). 3. Botol penampung darah Kering dan tertutup, untuk keperluan mikrobiologi harus steril. Volumenya tidak terlalu besar untuk jumlah darah yang akan ditampung dan diberi label. 4. Kapas bersih beralkohol 70 % sebagai antiseptik 5. Bantalan Sebagai pengganjal atau penopang tangan (jika diperlukan) III.1.3.2 Lokalisasi Vena yang cukup besar dan letaknya superficial (permukaan) merupakan yang ideal sebagai vena yang akan ditusuk. Pada orang dewasa dapat menggunakan : vena diffosa cubiti, vena cephalica, vena cephalica mediana, vena basilica atau vena basilica mediana. Pada kondisi lain dapat juga menggunakan vena pada tangan, dimana biasanya perawat memasang infus, namun harus berhati – hati karena resiko tertusuk tulang sangat besar. Anak-anak dan bayi bila mengalami kesulitan dapat menggunakan vena Jugularis Externa (lebar), vena Femoralis (paha) dan atau vena Sinus sagitalis Superior (kepala), namun harus berpengalaman dan ahli dalam pengambilan darah. Pada pengambilan darah vena (venipuncture), contoh darah umumnya diambil dari vena median cubital, pada anterior lengan (sisi dalam lipatan siku). Vena ini terletak dekat dengan permukaan kulit, cukup besar, dan tidak ada pasokan saraf besar. Apabila tidak memungkinkan, vena chepalica atau vena basilica bisa menjadi pilihan berikutnya. Venipuncture pada vena basilica harus dilakukan dengan hati-hati karena letaknya berdekatan dengan arteri brachialis dan syaraf median. Jika vena cephalica dan basilica ternyata tidak bisa digunakan, maka pengambilan darah dapat dilakukan di vena di daerah pergelangan tangan. Lakukan pengambilan dengan dengan sangat hati-hati dan menggunakan jarum yang ukurannya lebih kecil. III.1.3.3 Teknik Kerja 1. Alat-alat yang diperlukan disiapkan di meja kerja. 2. Keadaan pasien diperiksa, diiusahakan pasien tenang begitu pula petugas pengambil darah (phlebotomis). 3. Ditentukan vena yang akan ditusuk, pada orang gemuk atau untuk vena yang tidak terlihat dibantu dengan palpasi (perabaan). 4. Daerah vena yang akan ditusuk diperhatikan dengan seksama terhadap adanya peradangan, dermatitis atau bekas luka, karena mempengaruhi hasil pemeriksaan. 5. Tempat penusukan beri antiseptik dengan Alkohol 70 % dan dibiarkan kering 6. Tourniquet dipasang pada lengan atas (bagian proximal lengan) 6 – 7 cm dari lipatan tangan. 7. Tegakkan kulit diatas vena dengan jari-jari tangan kiri supaya vena tidak bergerak.



14



8. Dengan lubang jarum menghadap keatas, kulit ditusuk dengan sudut 45o – 60o sampai ujung jarum masuk lumen vena yang ditandai dengan berkurangnya tekanan dan masuknya darah ke ujung plastik jarum. 9. Holder ditarik perlahan-lahan sampai volume darah yang diinginkan apabila menggunakan syringe. Apabila menggunakan tabung vakum, tabung diambil dan ditusukkan pada ujung lain dari jarum tadi, maka darah akan masuk dengan sendirinya. 10. Torniquet dilepas pada lengan. 11. Kapas diletakkan diatas jarum dan ditekan sedikit dengan jari kiri, lalu jarum ditarik. 12. Pasien diinstruksikan untuk menekan kapas selama 1 menit pada tempat tusukan. Setelah itu direkatkan kapas menggunakan plester. 13. Jarum ditutup lalu dilepaskan dari sempritnya, darah dimasukkan kedalam botol penampung melalui dinding secara perlahan. Bila menggunakan antikoagulan, segera perlahan-lahan dicampur. Untuk tabung vakum segera dikocok perlahan untuk mencampurkan darah dengan zat aditif didalamnya. III.1.3.4 Hal – hal yang perlu diperhatikan 1. Pastikan petugas telah menggunakan alat pelindung diri (APD) : jas laboratorium, masker, sarung tangan karet dan penutup kepala. 2. Pasien yang takut harus ditenangkan dengan memberi penjelasan mengenai apa yang akan dilakukan, maksud beserta tujuannya. 3. Pada pasien anak, perlu di fiksasi tangannya dengan petugas lain agar tidak bergerak pada saat penusukan. 4. Vena yang kecil terlihat sebagai garis-garis biru biasanya sukar digunakan 5. Untuk vena yang tidak dapat ditentukan karena letaknya yang dalam, usaha cobacoba dilarang untuk dilakukan 6. Pembendungan yang terlalu lama jangan dilakukan karena dapat mengakibatkan hemokonsentrasi setempat. 7. Hematoma, yaitu keluarnya darah dibawah kulit dalam jaringan pada kulit disekitar tusukkan akan terlihat berwarna biru, biasanya akan terasa nyeri, perintahkan pasien untuk mengompresnya dengan air hangat beberapa menit atau beberapa hari sampai sakitnya hilang. III.2 PERALATAN PENGAMBILAN DARAH III.2.1 Kode Warna Jarum Jarum yang digunakan untuk pengambilan darah bermacam - macam ukurannya. Untuk itu perlu diketahui dan dipilih jenis jarum yang akan digunakan serta disesuaikan dengan volume yang akan diambil dan pasien yang akan diambil darah. Semakin besar nomor jarum, maka semakin kecil diameter lubang jarum. Kode warna jarum dapat dilihat pada plastik holder jarum yang akan disambungkan dengan spuit/semprit/syringe atau tabung vakum. Gambar 3. Ukuran jarum dengan kode warna pada plastik holder.



Jarum no. 27 G dengan warna merah jambu berukuran paling kecil, diikuti jarum No. 25 G warna kuning, jarum no. 24 G berwarna ungu, jarum no. 23 G biru, jarum no. 22 15



berwarna hitam, jarum no. 21 berwarna hijau, jarum no.20 kuning krim, jarum no.18 putih dan lainnya. Untuk pemeriksaan hematologi biasanya digunakan jarum no. 21, 22 dan 23 pada orang dewasa dan anak, sedangkan pada bayi digunakan no.27 dan 25 G. III.2.2 Ukuran Syringe (Spuit/Semprit) Syringe yang tersedia dipasaran beragam ukuran mulai 1 ml, 3 ml, 5 ml, 10 ml, hingga 20 ml. Untuk pemeriksaan hematologi idealnya menggunakan syringe ukuran 1 ml, 3 ml dan 5 ml. Hal ini karena dalam pemeriksaan hematologi tidak terlalu banyak menggunakan darah untuk pemeriksaan di laboratorium. Syringe ukuran 3 ml sangat sering digunakan di laboratorium sehari-hari, hal ini selain mudah didapat juga menggunakan jarum no.23 sehingga cocok dengan hampir semua umur pasien. III.2.3 Kode Warna Tabung vakum Tabung vakum merupakan tabung yang telah hampa udara yang diproduksi oleh perusahaan, sehingga saat pengambilan darah maka akan tersedot sendiri dengan gaya vakum tabung ini. Tabung vakum rata-rata terbuat dari kaca antipecah atau plastik bening dengan berbagai ukuran volume yang berisi zat additif didalamnya. Tabung vakum dibedakan jenisnya berdasarkan warna tutup dan etiketnya, berikut kode warna untuk tiap tabung vakum : 1. Tutup dan Etiket Merah (Red Top) Tabung jenis ini telah berisi reagent Clot Activator yang akan mempercepat pembekuan darah. Umumnya digunakan untuk Kimia darah, Serologi dan Bank Darah. Waktu pembekuan ideal 60 menit (sesuai standart NCCLS/National Committee Clinical Laboratory System) tetapi bisa di sentrifuge dibawah 60 menit asalkan sampel sudah mengental. Sample harus segera di sentrifuge dalam waktu maksimal 2 jam (dari pengambilan sampel). Di sentrifuge 1300-2000 rpm selama 10 menit. Penyimpanan sampel : 22°C (dapat digunakan sampai 8 jam), 4°C (dapat digunakan 8-48 jam), -20°C (dapat digunakan diatas 48 jam). Ukuran tersedia 4 ml, 6 ml dan 10 ml. 2. Tutup dan Etiket Ungu muda (Lavender) Berisi antikoagulan K3EDTA, sehingga darah diperoleh tidak beku. Umumnya digunakan untuk pemeriksaan Hematologi. Ukuran tersedia 1 ml, 2 ml, 3 ml, 4 ml, 6 ml dan 8 ml. 3. Tutup dan Etiket Ungu (Violet) Berisi antikoagulan K2EDTA, untuk mencegah pembekuan darah. Umumnya digunakan untuk pemeriksaan Hematologi. Yang membedakan hanyalah isi dari antikoagulannya saja dibandingkan dengan K3EDTA lavender. Dinding tabung bagian dalam dilapisi pengawet sehingga dapat memperpanjang waktu hidup dan metabolisme Sel darah Merah setelah proses pengambilan darah. Berisi antikoagulan K2EDTA (Ethylene Tetra Acetic Acid) yang berbentuk Spray dry. Setelah darah masuk penuh ke tabung ‘segera mungkin’ lakukan homogenisasi sebanyak 6x untuk menghindari penggumpalan thrombosit karena pada situasi thrombosit sangat bagus darah cepat sekali menggumpal. Agar mesin dapat membaca leukositenya disarankan sample darah yang masuk ketabung minimal 75% dari ml tabung yang dipakai. Ukuran tersedia 1 ml, 2 ml, 3 ml, 4 ml, 6 ml dan 8 ml. 4. Tutup dan Etiket Biru (Blue) Berisi Trisodium sitrat 3,2% sesuai standart NCCLS dengan rasio sample darah : citrate = 9 : 1 (rasio yang selalu konstan akurasinya). Didesign khusus untuk tes koagulasi dan agregasi thrombosit. Dilapisi oleh double cover, yaitu : Poly Propylene (bagian dalam) agar tidak ada penguapan aditive, terjaga kevakuman. Poly Ethyline (bagian luar) mampu mengurangi insiden aktivasi platelet. Tersedia ukuran 1,8 ml, 2,7 ml dan 4,5 ml (Full Draw). 5. Tutup dan Etiket Hijau (Green) 16



Berisi Lithium Heparin dengan gel (PGS), baik digunakan sebagai antikoagulan karena tidak mengganggu analisa beberapa macam ion yang ada dalam darah. Direkomendasikan untuk pemeriksaan Kimia Darah, Kreatinin dan BUN, elektrolit dan enzim. Dihomogenisasi 6x dan di sentrifuge pada 1300 - 2000 rpm selama 10 menit dan kemudian plasma siap untuk dianalisa. Tersedia ukuran 1 ml, 2 ml, 3,5 ml, 5 ml dan 8 ml. 6. Tutup dan Etiket Abu-abu (Grey) Berisi Kalium Oxalate berfungsi sebagai antikoagulan dan NaF yang berfungsi sebagai pengawet sehingga dapat menstabilkan kadar gula darah selama 24 jam pada suhu ruangan dan selama 48 jam jika disimpan pada suhu 4°C. NaF menghambat enzim Phosphoenol Pyruvate dan kerja urease (mencegah Glycolysis). Ukuran tersedia 2 ml, dan 3 ml. 7. Tutup dan Etiket Kuning (Yellow) Disebut juga SST II/Serum Separator Tube. Berisi Silica sebagai Clot Activator dan Polymer Gel Innert sebagai pemisah serum sehingga diperoleh kualitas serum yang bagus dan mengurangi resiko timbulnya fibrin yang bisa menyumbat instrument. Waktu mendapatkan serum hanya separuh dari Clot Activator/Red Top maka lebih menghemat waktu dan biaya. SST II / Serum Separator Tube. Sebagai pilihan terbaik untuk pemeriksaan kimia darah cito. Serum yang diperoleh lebih banyak jika dibanding dengan Clot Activator/Red Top sehingga efisien dalam pengambilan darah. Memungkinkan untuk penundaan analisa specimen (diambil malam hari dan diproses/dianalisa esok hari). Satu tabung berfungsi sebagai penyimpan sekaligus analisa tube sehingga mengurangi kesalahan identifikasi. Setelah specimen masuk tabung dihomogenisasi 6x kemudian diamkan 15-30 menit (mengurangi resiko fibrin).Dicentrifuge pada 4000 rpm selama 10 menit (swing head) atau 15 menit (fixed angle). Ukuran tersedia 3,5 ml, 5 ml dan 8,5 ml 8. Tutup dan Etiket Hijau muda (Citrus) Berisi Lithium Heparin sangat banyak digunakan sebagai antikoagulan karena tidak mengganggu analisa beberapa macam ion yang ada dalam darah. Direkomendasikan untuk pemeriksaan Kimia Darah, Kreatinin dan BUN, elektrolit dan enzim. 9. Tutup dan Etiket Jingga (Orange) Tabung tidak hampa/vakum, berisi Clot Activator yang berisi gel. Digunakan untuk laboratorium yang tidak memerlukan tabung vakum untuk mengumpulkan darah. Dapat digunakan pemeriksaan Kimia darah dan Serologi. Ukuran tabung 5 ml. 10. Tutup dan Etiket Hitam (Black) Berisi Trisodium sitrat 3,8% untuk pemeriksaan LED/ESR metode Westergren. Ukuran tabung dengan isi 2,4 ml volume cairan. III.2.3 Urutan Pengambilan Darah denganTabung Vakum Untuk mendapatkan spesimen darah yang baik, maka pengambilan darah dengan tabung vakum dengan urutan sebagai berikut : 1. Pertama menggunakan tabung tutup biru berisi sitrat 3,2% untuk faal hemostasis. 2. Kedua menggunakan tabung tutup kuning berisi SST II Gel clot activator untuk kimia darah rutin, serologi, bank darah, TDM. 3. Ketiga menggunakan tabung tutup hijau berisi lithium heparin untuk kimia darah rutin, elektrolit, enzim, urea dan kreatinin. 4. Keempat menggunakan tabung tutup ungu/lavender berisi EDTA untuk hematologi. 5. Kelima menggunakan tabung tutup abu-abu berisi NaF Kalium oxalat untuk pemeriksaan glukosa (terutama).



17



Gambar 4. tabung vakum berdasarkan warna tutup dan pemakaiannya.



III.2.4 Hal Yang diperhatikan pada Tabung Vakum Penggunaan tabung vakum sebaiknya belum kadaluarsa (expired date) karena dapat menyebabkan : 1. Daya isap darah ke dalam tabung berkurang sehingga rasio antikoagulan berkurang sehingga akan didapatkan darah dengan antikoagulan berlebihan. 2. Aktivitas antikoagulan berkurang, dapat menimbulkan mikrotrombi dan menyumbat alat pemeriksaan. 3. Antikoagulan dalam tabung dapat menguap sehingga berubah rasio antara jumlah darah dan antikoagulan, terutama pada natrium sitrat.



Gambar 5. Tabung Vakum dan adapter jarum



18



BAB IV ANTIKOAGULAN IV.1 PENGERTIAN Antikoagulan (anticoagulant) adalah senyawa atau bahan yang digunakan untuk mencegah pembekuan darah. Agar darah yang akan diperiksa jangan sampai membeku dapat dipakai bermacam-macam anticoagulant. Tidak semua macam antikoagulan dapat dipakai karena ada yang terlalu banyak berpengaruh terhadap bentuk eritrosit atau leukosit yang akan diperiksa morfologinya. Tiap antikoagulan memiliki kerja yang berbeda dalam upaya mencegah pembekuan darah. Ada beberapa pemeriksaan darah menggunakan antikoagulan yang berbeda. Hal ini karena beberapa antikoagulan dapat berpengaruh terhadap bentuk eritrosit atau leukosit yang akan diperiksa morfologinya dan hasil pemeriksaan. Pemakaian berlebih antikoagulan dapat mengakibatkan spesimen darah yang digunakan mengalami perubahan komposisi hingga morfologi sel darah, oleh sebab itu pemakaian jumlah yang tepat merupakan hal yang tepat dan tidak mempengaruhi komponen darah. IV.2 JENIS ANTIKOAGULAN Antikoagulan yang sering digunakan dalam pemeriksaan hematologi adalah sebagai berikut : 1. EDTA (Ethylene Diamine Tetra Acetic Acid) Yang dipakai disini adalah garam kalium dan natriumnya, tetapi yang sering digunakan adalah garam kaliumnya (dipotassium EDTA) karena daya larutnya dalam air kira-kira 15 kali lebih besar daripada garam natriumnya. Cara kerjanya dengan garam kaliumnya (K2EDTA) yaitu dapat mengubah ion Calcium dari darah menjadi bentuk yang bukan ion membentuk senyawa kompleks yang larut berdasarkan pembentukan ikatan Chelate senyawa. Namun jenis Na2EDTA (Di-Natrium Ethylene Diamine Tetra Acetate dihydrate = Na2C10H13O8N2.2H2O) lebih murah dibandingkan K2EDTA ataupun K3EDTA. Antikoagulan K3EDTA kurang baik dalam penggunaanya karena memiliki pH lebih alkali sehingga berpengaruh terhadap pH darah. Sebaliknya Na2EDTA juga kurang baik karena lambat larut sehingga perlu pengocokan beberapa kali. Na2EDTA dan K2EDTA biasanya digunakan dalam bentuk kering, sedangkan K3EDTA biasanya digunakan dalam bentuk cair. Dari ketiga jenis EDTA tersebut, K2EDTA adalah yang paling baik dan dianjurkan oleh ICSH (International Council for Standardization in Hematology) dan CLSI (Clinical and Laboratory Standards Institute). Tabung EDTA tersedia dalam bentuk tabung hampa udara (vacutainer tube) dengan tutup lavender (purple) atau pink seperti yang diproduksi oleh Becton Dickinson. Keuntungan : - Tidak berpengaruh terhadap besar dan bentuknya erithrosit dan leukosit. - Mencegah thrombosit menggumpal - Dapat digunakan berbagai macam pemeriksaan hematologi.



Gambar 6. Struktur Na2 EDTA



19



Kerugian : Lambat larut karena sering digunakan dalam bentuk kering sehingga harus menggoncang wadah yang berisi darah EDTA selama 1-2 menit. Cara pembuatan : 1. Ambil botol yang bersih dan kering 2. Pipet EDTA 10% sebanyak 0,020 ml dengan pipet sahli 3. Masukkan kedalam botol dan keringkan. Dengan jumlah EDTA 10% sebanyak 0,02 ml ini dapat mencegah membekunya darah sebanyak 2 ml atau 1 mg EDTA dalam 1 ml. Untuk pemeriksaan LED, maka darah yang telah dicampur dengan antikoagulan EDTA digunakan pengencer NaCl 0,9% dalam perbandingan 4 bagian darah dan 1 bagian pengencer NaCl 0,9%. 2. Trisodium Citrate Antikoagulan Natrium Sitrat (Na3C6H5O7.2H2O) sering digunakan dalam bentuk larutan dengan konsentrasi 3,8% dan 3,2%. Cara kerjanya sebagai bahan yang isotonik dengan darah dan mencegah pembekuan darah dengan cara mengikat ion Ca++ melalui gugus karboksilat dari senyawa ini membentuk ikatan kompleks khelasi larut. Sering digunakan beberapa macam pemeriksaan percobaan hemostasis dan LED metode Westergren. Pemeriksaan LED metode Westergren digunakan perbandingan 1 bagian Natrium Sitrat 3,8% dan 4 bagian darah. Untuk percobaan hemostasis menggunakan konsentrasi 3,2% dengan perbandingan 1 bagian Natrium Sitrat 3,2% : 9 bagian darah sesuai dengan NICCLS. Janganlah Natrium Sitrat 3,2% digunakan untuk pemeriksaan LED metode Westergren karena konsentrasi yang lebih rendah dapat berpengaruh pada besar sel eritrosit. Antikoagulan Natrium Sitrat 3,8% dan 3,2% tidak bisa lagi digunakan bila mengalami kekeruhan.



Gambar 7. Struktur Na3 Sitrat (Trisodium citrate) Keuntungan : Antikoagulan ini karena tidak toksis maka sering digunakan dalam unit transfusi darah dalam bentuk ACD (Acid Citric Dextrose). Kerugian : Pemakaiannya terbatas dalam pemeriksaan hematologi. 3. Heparin Antikoagulan ini merupakan asam mukopolisacharida yang bekerja dengan cara menghentikan pembentukan trombin dari prothrombin sehingga menghentikan pembentukan fibrin dari fibrinogen sehingga cara kerjanya berdaya seperti antitombin dan antitromboplastin. Heparin merupakan antikoagulan yang normal terdapat dalam tubuh tetapi dalam di laboratorium jarang dipakai pada pemeriksaan hematologi karena mahal. Untuk tiap 0,1 – 0,2 mg heparin dapat mencegah pembekuan 1 ml darah. Sering digunakan dalam penentuan PCV cara mikrokapiler yang bagian dalamnya dilapisi dengan heparin. Ada tiga macam heparin: ammonium heparin, lithium heparin dan sodium heparin. Dari ketiga macam heparin tersebut, lithium heparin paling banyak digunakan sebagai antikoagulan karena tidak mengganggu analisa beberapa macam ion elektrolit dalam darah. 20



Heparin banyak digunakan pada analisa kimia darah, enzim, kultur sel, OFT (osmotic fragility test). Konsentrasi dalam penggunaan adalah : 15I U/mL +/- 2.5IU/mL atau 0.1 – 0.2 mg/ml darah. Keuntungan : Hanya digunakan terutama dalam transfusi darah yang menggunakan banyak darah dan extracorporal circulation. Kerugian : - Tidak boleh digunakan dalam pemeriksaan hapusan darah karena dapat terjadinya dasar biru kehitam-hitaman pada preparat bila dicat dengan wright’s stain. - Harganya mahal. 4. Double Oxalat Nama lainnya adalah anticoagulant dari Heller and Paul atau Balanced Oxalate Mixture. Dipakai dalam bentuk kering agar tidak mengencerkan darah yang diperiksa. Kalium oxalat menyebabkan erythrosit mengkerut sedangkan amonium oxalat menyebabkan erytrosit mengembang, campuran keduanya dengan perbandingan 3 : 2 maka terjadi keseimbangan tekanan osmotik eryhtrosit. Setiap 2 mg antikoagulant ini dapat mencegah pembekuan 1 ml darah. Keuntungan : Dapat digunakan dalam berbagai pemeriksaan hematologi Kerugian : - Tidak dapat digunakan dalam pemeriksaan hapusan darah karena bahan ini toksis sehingga dapat menyebabkan perubahan-perubahan morfologi sel leukosit dan eryhtrosit. - Tidak boleh digunakan juga pada pemeriksaan osmotik fargility. 5. Natrium Oxalat Natrium oksalat bekerja dengan cara mengikat kalsium membentuk kalsium oxalat. Penggunaannya 1 bagian oksalat + 9 bagian darah. Biasanya digunakan untuk pembuatan adsorb plasma dalam pemeriksaan hemostasis Antikoagulan jenis ini sudah jarang digunakan karena selain tidak luas pemakaian, juga menyebabkan perubahan morfologi pada sel darah bila terlalu lama dibiarkan. Antikoagulan ini memiliki kemiripan sifat dengan double oxalate Dalam kondisi darurat dapat digunakan sebagai antikoagulan. 6. NaF dan Kalium Oxalat Antikoagulan ini sebenarnya dikhususkan untuk pemeriksaan glukosa darah, namun masih dapat digunakan untuk pemeriksaan hematologi. Antikoagulan ini biasanya tersedia dalam tabung vakum yang diproduksi pabrikan. Kalium oksalat berfungsi sebagai antikoagulan dan NaF berfungsi sebagai antiglikolisis dengan cara menghambat kerja enzim Phosphoenol pyruvate dan urease sehingga kadar glukosa darah stabil.



21



BAB V HEMOGLOBIN V.1 METODE SAHLI V.1.1 Prinsip Hemoglobin darah (OksiHemoglobin) diubah menjadi asam Hematin dengan pertolongan larutan HCl, kemudian warna yang terjadi dibandingkan secara visual dengan standard permanen alat tersebut. V.1.2 Alat dan Reagensia :  Hemoglobinometer Sahli : pipet sahli, tabung hemometer sahli, standar warna, batang pengaduk, karet pengisap  Kapas atau kertas tissue  HCl 0,1 N  Aquadest



V.1.3 Bahan Pemeriksaan : Darah vena dengan antikoagulan EDTA/heparin atau darah kapiler. V.1.4 Cara Kerja : 1. Masukkan HCl 0,1 N kedalam tabung Gambar 8. Hemometer Sahli hemometer sampai tanda 2 g%. 2. Diisap darah EDTA / darah kapiler dengan pipet sahli sampai tanda 20 cmm. 3. Bagian luar pipet dibersihkan dengan kapas kering (jangan sampai mengisap darah yang ada dalam pipet). 4. Masukkan ke dalam tabung Hemometer dan darah segera dicampur hati-hati kedalam larutan HCl tersebut tanpa menimbulkan gelembung udara. 5. Sebelum pipet dikeluarkan, bilas dahulu dengan cara mengisap dan meniup HCl yang ada dalam tabung beberapa kali. Bagian luar pipet dibilas dengan aquadest. 6. Ditunggu 5-10 menit untuk pembentukan asam Hematin. 7. Asam Hematin ini diencerkan dengan aquadest tetes demi tetes sambil diaduk dengan batang pengaduk sampai didapatkan warna yang sama dengan standard. 8. Meniskus cekung dibaca dan dinyatakan dalam g%. V.1.5 Nilai normal :  Laki-laki  Wanita



: 12 – 16 g% : 12 – 14 g%



V.1.6 Hal-hal yang peru diperhatikan : 1. Warna standard dari alat Sahli lama-lama akan menjadi pucat karena pengaruh sinar matahari dan iklim tropik sehingga perlu di kalibrasi dengan Spektrofotometer untuk diberikan faktor koreksi. 2. Kesalahan – kesalahan yang terjadi disebabkan antara lain : - Volume pipet sahli tidak selalu tepat. - Pengambilan darah kurang baik terutama kapiler. - Pembilasan pipet tidak sempurna. - Warna standar sudah berubah. - Konsentrasi HCl tidak stabil dan tidak tepat - Faktor pembacaan (orangnya). - Penerangan dalam ruangan. - Kehilangan cairan dari tabung akibat mencampur dengan bolak-balik. - Ada gelembung udara saat membaca meniskus. 22



- Memakai peralatan sahli beda merk. 3. Cara sahli bukanlah cara yang teliti, karena menggunakan cara visual, larutan asam hematin bukan larutan sejati dan alat ini tidak dapat di standardisasi. 4. Dengan metode sahli ini hanya oksihemoglobin yang terukur sedangkan karboksihemoglobin, methemoglobin dan sulfhemoglobin tidak terukur. 5. Satuan g% setara dengan g/dL, sehingga dalam aplikasi dilapangan lebih sering digunakan satuan g/dL. V.2 METODE CYANMETHEMOGLOBIN V.2.1 Prinsip Hemoglobin darah diubah menjadi Cyanmethemoglobin dalam larutan yang berisi Kalium Ferricyanida dan Kalium Cyanida (larutan Drabkins). Disini Kalium Ferricyanida mengoksidasi Hemoglobin menjadi Methemoglobin, kemudian bereaksi dengan Kalium Cyanida menjadi Cyanmethemoglobin. Warna yang terjadi diukur serapan optiknya (optical density) secara fotometer dengan panjang gelombang 546 nm menggunakan standard atau kurva kalibrasi. Dengan cara ini semua jenis hemoglobin dapat diukur kecuali SulfHb. V.2.2 Alat dan Regensia : 1. Mikropipet 10 µL atau pipet Sahli 20 cmm 2. Dispenser Hemoglobin 2500 µL atau pipet ukur 5 mL. 3. Spektrofotometer atau fotometer 4. Kuvet 5. Tabung reaksi 6. Kertas Tissue 7. Timer 8. Standard Hb 13,7 g/dL (Biosystems) 9. Larutan Drabkins : - NaHCO3…………………………….. gram - KCN………………………………….50 mg - K3[Fe(CN)6]………………………….200 mg - Aquadest……………………………1000 ml V.2.3 Bahan Pemeriksaan : Darah vena dengan antikoagulan EDTA/heparin atau darah kapiler. V.2.4 Cara kerja : 1. Pipet darah EDTA / darah kapiler 10 µL dengan mikropipet. 2. Bagian luar mikropipet dibersihkan dengan tissue kering. 3. Darah dimasukkan ke dasar tabung yang berisi larutan 2500 µL Drabkins. 4. Mikropipet dibilas dengan larutan Drabkins beberapa kali. 5. Ditunggu selama 3-5 menit untuk pembentukan Cyanmethemoglobin. 6. Larutan dipindahkan kedalam kuvet dan diukur dengan Fotometer pada panjang gelombang 546 nm terhadap blanko reagent dan standard. 7. Hasil pembacaan dinyatakan dalam g/dL. V.2.5 Nilai normal : - Laki-laki : 12 – 16 gr/dL - Perempuan : 12 - 14 gr/dL V.2.6 Hal – Hal yang perlu diperhatikan :



23



1. Larutan ini harus disimpan dalam botol coklat dan tiap bulan harus diganti dengan larutan yang baru. Larutan ini akan memucat apabila menggunakan botol transparan dan setelah 1 bulan akan memucat juga. 2. Gunakanlah standard hemoglobin untuk menghitung kadar sampel atau faktor perhitungan. 3. Penggunaan kurva kalibrasi sangat dianjurkan dan mengkoreksi kesalahan pengukuran. 4. Larutan Drabkins walaupun mengandung cyanida namun tidak bersifat toksik. 5. Darah harus tercampur rata dengan larutan drabkins, bila perlu menggunakan pengocok khusus atau parafilm. 6. Cara ini paling dianjurkan untuk pemeriksaan hemoglobin rutin di laboratorium. 7. Penambahan larutan deterjen nonionik akan mempercepat reaksi pembentukan cyanmethemoglobin. V.2.7 Cara Pembuatan Kurva Standard Hemoglobin Sederhana 1. Dibuat 7 deret standard Hemoglobin yang telah diketahui konsentrasinya menggunakan mikropipet variabel 1 – 20 µL. (Misal Hemoglobin Standard = 15,0 g/dL) : No Standard Pipet Larutan Drabkins Konsentrasi 1 Standard 1 5 µL 2500 µL 2 Standard 2 6 µL 2500 µL 3 Standard 3 7 µL 2500 µL 4 Standard 4 8 µL 2500 µL 5 Standard 5 9 µL 2500 µL 6 Standard 6 10 µL 2500 µL 7 Standard 7 11 µL 2500 µL 8 Standard 8 12 µL 2500 µL 9 Standard 9 13 µL 2500 µL 10 Standard 10 14 µL 2500 µL 2. Diukur Absorben semua standard dan dihitung semua konsentrasi standard, kemudian hasil pengukuran di plot pada kertas grafik miliblock khusus. 3. Apabila hasil pengerjaan dan pengukuran yang baik maka akan didapatkan grafik linear lurus pada semua titik-titik plot dengan slope, intercept dan coefisien standard yang memenuhi kriteria. V.2.8 Catatan : Dahulu standard hemoglobin dalam bentuk larutan yang sudah diketahui kadarnya dalam botol ampul yang harus dipatah terlebih dahulu bagian atas ampul tersebut. Buatlah pengenceran larutan standar 100%, 75%, 50%, 25% dan 0%, sebagai blanko dengan larutan Drabkin. Setelah semua tercampur, biarkan 3-5 menit pada suhu kamar lalu baca serapan (absorbance atau optical density/OD) pada fotometer dengan panjang gelombang 540 nm. Buatlah kurvanya dengan kadar Hb sebagai absis dan serapan sebagai ordinat. Selanjutnya untuk menetapkan kadar Hb pasien tinggal memplotkan pada kurva kalibrasi. V.2.9 Faktor Yang Mempengaruhi Temuan Laboratorium • Mengambil darah pada tangan atau lengan yang terpasang cairan intra-vena menyebabkan darah terencerkan • Memasang turniket terlalu lama (lebih dari 1 menit) menyebabkan hemokonsentrasi • Tinggal di dataran tinggi menyebabkan peningkatan kadar Hemoglobin • Penurunan asupan atau kehilangan cairan akan meningkatkan kadar Hemoglobin akibat hemokonsentrasi, dan kelebihan asupan cairan akan mengurangi kadar Hemoglobin akibat hemodilusi. 24



BAB VI HITUNG LEUKOSIT VI.1 CARA PEMERIKSAAN VI.1.1 Prinsip Darah diencerkan dengan suatu larutan zat warna tertentu (Turk) akan membentuk sel-sel Leukosit, sedangkan sel-sel yang lisis dan dihitung selnya dalam kamar hitung di bawah mikroskop. VI.1.2 Alat dan Reagensia 1. Hemocytometer : - Bilik hitung Improved Neubauer - Pipet leukosit dari Thoma - Kaca penutup dan karet pengisap 2. Blue dan Yellow Tips 3. Mikropipet 400 µL dan 20 µL 4. Tabung Reaksi kecil 5. Parafilm 6. Pengocok Vortex Mixer 7. Kertas Saring/Tissue 8. Larutan Turk : - Asam Asetat Glacial.................15 mL - Larutan Gentian Violet 1%..........1mL - Air Suling................................475 mL Larutan Gentian Violet 1% sebagai pewarna dan tidak memiliki efek terhadap leukosit, sehingga hanya digunakan untuk membedakan antara larutan Turk dan Hayem karena sama-sama tidak berwarna agar tidak tertukar. VI.1.3 Bahan Pemeriksaan Darah vena dengan antikoagulan EDTA atau darah kapiler. VI.1.4 Cara Kerja menggunakan Pipet Thoma : 1. Di isap darah sampai tanda 0,5 tepat dengan pipet leukosit. 2. Di isap larutan Turk tanda 11 tepat. 3. Kocok selama 15-20 detik dengan gerakan angka delapan. 4. Sebelum mengisi kamar hitung pipet leukosit dikocok selama 3 menit 5. Buang cairan kira-kira 3 – 4 tetes 6. Isi kamar hitung dengan menempelkan ujung pipet di tepi kaca penutup biarkan kamar hitung terisi perlahan-lahan dengan daya kapilaritasnya. (jangan sampai berlebihan hingga akhirnya cairan melewati garis batas kedua bidang) 7. Biarkan 2 – 3 menit pada tempat yang rata untuk memberi kesempatan kepada leukosit mengendap. 8. Hitung semua leukosit yang terdapat dalam 4 mm2 atau dalam 4 bidang besar. VI.1.5 Cara Kerja Pengenceran dalam Tabung : 1. Dimasukkan larutan Turk 400 µL dalam tabung reaksi yang bersih dengan menggunakan mikropipet. 2. Buang cairannya 20 µL dengan mikropipet. 3. Darah dikocok dahulu lalu diambil 20 µL dengan mikropipet 4. Bagian luar dari yellow tips dibersihkan dengan tissue kering, lalu dicampur dengan larutan Turk dengan memasukkan ujung yellow tips ke dasar tabung. 5. Bilas beberapa kali larutan agar tercampur.



25



6. Kocok tabung 4 – 5 kali (untuk lebih baiknya menggunakan pengocok khusus vortex mixer atau tabung ditutup dengan parafilm dan dikocok bolak balik) dan diamkan selama 2-3 menit. 7. Sebelum mengsisi kamar hitung tabung dikocok beberapa kali. 9. Isi kamar hitung dengan menempelkan ujung mikropipet ditepi kaca penutup biarkan kamar hitung terisi denga daya kapilaritasnya. (jangan sampai berlebihan hingga akhirnya cairan melewati garis batas kedua bidang) 8. Biarkan 2 – 3 menit pada tempat yang rata untuk memberi kesempatan kepada leukosit mengendap. 9. Hitung semua leukosit yang terdapat dalam 4 mm2 atau dalam 4 bidang besar. VI.1.6 Cara Perhitungan : - Dalam 4 bidang besar atau 1 mm2 ke I terdapat sel leukosit = 40 sel, bidang ke II = 50 sel, bidang ke III = 30 sel, bidang ke IV = 30 sel, Jumlah seluruhnya adalah 150 sel. - Pengenceran darah = 10 bagian / 0,5 bagian darah = 20 x - Tinggi Kaca Penutup = 1/0,1 mm = 10 x



Gambar 8. Posisi dan tinggi kaca penutup



RUMUS



: PDP X TKP X KKS X Leu KBH



Contoh Perhitungan



: 20 X 10 X 150 sel 4 Jadi jumlah sel leukosit yang di hitung = 7.500 sel / mm3



= ……./mm3 = 7.500 / mm3



Keterangan : PDP = Pengenceran darah dalam pipet Leukosit TKP = Tinggi Kaca Penutup KBH = Kotak besar yang dihitung Untuk mencari faktor perhitungan yang lebih praktis maka dapat digunakan angka perhitungan sebagai berikut : Faktor (F) = 20 x 10 4 = 50 Jadi setiap sel yang didapat dalam 4 kotak sedang (KBH) langsung dikalikan dengan faktor tersebut diatas dan dapat diolah berupa tabel microsoft Excel untuk mempermudah dalam bekerja di laboratorium. VI.2.7 Tingkat Pengenceran Pengenceran tidak selalu mutlak 20x, namun dapat disesuaikan dengan kondisi darah yang diperiksa. Apabila pasien mengalami leukositosis maka perlu dinaikkan pengenceran menjadi 50x hingga 100x pengenceran. Apabila kondisi leukemia dengan jumlah leukosit di atas 50.000 hingga 500.000 sel, maka pipet leukosit diganti dengan pipet leukosit dan pengenceran dalam pipet mengikuti cara pipet eritrosit dan untuk cara tabung menggunakan pengenceran cara eritrosit juga. 26



Darah sampai Tanda 0,1 Tanda 0,2 Tanda 0,4 Tanda 0,5 Tanda 0,8 Tanda 1,0



Volume 5 µL 10 µL 20 µL 40 µL 50 µL



Daftar Pengenceran pipet Leukosit Cairan pengencer Pengenceran darah tanda 11 100 kali tanda 11 50 kali tanda 11 25 kali tanda 11 20 kali tanda 11 12,5 kali tanda 11 10 kali Daftar pengeceran Tabung Cairan pengenceran 395 µL 390 µL 380 µL 360 µL 350 µL



Pengenceran 80 kali 40 kali 20 kali 10 kali 8 kali



VI.2.8 Koreksi Normoblast Rumus untuk mengkoreksi adanya normoblast (eritrosit berinti) dengan hapusan darah adalah sebagai berikut : Jumlah Leukosit = Jumlah normoblast yang ditemukan x Jumlah leukosit/mm3 darah 100 Leukosit diperiksa VI.2.9 Kesalahan yang sering di jumpai : 1. Tidak sempurna mencampur darah dengan antikoagulan.(tidak dikocok sempurna) 2. Darah kurang atau lebih di isap dengan pipet Thoma. 3. Pipet Thoma masih basah dengan cairan. 4. Terdapat gelembung udara dalam pipet. 5. Cairan Turk turun setelah di pipet dilepas dari karet pengisap dan belum dikocok. 6. Cairan ludah masuk dalam pipet 7. Tidak mengocok pipet leukosit segera setelah mengisap cairan pengencer (larutan Turk) 8. Kamar hitung, kaca penutup masih kotor 9. Sel-sel tidak merata di dalam pembagian skala (garis-garis bagi) dalam bilik hitung. 10. Salah menghitung sel-sel yang menyinggung garis batas dan jumlah bidang yang dihitung kurang. 11. Mikropipet yang digunakan tidak di kalibrasi. 12. Jumlah leukosit tidak di koreksi bila mana dalam darah banyak sel-sel darah merah berinti (Normoblast). VI.2.11 Konversi Satuan Seiring dengan perkembangan zaman, maka satuan untuk pemeriksaan leukosit mengalami perubahan satuan menjadi satuan baru (SI). Konversi satuan tersebut adalah sebagai berikut : Satuan lama : Jumlah leukosit = ............../mm3 darah atau dalam .........../µL Satuan Baru : Jumlah leukosit = ............./L Untuk konversinya : Jumlah leukosit per Liter (/L) = Jumlah leukosit x 103/mm3 x 1.000.000 atau 106 = ................x 109/L



27



VI.2.9 Nilai normal Laki-laki / Perempuan



6.000 – 10.000 / mm3 darah



VI.2.10 Aturan Penghitungan Aturan penghitungan yang digunakan dua cara pada bilik hitung, dianggap masuk dalam perhitungan apabila menyinggung garis kiri dan garis atas atau cara kedua menyinggung garis kanan dan garis bawah. Umumnya digunakan menyinggung garis kiri dan atas supaya lebih seragam. Atas



Bidang I



Bidang II



Kiri



Arah : ke kiri ke bawah ke kanan ke bawah



Bidang III



Bidang IV



VI.2.11 Bilik Hitung Bilik hitung yang sangat baik digunakan adalah Improved Neubauer untuk hitung leukosit. Namun untuk hasil terbaik dapat digunakan Improved Neubauer Brightline produksi American Optical karena lapang pandang lebih jelas. Bilik hitung jenis lain dapat juga digunakan seperti Thoma, Burker, Turk atau Fuchs Rosenthal. Sampai saat ini bilik hitung improved neubauer yang paling banyak digunakan di laboratorium di Indonesia, selain garis bagi yang jelas dan dapat dilakukan penghitungan sel leukosit, eritrosit dan trombosit. Kotak untuk pengitungan leukosit berada di ujungujung garis bagi yang berukuran 3 x3 mm. garis bagi ini tampak jelas terlihat pada lensa objektif 10x dan 40x. Untuk menemukan garis bilik hitung ini harus menggunakan pencahayaan rendah dengan cara menutup rapat difragma dan menurunkan kondensor mikroskop. Untuk mikroskop cahaya biasa, sebaiknya menggunakan cermin datar dan tidak menggunakan cermin cekung.



28



Luas Area Bilik Hitung Improved Neubauer



Gambar 9. Bilik Hitung Improved Neubauer



-



-



Luas areal total bilik hitung : 3 x 3 m2 yang terdiri atas kotak leukosit dan eritrosit. Area L untuk hitung leukosit dan Area E untuk hitung eritrosit dan trombosit. Kotak leukosit 1 bidang besar (KBH) terdiri atas 4 x 4 kotak sedang atau 1 x 1 mm2, sehingga apabila 4 bidang besar berarti 4 x 4 x 4 atau 16 x 4 bidang besar atau 2 x 2 mm2. Setiap kotak sedang dalam 1 bidang besar berukuran 0,25 m x 0,25 m



29



BAB VII HITUNG ERITROSIT VII.1 PEMERIKSAAN METODE HEMOCYTOMETER VII.1.1 Prinsip Darah diencerkan dengan suatu larutan zat warna tertentu (Hayem/Gower/Toison) akan membentuk sel-sel erytrosit, sedangkan sel-sel yang lisis dan dihitung selnya dalam kamar hitung di bawah mikroskop. VII.1.2 Alat dan Reagensia : 1. Hemocytometer : Berisi Bilik Hitung Improved Neubauer, Pipet Eritrosit dari Thoma, kaca penutup dan karet pengisap. 2. Kapas / kertas tissue 3. Parafilm 4. Pengocok Vortex Mixer 5. Mikropipet 1000 µL 6. Mikropipet 10 µL 7. Tabung reaksi 8. Kertas saring 9. Blue dan Yellow Tips 10. Larutan Hayem : - HgCl2 .................................0,2 gram - NaCl....................................0,5 gram - Na2SO4..............................2,50 gram - Aquadest Add....................100 mL 11. Larutan Gower (Larutan Alternatif) : - Natrium sulfat....................12.5 gram - Asam Asetat Glasial..........33.3 mL - Aquadest...........................200 mL VII.1.3 Bahan Pemeriksaan : Darah vena dengan antikoagulan EDTA/heparin atau darah kapiler. VII.1.4 Cara Kerja menggunakan Pipet Thoma : 1. Diisap darah sampai tanda 0,5 tepat dengan pipet eritrosit 2. Diisap larutan hayem tanda 101 tepat 3. Kocok selama 15 - 20 detik dengan cara memegang kedua ujung pipet dengan jari telunjuk/tengah dan jempol. Dikocok dengan gerakkan angka delapan. 4. Sebelum mengisi kamar hitung pipet eritrosit dikocok selama 3 menit 5. Buang cairan kira-kira 3 - 4 tetes pada ujung pipet. 6. Isi kamar hitung dengan menempelkan ujung pipet di tepi kaca penutup biarkan kamar hitung terisi perlahan-lahan dengan daya kapilaritasnya 7. Biarkan 2 - 3 menit pada tempat yang rata untuk memberi kesempatan kepada eritrosit mengendap. 8. Hitung semua erytrosit yang terdapat dalam 80 kotak kecil. Hasil perhitungan dinyatakan dalam /mm3 darah. VII.1.5 Cara Kerja Pengenceran dalam tabung : 1. Dimasukkan larutan Hayem 2000 µL dalam tabung reaksi yang bersih dengan menggunakan mikropipet. 2. Buang cairannya 10 µL dengan mikropipet 3. Darah dikocok dahulu lalu diambil 10 µL dengan mikropipet 30



4. Bagian luar dari yellow tips dibersihkan dengan tissue kering, lalu dicampur dengan larutan Hayem dengan memasukkan ujung yellow tips ke dasar tabung. 5. Bilas beberapa kali larutan agar tercampur 6. Kocok tabung 4 - 5 kali dan diamkan selama 2 - 3 menit. 7. Sebelum mengsisi kamar hitung tabung dikocok beberapa kali. 8. Isi kamar hitung dengan menempelkan ujung mikropipet ditepi kaca penutup biarkan kamar hitung terisi denga daya kapileritetnya 9. Biarkan 2-3 menit pada tempat yang rata untuk memberti kesempatan kepada ertitrosit mengendap. 10. Hitung semua eritrosit yang terdapat dalam 80 kotak kecil. Hasil perhitungan dinyatakan dalam /mm3 darah. VII.1.6 Cara Perhitungan : - Dalam 80 kotak kecil terdapat jumlah erytrosit : 400 sel Terdiri atas 5 bidang kotak kecil, yang berarti Bidang kotak kecil I (16 Kotak kecil) : 64 sel, Bidang kotak kecil II : 80 sel, Bidang kotak kecil III : 96 sel, Bidang kotak kecil IV : 80 dan Bidang kotak kecil V : 80 - Pengenceran darah 100 / 0,5 : 200 kali - Tinggi kaca penutup 1 / 0,1 : 10 kali - Dalam 1 mm2 kamar hitung terdapat : 400 kotak kecil



Gambar 10. Posisi dan tinggi kaca penutup



RUMUS



: PDP X TKP X KKS X Ery KKH



= ……./mm3



: 200 X 10 X 400 X 400 sel = 4.000.000 / mm3 80 Jadi jumlah Erytrosit = 4.000.000 sel/mm3 atau 4,0 juta sel / mm3



Contoh Perhitungan



Keterangan : PDP = Pengenceran darah dalam pipet Erytrosit TKP = Tinggi kaca penutup KKS = Kotak kecil sebenarnya KKH = Kotak kecil yang dihitung Ery = Erytrosit yang dihitung jumlahnya Untuk mencari faktor perhitungan yang lebih praktis maka dapat digunakan angka perhitungan sebagai berikut : Faktor (F) = 200 x 10 x 400 80 = 10.000 Jadi setiap sel yang didapat dalam 4 kotak sedang (KBH) langsung dikalikan dengan faktor tersebut diatas dan dapat diolah berupa tabel microsoft Excel untuk mempermudah dalam bekerja di laboratorium.



31



Gambar 11. Bilik hitung Improved Neubauer Brightline untuk hitung eritrosit menggunakan cara hayem



VII.1.7 Tingkat Pengenceran Pengenceran tidak selalu mutlak 200x, namun dapat disesuaikan dengan kondisi darah yang diperiksa. Apabila pasien mengalami anemia maka perlu diturunkan pengenceran menjadi 100x pengenceran. Untuk cara tabung lebih fleksibel lagi karena volume darah dan volume pengencer dapat diatur volume yang diambil.



Darah sampai Tanda 0,1 Tanda 0,2 Tanda 0,5 Tanda 1,0



Volume 5 µL 10 µL 20 µL 40 µL 50 µL



Daftar pengenceran pipet Erytrosit Cairan pengencer Pengenceran darah Tanda 101 1000 kali Tanda 101 500 kali Tanda 101 200 kali Tanda 101 100 kali Daftar Pengenceran Tabung Cairan pengencer 1995 µL 1990 µL 1980 µL 1960 µL 1950 µL



Pengenceran darah 400 kali 200 kali 100 kali 50 kali 40 kali



VII.1.8 Nilai normal : Laki-laki : 4,5 – 6,0 juta / mm3 darah Perempuan : 4,0 – 5,5 juta / mm3 darah VII.1.9 Bilik Hitung Bilik hitung yang sangat baik digunakan adalah Improved Neubauer untuk hitung leukosit. Namun untuk hasil terbaik dapat digunakan Improved Neubauer Brightline produksi American Optical karena lapang pandang lebih jelas dengan lapang pandang gelap dan garis bagi yang berwarna putih.



32



Luas Area Bilik Hitung Improved Neubauer



Bidang Kotak Kecil II Bidang Kotak Kecil I



Bidang kotak kecil III



Bidang kotak kecil IV Bidang kotak kecil V



-



Luas area kotak eritrosit 1 x 1 m2 atau 400 kotak kecil atau 5 x 5 bidang kotak kecil. Setiap 16 kotak kecil atau 1 bidang kotak kecil, tiap 1 bidang kotak kecil nya berukuran 0,2 mm x 0,2 mm. Area untuk penghitungan eritrosit pada pada sudut atas kiri, sudut atas kanan, tengah, sudut bawah kiri dan sudut bawah kanan.



VII.1.10 Kesalahan yang sering di jumpai : 1. Tidak sempurna mencampur darah dengan antikoagulan. 2. Darah kurang atau lebih di isap dengan pipet Thoma 3. Pipet Thoma masih basah. 4. Terdapat gelembung udara dalam pipet 5. Cairan ludah masuk dalam pipet 33



:



6. Tidak mengocok pipet Eritrosit segera setelah mengisap cairan pengencer (larutan Hayem) 7. Kamar hitung, kaca penutup masih kotor 8. Sel-sel tidak merata di dalam pembagian skala (garis-garis bagi) 9. Salah menghitung sel-sel yang mentinggung garis batas dan jumlah bidang yang dihitung kurang. VII.1.11 Aturan Penghitungan Aturan penghitungan eritrosit yang digunakan sama dengan hitung leukosit Umumnya digunakan menyinggung garis kiri dan atas supaya lebih seragam. VII.1.12 Konversi Satuan Seiring dengan perkembangan zaman, maka satuan untuk pemeriksaan leukosit mengalami perubahan satuan menjadi satuan baru (SI). Konversi satuan tersebut adalah sebagai berikut : Satuan lama : Jumlah eritrosit = ............../mm3 darah atau dalam .........../µL Satuan Baru : Jumlah eritrosit = ............./L Untuk konversinya : Jumlah eritrosit per Liter (/L) = Jumlah eritrosit x 106/mm3 x 1.000.000 atau 106 = ...........x 1012/L



34



BAB VIII HITUNG JENIS LEUKOSIT (DIFF. COUNT)



VIII.1.1 Prinsip Setetes darah dibentangkan berupa dibuat hapusan darah diatas objek glass lalu diwarnai secara polikromatik dan diperiksa dibawah mikroskop dengan pembesaran objektif 100 X, dihitung dalam 100 % leukosit dan digolongkan menurut jenisnya. VIII.1.2 Alat dan reagensia : 1. Gelas objek : Bersih, kering dan bebas dari lemak. Sebaiknya menggunakan yang baru untuk hasil yang optimal. Sebaiknya juga menggunakan jenis cleared edges bukan jenis frosted glass. 2. Gelas penghapus : yang rata dan menghilangkan sudut-sudutnya. Gelas penghapus dapat digunakan objek gelas yang telah digosok sudutnya agar rata atau menggunakan deck glass (cover gelas) ukuran 22 x 22 mm atau 24 x 24 mm sebagai gelas penggeser. 3. Mikroskop. 4. Minyak emersi. 5. Cat wright yang terdiri dari : - Wright stain……………………………….0,1 gr ( digerus ) - Metanol absolut…………………………..60 mL Simpan dalam botol berwarna coklat dan diberi tutup ditempat gelap sampai 2 – 3 minggu, sebelum dipakai harus disaring terlebih dahulu. 6. Buffer Phosphat : pH 7,0 yang terdiri dari : - KH2PO4…………………………………….6,66 gr - Na2HPO4…………………………………...3,20 gr - Aquadest add……………………………...1000 mL 7. Aquadest / Air suling. 8. Alat Counter Diff. Count.



Gambar 12. Alat counter hitung jenis leukosit VIII.1.3 Bahan Pemeriksaan : Darah Vena dengan antikoagulant EDTA atau Darah kapiler VIII.1.4 Pembuatan Hapusan Darah : 1. Alat – Alat : a. Gelas Objek. Ini harus bersih, kering dan tidak berlemak, permukaannya harus rata dan licin, bila kotor harus dicuci dengan sabun dengan alkohol lalu dikeringkan dengan kain atau kapas yang kering dan bersih b. Gelas Penghapus. Dapat dibuat dari delas objek dengan menghilangkan sudut – sudutnya , tepinya harus rata dan bersih. 2. Teknik Kerja : 35



1. Setetes darah kapiler atau darah Vena dengan antikoagulan EDTA diletakan dekat ujung salah satu dari gelas objek. 2. Gelas penghapus dipegang sedemikian rupa sehingga membuat sudut 300 dengan gelas objek dan tetesan darah tadi terletak didalam sudut tersebut. 3. Gelas penghapus ini digeserkan kearah tetesan darah sehingga menyentuhnya dan darah tadi akan merata antara ujung gelas penghapus dan gelas objek. 4. Dengan cepat gelas penghapus digeserkan kearah yang bertentangan dengan arah pertama. Dengan semikian darah tadi akan merata diatas gelas objek sebagai lapisan tipis. 5. Hapusan ini segera dikeringakan dengan menggerak – gerakannya diudara atau dapat dipakai kipas angin, tetapi jangan ditiup dengan hembusan napas. 6. Tebalnya lapisan darah tergantung dari : 1.1 Besarnya tetesan darah. 1.2 Cepatnya kita menggeserkan gelas penghapus. 1.3 Sudut antara gelas penghapus dan gelas objek. gerakan yang pelan dan atau sudut yang lebih kecil dari 300 akan menghasilkan lapisan darah yang tipis dan sebaliknya penggeseran yang cepat dan atau sudut yang lebih besar dari 300 akan menghasilkan lapisan darah yang tebal. 7. Leukosit – leukosit tak boleh bergerombol di bagian terakhir dari hapusan, Bila ini terjadi maka distribusi dari macam – macam lekosit tak refresentatif. Gerakan yang paling pelan atau gelas penghapus yang kotor dapat menyebabkan kesalahan ini. 8. Mengeringkan hapusan darah dengan segera penting sekali, karena bila tidak maka eritrosit – eritrosit akan mengalami kerusakan – kerusakan (crenation) dan memudahkan terjadinya rouleaux. Leukosit – leukosit akan mengkerut.



Gambar 13. Cara Pembuatan Hapusan Darah



36



VIII.1.5 Penilaian Kualitas Preparat yang Sudah Dibuat • Lebar x panjang kira-kira 2,5 x 3 cm • Ada bagian yang tebal dan tipis. • Terlalu tebal sel-sel eritrosit menutupi satu sama lain sehingga mempersulit penilaian. • Terlalu tipis sel-sel akan kehilangan bentuk bikonkafitasnya terutama daerah tepi. • Ekor tidak seperti bendera robek • Preparat tidak berlubang • Preparat tidak terputus-putus. * Contoh preparat yang bagus atau yang layak di baca di bawah ini :



* Contoh preparat yang tidak layak atau tidak bisa di baca :



* Tidak layak karena : - Preparat berlobang - Preparat terputus-putus VIII.1.5 Teknik Pewarnaan Wright : 1. Hapusan yang sudah kering difiksasi dengan meneteskan Wright’s Stain pada lapisan darah, sehingga ini tertutup seluruhnya, waktu fiksasi 2 menit. 2. Pengecatan dilanjutkan dengan menambahkan (meneteskan larutan buffer yang sama banyaknya / satu setengah kali banyaknya) pada Wright’s tadi. Buffer phosphate pH 7,0 dan Wright’s Stain ini segera dicampur dengan jalan meniup – niup beberapa kali. 3. Diamkan 20 menit untuk memberi kesempatan kepada sel –sel tercat dengan baik. 4. Hapusan dicuci dengan aquadest / air biasa. 5. Keringkan dan periksa dibawah mikroskop dengan pembesaran 100x pakai anisol/oli Imersi. Pemeriksaan Darah Hapus : 1. Preparat yang sudah kering di evaluasi terlebih dahulu di bawah mikroskop dengan pembesaran 10x, Untuk melihat keadaan pewarnaan baik / tidak dan untuk melihat keadaan eritrosit apakah merata atau bertumpuk – tumpuk. Tempat pemeriksaan yang baik adalah didaerah eritrosit yang merata dan berdampingan yang berwarna merah jambu. 2. Pemeriksaan dilakukan mulai dari tepi sebelah atas turun kebawah, kemudian kesamping, keatas, kesamping, kebawah dan seterusnya sampai mencapai jumlah 100 atau 200 sel leukosit, Ini tergantung dari jumlah leukosit dalam 1 mm3



37



Yang perlu diperhatikan : 1. Fiksasi harus cukup lama, bila tidak maka kromatin dan inti akan larut. 2. Sediaan hapusan dikeringkan di udara terbuka atau kipas angin. Sediaan hapusan tidak dibolehkan mengeringkan dengan cara meniupkan dengan mulut karena menyebabkan lisis sel darah. Pengeringan menggunakan oven tidak diperkenankan karena menyebabkan sediaan kering terkelupas. Penggunaan inkubator suhu 37 C masih dapat diperkenankan, namun hanya 1 menit saja. 3. Pada hapusan yang baik eritrosit-eritrosit warnanya merah orange (red orange) dan warna leukosit sesuai dengan daya serap masing-masing terhadap zat warna basa, asam, netral dan afinitasnya. 4. Bila eritrosit-eritrosit biru warnanya, maka ini disebabkan karena buffer yang terlalu alkalis atau pencucian yang kurang bersih. 5. Bila inti sel-sel warnanya biru dan tak ungu, maka ini disebabkan karena pengecatan yang kurang 6. Bila pengecatan dilakukan terlalu lama kemudian dicuci, granula-granula tak tampak lagi. 7. Untuk menghindari pengendapan dari metallic scum pada hapusan, kita tidak boleh memiringkan gelas objek untuk membuang cat, melainkan cat tersebut harus dihanyutkan dengan menuangkan aquadest yang cukup banyaknya sedangkan hapusan tetap horizontal diatas rak. 8. Waktu fiksasi dan pengecatan dapat diubah-ubah tergantung dari kualitas cat yang digunakan. Pemeriksaaan kualitas Hapusan darah : Dilakukan dengan memakai penbesaran kecil dengan lensa objektif 10 x. yang perlu dinilai adalah : 1. Lapisan darah harus cukup tipis sehingga eritrosit-erithrosit dan leukosit-leukosit jelas terpisah satu dengan lainnya. 2. Hapusan tidak boleh mengandung endapan cat. 3. Leukosit-leukosit tidak boleh menggerombol pada bagian akhir hapusan 4. Bila hapusan tidak memenuhi syarat-syarat tersebut diatas maka perlu diadakan pemeriksaan lebih lanjut atau membuat hapusan baru. Nilai Normal : -



Basopil Eosinopil Batang / Stab Segmen Limposit Monosit



Persen 0–1% 1–3% 2–6% 50 – 70 % 20 – 40 % 2–8%



Jumlah 0 – 50 /mm3 darah 40 – 300/mm3 darah 80 – 600/mm3 darah 2000 – 7000/mm3 darah 800 – 4000/mm3 darah 80 – 800/mm3 darah



VIII.2 PEWARNAAN HAPUSAN DARAH LAIN : 1. Pengecatan Romanowsky : Pengecatan dengan menggunakan Larutan Romanowsky ini dengan pengenceran 5 kali yaitu 1 Bagian Romanowsky : 4 Bagian Larutan Buffer Phosfat pH 7,2 (1 : 4). Komposisi Larutan Romanowsky : - Wright Stain…………………….5,0 gram - Giemsa Stain……………………..1,0 gram - Glycerin……………………………90 ml - Metanol Absulot ………………….2910 ml Masukan kedalam botol cokelat dan simpan dlm lemari es selama 30 hari ( 1 bulan ), Baru boleh dipergunakan. 38



Teknik Kerja : 1. Preparat yang sudah kering difiksasi dengan metanol selama 2 menit. 2. Sisa metanol dibuang 3. Tuang larutan Romanowsky yang telah dibuat dengan perbandingan 1 : 4 tadi. 4. Diamkan selama 15 – 20 menit. 5. Cuci dengan aquadest atau air biasa. 6. Keringkan dan periksa dibawah mikroskop dengan pembesaran 100 X dengan memakai oli Imersi / Anisol. 2. Pengecatan Giemsa Pengecatan dengan menggunakan larutan Giemsa ini dengan perbandingan satu banding satu yaitu 1 tetes giemsa ditambah 1 tetes buffer phosfat pH 7,2 (1 : 1). Teknik Kerja : 1. Preparat yang sudah kering difiksasi dengan metanol selama 2 menit. 2. Kelebihan metanol di buang 3. Tuang larutan giemsa yang telah diencerkan dan diamkan selama 15 – 20 menit . 4. Cuci dengan aquadest atau air biasa. 5. Keringkan dan periksa dibawah mikroskop pembesaran 100 kali pakai oli Imersi atau Anisol. 3. Pengecatan Kiewiet de Jong Pewarnaan ini hampir sama dengan cara Wrights Stain, hasil pewarnaannya juga baik dan kualitasnya sama dengan cara Wrights, tetapi cara ini lebih cepat dan singkat sehingga cocok digunakan pada laboratorium yang memerlukan pemeriksaan cepat. Campur larutan Kiewiet de Jong A (Methylene Blue) dengan Kiewiet de Jong B (eosin) dengan perbandingan 1 : 1, campur dan diamkan selama minimal 7 hari, baru dapat dipakai. Teknik Kerja : 1. Sediaan yang sudah kering difiksasi dengan meneteskan larutan Kiewiet de Jong pada pada sediaan secara merata. 2. Diamkan selama 30 – 60 detik agar sediaan terfiksasi. 3. Tambahkan sama banyaknya buffer Phosphat pH 6,4 pada sediaan tadi dan segera langsung ditiup-tiup untuk tujuan mencampur. 4. Diamkan selama 2 – 3 menit agar sediaan terwarnai. 5. Cuci dengan aquadest dan keringkan. 6. Diperiksa dibawah mikroskop lensa objektif 100 x dengan anisol / imersi.



Gambar 13. Preparat sediaan Hapus Darah 4. Pengecatan Tanding dua Polikromatik Adakalanya pengecatan/pemulasan dengan teknik Giemsa atau Wright tidak memuaskan hasilnya karena masing-masing memiliki kelemahan dan kelebihan. Untuk menutupi kelemahan ini perlu dilakukan pulasan tanding, sehingga kekurangan keduanya 39



dapat ditutupi, sifat baik keduanya dapat dimunculkan. Caranya Zat warna Wright untuk fiksasi dan Giemsa encer dengan buffer fosfat sebagai pengganti buffer Wright. Kombinasi lain yang memungkinkan Kiewit de Jong-Giemsa atau Kiewit de Jong-MayGrunwaldGiemsa. 1. Sediaan hapus darah yang kering difiksasi dengan meneteskan zat Wright dan dibiarkan selama 1-2 menit untuk merekatkan sediaan. 2. Ditambahkan sama banyak jumlahnya Giemsa yang telah diencerkan dengan Buffer fosfat pH 7,2 dan dicampur dengan cara ditiup-tiup. 3. Biarkan sediaan diwarnai selama 15 menit. 4. Dihanyutkan zat warna dengan air dan dicuci hingga bersih dan dikeringkan. VIII.3 PERHITUNGAN Perhitungan Persentase (%) Perhitungan persentase dengan cara menghitung sebanyak 100 leukosit yang ditemui dalam lapang pandang mikroskop. Setiap leukosit yang ditemukan pada 10 pembagian dimasukkan ke tiap jenis sel leukosit sebanyak 10, sehingga apabila dijumlahkan maka 10 x 10 menjadi 100 sel leukosit. No 1. 2. 3. 4. 5. 6.



Nama sel Basophil Eosinophil Neutrophil Stab N.Segmen Limposit Monosit



I



II



III



IV



V



VI



VII



VIII



IX



X



Persentase



Perhitungan Mutlak (mm3 darah) Penghitungan untuk mencari jumlah mutlak sel. Untuk menghitung ini diperlukan jumlah leukosit per mm3 darah, lalu dikalikan silang dengan jumlah persen untuk tiap jenis leukosit dan dibagi 100% akan didapatkan hasil. Jumlah sel = Jumlah hitung leukosit x % Hasil Diff Count = ………/mm3 darah 100 % 3



Nilai Normal 3 0 – 50 /mm darah



……………../mm



3



40 – 300/mm darah



………………%



……………../mm



3



80 – 600/mm darah



Neutrofil segmen



………………%



……………../mm



3



2000 – 7000/mm darah



5.



Limposit



………………%



……………../mm



3



800 – 4000/mm darah



6.



Monosit



………………%



……………../mm



3



80 – 800/mm darah



No 1.



Nama sel Basofil



% hasil Diff Count ………………%



Jumlah sel (mm ) 3 ……………../mm



2.



Eosinofil



………………%



3.



Neutrofil stab



4.



3 3



3



3



3



VIII.4 JENIS LEUKOSIT DARAH TEPI NORMAL



Basofil



Eosinofil



40



Netrofil Stab



Netrofil Segmen



Limfosit



Monosit



VIII.5 KARAKTERISTIK LEUKOSIT DARAH TEPI NORMAL 1. Basofil Sel ini menyerap zat warna basa sehingga dinamakan basofil, sehingga mempunyai sifat basofilik. Ciri – ciri sebagai berikut : - Besarnya sel : 8 – 14 mikron - Inti sel o Letaknya dalam sel : Sentral / Eksentrik o Bentuk inti : Tidak jelas karena tertutup oleh granula-granula. o Warna inti : Kebiru-biruan. o Kromatin : Kasar o Membran inti : ada - Sitoplasma o Luasnya / lebarnya : Sedang o Warna sitoplasma : Oxyphil (faint pink) o Perinuklear Zone : Tidak ada - Granula : Sedikit atau banyak, kasar tidak sama besar, warna biru tua atau gelap. - Granula : Mengandung Mukopolisakarida, Histamin. - Fungsi : Dalam reaksi Alergi, reaksi Hipersensitifitas, meningkat dalam infeksi virus tertentu. 2. Eosinofil Sel ini menyerap zat warna eosin yang bersifat asam sehingga dinamakan eosinofil, sehingga mempunyai sifat eosinofilik. Ciri – ciri sebagai berikut : - Besarnya sel : 10 – 15 mikron - Inti sel o Letaknya dalam sel : Sentral / Eksentrik o Bentuk inti : Bersegmen (2 – 3 lobi) o Warna inti : Kebiru-biruan (agak pucat) o Kromatin : Kasar o Membran inti : ada o Butir inti (nucleoli) : Tidak ada - Sitoplasma Luasnya / lebarnya : Relatif lebih besar/lebih lebar Warna sitoplasma : Oxyphil / Eosinophil / kemerahan Perinuklear Zone : Tidak ada - Granula dalam sitoplasma : Banyak, sama besar , bulat, warna orange kemerahan kuning-kuning mengkilap (bronze). - Granula : Mengandung enzim yang menghambat mediator inflamasi dan histaminasi. - Fungsi : Berhubungan dengan Inflamasi akibat respon Imunologik. Eosinophil mampu melakukan fagositosis tetapi tidak mampu membunuh kuman.



41



3. NEUTROFIL STAB (BATANG) - Besarnya sel : 10 – 15 mikron - Inti sel o Letaknya dalam sel : Sentral / Eksentrik o Bentuk inti : Bentuk batang. o Warna inti : Biru keunguan (agak pucat) o Kromatin : Kasar bergerombol o Membran inti (nucleoli) : Tidak ada - Sitoplasma Luasnya / lebarnya : Relatif lebih lebar Warna sitoplasma : Oxyphil. Perinuklear Zone : Tidak ada - Granula dalam sitoplasma : Biasa oxyphil, namun ada juga basophil atau Neutrophilic. Tersebar halus homogen. - Fungsi : Melakukan Fagositosis 4. NEUTROFIL SEGMEN. - Besarnya sel : 10 – 15 mikron - Inti sel o Letaknya dalam sel : Sentral / Eksentrik o Bentuk inti : Bersegmen (2 – 3 lobi) o Warna inti : Biru pucat keunguan o Kromatin : Kasar lebih kompak. o Butir inti (nucleoli) : tidak ada - Sitoplasma o Luasnya / lebarnya : Relatif lebih lebar o Warna sitoplasma : Oxyphil (faint pink) o Perinuklear Zone : Tidak ada o Granula dalam sitoplasma : Tersebar halus dan berwarna ungu (neutrofilic). - Fungsi : Melakukan fagositosis. 5. LIMPOSIT. - Besarnya sel - Inti sel o Letaknya dalam sel o Bentuk inti o Warna inti o Kromatin o Membran inti o Butir inti (nucleoli) - Sitoplasma o Luasnya / lebarnya o Warna sitoplasma o Perinuklear Zone - Granula dalam sitoplasma - Fungsi



: 10 – 15 mikron , Ada yang besar (limposit besar), ada yang sedang (limposit sedang), ada yang kecil (limposit kecil). : : : : : :



Eksentrik Oval / bulat dan relatif besar. Biru gelap Kompak memadat Kurang jelas terlihat Tidak ada



: Relatif sempit : Oxyphil : Umumnya tidak ada : Tidak ada. Kalau ada granula disebut granula Azurophil. : Berhubungan aktifitas imunitas seluler dan imunitas humoral.



6. MONOSIT. - Besarnya sel : 10 – 22 mikron - Inti sel o Letaknya dalam sel : Eksentrik 42



o Bentuk inti o Warna inti o Kromatin o Butir inti (nucleoli) - Sitoplasma o Luasnya / lebarnya o Warna sitoplasma o Perinuklear Zone - Granula dalam sitoplasma - Fungsi



: Menyerupai otak (brain like form) : Kemerah-merahan / keunguan : Tersusun lebih kasar : Tidak ada : Relatif lebih besar kadang-kadang ada pseudopodia : Biru pucat : Tidak ada : Kadang-kadang ada granula Azurophil : Melakukan fagositosis.



43



BAB IX LAJU ENDAP DARAH



IX.1. PENDAHULUAN Istilah-istilah yang kadang-kadang digunakan untuk LED dalam bahasa asing adalah : 1. ESR : Erytrocyte Sedimentation Rate (Amerika) 2. BBS : Bloed Bezenking Snelheid (Belanda) 3. BSR : Blood Sedimentation Rate (Inggris) 4. BS : Blood Sedimentation 5. BSE : Blood Sedimentation Erythrocyte 6. KPD : Kecepatan Pengendapan Darah (Indonesia) IX.2 CARA KERJA Prinsip : Darah vena dengan anticoagulant tertentu dimasukkan kedalam tabung tertentu dan dicatat waktu pengendapan dari eritrosit Tujuan : untuk mengetahui kecepatan pengendapan eritrosit abnormal dalam darah seseorang dengan waktu tertentu IX.2.1 Cara Westergreen Alat dan Reagensia : a. Tabung / pipet Westergreen - Panjangnya 300 mm - Garis tengah dalam 2,5 mm - Pembagian skala dari 0-200 mm - Isi pipet 1,0 mL - Ujung pipet terbuka b. Rak dari tabung Westergreen - Untuk menempatkan tabung westergreen harus dalam keadaan vertikal - Bagian bawah terdapat karet untuk menutup lubang tabung - Dibagian atas terdapat pegas untuk menekan tabung ke bawah c. Kertas saring d. Pengatur waktu e. Anticogulant Na. Citrat 3,8 % f. Anticoagulant EDTA bubuk g. NaCl 0,9 % Bahan Pemeriksaan : ♦ Darah vena dengan anticoagulant Na.citrat 3,8 % (perbandingan darah : citrat 3,8% adalah 4 : 1) ♦ Darah vena dengan Anticoagulant EDTA bubuk 1. Teknik Kerja langsung dengan anticoagulant Na.Sitrat 3,8% • Darah vena diambil sebanyak 1,6 mL dan dimasukkan ke dalam tabung yang telah berisi 0,4 mL Natrium sitrat 3,8%. • Dicampur perlahan dan dipipet hingga tanda 0 pada skala pipet dengan alat bantu bola isap, bagian luar pipet dibersihkan dengan kertas saring atau tissue. • Diletakkan di rak Westergren dengan posisi vertikal dan dihitung jamnya. • Dibaca tinggi lapisan plasma dari atas hingga pada permukaan atas dari kolom eritrosit dibaca setelah satu dan dua jam 2. Teknik kerja dengan antikoagulan Na.Citrat 3,8 % Tabung Vakum



44



• • • •



Dilakukan pengambilan darah menggunakan jarum dan holder, setelah terlihat darah memasuki ujung jarum, ditusukkan tabung vakum hitam berisi Natrium Sitrat 3,8% hingga tanda atau vakumnya habis. Darah dengan antikoagulan Na. Citrat 3,8 % tadi diisap dengan tabung westergreen tepat tanda nol menggunakan alat bantu bola isap, bagian luar pipet dibersihkan dengan kertas saring atau tissue. Di letakkan di rak Westergreen dalam keadaan tabung harus tepat vertikal. Dibaca tinggi lapisan plasma dari atas hingga pada permukaan atas dari kolom eritrosit dibaca setelah satu dan dua jam.



3. Teknik kerja dengan Modifikasi Antikoagulan EDTA • Dipipet NaCl 0,9 % dengan pipet westergreen sampai tanda 150, masukkan dalam tabung reaksi, • Dipipet darah dengan pipet Westergreen tadi sampai tanda 0, dimasukkan dalam tabung yang berisi NaCl 0,9 % tadi , dicampur. • Darah dengan antikoagulan EDTA tadi diisap dengan tabung Westergreen tepat tanda nol, bagian luar pipet dibersihkan dengan kertas saring atau tissue. • Lubang atas dari pipet ditutup dengan jari lalu ditempatkan dirak Westergreen dalam keadaan tabung harus tepat vertikal. • Dibaca tinggi lapisan plasma dari atas hingga pada permukaan atas dari kolom eritrosit dibaca setelah satu dan dua jam. IX.2.2 Cara Wintrobe Teknik Kerja : 1. Darah dengan antikoagulan Na.Citrat 3,8 % dimasukkan pada tabung Wintrobe sampai garis tanda nol tepat, jagalah jangan sampai terjadi gelembung udara. 2. Biarkan tabung Wintrobe dalam sikap lurus pada satu tempat yang tak banyak angin selama 1 jam. 3. Bacalah tinggi lapisan plasma dengan milimeter sebagai laju endapan darah. IX.3 NILAI NORMAL Cara Westergren : Laki-laki : 0 – 10 mm/jam Perempuan : 0 – 15 mm/jam Cara Wintrobe : Laki-laki : 0 – 9 mm/jam Perempuan : 0 – 20 mm/jam IX.4 YANG PERLU DIPERHATIKAN 1. Antikoagulan dan darah harus tercampur dengan baik dan rata. 2. Hindari terjadinya hemolisa 3. Tabung yang dipakai harus bersih dan kering 4. Keadaan tabung harus vertikel atau tegak. 5. Keadaan darah tidak boleh mengandung gelembung udara 6. Penentuan LED sebaiknya dilakukan tidak lebih dari 1 jam sesudah pengambilan darah.



45



BAB X HITUNG EOSINOFIL X.1 PENDAHULUAN Eosinofil merupakan salah satu dari seri leukosit yang memiliki granula dan tergolong dalam granulosit. Granula dalam sel ini mempunyai afinitas yang tinggi terhadap eosin sehingga pada pewarnaan mengambil zat warna asam eosin dan berwarna merah orange. Jumlah normal eosinofil berkisar antara 1-3 sel per 100 leukosit. Mempunyai sedikit kemampuan phagositosis. Peranan utama dari eosinofil masih belum jelas. Hanya dikatakan terjadi peningkatan jumlahnya apabila tubuh kemasukkan benda-benda asing, baik suatu protein asing ataupun parasit yaitu disebut keadaan alergi. Selain terdapat di sirkulasi juga dapat tinggal di jaringan-jaringan pada keadaan alergi, misalnya di mukosa usus, jaringan paru-paru. Sel eosinofil dalam sitoplasmanya terdapat granula-granula yang berisi dan mempunyai bahan-bahan : 1. Peroksidase (untuk deaminasi oksidatif histamin) 2. Aryl Sulfatase B (yang merusak SRS dari reaksi anafilaktik) 3. Histaminase ( untuk deaminasi oksidatif histamin) 4. Fosfolipase D (yang menginaktifkan platelet anaphylaxis factor) Sel ini selain berfungsi melindungi tubuh dari benda asing juga berfungsi mengakhiri reaksi alergi. Sel ini juga banyak dijumpai pada infeksi parasit. X.2 CARA KERJA X.2.1 Prinsip Darah diencerkan dengan suatu larutan zat warna tertentu (Eosin) akan membentuk sel-sel Leukosit, sedangkan sel-sel yang lisis dan dihitung selnya dalam kamar hitung di bawah mikroskop. X.2.2 Alat dan Reagensia 1. Hemocytometer : - Bilik hitung Improved Neubauer - Pipet leukosit dari Thoma - Kaca penutup dan karet pengisap 2. Blue dan Yellow Tips 3. Mikropipet 500 µL dan 50 µL 4. Tabung Reaksi kecil 5. Parafilm 6. Pengocok Vortex Mixer 7. Kertas Saring/Tissue 8. Larutan Eosin : - Larutan Eosinofil 2%.................5 mL - Aseton …………………….........1 mL - Aquadest...............................100 mL X.2.3 Bahan Pemeriksaan Darah vena dengan antikoagulan EDTA atau darah kapiler. X.2.4 Cara Kerja menggunakan Pipet Thoma : 1. Di isap darah sampai tanda 1 tepat dengan pipet leukosit. 2. Di isap larutan Turk tanda 11 tepat. 3. Kocok selama 1 menit dengan gerakan angka delapan. 4. Sebelum mengisi kamar hitung pipet leukosit dikocok selama 1 menit 5. Buang cairan kira-kira 3 – 4 tetes



46



6. Isi kamar hitung dengan menempelkan ujung pipet di tepi kaca penutup biarkan kamar hitung terisi perlahan-lahan dengan daya kapilaritasnya. (jangan sampai berlebihan hingga akhirnya cairan melewati garis batas kedua bidang) 7. Biarkan 2 – 3 menit pada tempat yang rata untuk memberi kesempatan kepada eosinofil mengendap. 8. Hitung semua eosinofil yang terdapat dalam 4 mm2 atau dalam 4 bidang besar. X.2.5 Cara Kerja Pengenceran dalam Tabung : 1. Dimasukkan larutan Eosin 500 µL dalam tabung reaksi yang bersih dengan menggunakan mikropipet. 2. Buang cairannya 50 µL dengan mikropipet. 3. Darah dikocok dahulu lalu diambil 50 µL dengan mikropipet 4. Bagian luar dari yellow tips dibersihkan dengan tissue kering, lalu dicampur dengan larutan eosin dengan memasukkan ujung yellow tips kedasar tabung. 5. Bilas beberapa kali larutan agar tercampur. 6. Kocok tabung 4 – 5 kali (untuk lebih baiknya menggunakan pengocok khusus vortex mixer atau tabung ditutup dengan parafilm dan dikocok bolak balik) dan diamkan selama 2-3 menit. 7. Sebelum mengisi kamar hitung tabung dikocok beberapa kali. 8. Isi kamar hitung dengan menempelkan ujung mikropipet ditepi kaca penutup biarkan kamar hitung terisi denga daya kapilaritasnya. (jangan sampai berlebihan hingga akhirnya cairan melewati garis batas kedua bidang) 9. Biarkan 2 – 3 menit pada tempat yang rata untuk memberi kesempatan kepada eosinofil mengendap. 10. Hitung semua eosinofil yang terdapat dalam 4 mm2 atau dalam 4 bidang besar. X.2.6 Cara Perhitungan : - Dalam 4 bidang besar atau 1 mm2 ke I terdapat sel eosinofil = 3 sel, bidang ke II = 3 sel, bidang ke III = 2 sel, bidang ke IV = 4 sel, Jumlah seluruhnya adalah 12 sel. - Pengenceran darah = 10 bagian / 1 bagian darah = 10 x - Tinggi Kaca Penutup = 1/0,1 mm = 10 x



RUMUS



: PDP X TKP X KKS X Leu KBH



= ……./mm3



: 10 X 10 X 12 sel = 300 / mm3 darah 4 Jadi jumlah sel eosinofil yang di hitung = 300 sel / mm3 darah Contoh Perhitungan



Keterangan : PDP = Pengenceran darah dalam pipet Leukosit TKP = Tinggi Kaca Penutup KBH = Kotak besar yang dihitung Untuk mencari faktor perhitungan yang lebih praktis maka dapat digunakan angka perhitungan sebagai berikut : 47



Faktor (F) = 10 x 10 4 = 25 Jadi setiap sel yang didapat dalam 4 kotak sedang (KBH) langsung dikalikan dengan faktor tersebut diatas dan dapat diolah berupa tabel microsoft Excel untuk mempermudah dalam bekerja di laboratorium. X.2.9 Kesalahan yang sering di jumpai : 1. Tidak sempurna mencampur darah dengan antikoagulan.(tidak dikocok sempurna) 2. Darah kurang atau lebih di isap dengan pipet Thoma. 3. Pipet Thoma masih basah dengan cairan. 4. Terdapat gelembung udara dalam pipet. 5. Cairan eosin turun setelah di pipet dilepas dari karet pengisap dan belum dikocok. 6. Cairan ludah masuk dalam pipet 7. Tidak mengocok pipet leukosit segera setelah mengisap cairan pengencer. 8. Kamar hitung, kaca penutup masih kotor 9. Sel-sel tidak merata di dalam pembagian skala (garis-garis bagi) dalam bilik hitung. 10. Salah menghitung sel-sel yang menyinggung garis batas dan jumlah bidang yang dihitung kurang. 11. Mikropipet yang digunakan tidak di kalibrasi. 12. Salah menghitung sel yang berwarna kuning muda sebagai eosinofil (netrofil), eosinofil berwarna merah orange. VI.2.11 Konversi Satuan Seiring dengan perkembangan zaman, maka satuan untuk pemeriksaan leukosit mengalami perubahan satuan menjadi satuan baru (SI). Konversi satuan tersebut adalah sebagai berikut : Satuan lama : Jumlah leukosit = ............../mm3 darah atau dalam .........../µL Satuan Baru : Jumlah leukosit = ............./L Untuk konversinya : Jumlah leukosit per Liter (/L) = Jumlah eosinofil x 103/mm3 x 1.000.000 atau 106 = ................x 109/L VI.2.9 Nilai normal Laki-laki / Perempuan :



50 - 300 / mm3 darah



VI.2.10 Aturan Penghitungan Aturan ini sama dengan yang dilakukan pada hitung leukosit. Namun sangat disarankan untuk menghitung seluruh kotak leukosit atau seluruh bidang bilik hitung 3 x 3 mm. VI.2.11 Bilik Hitung Bilik hitung yang sangat baik digunakan adalah Improved Neubauer untuk hitung eosinofil. Namun untuk hasil terbaik dapat digunakan Improved Neubauer Brightline produksi American Optical karena lapang pandang lebih jelas. Bilik hitung jenis lain dapat juga digunakan seperti Thoma, Burker, Turk atau Fuchs Rosenthal.



48



BAB XI HEMATOKRIT XI.1 PENDAHULUAN Hematokrit (HCT) adalah volume eritrosit yang dipisahkan dari plasma dengan memutarnya di dalam tabung khusus yang nilainya dinyatakan dalam persen (%). Hematokrit biasa juga disebut Packed Cell Volume (PCV). Padatnya kolom eritrosit yang didapat dengan cara memutar darah dengan sentrifuge ditentukan oleh : - Radius sentrifuge - Kecepatan sentrifuge - Lamanya sentrifuge XI.2 METODE PEMERIKSAAN Prinsip : Darah dengan antikoagulan isotonik dalam tabung diputar selama beberapa menit dengan kecepatan 3000 rpm dan di hitung tinggi lapisan eritrosit terhadap lapisan plasma. Tujuan : Untuk menentukan dan mengukur Volume erythrosit yang dipadatkan sehingga derajat anemia atau polycethaemia seseorang diketahui. Bahan Pemeriksaan : Darah vena dengan antikoagulan EDTA atau darah kapiler atau darah heparin (mikrohematokrit). Alat dan Reagensia : 1. Spuit dan Neddle 2. Tourniquette 3. Sentrifuge 4. Sentrifuge Mikrohematokrit 5. Tabung Wintrobe



6. 7. 8. 9.



Wax Lampu spritus Tabung Mikrokapiler Stopwatch



Teknik Kerja : b. Cara Makro menurut Wintrobe. − Isilah tabung Wintrobe dengan darah vena EDTA atau oxalat sampai tanda garis 100 diatas. − Masukkan tabung itu ke dalam sentrifuge yang cukup besar dan putarlah selama 30 menit pada kecepatan 3000 rpm. − Baca penetapan itu dengan memperhatikan : • Warna plasma • Tebalnya lapisan putih yang tersusun atas leukosit dan thrombosit (Buffy coat) diatas lapisan Erythrosit. − Hitung volume erythrosit dan dinyatakan dalam % c. Cara Mikrohematokrit − Isilah tabung mikrokapiler khusus dengan darah vena atau darah kapiler sebanyak 4/5 bagian. − Salah satu ujungnya ditutup dengan cara membakar atau dengan lilin (wax). − Masukkan tabung kapiler itu ke dalam sentrifuge mikrohematokrit dengan ujung yang tertutup diletakkan ke arah luar. − Putar selama 3-5 menit dengan kecepatan 16.000 rpm. − Bacalah nilai hematokrit dengan menggunakan grafik khusus atau alat khusus.



49



Nilai Normal : - Laki-laki - Perempuan



: 40 - 48 % : 37 – 43 %



Menurut literatur lain nilai normal : Welly : Pria : 42 – 50% Wanita : 40 – 48% Heplen : Pria : 40 – 54% Wanita : 37 – 47% Perhitungan : Hematokrit = Tinggi volume eritrosit yang dipadatkan x 100% Tinggi Volume Total darah Contoh : Tinggi kolom volume eritrosit yang dipadatkan = 4,5 mm Tinggi volume total darah = 10 mm Hematokrit = 4,5 mm x 100% = 45% 10 mm Sumber Kesalahan : 1. Kesalahan sampel darah 2. Tidak memakai jumlah antikoagulan yang sesuai dengan jumlah darah yang dipakai. 3. Tabung hematokrit tidak bersih dan kering 4. Tidak cukup waktunya memutar tabung hematokrit 5. Pembacaan yang tidak tepat. 6. Memakai darah wintrobe yang disimpan lebih dari 3 jam. 7. Tidak mencampur darah di dalam botol sewaktu akan mengisi tabung.



Gambar Hematokrit mikrokapiler terdiri : lilin, tabung mikro, skala pembacaan



50



BAB XII INDEKS ERITROSIT XII.1 PENDAHULUAN Untuk menghitung indeks eritrosit, maka diperlukan nilai hemoglobin, eritrosit dan hematokrit pada seseorang yang akan dihitung nilainya. Ada 3 macam index erythrosit yaitu : 1. Volume Index (V.I) dan MCV 2. Color Index (C.I) dan MCH 3. Saturation Index (S.I) dan MCHC Ketiga index ini gunanya untuk mengetahui ukuran dan jumlah Hb dalam eryhtrosit ratarata. Biasanya dalam alat hematology analyzer telah ada perhitungan nilai ini. Tujuan : Untuk mengetahui dan menentukan derajat anemia dan jenis anemia yang terjadi pada seseorang. XII.2 INDEKS ERITROSIT 1. Mean Corpuscular Volume (MCV). Nilai normal : 80 – 94 fL (femtoliter). Satuan lama yang digunakan adalah µ3 (mikron kubik). Untuk mencari MCV ini harus diketahui nilai hematokrit dan jumlah erythrosit per mm3 darah. MCV ini menyatakan volume rata-rata dari sebuah erythrosit. Rumus : MCV = Hematokrit x 10 fL Erythrosit Telah ditetapkan nilai rujukan baru dan telah diaplikasikan di alat hematology analyzer sebagai berikut di bawah ini : 1. Dewasa : 80 - 100 fL (baca femtoliter) 2. Bayi baru lahir : 98 - 122 fL 3. Anak usia 1-3 tahun : 73 - 101 fL 4. Anak usia 4-5 tahun : 72 - 88 fL 5. Anak usia 6-10 tahun : 69 - 93 fL Isi erythrosit rata-rata digunakan untuk menetapkan apakah anemia itu Makrocytair, Normocytair atau Mikrocytair. 1. Anemia Makrocytair : MCV lebih dari 94 fL 2. Anemia Normocytair : MCV rata-rata 80 – 94 fL 3. Anemia Mikrocytair : MCV kurang dari 80 fL Color Index



= Hb yang didapat Hb normal Normal Color Index = 0,9 - 1,1



:



Erythrosit yang dihitung Eryhtrosit normal



2. Mean Corpuscular Hemoglobin (MCH) Nilai normal : 28 – 32 pikogram. Untuk mencari MCH ini harus diketahui nilai hemoglobin dan erythrosit per mm3 darah. MCH ini menyatakan banyaknya Hemoglobin dalam Erythrosit rata-rata. Rumus : MCH = Hemoglobin x 10 pg Erythrosit Nilai rujukan baru dan telah diaplikasikan di alat hematology analyzer adalah sebagai berikut : 1. Dewasa : 26 - 34 pg (baca pikogram) 2. Bayi baru lahir : 33 - 41 pg 3. Anak usia 1-5 tahun : 23 - 31 pg 51



4. Anak usia 6-10 tahun : 22 - 34 pg Volume Index



= PCV yang didapat PCV normal Normal Volume Index = 0,9 - 1,1



:



Erythrosit yang dihitung Eryhtrosit normal



Untuk MCH dan Indeks warna gunanya untuk menetapkan apakah anemia itu : Anemia Hyperkhrom, Anemia Normokhrom atau Anemia Hypokhrom. 1. Anemia Hyperkhrom : MCH lebih dari 32 pg 2. Anemia Normokhrom : MCH rata-rata 28 – 32 pg 3. Anemia Hypokhrom : MCH kurang dari 28 pg 3. Mean Corpuscular Hemoglobin Concentration (MCHC) Nilai normal : 32 – 36 %. Untuk mencari MCHC ini harus diketahui nilai Hemoglobin dan Hematokrit darah. MCHC ini menyatakan banyaknya kadar Hemoglobin yang didapat dalam erythrosit rata-rata. Dalam aplikasi alat hematology analyzer tidak menggunakan satuan persentase (%), dan ada juga yang hasilnya masih berupa nilai desimal karena tidak dikalikan dengan 100% Rumus : MCHC = Hemoglobin x 100 % Hematokrit Nilai rujukan baru dan telah diaplikasikan di alat hematology analyzer adalah sebagai berikut : 1. Dewasa : 32 - 36 % 2. Bayi baru lahir : 31 - 35 % 3. Anak usia 1.5 - 3 tahun : 26 - 34 % 4. Anak usia 5 - 10 tahun : 32 - 36 % Saturation Index = Hb yang didapat Hb normal Normal Saturation Index = 0,9 - 1,1



:



52



Hematokrit yang dihitung Hematokrit normal



BAB XIII HITUNG RETIKULOSIT XIII.1 PENDAHULUAN Retikulosit adalah eritrosit yang lebih muda daripada eryhtrosit dewasa, ukuran 8-9 mikron dan didalam sitoplasmanya terdapat sisa-sisa inti yang tersusun secara retikulair, oleh karena itu disebut retikulosit, retikulum tersebut berupa fragmen-fregmen yang hanya dapat dilihat dengan memakai pewarnaan khusus yaitu pewarnaan supravital, misalnya Brilliant Cresyl Blue yang mewarnai retikulum tersebut. Jadi dalam pemeriksaan retikulosit hendaknya memakai sampel darah segar, dan janganlah terlalu lama membiarkannya kering pada kaca benda. Kalau akan mempergunakan darah oxalat untuk pemeriksaan retikulosit harus dillakukan dalam waktu 24 jam. Banyak retikulum tergantung pada umur retikulosit yaitu makin muda makin banyak, makin tua makin kurang retikulumnya. Retikulosit mempunyai sedikit retikulum dan mempunyai granula-granula. Lagi pula densitasnya tergantung pada beberapa faktor yaitu : - Semakin tinggi kadar zat warna yang dipakai semakin baik retikulum itu nampaknya yaitu lebih lebar dan kurang pecah-pecahnya. - Dengan mengeringkan smear darah retikulum menjadi halus. - Dengan memanaskan dapat merusak retikulum sehingga hanya terlihat bentukbentuk batang atau granula-granula. - Perubahan pH larutan suatu zat warna kearah sifat asam menyebabkan retikulum berbentuk granula halus sedangkan kearah sifat alkalis menyebabkan terikulum berbentuk noktah-noktah. - Creanated eryhtrosit (keriput) menghambat masuknya zat warna kedalam sel sehingga tak terlihat apa-apa. Jumlah retikulosit merupakan cermin bagi aktifitas eryhtrositetik, artinya dapat menunjukkan baik tidaknya fungsi eryhtropoitik dalam keadaan tertentu. Bila oleh suatu keadaan patologis (anemia hemolitik) jumlah retikulosit sangat meningkat mencapai 3050% maka keadaan ini disebut krisis retikulositosis. Pada anemia aplastik kadang-kadang tidak ada retikulosit dalam darah perifer. Sebenarnya banyak retikulosit yang ada dalam darah perifer menunjukkan jumlah eritrosit yang harus diganti setiap harinya, yang mengalami destruksi secara fisiologis oleh karena telah mencapai umurnya. XIII.2 METODE LANGSUNG Prinsip : Darah dicat supravital lalu jumlah retikulosit dibandingkan dengan jumlah eritrosit dan dinyatakan dalam prosen (%). Tujuan : Untuk mengetahui dan menentukan jumlah retikulosit dalam darah seseorang. Metode : Cara Langsung (Direct Test) Alat dan Reagensia : 1. Tabung reaksi kecil 2. Gelas Objek 3. Mikroskop 4. Hemocytometer 5. Mikropipet 10 µL dan mikropipet 1000 µL 6. Pipet tetes 7. Larutan Retikulosit BCB yang terdiri dari : - Brilliant Cresyl Blue (BCB) 53



jenuh dalam air (0,5%) …………..0,5 mL - NaCl 0,9 % …………………………5 ml - Potasium oxalat 2% ……………….2 tetes Bahan pemeriksaan : Darah vena dengan Antikoagulan EDTA atau darah kapiler. Cara Kerja Metode Hemocytometer : 1. Hitung terlebih dahulu jumlah eritrosit menggunakan larutan Hayem. 2. Isap darah EDTA / kapiler dengan pipet eryhtrosit sampai tanda 0,5 tepat. 3. Isap larutan Retikulosit sampai tanda 101 tepat. 4. Kocok selama 3-5 menit membentuk angka 8 atau diatas vortex mixer/vibrator dan diamkan selama 5-10 menit. 5. Sebelum mengisi kamar hitung pipet dikocok selama 1-2 menit. 6. Di tempelkan ujung pipet pada bilik hitung dan biarkan bilik hitung terisi dengan daya kapileritasnya. 7. Hitung sel Retikulosit dalam 80 kotak kecil pada lensa objektif 10x / 40 x. 8. Retikulosit tampak berupa sel eritrosit yang memiliki titik / granula berwarna hitam. Cara Kerja Metode Tabung : 1. Hitung terlebih dahulu jumlah eritrosit menggunakan larutan Hayem. 2. Dimasukkan larutan retikulosit 2000 µL dalam tabung reaksi yang bersih dengan menggunakan mikropipet. 3. Buang cairannya 10 µL dengan mikropipet 4. Darah dikocok dahulu lalu diambil 10 µL dengan mikropipet 5. Bagian luar dari yellow tips dibersihkan dengan tissue kering, lalu dicampur dengan larutan Hayem dengan memasukkan ujung yellow tips ke dasar tabung. 6. Bilas beberapa kali larutan agar tercampur 7. Kocok tabung 4 - 5 kali dan diamkan selama 2 - 3 menit. 8. Sebelum mengsisi kamar hitung tabung dikocok beberapa kali. 9. Isi kamar hitung dengan menempelkan ujung mikropipet ditepi kaca penutup biarkan kamar hitung terisi dengan daya kapileritasnya 10. Biarkan 2-3 menit pada tempat yang rata untuk memberti kesempatan kepada retikulosit mengendap. 11. Hitung semua retikulosit yang terdapat dalam 80 kotak kecil. Hasil perhitungan dinyatakan dalam /mm3 darah. Perhitungan : Jumlah retikulosit dalam 80 kotak kecil = 2 sel Jumlah eritrosit dalam 80 kotak kecil 500 sel jadi = 5.000.000 sel/mm3 darah Pengenceran = 200x Tinggi kaca penutup 1/0,1 = 10x Retikulosit = Retikulosit x KKS x PDP x TKP KKH = 2 x 400 x 200 x 10 = 20.000 sel/mm3 darah 80 Jumlah Retikulosit = Retikulosit x 100% Eritrosit = 20.000 sel/mm3 darah 5.000.000 sel/mm3 darah = 0,4%



54



x 100%



XIII.3 METODE TIDAK LANGSUNG Alat dan Reagensia : 1. Tabung reaksi 2. Gelas Objek 3. Mikroskop 4. Pipet tetes 5. Imersi / Anisol 6. Brilliant Cresyl Blue (BCB) yang terdiri dari : - Brilliant Cresyl Blue ………………..1 gr - NaCl ………………………………..0,85 gr - Natrium Citrat ……………………...0,40 gr - Aquadest …………………………...100 ml 7. Inkubator Bahan pemeriksaan : Darah vena dengan Antikoagulan EDTA atau darah kapiler. Cara Kerja 1. Campur 2 atau 3 tetes larutan cat dengan darah EDTA atau kapiler sama banyaknya dengan larutan cat tersebut. 2. Kocok dan biarkan selama 15 menit di dalam inkubator 37O C 3. Ambil dan kocok dengan baik, lalu dibuat hapusan darah. 4. Keringkan dan ada 2 cara untuk memeriksa yaitu dengan langsung memeriksanya sebelum dicat dengan pewarna Giemsa / Wright dan pemeriksaan tak langsung dicat dahulu baru diperiksa. 5. Hapusan diperiksa dengan pembesaran 100 x pakai anisol 6. Hitung jumlah retikulosit dalam 1000 eryhtrosit. Perhitungan : Cara perhitungan : Lapangan pandang Eritrosit Retikulosit I 40 3 II 130 2 III 150 1 …… ….. …… Dalam 1000 eritrosit ditemukan 8 sel retikulosit Jumlah Retikulosit = Retikulosit x 100% 1000 eritrosit = 8 x 100% 1000 = 0,8%



Gambar 15. Retikulosit



55



XIII.3 METODE LAINNYA Metode Sediaan Basah 1. Letakkan setetes larutan BCB pada objek gelas biarkan sampai kering atau kondisi basah. 2. Tambahkan setetes darah kecil ke atas zat warna BCB tadi dan segera dicampur dengan menggunakan pengaduk atau sudut objek gelas lain. 3. Tutuplah campuran darah tadi dengan kaca penutup dengan sedikit menekan agar didapatkan lapisan tipis. 4. Biarkan beberapa menit agar zat warna BCB mewarnai dengan sempurna retikulosit dan letakkan sediaan dalam cawan petri berisi kertas saring/tissue basah. 5. Periksa di bawah mikroskop dengan lensa objektif 100x menggunakan imersi, dihitung retikulosit dalam 1000 eritrosit. Metode Sediaan Kering 1. Letakkan 2 tetes larutan BCB di atas objek gelas dan biarkan kering. 2. Letakkan setetes darah dekat tetes larutan BCB tadi yang sudah kering dan campur perlahan sampai berwarna biru. 3. Segera buat hapusan darah di atas objek gelas dengan campuran tadi. Biarkan kering. 4. Warnai sediaan dengan cara Wright dan hitunglah jumlah retikulosit tersebut. Metode Sediaan Basah dan Kering 1. Campurlah dalam sebuah tabung atau pipet leukosit sejumlah darah (5 tetes darah kapiler atau darah vena) dengan larutan BCB dalam NaCl 0,9%. 2. Biarkan selama 5 menit campuran tadi. 3. Buatlah sediaan basah atau sediaan kering. (seperti diatas) Catatan : • Cara yang lebih baik untuk menyatakan retikulosit adalah dengan angka mutlak dari jumlah eritrosit per mm3 darah yaitu antara 25.000 – 75.000 retikulosit per mm3 darah. • Sediaan kering atau sediaan basah yang dibuat harus dibuat tipis sekali, agar retikulosit tidak over lepping (menumpuk) sehingga mudah mengenai retikulosit. • Untuk memudahkan menghitung retikulosit, maka lapangan pandang penglihatan pada mikroskop dapat diperkecil dengan meletakkan kepingan logam bundar atau kertas yang berlubang pada bagian tengahnya pada lensa okuler. • Pemeriksaan sediaan basah nampak retikulum pada retikulosit disamping juga inti leukosit dan trombosit berwarna biru. Pemeriksaan sediaan kering yang diwarnai Wright, retikulum dari retikulosit berwarna biru berupa noktah atau rantai bercak, sedangkan sel lainnya berwarna seperti biasanya. • Saringlah larutan sebelum digunakan. Pulasan vital basah sangat baik dalam laboratorium rutin karena lebih cepat. XIII.4 NILAI NORMAL/RUJUKAN : Dewasa : 0.5 - 1.5 % Bayi baru lahir : 2.5 - 6.5 % Bayi : 0.5 - 3.5 % Anak : 0.5 - 2.0 %



56



BAB XIV FRAGILITAS OSMOTIK XIV.1 PENDAHULUAN Pemeriksaan fragilitas osmotik adalah pemeriksaan untuk melihat ketahanan eritrosit terhadap larutan hipotonik bertalian dengan bentuk eritrosit. Pemeriksaan ini bermakna pada bermacam-macam kelainan seperti pada : Anemia hemolitik, Hemoglobin abnormal. XIV.2 METODE PEMERIKSAAN Metode pemeriksaan ini ada 2 cara, yaitu cara pembacaan fotoelektrik dan visual. Untuk hasil yang lebih teliti menggunakan cara fotoelektrik kolorimetri. 1. Fotoelektrik Kolorimetri Prinsip : Eritrosit bila dimasukkan ke dalam larutan isotonik atau NaCl 0,85 % air tak dapat meninggalkan atau tak dapat masuk ke dalam Eritrosit. Tetapi bila dimasukkan kedalam larutan hipotonik maka air akan masuk kedalam sel eritrosit sehingga akan mengembang dan pecah (hemolisis), kemudian jumlah hemolisis diukur dengan membaca supernatan secara Fotoelektrik dengan panjang gelombang 546 nm. Tujuan : Untuk mengetahui apakah benar ada penurunan daya osmotik atau tindakan dari eritrositeritrosit yang mengalami hemolisis yang berlebihan. Alat dan Reagensia : 1. Spuit dan Neddle 9. Pipet ukur 5 ml 2. Tourniquette 10. Sentrifuge 3. Tabung reaksi 11. Waterbath 37°C 4. Pipet Sahli 20 cmm / mikropipet 20 µL 5. Spektrofotometer/fotometer 6. Kuvet 7. NaCl 1% 8. Aquadest Bahan pemeriksaan : Darah vena dengan anticoagulant EDTA Teknik kerja : 1. Sediakan 14 tabung reaksi dan isikan ke dalamnya sebagai berikut : No. Tab NaCl 1% (ml) Aquadest (ml) Konsentrasi NaCl (%) 1. 10,0 1% 2. 8,5 1,5 0,85 % 3. 7,5 2,5 0,75 % 4. 6,5 3,5 0,65 % 5. 6,0 4,0 0,60 % 6. 5,5 4,5 0,55 % 7. 5,0 5,0 0,50 % 8. 4,5 5,5 0,45 % 9. 4,0 6,0 0,40 % 10. 3,5 6,5 0,35 % 11. 3,0 7,0 0,30 % 12. 2,0 8,0 0,20 % 13. 1,0 9,0 0,10 % 14. 10,0 0% 57



2. Masing-masing tabung tambahkan 20 µL darah, campur. 3. Inkubasi pada Waterbath suhu 37OC selama 30 menit. 4. Masing-masing tabung dicampur lagi dan sentrifuge selama 5 menit pada 2000 rpm. Dilihat tabung yang menunjukkan tidak hemolisis, mulai hemolisis dan hemolisis sempurna. 5. Pisahkan supernatan dari endapan dan baca optical density (OD) pada spektrofotometer dengan panjang gelombang 546 nm terhadap supernatant tabung pertama. 6. Hitung persen (%) hemolisis : % Hemolisis = OD Supernatant x 100 % OD Supernatant tab.1 Nilai Normal : % NaCl % Hemolisis 0,30 97 – 100 % 0,40 50 – 90 % 0,45 5 - 45 % 0,55 0% 2. Dacie Prinsip : Eritrosit bila dimasukkan kedalam larutan isotonis NaCl, air tak dapat meninggalkan atau masuk ke dalam Erythrosit, akan tetapi bila dimasukkan dalam larutan hipotonik maka air akan masuk kedalam sel sehingga sel akan mengembang dan pecah, diamati secara visual. Tujuan : Untuk mengetahui apakah benar ada penurunan daya osmotik atau tindakan dari eritrositeritrosit yang mengalami hemolisis yang berlebihan. Alat dan Reagensia : 1. Spuit dan Neddle 2. Tourniquette 3. Tabung reaksi 4. Pipet tetes 5. NaCl 0,9 % 6. Aquadest 7. Pipet tetes. 8. Kapas alkohol 70 %



9. Pipet ukur 5 ml 10. Sentrifuge 11. Waterbath 37O C



Bahan pemeriksaan : Darah vena dengan antikoagulan EDTA Teknik kerja : 1. Sediakan 10 tabung reaksi dan isikan ke dalamnya : No. Tabung NaCl 0,9 % (ml) Aquadest (ml) 1. 1,2 ml 0,6 ml 2. 1,1 ml 0,7 ml 3. 1,0 ml 0,8 ml 4. 0,9 ml 0,9 ml 5. 0,8 ml 1,0 ml 6. 0,7 ml 1,1 ml 7. 0,6 ml 1,2 ml 8. 0,5 ml 1,3 ml 58



Konsentrasi 0,60 % 0,55 % 0,50 % 0,45 % 0,40 % 0,35 % 0,30 % 0,25 %



2. 3. 4. 5.



9. 0,4 ml 1,4 ml 0,20 % 10. 0,3 ml 1,5 ml 0,15 % Masing – masing tabung tambahkan 1 tetes darah, campur baik-baik. Biarkan selama 15 – 30 menit. Putar pada sentrifuge pada 2000 rpm selama 5 menit. Periksa hasilnya secara visual dimana terjadi permulaan hemolisis dan hemolisis sempurna.



Nilai Normal : - Permulaan Hemolisis konsentrasi NaCl 0,42 ± 0,02 % - Hemolisis sempurna konsentrasi NaCl 0,32 ± 0,02 % 3. Visual Skrining Prinsip : Eritrosit bila dimasukkan kedalam larutan isotonis NaCl, air tak dapat meninggalkan atau masuk ke dalam Erythrosit, akan tetapi bila dimasukkan dalam larutan hipotonik maka air akan masuk kedalam sel sehingga sel akan mengembang dan pecah, diamati secara visual. Tujuan : Untuk mengetahui apakah benar ada penurunan daya osmotik atau tindakan dari eritrositeritrosit yang mengalami hemolisis yang berlebihan. Alat dan Reagensia : 1. Spuit dan Neddle 2. Tourniquette 3. Tabung reaksi 4. Pipet tetes 5. NaCl 1 % 6. Aquadest 7. Pipet tetes. 8. Kapas alkohol 70 %



9. Pipet ukur 5 ml 10. Sentrifuge 11. Waterbath 37O C 12. Darah EDTA sebagai kontrol



Bahan pemeriksaan : Darah vena dengan antikoagulan EDTA Teknik kerja : 1. Sediakan 10 tabung reaksi dan isikan ke dalamnya : No. Tabung NaCl 0,9 % (ml) Aquadest (ml) Konsentrasi 1. 6,4 ml 3,6 ml 0,64 % 2. 6,0 ml 4,0 ml 0,60 % 3. 5,6 ml 4,4 ml 0,56 % 4. 5,2 ml 4,8 ml 0,52 % 5. 4,8 ml 5,2 ml 0,48 % 6. 4,4 ml 5,6 ml 0,44 % 7. 4,0 ml 6,0 ml 0,40 % 8. 3,6 ml 6,4 ml 0,36 % 9. 3,2 ml 6,8 ml 0,32 % 10. 2,8 ml 7,2 ml 0,28 % 2. Diambil larutan pengenceran diatas tiap tabung 2 ml. 3. Pada tiap tabung tersebut tambahkan 1 tetes bahan pemeriksaan (apabila darah dari pasien anemia 2 tetes). 4. Didiamkan pada suhu kamar selama 2 jam atau lebih sehingga eritrosit mengendap. 59



5. Periksa hasilnya secara visual dimana terjadi permulaan hemolisis dan hemolisis sempurna. Nilai Normal : - Permulaan Hemolisis konsentrasi NaCl 0,42 ± 0,02 % - Hemolisis sempurna konsentrasi NaCl 0,32 ± 0,02 % Catatan : 1. Dalam melakukan pemeriksaan fragilitas osmotik perlu dikerjakan pemeriksaan kontrol darah normal dan pengerjaannya dalam waktu yang sama dengan darah sampel. 2. Hemolisis permulaan (tidak lengkap) adalah saat mulai terjadi hemolisis eritrosit akibat penurunan konsentrasi NaCl 0,9% yang ditandai dengan larutan yang berwarna kuning kemerahan. 3. Hemolisis sempurna (lengkap) adalah saat terjadi hemolisis lengkap eritrosit akibat penurunan konsentrasi yang lebih rendah NaCl 0,9% yang ditandai dengan larutan yang berwarna merah.



Gambar hasil pemeriksaan Osmotic Fragility



60



BAB XV HITUNG TROMBOSIT XV.1 PENDAHULUAN Trombosit adalah sel berupa fragmen atau keping darah hasil pecahan sitoplasma megakariosit di sumsum tulang berukuran 3 - 4 mikron. Umur trombosit 9 -12 hari (ratarata 10 hari) dalam darah tepi. Nilai normal trombosit adalah 200.000 - 400.000 per milimeter kubik darah. Beberapa literatur menuliskan 150.000 – 450.000/mm3 darah. Trombosit yang rusak akan dihancurkan di dalam limpa. Mekanisme pembentukan trombosit dengan cara pembentukan pseudopodia dan fragmentasi dari sitoplasma mengakariosit. Istilah sekarang yang sering digunakan adalah platelet. Trombosit membantu proses koagulasi dan membentuk sumbatan pada luka dengan perdarahan, karena itu hitung jumlah trombosit sangat penting. Namun karena trombosit sangat kecil dan mudah melekat pada permukaan asing misalnya endotel yang rusak, maka hitung jumlah trombosit perlu memperhatikan hal tersebut. XV.2 TUJUAN 1. Evaluasi produksi trombosit. 2. Mengetahui efek kemoterapi atau radiasi terhadap produksi trombosit. 3. Diagnosis dan monitor trombositosis atau trombositopenia. 4. Konfirmasi estimasi jumlah dan morfologi trombosit pada sediaan apus apabila menggunakan penghitungan secara manual atau automatik mengalami flag. XV.3 METODE PEMERIKSAAN Prinsip : Darah diencerkan dengan larutan zat warna tertentu akan membentuk sel-sel trombosit, sedangkan sel-sel yang lain akan lisis dan dihitung selnya dalam kamar hitung dibawah mikroskop. Tujuan : Untuk mengetahui dan menentukan jumlah sel trombosit dalam darah seseorang. Alat dan Reagensia : 1. Hemocytometer : - Bilik hitung Improved Neubauer - Pipet Erytrosit dari Thoma - Kaca penutup - Karet pengisap 2. Kertas tissue 3. Spuit dan Neddle 4. Yellow Tips dan Blue Tips 5. Larutan Rees Ecker : - Natrium citrat………………..3,8 gr - Brillian Cresyl Blue………... 0,2 ml - Aquadest…………………….100 ml



6. Tourniquete 7. Kertas Saring 8. Botol EDTA 9. Mikropipet 10 µL 10. Tabung Reaksi Kecil 11. Mikroskop 12. Botol Kecil 13. Mikropipet 1000 µL



Bahan pemeriksaan : Darah vena dengan Antikoagulan EDTA atau darah kapiler. Rees Ecker Cara Pipet Thoma : 1. Di isap darah sampai tanda 0,5 tepat dengan pipet eritrosit. 2. Di isap larutan Rees Ecker sampai tanda 101 tepat.



61



3. Pipet dikocok selama 15-30 detik dengan membentuk angka delapan atau diatas vortex mixer atau vibrator. 4. Sebelum mengisi kamar hitung pipet dikocok selama 3 menit 5. Di buang cairan sebanyak 3-4 tetes, tetesan berikutnya diisikan ke bilik hitung. 6. Dibiarkan selama 5 – 10 menit dalam cawan petri yang telah diberi alas kertas saring basah atau tissue untuk memberi kesempatan trombosit mengendap. 7. Hitung semua sel trombosit yang terdapat didalam 80 kotak kecil atau 400 kotak kecil. 8. Trombosit tampak berwarna biru mengkilat dengan latar eritrosit yang berwarna biru juga. Cara Pengenceran Mikropipet dalam Tabung : 1. Dimasukkan larutan Rees Ecker 2000 µL dalam tabung reaksi bersih dengan menggunakan mikropipet. 2. Buang cairannya 10 µL dengan mikropipet 10 µL. 3. Darah dikocok dahulu, lalu diambil 10 ul dengan mikropipet. 4. Bagian luar dari yellow tips dibersihkan dengan tissue kering, lalu dicampur dengan larutan Rees Ecker dengan memasukkan ujung mikropipet hingga dasar tabung. 5. Bilas beberapa kali larutan agar tercampur. 6. Kocok tabung 4-5 kali dan diamkan selama 2-3 menit. 7. Biarkan selama 5-10 menit dalam cawan petri yang telah diberi alas kertas saring basah untuk memberi kesempatan trombosit mengendap. 8. Hitung semua sel trombosit yang terdapat didalam 80 kotak kecil atau 400 kotak kecil. 9. Trombosit tampak berwarna biru dengan latar eritrosit yang berwarna biru juga. Van Herwerden Reagensia : Larutan Herwerden : - Ureum 10 %.......................5,25 mL - Air garam faal……….……..1,0 mL Cara Pipet Thoma : 1. Di isap darah sampai tanda 0,5 tepat dengan pipet eritrosit. 2. Di isap larutan Van Herwerden sampai tanda 101 tepat. 3. Pipet dikocok selama 15-30 detik dengan membentuk angka delapan atau diatas vortex mixer atau vibrator. 4. Sebelum mengisi kamar hitung pipet dikocok selama 3 menit 5. Di buang cairan sebanyak 3-4 tetes, tetesan berikutnya diisikan ke bilik hitung. 6. Dibiarkan selama 5 – 10 menit dalam cawan petri yang telah diberi alas kertas saring basah atau tissue untuk memberi kesempatan trombosit mengendap. 7. Hitung semua sel trombosit yang terdapat didalam 80 kotak kecil atau 400 kotak kecil. 8. Trombosit tampak tidak berwarna dan sel lainnya lisis. Cara Pengenceran Mikropipet dalam Tabung : 1. Dimasukkan larutan Van Herwerden 2000 µL dalam tabung reaksi bersih dengan menggunakan mikropipet. 2. Buang cairannya 10 µL dengan mikropipet 10 µL. 3. Darah dikocok dahulu, lalu diambil 10 ul dengan mikropipet. 4. Bagian luar dari yellow tips dibersihkan dengan tissue kering, lalu dicampur dengan larutan Rees Ecker dengan memasukkan ujung mikropipet hingga dasar tabung. 5. Bilas beberapa kali larutan agar tercampur. 6. Kocok tabung 4-5 kali dan diamkan selama 2-3 menit. 7. Biarkan selama 5-10 menit dalam cawan petri yang telah diberi alas kertas saring basah untuk memberi kesempatan trombosit mengendap. 8. Hitung semua sel trombosit yang terdapat didalam 80 kotak kecil atau 400 kotak kecil. 62



Ammonium Oxalat 1% Reagensia : Larutan Ammonium Oxalat 1% : - Ammonium Oxalat …………….1 gram - Aquadest …………………….…100 mL Cara Pipet Thoma : 1. Di isap darah sampai tanda 0,5 tepat dengan pipet eritrosit. 2. Di isap larutan Ammonium Oxalat 1% sampai tanda 101 tepat. 3. Pipet dikocok selama 15-30 detik dengan membentuk angka delapan atau diatas vortex mixer atau vibrator. 4. Sebelum mengisi kamar hitung pipet dikocok selama 3 menit 5. Di buang cairan sebanyak 3-4 tetes, tetesan berikutnya diisikan ke bilik hitung. 6. Dibiarkan selama 5 – 10 menit dalam cawan petri yang telah diberi alas kertas saring basah atau tissue untuk memberi kesempatan trombosit mengendap. 7. Hitung semua sel trombosit yang terdapat didalam 80 kotak kecil atau 400 kotak kecil. 8. Trombosit tampak tidak berwarna dan sel lainnya lisis. Cara Pengenceran Mikropipet dalam Tabung : 1. Dimasukkan larutan Ammonium Oxalat 1% 2000 µL dalam tabung reaksi bersih dengan menggunakan mikropipet. 2. Buang cairannya 10 µL dengan mikropipet 10 µL. 3. Darah dikocok dahulu, lalu diambil 10 ul dengan mikropipet. 4. Bagian luar dari yellow tips dibersihkan dengan tissue kering, lalu dicampur dengan larutan Rees Ecker dengan memasukkan ujung mikropipet hingga dasar tabung. 5. Bilas beberapa kali larutan agar tercampur. 6. Kocok tabung 4-5 kali dan diamkan selama 2-3 menit. 7. Biarkan selama 5-10 menit dalam cawan petri yang telah diberi alas kertas saring basah untuk memberi kesempatan trombosit mengendap. 8. Hitung semua sel trombosit yang terdapat didalam 80 kotak kecil atau 400 kotak kecil. Perhitungan : • Dalam 400 kotak kecil terdapat Trombosit • Pengenceran darah 100 / 0,5 • Tinggi kaca penutup 1/ 0,1 • Dalam 1 mm2 kamar hitung terdapat RUMUS



:



: : : :



……sel 200 kali 10 kali 400 kotak kecil



PDP X TKP X KKS X Throm = ………../mm3 Trombosit KKH



Keterangan : PDP = Pengenceran darah dalam pipet / mikropipet TKP = Tinggi kaca penutup KKS = Kotak kecil sebenarnya KKH = Kotak kecil dihitung



Darah sampai Tanda 0,1 Tanda 0,2 Tanda 0,5 Tanda 1,0



Daftar Pengenceran Pipet Thoma Cairan pengencer Pengenceran darah tanda 101 1000 kali tanda 101 500 kali tanda 101 200 kali tanda 101 100 kali



63



Daftar Pengenceran tabung Cairan pengencer 1995 µL 1990 µL 1980 µL 1960 µL 1950 µL



Volume 5 µL 10 µL 20 µL 40 µL 50 µL Nilai normal



:



Pengenceran darah 400 kali 200 kali 100 kali 50 kali 40 kali



200.000 – 400.000 / mm3 darah



Plasma Sitrat 3,8% Prinsip : Plasma darah diencerkan dengan larutan Natrium citrat 3,8 %, dihitung sel Trombosit dalam kamar hitung dibawah mikroskop dan volume plasma dikoreksi dengan menghitung Hematokrit. Tujuan : Untuk mengetahui dan menentukan jumlah sel trombosit dalam darah seseorang. Reagensia : Larutan Na.Citrat 3,8 % : - Na. Citrat……………….3,8 gram - Aquadest……………….100 ml Bahan pemeriksaan : Darah vena dengan Anticoagulant EDTA atau darah kapiler. Cara Pipet Thoma : 1. Darah ditentukan dahulu hematokritnya dengan cara hematokrit cara mikro. 2. Darah vena dengan antikoagulan EDTA dibiarkan mengendap sehingga terpisah antara sel dan cairan plasmanya. (waktu 10 – 30 menit) 3. Plasma dipipet dengan pipet leukosit sampai tanda 1 tepat 4. Isap larutan Natrium Citrat 3,8 % sampai tanda 11 tepat. 5. Pipet dikocok selama 15-30 detik. 6. Sebelum mengisi kamar hitung pipet dikocok selama 3 menit 7. Buang cairan sebanyak 3-4 tetes, tetesan berikutnya diisikan ke bilik hitung. 8. Biarkan selama 5 – 10 menit dalam cawan petri yang telah diberi alas kertas saring basah untuk memberi kesempatan thrombosit mengendap. 9. Hitung semua sel trombosit yang terdapat didalam 80 kotak kecil atau 400 kotak kecil dan dikoreksi volume plasma dengan hematokrit. 10. Trombosit tampak bulat-bulat kecil tak berwarna. Cara Pengenceran Mikropipet dalam Tabung : 1. Darah ditentukan dahulu hematokritnya dengan cara hematokrit cara mikro. 2. Dimasukkan larutan Na.Citrat 3,8 % 400 µL dalam tabung reaksi bersih dengan menggunakan mikropipet. 3. Buang cairannya 20 µL dengan mikropipet 20 µL. 4. Darah vena dengan antikoagulan EDTA dibiarkan mengendap sehingga terpisah antara sel dan cairan plasmanya. 5. Dipipetl 20 µL Plasma tadi dengan mikropipet. 6. Bagian luar dari yellow tips dibersihkan dengan tissue kering, lalu dicampur dengan larutan Na.Citrat 3,8 % dengan memasukkan ujung mikropipet hingga dasar tabung. 7. Bilas beberapa kali larutan agar tercampur. 64



8. Kocok tabung 4-5 kali dan diamkan selama 2-3 menit. 9. Biarkan selama 5-10 menit dalam cawan petri yang telah diberi alas kertas saring basah untuk memberi kesempatan trombosit mengendap. 10. Hitung semua sel thrombosit yang terdapat didalam 80 kotak kecil atau 400 kotak kecil dan dikoreksi volume plasma dengan hematokrit 11. Trombosit tampak bulat-bulat kecil tak berwarna. Perhitungan • • • •



: Dalam 400 kotak kecil terdapat Trombosit Pengenceran darah 10 / 0,5 Tinggi kaca penutup 1/ 0,1 Dalam 1 mm2 kamar hitung terdapat



: ….. sel : 20 kali : 10 kali : 400 kotak kecil



RUMUS : PDP X TKP X KKS X [100% - % Hct ] x trombo = …….../mm3 trombo KKH Hct% Keterangan : PDP = Pengenceran darah dalam pipet TKP = Tinggi kaca penutup KKS = Kotak kecil sebenarnya KKH = Kotak kecil dihitung



Darah sampai Tanda 0,1 Tanda 0,2 Tanda 0,5 Tanda 1,0



Darah sampai 5 ul 10 ul 20 ul 40 ul 50 ul



Daftar Pengenceran Pipet Thoma Cairan pengencer Pengenceran darah tanda 11 100 kali tanda 11 50 kali tanda 11 20 kali tanda 11 10 kali Daftar Pengenceran tabung Cairan pengencer Pengenceran darah 395 ul 80 kali 390 ul 40 kali 380 ul 20 kali 360 ul 10 kali 350 ul 8 kali



Nilai Normal : 150.000 – 300.000/mm3 darah Plasma Rees Ecker Modifikasi Prinsip : Plasma darah diencerkan dengan larutan Rees Ecker, dihitung sel Trombosit dalam kamar hitung dibawah mikroskop dan volume plasma dikoreksi dengan menghitung Hematokrit. Tujuan : Untuk mengetahui dan menentukan jumlah sel trombosit dalam darah seseorang. Reagensia : Larutan Rees Ecker : - Natrium Citrat………………..3,8 gr - Brillian Cresyl Blue………... 0,2 ml - Aquadest…………………….100 ml Bahan pemeriksaan : Darah vena dengan Anticoagulant EDTA atau darah kapiler. 65



Cara Pipet Thoma : 1. Darah ditentukan dahulu hematokritnya dengan cara hematokrit cara mikro. 2. Darah vena dengan antikoagulan EDTA dibiarkan mengendap sehingga terpisah antara sel dan cairan plasmanya. (waktu 10 – 30 menit) 3. Plasma dipipet dengan pipet leukosit sampai tanda 0,5 tepat 4. Isap larutan Rees Ecker sampai tanda 11 tepat. 5. Pipet dikocok selama 15-30 detik. 6. Sebelum mengisi kamar hitung pipet dikocok selama 3 menit 7. Buang cairan sebanyak 3-4 tetes, tetesan berikutnya diisikan ke bilik hitung. 8. Biarkan selama 5 – 10 menit dalam cawan petri yang telah diberi alas kertas saring basah untuk memberi kesempatan thrombosit mengendap. 9. Hitung semua sel trombosit yang terdapat didalam 80 kotak kecil atau 400 kotak kecil dan dikoreksi volume plasma dengan hematokrit. 10. Trombosit tampak bulat-bulat kecil berwarna biru kehijauan mengkilat. Cara Pengenceran Mikropipet dalam Tabung : 1. Darah ditentukan dahulu hematokritnya dengan cara hematokrit cara mikro. 2. Dimasukkan larutan Rees Ecker 400 µL dalam tabung reaksi bersih dengan menggunakan mikropipet. 3. Buang cairannya 20 µL dengan mikropipet 20 µL. 4. Darah vena dengan antikoagulan EDTA dibiarkan mengendap sehingga terpisah antara sel dan cairan plasmanya. 5. Dipipetl 20 µL Plasma tadi dengan mikropipet. 6. Bagian luar dari yellow tips dibersihkan dengan tissue kering, lalu dicampur dengan larutan Na.Citrat 3,8 % dengan memasukkan ujung mikropipet hingga dasar tabung. 7. Bilas beberapa kali larutan agar tercampur. 8. Kocok tabung 4-5 kali dan diamkan selama 2-3 menit. 9. Biarkan selama 5-10 menit dalam cawan petri yang telah diberi alas kertas saring basah untuk memberi kesempatan trombosit mengendap. 10. Hitung semua sel thrombosit yang terdapat didalam 80 kotak kecil atau 400 kotak kecil dan dikoreksi volume plasma dengan hematokrit 11. Trombosit tampak bulat-bulat kecil berwarna biru kehijauan mengkilat. Perhitungan • • • •



: Dalam 400 kotak kecil terdapat Trombosit Pengenceran darah 10 / 0,5 Tinggi kaca penutup 1/ 0,1 Dalam 1 mm2 kamar hitung terdapat



: ….. sel : 20 kali : 10 kali : 400 kotak kecil



RUMUS : PDP X TKP X KKS X [100% - % Hct ] x trombo = …….../mm3 trombo KKH Hct% Keterangan : PDP = Pengenceran darah dalam pipet TKP = Tinggi kaca penutup KKS = Kotak kecil sebenarnya KKH = Kotak kecil dihitung



Darah sampai Tanda 0,1 Tanda 0,2 Tanda 0,5 Tanda 1,0



Daftar Pengenceran Pipet Thoma Cairan pengencer Pengenceran darah tanda 11 100 kali tanda 11 50 kali tanda 11 20 kali tanda 11 10 kali 66



Darah sampai 5 ul 10 ul 20 ul 40 ul 50 ul



Daftar Pengenceran tabung Cairan pengencer Pengenceran darah 395 ul 80 kali 390 ul 40 kali 380 ul 20 kali 360 ul 10 kali 350 ul 8 kali



Nilai Normal : 150.000 – 300.000/mm3 darah Fonio Prinsip : Darah diencerkan dengan larutan MgSO4 14 % akan mencegah sel-sel trombosit menggumpal, dibuat Hapusan darah, diwarnai dan diperiksa dibawah mikroskop. Tujuan : Untuk mengetahui dan menentukan jumlah sel thrombosit abnormal dalam darah seseorang. Alat dan Reagensia : 1. Blood Lancet / Autoklik 2. Objek Glass 3. Kapas 4. Larutan MgSO4 14 % 5. Oil emersi / Anisol 6. Zat warna Wright / Giemsa / Romanowsky 7. Mikroskop Bahan Pemeriksaan : Darah Kapiler Teknik kerja : 1. Hitung dulu jumlah Erytrosit per mm3 darah dengan menggunakan bilik hitung. 2. Untuk menghitung Thrombosit, ujung jari dibersihkan dengan alkohol 70 % dan biarkan kering. 3. Bubuhkan 1 tetes besar MgSO4 14 % pada ujung jari tadi. 4. Melalui tetes MgSO4 14 % ini jari ditusuk dengan Lancet dan darah dibiarkan keluar sampai yang keluar menjadi kira-kira ¼ jumlah MgSO4 14 % dan dibuat Hapusan darah. 5. Keringkan dan difiksasi dengan mentanol selama 2 menit. 6. Preparat dicat dengan larutan Wright / Giemsa / Romanowsky selama 20-30 menit. 7. Cuci dengan air suling dan keringkan. 8. Periksa di bawah mikroskop dengan lensa objektif 100 x menggunakan oil emersi / anisol. 9. Hitung jumlah trombosit yang ditemukan dalam 1000 erytrosit. RUMUS :



Nilai normal :



Thrombosit = Jumlah Erytrosit per mm3 X jumlah trombosit didapat 1000 erytrosit = …………..sel / mm3 darah Pria dan wanita



: 200.000 – 400.000 / mm3 darah.



67



Luas Area Bilik Hitung Improved Neubauer



Bidang Kotak Kecil II Bidang Kotak Kecil I



Bidang kotak kecil III



Bidang kotak kecil IV Bidang kotak kecil V -



Luas area kotak eritrosit 1 x 1 m2 atau 400 kotak kecil atau 5 x 5 bidang kotak kecil. Setiap 16 kotak kecil atau 1 bidang kotak kecil, tiap 1 bidang kotak kecil nya berukuran 0,2 mm x 0,2 mm. Area untuk penghitungan trombosit pada pada sudut atas kiri, sudut atas kanan, tengah, sudut bawah kiri dan sudut bawah kanan.



Penghitungan trombosit menggunakan bilik hitung improved neubauer menggunakan kotak eritrosit dan teknik pengitungan hampir sama dengan eritrosit, kecuali pada hitung trombosit ini area pengitungan pada semua kotak eritrosit untuk mengurangi kesalahan penghitungan, namun juga pada 80 kotak kecil sudah memenuhi syarat pada kondisi normal. Kesalahan yang sering di jumpai : : 1. Sama halnya seperti pada penghitungan eritrosit dan leukosit. 2. Tidak dapat membedakan antara trombosit dan kotoran zat warna. Aturan Penghitungan Aturan penghitungan trombosit yang digunakan sama dengan hitung leukosit Umumnya digunakan menyinggung garis kiri dan atas supaya lebih seragam. Konversi Satuan Seiring dengan perkembangan zaman, maka satuan untuk pemeriksaan trombosit mengalami perubahan satuan menjadi satuan baru (SI). Konversi satuan tersebut adalah sebagai berikut : Satuan lama : Jumlah trombosit = ............../mm3 darah atau dalam .........../µL Satuan Baru : Jumlah trombosit = ............./L 68



Untuk konversinya : Jumlah trombosit per Liter (/L) = Jumlah trombosit x 106/mm3 x 1.000.000 atau 106 = ...........x 1012/L XV.4 HAL YANG DIPERHATIKAN 1. Pemeriksaan trombosit cara Rees Ecker tidak diperkenankan menggunakan bilik hitung Improved Neubauer Brightline karena akan terlihat gelap. 2. Apabila mengalami kekeruhan pada larutan Rees Ecker, maka harus di saring. 3. Larutan Van Herwerden bersifat tidak stabil sehingga dibuat apabila akan digunakan untuk pemeriksaan. 4. Pemeriksaan menggunakan larutan ammonium oxalat perlu waktu agak lama untuk menghancurkan seluruh eritrosit (10-15 menit) secara sempurna, bila tidak fragmen eritrosit akan mengganggu pemeriksaan. 5. Metode Plasma Sitrat 3,8% sangat sensitif untuk mengukur jumlah trombosit dibawah 50.000 hingga 20.000/mm3 darah dibandingkan metode lainnya. 6. Pembentukan plasma harus menunggu darah mengendap dan tidak boleh disentrifuge, karena akan menyebabkan plasma miskin trombosit. 7. Larutan pengencer Natrium sitrat 3,8% dapat digantikan dengan NaCl 0,9% apabila tidak ada. 8. Cara Fonio lebih rumit dan memerlukan ketelitian yang lebih baik, namun dapat langsung melihat morfologi trombosit dibandingkan metode kamar hitung.



69



BAB XVI PARAMETER FAAL HEMOSTASIS XVI.1 PENDAHULUAN Pemeriksaan hemostasis ini dibagi dua golongan yaitu pemeriksaan penyaring dan pemeriksaan khusus. Pilihan tergantung dari tujuan pemeriksaan hemostasis yang diinginkan sesuai dengan kondisi dan tindakan yang akan dilakukan pada pasien. Pemeriksaan penyaring biasanya dilakukan pada pasien yang akan menjalani operasi, sedang bila sudah ada perdarahan maka permintaan pemeriksaan hemostasis didasarkan atas diagnosis klinik. Pemeriksaan ini meliputi hitung trombosit, bleeding time, prothrombin time, partial thromboplastin time, thrombin time, pemeriksaan konsentrasi fibrinogen dan hasil pecahannya, serta pemeriksaan kadar inhibitor seperti antitrombin III dan alpha-2 antiplasmin. XVI.2 MANFAAT 1. Untuk melihat fungsi hemostasis secara umum, baik terhadap gangguan tombosit kongenital maupun akuisita. 2. Untuk persiapan operasi, maka dilakukan pemeriksaan faal hemostasis yang tergantung dari jenis operasinya. Makin besar operasi yang dilakukan, makin banyak pemeriksaannya. Untuk operasi besar seperti operasi jantung, paru-paru dan prostat maka dilakukan pemeriksaan faal hemostasis lengkap. Namun apabila hanya operasi kecil seperti operasi tonsil atau usus buntu, maka pemeriksaan yang dilakukan setidaknya : pemeriksaan trombosit, bleeding time, clotting time, retraksi bekuan dan plasma protrombin time. 3. Untuk diagnosa penyakit-penyakit perdarahan. Pemeriksaan ini bermanfaat dalam melihat adanya defect (cacat) pada sistem pembekuan darah normal yang disebabkan adanya defisiensi atau kerusakan atau kelainan pada faktor-faktor pembekuan darah. 4. Untuk pemantauan pengobatan dengan obat-obat antikoagulansia. Beberapa jenis obat-obat seperti warfarin, koumarine dan antikoagulan lainnya menyebabkab terjadinya gangguan pada pembekuan darah, oleh sebab itu perlu dipantau kondisi pembekuan darah. XVI.3 PEDOMAN UMUM UNTUK PEMERIKSAAN FAAL HEMOSTASIS 1. Waktu pengambilan darah, pembendungan tidak boleh terlalu lama. 2. Clean veni pucnture, yaitu pengambilan darah menggunakan jarum tidak boleh diungkit-ungkit yang menyebabkan kemasukkan cairan jaringan dan jaringan menjadi trauma sehingga mengakibatkan aktivasi pembekuan darah. 3. Perfusi darah yang diambil harus baik, karena bila anemia akan terjadi peningkatan fibrinolitik. 4. Antikoagulan yang digunakan natrium sitrat 3,8% atau 3,2% (tabung vakum) dengan perbandingan 1 bagian antikoagulan dan 9 bagian darah. 5. Botol penampung harus bebas dari sabun/deterjen. 6. Jarum yang digunakan cukup besar, yaitu nomor 21, 22 atau 23. 7. Temperatur tempat bekerja harus sesuai. Rata-rata pemeriksaan skrining seperti Bleeding time dan Clotting time dilakukan pada suhu kamar. Pada suhu 37°C terjadi kenaikan pembekuan darah sebanyak 2x dibandingkan 20°C. 8. Untuk aPTT (kPTT) dan PPT dilakukan pada suhu 37°C dengan waterbath. XVI.4 PERCOBAAN PEMBENDUNGAN (RUMPELL LEEDE) Prinsip : Vena dibendung dengan tekanan tertentu dan lihat adanya petechiae dan ecchymosis pada permukaan kulit dibagian distal pembendungan.



70



Tujuan : Untuk mengetahui dan menguji ketahanan kapiler darah seseorang. Alat : 1. Stetoskop 2. Spimomanometer 3. Stopwatch Cara Kerja : 1. Pasanglah ikatan Spigmomanometer pada lengan atas dan pompalah sampai tekanan 100 mmHg (jika tekanan sistolik kurang dari 100 mmHg, pompalah sampai tekanan di tengah-tengah nilai sistolik dan diastolik). 2. Pertahankan tekanan itu selama 10 menit. (jika melanjutkan cara Ivy cukup 5 menit). 3. Lepaskan ikatan dan tunggulah sampai tanda-tanda statis darah hilang. Statis darah hilang bila warna kulit kembali seperti semula. 4. Carilah adanya petechiae yang timbul dengan diameter 5 mm kira-kira 4 cm distal dari fossa cubiti dan dihitung jumlahnya. Nilai normal : Tidak ditemukan Petechiae pada lengan yang dibendung.



71



BAB XVII BLEEDING TIME 1. Metode Duke Prinsip : Pemeriksaan terhadap fungsi pembuluh darah kapiler dan jumlah dari faktor-faktor pembekuan darah sehingga darah yang keluar tidak menyebabkan perpanjangan karena luka yang dibuat sedemikian rupa kecilnya sehingga perdarahan segera terhenti karena pengaruh darah dan Trombosit. Tujuan : Untuk menilai faktor hemostasis yang letaknya ekstravaskuler dan fungsi dari Trombosit dan faktor dinding kapiler. Alat dan reagensia : 1. Blood Lancet / Autoklik 2. Timer 3. Kertas saring 4. Kapas 5. Alkohol 70 % Bahan pemeriksaan : darah kapiler. Cara Kerja : 1. Cuping telinga dibersihkan dengan kapas beralkohol 70 % dan dibiarkan kering 2. Cuping ditusuk dengan lancet steril sehingga dapat luka yang dalam + 3 mm. 3. Waktu darah keluar stopwatch dijalankan 4. Tetesan darah yang keluar tiap 30 detik diisap dengan kertas saring. 5. Masa perdarahan dicatat mulai waktu keluar darah sampai berhenti keluar. Nilai normal



: 1 – 3 menit



2. Metode Ivy Prinsip : Pemeriksaan terhadap fungsi pembuluh darah kapiler dan jumlah dari faktor-faktor pembekuan darah sehingga darah yang keluar tidak menyebabkan perpanjangan karena luka yang dibuat sedemikian rupa kecilnya sehingga perdarahan segera terhenti karena pengaruh darah dan Trombosit. Tujuan : Untuk menilai faktor hemostasis yang letaknya ekstravaskuler dan fungsi dari Trombosit dan faktor dinding kapiler. Alat dan reagensia : 1. Blood Lancet / Autoklik 2. Timer 3. Kertas saring 4. Kapas 5. Alkohol 70 % Bahan pemeriksaan : darah kapiler. Cara Kerja : 1. Spigmomanometer dipasang pada lengan atas dan dipompa sampai tekanan 40 mmHg. Selama percobaan berlangsung tekanan harus tetap/konstan.



72



2. Kira-kira 5 jari dibawah pembendungan, dibersihkan dengan alkohol 70% dan dibiarkan kering 3. Ditusuk kulit tersebut menggunakan lancet hingga menimbulkan luka dan darah mengalir. (beberapa modifikasi menggunaan jari untuk ditusuk dengan Blood Lancet / Autoklik steril hingga didapatkan luka yang dalamnya ± 3 mm). 4. Pada saat terlihat darah keluar, stopwatch dijalankan. 5. Darah yang keluar diisap dengan sepotong kertas saring atau tissue tiap 30 detik. 6. Stopwatch dihentikan setelah darah tidak dapat diisap kertas saring. 7. Hasil dinyatakan dan dibulatkan menjadi per 30 detik. Nilai Normal : 1-6 menit Faktor yang dapat mempengaruhi temuan laboratorium : a. Metode yang digunakan; teknik yang tidak tepat – bila terjadi luka pungsi yang mungkin lebih dalam daripada yang seharusnya. b. Bila tetesan darah ditekan paksa pada permukaan kertas dan tidak menunggu tetesan darah benar-benar terisap dengan sendirinya pada kertas penghisap, hal ini dapat merusak partikel fibrin sehingga memperlama perdarahan. c. Obat aspirin dan antikoagulan dapat memperlama perdarahan.



Gambar 16. Teknik kerja Bleeding Time metode Duke dan Ivy



73



BAB XVIII CLOTTING TIME 1. Cara Tabung kapiler (Duke) Prinsip : Darah kapiler dimasukkan kedalam tabung kapiler sampai terjadi pembekuan dengan terlihatnya benang fibrin pada pematahan terakhir. Alat dan Reagensia : 1. Tabung kapiler 2. Lancet 3. Stop watch 4. Kikir ampul 5. Kapas 6. Alkohol 70 % Bahan pemeriksaan : Darah kapiler Cara Kerja : 1. Dibuat dulu tusukan pada ujung jari atau cuping telinga hingga darah leluasa mengalir keluar dan stop watch dijalankan. 2. Tetesan darah pertama dihapus dan tetesan berikutnya dimasukkan ke dalam tabung kapiler sampai penuh. 3. Tiap 30 detik tabung kapiler dipatahkan sepanjang 1 cm. 4. Setelah pematahan terakhir dan terlihat benang fibrin, stop watch dihentikan. Nilai Normal : 6 menit 2. Cara Objek Glass / kaca arloji Prinsip : Darah vena diletakkan pada kaca arloji atau objek glass sambil dipancing sampai terjadi pembekuan darah dengan terbentuknya benang fibrin pada tetes darah yang kedua terhitung mulai darah keluar dari spuit. Alat dan Reagensia : 1. Objek glass 2. Kaca arloji 3. Spuit dan neddle 4. Stop watch 5. Jarum atau Ose 6. Kapas 7. Alkohol 70 % Cara Kerja : 1. Darah vena diambil dan saat darah masuk kedalam spuit stop watch dijalankan. 2. Jarum dilepaskan dan ditaruh diatas objek glass atau kaca arloji 2 tetes besar darah kira-kira berdiameter 5 mm secara terpisah. 3. Dengan jarum atau ose tetesan darah pertama dan kedua dipancing tiap 30 detik sampai terlihat benang fibrin. 4. Masa Pembekuan darah terjadi saat terbentuk benang fibrin pada tetes darah kedua sejak dari spuit. Nilai Normal : 2 – 6 menit.



74



3. Cara tabung reaksi (Lee and White) Prinsip : Darah vena dimasukkan dalam tabung reaksi dan dimiringkan tabung tiap 30 detik sampai terjadi pembekuan darah pada tabung ketiga. Alat dan Reagensia : 1. Objek glass 2. Kaca arloji 3. Spuit dan neddle 4. Stop watch 5. Jarum atau Ose 6. kapas 7. alkohol 70 % Bahan Pemeriksaan : Darah vena tanpa antikoagulan Cara kerja : 1. Disediakan dalam rak, 4 tabung berdiameter 7-8 mm 2. Darah vena diambil dan saat darah masuk kedalam spuit stop watch dijalankan. 3. Setelah itu darah dimasukkan kedalam tabung yang dimiringkan pada waktu memasukkannya. 4. Tiap 30 detik tabung pertama diangkat dari dan dimiringkan untuk melihat pembekuan. 5. Setelah darah tabung pertama beku, periksalah tabung kedua tiap 30 detik . 6. Tindakan sama dilakukan berturut-turut pada tabung ketiga dan keempat. Catat waktunya. 7. Masa pembekuan dihitung dari rata-rata tabung kedua, ketiga dan keempat. Nilai Normal : 2 – 6 menit Catatan : Hentikan tes apabila > 15 menit darah tidak membeku dan catatan hasilnya.



75



BAB XIX APTT Prinsip : Dengan menambah reagen APTT yang mengandung aktivator plasma dan fosfolipid pada sampel tes. Fosfolipid berfungsi sebagai pengganti platelet. Campuran diinkubasi selama 3-5 menit pada suhu 37O C di Waterbath untuk aktivasi optimum, kemudian direkalsifikasi dengan kalsium klorida dan beberapa saat akan terbentuk bekuan berupa benang fibrin. Tujuan : Untuk menguji fungsi thrombosit dan faktor VIII dan faktor IX (hemofilia) untuk jalur intrinsik pembekuan darah. Alat dan reagensia : 1. Spuit dan Neddle 8. Kaitan logam / Ose 2. Sentrifuge dan tabungnya. 9. Brain Tromboplastine 3. Pipet tetes 10. Larutan CaCl2 0,22 % 4. Tabung reaksi 10 x 200 mm 11. NaCl 0,9 % 5. Waterbath 37° C 12. Natrium Citrate 3,8 % 6. Stop watch 7. Pipet volume 0,5 mL dengan skala 0,02 mL / Mikropipet 100 µL Bahan pemeriksaan : Darah Vena dengan Anticoagulant Natrium sitrat 3,8 % 1 : 9 Persiapan Sampel : • Sampel. darah dapat diperoleh melalui vena punksi • Antikoagulan yang dipakai adalah sodium sitrat 3,2% atau 3,8% dengan perbandingan 9:1 (9 bagian darah:1 bagian Na.Sitrat). • Sampel darah disentrifus 10-15 menit dengan kecepatan 2000 g • Penampung tidak boleh terbuat dari bahan yang dapat menginduksi aktivasi kontak seperti gelas. Sebaliknya dipakai penampung gelas berlapis silikon atau plastik Cara Kerja : a. Pembuatan Plasma 1 : 9 1. Dipipet 0,2 mL Na. Citrate 3,8 % dimasukkan ke dalam tabung. 2. Darah yang ada dalam spuit dimasukkan kedalam tabung yang berisi Na.citrate 3,8 % sebanyak 1,8 mL. 3. Dicampur dengan cara membolak-balik tabung. 4. Diputar selama 5 menit pada 1500 rpm dengan sentrifuge. 5. Plasma yang terjadi dipisahkan dan dimasukkan kedalam tabung reaksi. b. Pemeriksaan APTT 1. Reagent APTT dan larutan CaCl2 0,25 M dimasukkan waterbath 37O C selama 5 menit. 2. Dipipet 0,1 mL plasma dan dimasukkan kedalam tabung reaksi. 3. Ditambah 0,1 mL reagent APTT dan dikocok. Lalu dimasukkan kedalam waterbath 37O C selama 3-5 menit. 4. Ditambah 0,1 mL CaCl2 0,25 M dan stop watch dijalankan. 5. Lalu didiankan dalam waterbath 37O C selama 20-35 detik, kemudian diangkat dan digoyang. 6. Dipancing dengan Ose sampai terjadi pembekuan pada plasma dengan terbentuk benang-benang fibrin dan stopwatch dihentikan.



76



Gambar 17. Cara Kerja pemeriksaan aPTT metode Manual



c. Cara Semiotomatik : 1. Siapkan sampel dan kontrol, sebelumnya, hangatkan hemostat CaC12 0,02 ml/l pada suhu ruang. 2. Masukkan plasma (0,1 ml) ke dalam tabung tes yang sudah terisi stiring bars, inkubasi selama 1-2 menit pada suhu ruang 3. Tambahkan reagen APTT-EL (0,1 ml), inkubasi 3 menit 4. Tambahkan CaC12 (0,1 ml) pada saat itujuga jalankan stop watch 5. Catat waktu yang dibutuhkan untuk membentuk bekuan (print out) Nilai Normal : 29 – 37 detik



77



BAB XX PLASMA PROTHROMBINE TIME (PPT) Prinsip : Suatu sediaan Tromboplastin yang kuat (Aceton dehydrated Rabbit Brain) ditambahkan plasma yang didapat dari darah citrat. Campuran tersebut diinkubasi pada suhu 37O C dan kemudian direcalcifikasi dengan penambahan larutan CaCl2 dan dicatat waktu pembukan plasma. Tujuan



: Untuk menguji faktor ekstrinsik jalur pembekuan darah.



Metode



: Quick Test



Bahan pemeriksaan : Darah vena dengan anticoagulant natrium citrat 3,8 %. Alat dan Reagensia : 1. Spuit dan Neddle 8. Kaitan logam / Ose 2. Sentrifuge dan tabungnya. 9. Brain Tromboplastine 3. Pipet tetes 10. Larutan CaCl2 0,22 % 4. Tabung reaksi 10 x 200 mm 11. NaCl 0,9 % 5. Waterbath 37° C 12. Natrium Citrate 3,8 % 6. Stop watch 7. Pipet volume 0,5 mL dengan skala 0,02 mL / Mikropipet 100 µL Cara Kerja : B. Pembuatan Plasma 1. Kedalam tabung sentrifuge masukkan 0,5 ml Na. Citrat 3,8 %. 2. Darah vena 4,5 ml masukkan ke dalam tabung yang berisi Na, Citrat tadi dan campur baik-baik. 3. putar pda sentrifuge selama 20 menit pada 3000 rpm 4. Pisahkan plasma yang terjadi, masukkan kedalam tabung dan kalau plasma tidak segera diperiksa masukkan kedalam lemari es. C. Pembuatan Larutan Tromboplastine 1. Masukkan 5 ml larutan NaCl 0,9 % dalam tabung lalu ditambah dengan 1 ampul Brain Thromboplastine. 2. Larutan siap digunakan untuk pemeriksaan. D. Pemeriksaan PPT 1. Masukkan tabung reaksi 10 x 200 mm ke dalam waterbath. 2. Masukkan 0,1 mL plasma kedalam tabung tadi dan tunggu sampai plasma bersuhu 37O C. 3. Tambahkan 0,1 mL Thromboplastine dan campur. 4. Kepada campuran tadi tambahkan larutan CaCl2 0,22 %. Jalankan Stop Watch tepat pada waktu larutan CaCl2 tercampur dengan plasma. 5. Biarkan selama 10 detik, kemudian dicoba apakah sudah ada fibrin dengan memancinnya berkali-kali dengan kaitan logam / ose. 6. Hentikan stop watch pada saat terdapat benang fibrin. Lamanya waktu terbentuknya benang fibrin disebut Masa Protrombin plasma. Nilai normal: 11- 15 detik.



78



BAB XXI THROMBIN TIME (TT) Prinsip : Plasma ditambah larutan Thrombin akan terjadi bekuan fibrin dan dicatat waktu pembekuannya. Tujuan : Untuk menguji faktor I dan faktor XIII Alat dan Reagensia : 1. Sentrifuge dan tabungnya. 1. Pipet tetes 2. Clinipette 3. Tabung reaksi 10 x 75 mm 4. Waterbath 37O C 5. Stop watch 6. Kaitan logam / Ose 7. Natrium Citrate 3,8 % 8. NaCl 0,9 % Bahan Pemeriksaan : darah vena dengan anticoagulant Natrium Citrat 3,8% 1 : 9 Teknik Kerja : 1. 0,2 mL plasma citrat dimasukkan kedalam tabung reaksi 2. Kemudian tambahkan 0,1 mL larutan thrombin, pada saat penambahan stopwatch dijalankan. 3. Dicatat saat terjadi bekuan awal dan dihentikan stopwatch saat terjadi bekuan sempurna. 4. Dicatat waktu dan hasilnya 5. Dilakukan juga uji ini terhadap plasma normal. Nilai Normal : - Permulaan - Sempurna



: 5 – 10 detik : 60 detik



79



BAB XXII RECALCIFIKASI TEST Prinsip : Penambahan calcium pada plasma akan mengaktifkan Protrombinase dengan merubah protrombin menjadi Trombin lalu merubah Fibrinogen menjadi Fiibrin. Tujuan : Untuk mencari adanya kekurangan faktor-faktor pembekuan darah pada jalur intrinsik (faktor V, VIII, IX, X, XI, XII, Protrombin dan Fibrinogen) dan faktor Trombosit. Alat dan Reagensia : 1. Sentrifuge dan tabungnya. 2. Pipet tetes 3. Clinipette 4. Tabung reaksi 10 x 200 mm 5. Waterbath 37O C 6. Stop watch



7. 8. 9. 10.



Kaitan logam / Ose Larutan CaCl2 0,025 % NaCl 0,9 % Natrium Citrate 3,8 %



Bahan pemeriksaan : Darah vena dengan anticoagulant natrium citrat 3,8 % kaya Trombosit dan rendah Thrombosit. Cara Kerja : B. Pembuatan Plasma kaya Trombosit 1 : 9 1. Dipipet 0,2 ml Na. Citrate 3,8 % dimasukkan ke dalam tabung. 2. Darah yang ada dalm spuit dimasukkan kedalam tabung yang berisi Na.citrate 3,8 % sebanyak 1,8 ml. 3. Dicampur dengan cara membolak-balik tabung. 4. Diputar selama 5 menit pada 1500 rpm dengan sentrifuge. 5. Plasma yang terjadi dipisahkan dan dimasukkan kedalam tabung reaksi. C. Pembuatan Plasma Miskin Trombosit 1 : 9 1. Dipipet 0,2 ml Na. Citrate 3,8 % dimasukkan ke dalam tabung. 2. Darah yang ada dalm spuit dimasukkan kedalam tabung yang berisi Na.citrate 3,8 % sebanyak 1,8 ml. 3. Dicampur dengan cara membolak-balik tabung. 4. Diputar selama 20 menit pada 3000 rpm dengan sentrifuge. 5. Plasma yang terjadi dipisahkan dan dimasukkan kedalam tabung reaksi. D. Pemeriksaan Recalcifikasi 1. Tabung yang berisi larutan CaCl2, larutan NaCl 0,85 % dan Plasma pasien diinkubasikan dalam waterbath 37O C. 2. Masukkan 0,1 ml plasma dan 0,1 ml NaCl 0,85 % pada tabung reaksi, inkubasi selama 1 menit pada 37O C. 3. Tambah 0,1 ml CaCl2 0,025 M pada suhu 37O C dan stopwatch dijalankan. Diinkubasi selama 60-80 detik. 4. Angkat tabung dari Waterbath dan diperiksa adanya bekuan tiap 1-2 detik dengan memiringkan tabung perlahan-lahan dengan latar hitam. 5. Saat terjadinya bekuan dihentikan stopwatch dan dicatat waktunya. 6. Dianjurkan menggunakan Plasma rendah trombosit Nilau Normal : 1. Plasma Kaya Trombosit : 80 – 150 detik. 2. Plasma miskin tombosit : 90 - 250 detik



80



BAB XXIII CLOT RETRACTION, KONSISTENSI DAN VOLUME CAIRAN BEKUAN Prinsip : Darah vena dimasukkan dalam tabung sentrifuge bergaris dan dibiarkan beku selama 2 jam, serum yang terjadi diukur dan dinyatakan dalam persen. Tujuan : Untuk menguji fungsi trombosit dan mengukur jumlah serum yang tertinggal dalam bekuan. Alat : 1. Tabung sentrifuge bergaris 2. Skala / penggaris 3. Lidi 4. Inkubator Bahan pemeriksaan : Darah vena tanpa anticoagulant Cara kerja : 1. Ambil kira-kira 5 mL darah dan masukkan kedalam tabung sentrifuge bergaris. Masukkan puka sebatang lidi kedalam tabung tadi. Catat volume darah. 2. Biarkan pada suhu kamar selama 2-3 jam (atau semalaman dalam lemari es). 3. Lepaskan bekuan darah dengan hati-hati dari dinding tabung, miringkan tabung dan angkatlah bekuan dari tabung dengan mengangkat lidi. 4. Catat volume serum (bersama sel yang masih tertinggal dalam tabung) yang ada dalam tabung dan dinyatakan dalam persen terhadap volume darah semula. Dilihat pula konsistensi bekuan. 5. Untuk menentukan Volume cairan bekuan ditentukan dulu nilai hemtokrit. Nilai normal :  Retraksi bekuan  Konsistensi bekuan  Volume cairan bekuan



: 40-60 % dari jumlah darah. : Kenyal : 0-20 %



81



BAB XXIV HEMATOLOGY ANALYZER



XXIV.1 PENDAHULUAN XXIV.1.1 Definisi Hematology Analyzer adalah alat yang digunakan untuk memeriksa darah lengkap dengan cara menghitung dan mengukur sel-sel darah secara otomatis berdasarkan variasi impedansi aliran listrik atau berkas cahaya terhadap sel-sel yang dilewatkan. Alat ini bekerja berdasarkan prinsip flow cytometer. Flow cytometri adalah metode pengukuran [= metri] jumlah dan sifat-sifat sel [= cyto] yang dibungkus oleh aliran cairan [= flow] melalui celah sempit. Ribuan sel dialirkan melalui celah tersebut sedemikian rupa sehingga sel dapat lewat satu per satu, kemudian dilakukan penghitungan jumlah sel dan ukurannya. Alat ini juga dapat memberikan informasi intraseluler, termasuk inti sel. XXIV.1.2 Prinsip Prinsip impedansi listrik : Berdasarkan pada variasi impedansi yang dihasilkan oleh sel-sel darah di dalam mikroaperture (celah chamber mikro), yang mana sampel darah yang diencerkan dengan elektrolit diluent / Sys DIL, akan melalui mikroaperture yang dipasangi dua elektroda pada dua sisinya (sisi vakum dan konstan) yang pada masingmasing arus listrik berjalan secara kontinyu, maka akan terjadi peningkatan resistensi listrik (impedansi) pada kedua elektroda sesuai dengan volume sel (ukuran sel) yang melewati. Impulse voltage yang dihasilkan oleh amplifier circuit ditingkatkan dan dianalisa oleh elektronik system, lalu Hemoglobin diukur dengan melisiskan Red Blood Cells (RBC) dengan Sys LYSE membentuk methemoglobin/cyanmethemoglobin dan diukur secara spektrofotometri pada panjang gelombang 550 nm pada chamber. Hasil yang didapat diprintout pada printer berupa nilai dan grafik sel. Prinsip light scattering adalah metode di mana sel dalam suatu aliran melewati celah di mana berkas cahaya difokuskan ke situ (sensing area). Apabila cahaya tersebut mengenai sel, akan dihamburkan, dipantulkan, atau dibiaskan ke semua arah. Beberapa detektor yang diletakkan pada sudut-sudut tertentu akan menangkap berkas-berkas sinar sesudah melewati sel itu. Alat yang memakai prinsip ini lazim disebut flow cytometeri. Prinsip Kombinasi Impedansi Listrik dan Light Scattering merupakan kombinasi pemeriksaan selain menggunakan teknik impedansi listrik terhadap sel, juga sel dialiri sinar yang dilewatkan melalui celah. Teknik kombinasi ini lebih baik dibandingkan kedua prinsip sebelumnya. XXIV.1.3 RBC Transducer : Di dalam transducer ini terjadi proses penghitungan RBC dan PLT. 1. 40 µL akan kembali ditambah oleh Cell Pack dengan perbandingan 1 : 25.000 2. Kemudian satu per satu sel akan dilewatkan melalui celah sempit yang disebut Aperture. 3. Sel-sel yang berukuran besar akan menimbulkan hambatan listrik yang besar dan sel-sel berukuran kecil akan menimbulkan hambatan listrik yang kecil. Hambatanhambatan ini akan menimbulkan pulsa yang akan dibaca oleh alat. Semakin besar ukuran sel, pulsa yang ditimbulkan semakin besar. 4. Saat sel satu per satu masuk, inilah terjadi pengelompokan sel. Sel-sel yang ukurannya masuk ke ukuran RBC akan langsung dianggap sebagai RBC, sedangkan yang masuk ukuran PLT akan dianggap sebagai PLT. XXIV.1.4 WBC Transducer : Dalam transducer ini terjadi proses penghitungan WBC dan DIFF (Lymph, Mixed, Gra) dan pemisahan HGB ke HGB Flow Cell (HGB Transducer). 6 µl sampel akan kembali



82



ditambah oleh Cell Pack dan Stromatolizer-WH sehingga terjadi perbandingan sampel dan reagen 1 : 500. XXIV.1.5 Hasil Background : Untuk background awal saat start up sebelum pengukuran dalam kondisi kosong harus memenuhi kriteria : - WBC ≤ 0,3 x 103 / µl - RBC ≤ 0,02 x 108 / µl - HGB ≤0,1g/dl - PLT ≤ 0,3 x 103 / µl XXIV.1.6 Parameter WBC (White Blood Count), RBC (Red Blood Count), HGB (Hemoglobin), PLT (Platelet), PCT (Plateletkrit), HCT (Hematokrit), MCH (Mean Corpuscular Hemoglobin), MCV (Mean Cell Volume), MCHC (Mean Corpuscular Hemoglobin Concentration), RDW (Red Cell Distribution Width), MPV (Mean Platelet Volume), PDW (Platelet Distribution Width), LYMP (Lymposit %), # LYMP (Lymposit Number), % GRAN (Granulocyte %), # GRAN (Granulocyte Number), % MON (Monocyte %), # MON (Monocyte Number). XXIV.2 MAINTENANCE (PERAWATAN) 1. Perawatan Harian : Shutdown dan membersihkan Trap Chamber (kosongkan jika perlu) 2. Perawatan Mingguan : Membersihkan SRV TRAY 3. Perawatan Bulanan : Membersihkan WASTE CHAMBER dan (setiap 2500 sampel) Membersihkan TRANSDUCER 4. Perawatan 3 Bulan : Membersihkan SRV (Sample Rotor Valve) (setiap 7500 sampel) 5. Perawatan Tak Berkala : AUTO RINSE (jika diperlukan) Larutan yang digunakan untuk membersihkan alat ini berupa larutan Hipoklorit alkali 5% atau setara dan larutan proteolitik berisi enzim yang menghancurkan sisa-sisa protein yang mungkin menyumbat alat dan selang-selangnya. Biasanya sudah tersedia oleh penyalur alat yang bersangkutan.



83



BAB XXV PEWARNAAN SITOKIMIA HEMATOLOGI



XXV.1 PENDAHULUAN Di laboratorium kadang dengan pewarnaan sediaan hapus darah tepi menggunakan metode Giemsa atau Wright belum memuaskan untuk membedakan seri leukosit untuk menunjang diagnosis leukemia dan kelainan leukosit, oleh sebab itu diperlukan pewarnaan sitokimia lainnya. Dalam bahasan kali ini membahas mengenai pewarnaan (pulasan) peroksidase, Sudan Black, Periodic Acid Schiff (PAS) dan Leukocyte Alkaline Phosphatase (LAP). XXV.2 PULASAN PEROKSIDASE Adakalanya membedakan jenis leukosit menemui kesukaran, teristimewa jika menghadapi sel muda atau yang abnormal. Dalam keadaan ini boleh digunakan bahwa granula dalam sel jajaran granulosit dan monosit mengandung peroksidase, sedangkan sel jajaran limfosit tidak ada. Pulasan peroksidase yang sering digunakan menurut Sato dan Sekiya. XXV.1.1 Sato dan Sekiya Larutan yang diperlukan : 1. Larutan Cupri Sulfat : CuSO4.5H2O 0,5 gram dalam 100 ml aquadest. 2. Larutan benzidine : benzidine basa 0,2 gram digerus dalam cawan porselin dalam 200 ml aqudest. Disaring dan tambahkan 0,25 ml H2O2 3% dan simpan dalam botol coklat. Tahan selama 6 bulan. 3. Larutan Safranin : safranin 1 gram dalam 100 ml aquadest. Cara : 1. Letakkan sediaan kering dan difiksasi di atas rak. 2. Genangi sediaan dengan larutan kuprisulfat selama 30 – 60 detik. 3. Buang larutan tadi dan genangi dengan larutan benzidine selama 2 menit. 4. Bilas dan warnai dengan larutan safranin selama 1 menit. 5. Bilas dan keringkan. Hasil : Plasma jajaran granulosit berwarna biru sedangkan granula berisi peroksidase akan berwarna hijau biru. Mielobast dengan hasil negatif. Monosit memiliki granula namun terlihat kecil-kecil. Limfosit tidak ada dan berwarna merah. XXV.1.2 Ellias Larutan yang digunakan : 1. Larutan Chloronaftol. Larutkan 15 mg 4-chloro-1-naftol dalam 2 ml etanol absolut, simpan suhu 4°C. 2. Buffer Tris. Larutan 19,2 ml larutan Tris-(hidroksimetil) aminometan 0,2 mol/L dicampur dengan 80,8 ml HCl 0,1 mol/L, kemudian tambahkan air sampai 500 mL. pH harus 7,4 – 7,6. 3. Larutan H2O2 segar : 0,4 mL H2O2 30% diencerkan dalam 100 mL aquadest. 4. Larutan methylgreen 1% dalam aquadest. Larutan peroksidase dibuat dengan mencampur 2 mL larutan Chloronaftol dengan 38 mL buffer Tris. Kemudian ditambahkan 1 mL H2O2. Cara : 1. Sediaan digenangi dengan reagent peroksidase selama 10 menit. 2. Bilas dengan air dan warnai dengan larutan methylgreen selama 2 menit. 3. Bilas dengan air dan keringkan. Hasil : Pulasan ini membuat granula yang peroksidase positif (+) berwarna biru tua.



84



XXV.3 PULASAN SUDAN BLACK Zat warna Sudan Black memberi warna hitam kepada granula dalam leukosit yang mengandung zat lemak. Antara sudanofilia dan reaksi peroksidase positif terhadap korelasi positif. Larutan yang diperlukan : 1. Larutan Sudan Black : 0,5 gram Sudan Black B dicampur dengan 100 mL etanol absolut. Biarkan selama 2 hari dan saring. 2. Larutan Buffer : Phenol 16 gram, etanol absolut 30 mL, Na2HPO4.12H2O 0,3 gram dan aquadest 100 mL. 3. Larutan kerja : dicampur 60 mL larutan Sudan Black dan 40 mL Buffer. Saring. Cara : 1. Sediaan direkatkan dengan uap formalin dalam wadah tertutup selama 10 menit. 2. Genangi sediaan dengan larutan kerja selama 30 menit. 3. Bilas dengan etabol absolut dan bilas dengan air. 4. Bisa juga di warnai dengan safranin 0,1 %. Hasil : Granula yang mengandung lipid/lemak akan berwarna hitam. XXV.4 PULASAN PAS (PERIODIC ACID SCHIFF) Pulasan ini berguna untuk mengenali sel-sel dalam jajaran limfosit yang mengandung glikogen. Reaksi yang terjadi adalah oksidasi glikogen oleh asam periodat (periodic acid) menjadi aldehide, lalu bereaksi dengan reagen schiff menjadi warna merah. Larutan yang diperlukan : 1. Larutan asam periodat : HIO4. 2H2O 1 gram dalam 100 mL aquadest. 2. Reagent Schiff : Basic Fuchsin 1 gram dimasukkan dalam 400 mL air mendidih, biarkan dingin sampai 50°C, saring, tambah 1 mL thionylchloride (SOCl2), simpan tempat gelap 24 jam, tambah 2 gram carbon adsorbens, kocok saring, simpan lemari es dalam botol gelap. 3. Larutan hematoksilin 2 gram dalam 100 mL aquadest. Cara : 1. Sediaan hapus direkatkan denga uap formalin dalam cawan petri selama 10 menit. 2. Bilas dengan air selama 15 menit. 3. Genangi sediaan dengan asam periodat selama 30 menit. 4. Bilas dengan aquadest, genangi dengan reagent schiff selama 30 menit. 5. Bilas dengan air, bilas dengan aquadest selama 5 menit. 6. Genangi dengan hematoksilin selama 10 menit. Hasil : Granula dalam leukosit yang berisi glikogen menjadi merah. XXV.5 PULASAN FOSFATASE ALKALIS (LAP) Adanya enzim ini dalam granula dan sitoplasma sel-sel jajaran granulosit dapat dipergunakan untuk membedakannya dari leukosit-leukosit lainnya. Hasil pulasan ini memberikan petunjuk dalam membedakan leukositosis oleh leukemia granulositik kronik dari leukositosis oleh sebab-sebab lain. Darah segar sebaiknya digunakan : kapiler, darah vena dengan antikoagulan heparin atau double oxalat. Darah EDTA tidak boleh digunakan karena mengganggu pulasan. Metode Kaplow LAP Larutan yang diperlukan : 1. Larutan perekat : formalin (40%) 10 mL, metanol absolut 90 mL. simpan dalam lemari es freezzer. Sebagian larutan diambil dan ditaruh pada suhu 5°C. 2. Larutan stok propanadiol : 2-amino-2-metil-1,3-propanadiol 10,5 gram dalam aquadest 500 mL.



85



3. Larutan kerja Buffer Proponadiol : larutan stock proponadiol 0,2 M 25 mL, larutan HCl 0,1 N 5 mL dan aquadest 100 mL dan pH harus 9,75 dan simpan dalam lemari es. 4. Larutan substrat pH 9,5 – 9,6 : natrium alfa naftil fosfat 35 mg. fast blue RR 35 mg, larutan kerja proponadiol 35 mL, saring. Larutan ini harus segar dan tidak boleh ditunda. 5. Larutan hematoksilin menurut Harris. Cara : 1. Sediaan hapus digenangi dengan larutan perekat bersuhu 5°C selama 30 detik. 2. Bilas dengan air mengalir selama 10 detik. 3. Genangi sediaan dengan larutan substrat selama 15 menit. 4. Bilas dengan air mengalir selama 10 detik. 5. Pulas tanding dengan larutan hematoksilin selama 4 menit. 6. Bilas dengan air mengalir selama 10 detik dan biarkan kering. Hasil : Adanya fosfatase alkalis dalam leukosit ditandai dengan warna coklat muda hingga hampir hitam. Penilaian : 0 : netrofil tidak berwarna coklat 1 : coklat sangat muda merata, jarang granula. 2 : coklat lebih tua merata, granula sedang jumlahnya. 3 : warna tegas dan granula banyak. 4 : warna tegas dan granula berdekatan dan warna sangat tua. Skorsing (100 leukosit) : >100 : LAP tinggi 20 – 70 : LAP normal 10 % dalam darah tepi. 2. NETROFILIA Peningkatan jumlah neutrofil dalam darah tepi lebih dari normal, ini bisa disebabkan : - Infeksi akut contoh : radang paru, pneumonia, meningitis - Infeksi lokal yang disertai dengan produksi dan penimbunan nanah - Intoksikasi, missal pada zat-zat kimia, uremia. - Selain itu ada juga Netrofilia Fisiologik yang disebabkan oleh olah raga yang berlebihan, stress, ini disebut juga Pseudonetrofilia. 3. EOSINOFILIA Peningkatan jumlah eosinofil dalam darah tepi, ditemukan pada : - Penyakit alergi (Urticaria, Asthma bronchiale). - Infeksi parasit misal pada : Schistosomiasis, Trichinosis, Cacing tambang) - Sesudah penyinaran - Hodgkin’s disease, Poli arthritis nodosa,dll - Keganasan, penyakit kulit misal Eksim 4. BASOFILIA Peningkatan jumlah basofil dalam darah, ditemukan pada : - Infeksi oleh virus (Smallpox, Chickenpox) - Kadang-kadang sesudah Spleenektomi, Anemia hemolitik kronis 5. MONOSITOSIS Peningkatan jumlah monosit dalam darah, ditemukan pada : - Infeksi Basil (TBC, Endocarditis sub akut) - Infeksi Protozoa (Malaria, dysentri amoeba kronik) - Hodgkin’s disease, Artritis Rheumatoid 6. LIMPOSITOSIS Peningkatan jumlah limposit dalam darah, ditemukan pada : - Infeksi akut (Pertusis, hepatitis, Mononucleusis infeksiosa) dan Infeksi menahun - Pada infant (bayi dan anak-anak) - Radang kronis misal Kolitis Ulseratif - Kelainan metabolic (Hipertiroidisme) 7. NEUTROPENIA Penurunan jumlah netrofil dalam darah tepi, penyebabnya : - Penyakit infeksi - Demam thypoid, Hepatitis, Influenza, campak, malaria, juga tiap jenis infeksi akut. - Bahan kimia dan fisika misal pada radiasi dan obat, Hiperspleenisme, penyakit hati. 8. LIMFOPENIA Penurunan jumlah limposit dalam darah tepi, penyebab : - Kematian kortikosteroid misalnya akibat terapi dengan obat Steroid. - Penyakit berat misal : Gagal jantung, gagal ginjal, TBC berat. 9. AGRANULOSITOSIS Menghilangnya granulosit dalam darah tepi secara mendadak pada seseorang yang sebelumnya normal. Pada agranulositosis yang umum jumlah leukosit rendah dan limposit matang merupakan satu-satunya jenis leukosit yang ada dalam darah tepi. Penyebabnya : Penyakit autoimmune, juga obat contoh obat : Antalgin dan sulfonamide 10. REAKSI LEUKEMOID



95



Leukositosis reaktif yang bukan proses keganasan (benigna) dengan sel-sel leukosit belum matang dan matang yang memasuki sirkulasi dalam jumlah berlebihan. Perbedaannya dengan Leukemia Granulositik Kronis adalah : Reaksi Leukemoid LGK Jumlah < 50.000 / mm3 > 50.000 / mm3 Basophilia Tidak ditemukan Ditemukan Skor LAP > 100 < 100 Limpa Tidak teraba Teraba Kromosom Philadephia Tidak ditemukan Ditemukan Eritrosit Anemia berat Anemia ringan Eosinofil Normal Eosinofilia Leukosit muda banyak matang banyak muda Bentuk sel Sel khas Atipik Anemia Sementara Progresif Trombosit Trombositopenia ringan Trombositopenia berat Trombositopenia Sementara Progresif Reaksi Leukemoid ada 2 macam tergantung dari jenis leukosit yang predominan : A. Reaksi Leukemoid Mieloid Yang dominan sel-sel seri myeloid, penyebabnya 3 macam : 1. Infeksi berat : Thypus Abdominalis, Pneumonia, Difteri, tuberkulosis miliaris 2. Intoksikasi : Intoksikasi Hg dan Benzol, Eklamsia, Preeklamsia, Toxemia Gravidarum dan combutio berat (luka bakar). 3. Proses Maligna : Metastasis Karsinoma, penyakit Hodgkin’s dan multipel myeloma. B. Reaksi Leukemoid Limfoid Yang predominan adalah Leukosit limposit Contoh : Pertusis (batuk rejan), Tuberculosa, Infeksi Mononukleusis, Varicella, syphilis congenita dan infeksius limfositosis. XXIX.2 MORFOLOGI YANG TIDAK NORMAL 1. GRANULA TOKSIK Didalam sitoplasma Neutrofil penderita dengan infeksi yang berat atau demam yang menyertai kerusakan jaringan sering ditemukan granula besar berwarna gelap ini disebut Granula Toksik. Granula ini diduga bukan benda inklusi atau benda yang di fagositosis tetapi granula berisi enzim yang di agregasi secara abnormal. 2. BENDA DOHLE Neutrofil pada penderita dengan infeksi berat, luka bakar, keganasan atau lisis sel yang berlebihan bisa ditemukan suatu massa yang besar yang berbentuk bulat dan berwarna biru pucat ditepi sitoplasma disebut Benda Dohle. Benda inklusi ini dapat juga dijumpai pada kehamilan. Benda inklusi itu terbentuk karena agregasi Retikulum Endoplasma. 3. BATANG AUER Mieloblast, Promielosit dan sel-sel mielomonosit pada leukemia mungkin mengandung Batang auer. Suatu benda yang berbentuk batang langsing yang berwarna merah muda atau ungu yang terbentuk dari bahan Lizosom. Batang auer dapat dipakai untuk membedakan Leukemia granulositik akut dengan Leukemia limpositik akut karena sel seri limposit tidak pernah selama hidupnya benda itu ada. 4. HIPERSEGMENTASI Kelainan metabolisme Asam Folat dan Vitamin B12 berpengaruh pada sel terutama kelainan morfologi. Diantaranya yang paling menyolok adalah Erythrosit Megaloblastik. Sel lain yang berproliferasi cepat juga mengalami gangguan perkembangan. Sel-sel seri granulosit cenderung berubah menjadi abnormal khususnya Metamielosit dalam sumsum tulang yang disebut Metamielosit raksasa / Giant Metamielosit dan netrofil dalam darah tepi mempunyai inti dengan jumlah lobus lebih dari enam disebut 96



Hypersegmentasi. Sitoplasma sel ini banyak tetapi masih menunjukkan morfologi yang normal. 5. DRUMSTICK Sel granulosit yang memiliki segmen kecil pada inti mirip stik drum. Ditemukan pada sel betina, merupakan agregasi pada kromosom. Kadang-kadang disebut juga Barr Body. XXIX.3 KELAINAN HEREDITER : 1. ANOMALI PERGER – HUET Kelainan bawaan, dimana Netrofil matang mempunyai inti dengan 2 lobus dan kromatin agak kasar tetapi fungsi sel tetap normal. Seseorang dengan kelainan sel semacam ini biasanya tetap sehat. 2. SINDROME CHEDIAK – HIGASHI Kelainan bawaan, dimana terdapat penumpukan Lizosom yang megandung berbagai enzim Hidrolase, terutama terdapat di netrofil selain ditemukan di sel epitel, sel syaraf dan Melanosit. Orang dengan sindrom ini akan rentan terhadap penyakit. 3. ANOMALI ALDER REILLY Kelainan dimana Netrofil mengandung granula berukuran besar dan berisi Polisakarida. 4. ANOMALI MAY – HEGLIN Kelainan dimana terdapat massa / benda berwarna biru / biru kemerahan yang mirip dengan benda Dohle yang terdapat pada sel Leukemia monositik.



97



BAB XXX GOLONGAN DARAH ABO



XXX.1 PENDAHULUAN XXX.1.1 Pengertian Golongan Darah sistem ABO ditemukan oleh seorang ahli Patologi Amerika kelahiran Austria bernama Karl Landsteiner pada tahun 1900. Antigen utama dalam sistem ini disebut antigen A dan B dan antibodi utama adalah anti-A dan anti-B. Gen yang menentukan ada tidaknya aktivitas A atau B terdapat pada kromosom nomor 9. Orang normal yang berumur diatas 6 bulan selalu mempunyai antibodi yang dapat bereaksi dengan antigen A atau B apabila antigen bersangkutan tidak terdapat dalam eryhtrositnya sendiri. Jika tidak terlihat sugroups maka dikenal empat golongan darah : - Golongan darah A Erythrositnya mengandung aglutinogen A dan serumnya mengandung aglutinin anti B - Golongan darah B Erythrositnya mengandung aglutinogen B dan serumnya mengandung aglutinin anti A - Golongan darah O Erythrositnya tidak mengandung aglutinogen dan serumnya mengandung aglutinin anti A dan aglutinin anti B. - Golongan darah AB Erythrositnya mengandung aglutinogen A dan aglutinogen B sedangkan serumnya tidak mengandung aglutinin. Walaupun anti-A dan anti-B bereaksi secara spesifik dan kuat dengan eryhtrosit yang relevan, rangsangan untuk pembentukan anti-A dan anti-B tidak ditimbulkan oleh eryhtrosit itu sendiri. Orang-orang dengan golongan darah A hanya membentuk anti-B dan mereka dengan golongan darah B hanya membentuk anti-A. Orang-orang dengan golongan darah O mempunyai baik anti-A maupun anti-B, sedangkan yang golongan darah AB tidak memiliki anti-A dan anti-B. Anti-A dan anti-B merupakan aglutinin yang kuat dan mudah dinyatakan dengan pemeriksaan laboratorium. Aglutinin ini dengan cepat menghancurkan eryhtrosit tidak kompatibel yang masuk dalam sirkulasi melalui aktivitas komplemen.satu-satunya cara eryhtrosit inkompatibel golongan darah ABO masuk dalam sirkulasi, melalui transfusi darah yang salah, kecuali pada beberapa kasus dimana eryhtrosit janin masuk dalam sirkulasi darah ibu pada waktu hamil atau saat melahirkan. Reaksi transfusi hemolitik pada umumnya disebabkan kesalahan dalam identifikasi penderita, kesalahan sampel darah penderita atau donor dan kesalahan administrasi. Penetapan golongan darah menentukan jenis aglutinogen yang ada dalam darah, adakalanya disamping itu juga dilakukan penetapan jenis aglutinin yang ada dalam serum (reverse grouping dan serum grouping). Ada beberapa cara untuk menentukan golongan darah yaitu dengan cara Objek glass dan cara Tabung. XXX.2 METODE PEMERIKSAAN XXX.2.1 Prinsip Darah diletakkan pada objek glass kemudian ditambahkan antiserum akan membentuk aglutinasi atau penggumpalan. Tujuan : Untuk menentukan golongan darah ABO pada seseorang Alat dan Reagensia : 1. Objek glass 4. Anti Serum anti B (kuning) 2. Lancet 5. Anti Serum anti AB (bening/merah) 3. Anti Serum anti A (biru)



98



Bahan pemeriksaan : Darah kapiler atau darah vena dengan atau tanpa anticoagulant Teknik kerja : 1. Letakkan diatas objek glass satu tetes anti serum anti A, satu tetes anti serum anti B dan satu tetes anti serum anti AB 2. Pada masing-masing tetesan anti sera tadi ditambah satu tetes darah 3. Dicampur masing-masing dan perhatikan adanya agglutinasi. 4. Aglutinasi terjadi berarti positif dan tidak terjadi aglutinasi negatif Penafsiran : Anti A Anti B Anti AB Golongan darah (-) (-) (-) O (+) (-) (+) A (-) (+) (+) B (+) (+) (+) AB A. Golongan Darah Tabung Darah vena dimasukkan dalam tabung kemudian ditambahkan anti serum akan terjadi aglutinasi atau gumpalan. Tujuan : Untuk menentukan golongan darah ABO pada seseorang Alat dan reagensia : 1. tabung reaksi 5. Serum anti A 2. Rak tabung 6. Serum anti B 3. Pipet tetes 7. NaCl 0,9 % 4. Sentrifuge Bahan pemeriksaan : Darah vena dengan atau tanpa anticoagulant Teknik kerja : A. Pembuatan suspensi erythrosit 5% 1. Kedalam tabung reaksi berukuran 12 x 75 mm dimasukkan larutan NaCl 0,9 % sebanyak 5 ml. 2. Tambahkan 5 tetes darah EDTA atau darah oxalat dan campur dengan cara menggoyangnya. 3. Putar dengan sentrifuge selama 5 menit pada kecepatan 1500 rpm 4. Cairan diatas dibuang dan endapan ditambahkan lagi larutan NaCl 0,9 % sebanyak 5 ml dan diputar lagi pada sentrifuge. 5. Pekerjaan ini berturut-turut diulangi sampai 3 kali dan pada penambahan NaCl yang keempat disebut sebagai suspensi eryhtrosit 2 % dan siap untuk digunakan pada pemeriksaan. B. Pemeriksaan golongan darah 1. Sediakan tiga buah tabung reaksi (12 x 75 mm) dalam rak tabung, tabung pertama diisi dengan setetes anti serum anti A, tabung kedua dengan setetes anti serum anti B dan tabung ketiga dengan anti serum anti AB 2. Pada masing-masing tabung tambahkan satu tetes suspensi eryhtrosit 5 % kemudian dicampur perlahan. 3. Diputar pada 1000 rpm selama 1 menit tabung tadi. 4. Goyang tabung dengan hati-hati dan perhatikan adanya aglutinasi secara makroskopis 5. Tafsiran sama dengan cara objek glass



99



Penafsiran : Anti A (-) (+) (-) (+)



Anti B (-) (-) (+) (+)



Anti AB (-) (+) (+) (+)



Golongan darah O A B AB



XXX.3 REVERSE GROUP Reverse group adalah penentuan golongan darah aglutinin berdasarkan atas antiserum yang terdapat dalam plasma/serum yang direaksikan dengan sel yang diketahui golongan darah ABO-nya. Disini yang akan ditentukan jenis aglutinin dalam serum, yang diperlukan ialah sel-sel yang diketahui golongannya (aglutinogennya). Cara ini hanya baik dipakai dengan tabung. Pemeriksaan reverse group ini bermanfaat dalam mengontrol kesalahan dalam penentuan golongan darah berdasarkan aglutinogen dan juga sebagai dasar dalam melakukan pemeriksaan reaksi crossmatch (reaksi silang serasi). XXX.4 METODE PEMERIKSAAN Prinsip : Serum dimasukkan dalam tabung kemudian ditambahkan eritrosit yang diketahui golongannya akan terjadi aglutinasi atau gumpalan. Tujuan : Untuk menentukan jenis aglutinin golongan darah ABO dalam serum pada seseorang Alat dan Reagensia : 1. Tabung reaksi dan rak tabung 5. Sel-sel golongan darah A 5% 2. Pipet tetes 6. Sel-sel golongan darah B 5% 3. Sentrifuge 4. NaCl 0,9 % Bahan pemeriksaan : Serum Teknik Kerja : 1. Buat suspensi baru dari sel golongan darah A dan sel golongan darah B dengan konsentrasi 5 % 2. Sediakan 2 buah tabung dan masing-masing diisi satu tetes serum pemeriksaan 3. Pada tabung sebelah kiri isikan golongan sel darah A 5 % satu tetes dan tabung sebelah kanan diisikan sel golongan darah B 5% satu tetes dan campur masingmasing. 4. Biarkan tabung tersebut pada suhu kamar selama 5-15 menit. 5. Putar pada sentrifuge 1000 rpm selama 1 menit 6. Goyang tabung dengan hati-hati dan perhatikan ada tidaknya aglutinasi secara makroskopis. Tafsiran hasil : Positif (+) terjadi aglutinasi Tabung A Tabung B Serum yang diperiksa golongan darah (+) (+) O (-) (+) A (+) (-) B (-) (-) AB Catatan : Suspensi sel darah merah 5 % akan memberikan hasil optimal, jika darah itu mempunyai nilai hematokrit normal maka suspensi tersebut boleh dibuat dengan mencampur 5 tetes darah dengan 3 ml larutan garam NaCl 0,9 %. 100



BAB XXXI RHESUS XXXI.2 METODE PEMERIKSAAN a. Cara dengan objek glass Prinsip : Darah diletakkan pada objek glass kemudian ditambahkan anti-Rh akan terjadi aglutinasi atau gumpalan. Tujuan : Untuk menentukan jenis Rhesus pada darah seseorang Alat dan Reagensia : 1. Objek glass 4. Anti Rhesus 2. Pipet tetes 5. Blood lancet 3. NaCl 0,9 % Bahan pemeriksaan : darah vena dengan atau tanpa anticoagulant atau darah kapiler Teknik kerja : 5. Letakkan diatas objek glass satu tetes anti Rhesus 6. Pada tetesan tadi ditambah satu tetes darah 7. Dicampur dan perhatikan adanya agglutinasi. 8. Aglutinasi terjadi berarti positif dan tidak terjadi aglutinasi negatif Tafsiran hasil : Positif (+) terjadi aglutinasi Anti Rhesus Tipe Rhesus (+) Rhesus positif atau Rh (+) (-) Rhesus negatif atau Rh (-)



Gambar 18. Hasil Aglutinasi cara objek gelas pemeriksaan Rhesus b. Cara dengan tabung Prinsip : Darah dimasukkan dalam tabung kemudian ditambahkan anti-Rh akan terjadi aglutinasi atau gumpalan. Tujuan : Untuk menentukan jenis Rhesus pada darah seseorang Alat dan Reagensia : 5. Tabung reaksi dan rak tabung 5. Anti Rhesus 6. Pipet tetes 6. Spuit & jarum 7. Sentrifuge 8. NaCl 0,9 % Bahan pemeriksaan : darah vena dengan atau tanpa anticoagulant Teknik kerja : A. Pembuatan suspensi erythrosit 5% 1. Kedalam tabung reaksi berukuran 12 x 75 mm dimasukkan larutan NaCl 0,9 % sebanyak 5 ml. 101



2. Tambahkan 5 tetes darah EDTA atau darah oxalat dan campur dengan cara menggoyangnya. 3. Putar dengan sentrifuge selama 5 menit pada kecepatan 1500 rpm 4. Cairan diatas dibuang dan endapan ditambahkan lagi larutan NaCl 0,9 % sebanyak 5 ml dan diputar lagi pada sentrifuge. 5. Pekerjaan ini berturut-turut diulangi sampai 3 kali dan pada penambahan NaCl yang keempat disebut sebagai suspensi eryhtrosit 5 % dan siap untuk digunakan pada pemeriksaan. B. Pemeriksaan golongan darah 1. Sediakan sebuah tabung reaksi (12 x 75 mm) dalam rak tabung, tabung diisi anti Rhesus 2. Di tambahkan satu tetes suspensi eryhtrosit 5 % kemudian dicampur perlahan. 3. Diputar pada 1000 rpm selama 1 menit tabung tadi. 4. Goyang tabung dengan hati-hati dan perhatikan adanya aglutinasi secara makroskopis 5. Tafsiran sama dengan cara objek glass. Tafsiran hasil : Positif (+) terjadi aglutinasi Anti Rhesus Tipe Rhesus (+) Rhesus positif atau Rh (+) (-) Rhesus negatif atau Rh (-)



HASIL PEMERIKSAAN GOLONGAN DARAH SLIDE OBJEK GELAS



102



BAB XXXII PEMERIKSAAN GOLONGAN DARAH STANDAR UDD PMI XXXII.1 METODE BIOPLATE Metode bioplate menggunakan plate plastik transparan yang telah berisi lubanglubang segi empat sebanyak 10 lubang. Cara ini lebih baik dibandingkan menggunakan metode slide. Namun suspensi test sel A, B dan O harus menggunakan konsentrasi lebih tinggi dari cara tabung yaitu 10%. Prinsip : Darah direaksikan antisera, suspensi test sel dan anti-D akan terjadi aglutinasi berupa gumpalan. Tujuan : Untuk menentukan golongan darah sistem ABO, Reverse group dan Rhesus dalam darah seseorang. Reagensia : 1. Test sera Anti-A 6. Test Sera Anti-D 2. Test Sera Anti-B 7. Bovin Albumin 6% 3. Test sel A 10 % 8. Saline 4. Test sel B 10 % 5. Test sel O 10 % Persiapan bahan pemeriksaan : 1. Plasma yang jernih 2. Sel Darah Merah suspensi 10% dalam plasma sendiri 3. Sel Darah Merah suspensi 40% dalam plasma sendiri Alat : 1. Sentrifuge 2. Plate (Bio plate) 3. Tabung reaksi uk 10x75 mm 4. Pipet plastik 1 ml Persiapan Reagensia : 1. Biarkan reagensia pada suhu kamar 2. Catat bacth no. ( lot. No) dan tanggal kadaluarsa Cara Kerja : 1. Siapkan plate beri label 2. Pada sumur no 1 teteskan anti-A sebanyak 1 tetes 3. Pada sumur no 2 teteskan anti-B sebanyak 1 1 tetes 4. pada sumur no 3 teteskan test sel A 10% sebanyak 1 1 tetes 5. Pada sumur no 4 teteskan test sel B 10 % sebanyak 1 1 tetes 6. Pada sumur no 5 teteskan test sel O 10% sebanyak 1 1 tetes 7. Pada sumur no 6 lihat insruksi kerja no 10 & no 12 8. Pada sumur no 7 teteskan anti-D sebanyak 1 1 tetes 9. Pada sumur no 8 teteskan bovin albumin 6% sebanyak 1 tts 10. Pada sumur no 3,4,5,6 masing-masing teteskan 2 1 tetes plasma donor 11. Suspensikan sel darah merah menjadi 10% dalam plasma sendiri, kemudian 12. Pada sumur no 1,2,6, masing-masing teteskan 1 1 tetes suspensi sel 13. Suspensikan sel darah merah menjadi 40% dalam plasma sendiri, kemudian 14. Pada sumur no 7,8 masing-masing teteskan 1 1 tetes suspensi sel 40% 15. Campurkan dengan cara menggoyangkan bioplate kedepan dan kebelakang hingga tercampur rata ± 2 menit, lalu baca reaksi. Derajat Aglutinasi hasil : ♦ ++++ (4+) : Gumpalan besar dengan cairan jernih disekitarnya ♦ +++ (3+) : Sebagian sel bergumpal besar dengan cairan jernih disekitarnya ♦ ++ (2+) : Gumpalan agak besar,dengan cairan agak merah disekitarnya ♦ + (1+) : Gumpalan kecil, dengan cairan merah disekitarnya 103



♦ ± (+w) : Gumpalan tidak terlihat jelas harus dengan bantuan mikroskop ♦ Lisis : Suspensi Sel darah berwarna merah jernih ♦ - /o (Negatip) : Tersuspensi/homogen Interpretasi Hasil : Nomor



1 2 3 4 5 6 8 9 10 11 12 13



Keterangan : No.1 s/d 4 No.5 s/d 12 No. 5,6 No.8 No.9 No.10 No.11 No.12.dan 13



Sel Grouping Anti-A Anti-B 3+ 3+ 2+ m.f.+ m.f.+ + 2+ -



3+ 3+ + -



Serum Grouping Sel A Sel B Sel O 2+ 2+ + + 2+ 3+ 2+ -



2+ 2+ 2+ 2+ 2+ 3+ 3+ 2+ -



2+ 3+ 2+ -



Gol.Darah Auto Kontrol +/s + -



A B O AB Subgroup A Subgroup A3 Bukan O Oh Mix ? A? O bayi



Hasil pemeriksaan lazim dijumpai sesuai dengan hukum Landstainer Tampak adanya penyimpangan Perlu dilengkapi sel grouping dengan anti-A1 Perlu dilengkapi pemeriksaan subtance dalam saliva Perlu dilengkapi sel grouping dengan anti-H Darah penderita post transfusi lain golongan Darah penderita yang mengandung Cold Auto Agglutinin golongan darah belum dapat ditetapkan Tidak ada regular antibodi, reaksi ini dapat terjadi pada darah bayi, darah orang hypogammaglobulinanemia, orang yang sangat lanjut usia



Pada Sistem ABO 1. Bila terjadi agglutinasi pada anti-A dan test sel –B maka golongan darah pasien adalah A 2. Bila terjadi agglutinasi pada anti- B dan test sel A maka golongan darah pasien adalah B 3. Bila terjadi agglutinasi pada anti-A dan anti-B, dan tidak terjadi agglutinasi pada test sel A1, test sel B maka golongan darah pasien adalah AB 4. Bila tidak terjadi agglutinasi pada anti-A, anti-B dan terjagi agglutinasi pada test sel-A, test sel B maka golongan darah pasien adalah O 5. Test sel O dan Auto kontrol harus negatip 6. Bila terjadi agglutinasi pada test sel O, diduga pasien adalah golongan darah Bombay ?, atau ada antibodi lain ?, lanjutkan pemeriksaan Pada Rhesus faktor 1. Bila terjadi agglutinasi pada anti-D maka golongan darah pasien adalah Rhesus positip (Rh.D+) 2. Bila tidak terjadi agglutinasi pada anti-D maka golongan darah pasien adalah Rhesus Negatip (Rh. Negatif)



104



Identitas donor



Anti-A



Anti-B



Test sel A 10%



Test sel B 10%



Test sel O 10%



Auto ktrl



Anti-D



B.A 6%



K E S



Peme riksa



Dicek oleh



Keterangan : Beri nama identitas pasien pada kolom 1, kolom 2-9 diberikan tanda hasil positif negatif sesuai aglutinasi yang terjadi, kolom 10 menyimpulkan golongan darah yang diperiksa dan kolom 11 dan 12 diparaf oleh petugas.



105



Lembar Checklist Pemeriksaan Identitas donor



Sel Grouping 1 tts sdm 10% + 1 tts Anti-A



1 tts sdm 10% + 1 tts Anti-B



Serum Grouping 2 tts. Serum + Test sel A 10%



2 tts. Serum + Test sel B 10%



2 tts. Serum + Test sel O 10%



Auto kontrol 2 tts. serum + 1 tts. Sdm 10%



Rhesus 1 tts sdm 40% + 1 tts Anti-D



Jam



1 tts sdm 40% + 1tts B.Alb. 6%



Angkat plate , goyang kedepan dan kebelakang hingga merata seluruh lobang Goyang-goyang sambil perhatikan reaksi  Baca reaksi tidak lebih 2 menit



Nama pemeriksa Tanggal Pemeriksaan Test Sera Test Sera Test Sera Test Sera Test sel A Test sel B Test sel O



: : : : : : : : :



Dicek oleh Penanggung jawab



: :



Validasi



:



XXXII.2 METODE TABUNG Metode tabung merupakan metode pilihan terbaik dibandingkan metode slide dan bioplate. Metode ini lebih sensitif dan spesifik, karena dapat mendeteksi golongan darah dengan tingkat aglutinasi yang lebih lemah. Reagensia 1. 2. 3. 4. 5.



: Test sera Anti-A Test Sera Anti-B Test sel A 5 % Test sel B 5 % Test sel O 5 %



6. Test Sera Anti-D 7. Bovin Albumin 6% 8. Saline



106



Alat 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. 10.



: Serosentrifuge Mikroskop Alat penghitung waktu (Timer) Rak tabung Tabung reaksi uk. 12x75mm Pipet plastik 1 ml Labu semprot Object glass Gelas pembilas Wadah limbah



Persiapan Reagensia : 1. Biarkan reagen pada suhu kamar 2. Catat batch no.(lot no.) dan tanggal kadaluarsa Cara Kerja : 1. Siapkan tabung sebanyak 8 buah pada sebuah rak • Beri label tabung 1 : -A • Beri label tabung 2 : -B • Beri label tabung 3 : EA • Beri label tabung 4 : EB • Beri label tabung 5 : EO • Beri label tabung 6 : AK • Beri label tabung 7 : –D • Beri label tabung 8 : B.Alb 2. Isi masing – masing tabung dengan : • tabung 1 : 1 tetes anti-A • tabung 2 : 1 tetes anti-B • tabung 3 : 1 tetes test sel A 5% • tabung 4 : 1 tetes test sel B 5% • tabung 5 : 1 tetes test sel O 5% • tabung 6 : lihat no.3 & no.4 • tabung 7 : 1 tetes anti –D • tabung 8 : 2 tetes Bovine albumine 6% 3. Teteskan masing-masing 1 (satu) tetes sel darah merah pasien suspensi 5% pada tabung : 1, 2, 6, 7, 8 4. Teteskan masing-masing 2 tetes serum/plasma pasien pada tabung : 3, 4,5,6 5. Kocok-kocok semua tabung hingga tercampur 6. Putar 3000 rpm selama 15”-20” / inkubasi pada suhu kamar selama 60’ Pembacaan Hasil : 1. Baca reaksi dengan cara mengocok tabung perlahan-lahan 2. Bila pada Sel darah merah pasien terjadi : • Agglutinasi : ada antigen padasel darah merah • Tidak terjadi agglutinasi : Tidak ada antigen pada sel darah merah 3. Bila dalam serum/plasma pasien terjadi : • Agglutinasi : ada antibodi dalam serum / plasma • Tidak terjadi agglutinasi : tidak ada antibodi dalam serum/plasma



107



Derajat Aglutinasi hasil : ♦ ++++ (4+) : Gumpalan besar dengan cairan jernih disekitarnya ♦ +++ (3+) : Sebagian sel bergumpal besar dengan cairan jernih disekitarnya ♦ ++ (2+) : Gumpalan agak besar,dengan cairan agak merah disekitarnya ♦ + (1+) : Gumpalan kecil, dengan cairan merah disekitarnya ♦ ± (+w) : Gumpalan tidak terlihat jelas harus dengan bantuan mikroskop ♦ Lisis : Suspensi Sel darah berwarna merah jernih ♦ - /o (Negatip) : Tersuspensi/homogen Interpretasi Hasil : Nomor



1 2 3 4 5 6 8 9 10 11 12 13



Keterangan : No.1 s/d 4 No.5 s/d 12 No. 5,6 No.8 No.9 No.10 No.11 No.12.dan 13



Sel Grouping Anti-A Anti-B 3+ 3+ 2+ m.f.+ m.f.+ + 2+ -



3+ 3+ + -



Serum Grouping Sel A Sel B Sel O 2+ 2+ + + 2+ 3+ 2+ -



2+ 2+ 2+ 2+ 2+ 3+ 3+ 2+ -



2+ 3+ 2+ -



Gol.Darah Auto Kontrol +/s + -



A B O AB Subgroup A Subgroup A3 Bukan O Oh Mix ? A? O bayi



Hasil pemeriksaan lazim dijumpai sesuai dengan hukum Landstainer Tampak adanya penyimpangan Perlu dilengkapi sel grouping dengan anti-A1 Perlu dilengkapi pemeriksaan subtance dalam saliva Perlu dilengkapi sel grouping dengan anti-H Darah penderita post transfusi lain golongan Darah penderita yang mengandung Cold Auto Agglutinin golongan darah belum dapat ditetapkan Tidak ada regular antibodi, reaksi ini dapat terjadi pada darah bayi, darah orang hypogammaglobulinanemia, orang yang sangat lanjut usia



Pada Sistem ABO 7. Bila terjadi agglutinasi pada anti-A dan test sel –B maka golongan darah pasien adalah A 8. Bila terjadi agglutinasi pada anti- B dan test sel A maka golongan darah pasien adalah B 9. Bila terjadi agglutinasi pada anti-A dan anti-B, dan tidak terjadi agglutinasi pada test sel A1, test sel B maka golongan darah pasien adalah AB 10. Bila tidak terjadi agglutinasi pada anti-A, anti-B dan terjagi agglutinasi pada test sel-A, test sel B maka golongan darah pasien adalah O 11. Test sel O dan Auto kontrol harus negatip 12. Bila terjadi agglutinasi pada test sel O, diduga pasien adalah golongan darah Bombay ?, atau ada antibodi lain ?, lanjutkan pemeriksaan



108



Pada Rhesus faktor 3. Bila terjadi agglutinasi pada anti-D maka golongan darah pasien adalah Rhesus positip (Rh.D+) 4. Bila tidak terjadi agglutinasi pada anti-D maka golongan darah pasien adalah Rhesus Negatip (Rh. Negatif)



Tube Test Identitas donor



Anti-A



Anti-B



Test sel A 10%



Test sel B 10%



Test sel O 10%



Auto ktrl



Anti-D



B.A 6%



K E S



Peme riksa



Dicek oleh



Keterangan : Beri nama identitas pasien pada kolom 1, kolom 2-9 diberikan tanda hasil positif negatif sesuai aglutinasi yang terjadi, kolom 10 menyimpulkan golongan darah yang diperiksa dan kolom 11 dan 12 diparaf oleh petugas.



109



Lembar Checklist Pemeriksaan Identitas donor



Sel Grouping 1 tts sdm 5% + 1 tts Anti-A



1 tts sdm 5% + 1 tts Anti-B



Serum Grouping 2 tts. Serum + Test sel A 5%



2 tts. Serum + Test sel B 5%



2 tts. Serum + Test sel O 5%



Auto kontrol 2 tts. serum + 1 tts. Sdm 5%



Rhesus 1 tts sdm 40% + 1 tts Anti-D



1 tts sdm 40% + 1tts B.Alb. 6%



Angkat plate , goyang kedepan dan kebelakang hingga merata seluruh lobang Goyang-goyang sambil perhatikan reaksi  Baca reaksi tidak lebih 2 menit



Nama pemeriksa Tanggal Pemeriksaan Test Sera Test Sera Test Sera Test Sera Test sel A Test sel B Test sel O



: : : : : : : : :



Dicek oleh Penanggung jawab



: :



Validasi



110



:



Jam



HASIL REAKSI AGLUTINASI ANTARA SEL ERITROSIT DAN SERUM Positif ++++ (+4)



Positif +++ (+3)



Positif +++ (+3)



Positif +++ (+3)



Positif +++ (+3)



Positif ++ (+2)



Positif ++ (+2)



Positif ++ (+2)



Positif + (+1) / Positif ++ lemah



Positif + (+1)



111



Positif + (+1)



Negatif (-) / Hemolisis



Negatif (-) / Hemolisis



Negatif (-) / Hemolisis



112



BAB XXXIII REAKSI SILANG SERASI (CROSSMATCH) XXXII.1 PENDAHULUAN XXXII.1.1 Pengertian Reaksi silang perlu dilakukan sebelum melakukan transfusi darah untuk melihat apakah darah penderita sesuai dengan darah donor. Mayor crossmatch adalah serum penerima dicampur dengan sel donor dan Minor Crossmatch adalah serum donor dicampur dengan sel penerima. Jika golongan darah ABO penerima dan donor sama, baik mayor maupun minor test tidak bereaksi. Jika berlainan umpamanya donor golongan darah O dan penerima golongan darah A maka pada test minor akan terjadi aglutinasi. Mayor Crossmatch merupakan tindakan terakhir untuk melindungi keselamatan penerima darah dan sebaiknya dilakukan demikian sehingga Complete Antibodies maupun incomplete Antibodies dapat ditemukan dengan cara tabung saja. Cara dengan objek glass kurang menjaminkan hasil percobaan. Reaksi silang yang dilakukan hanya pada suhu kamar saja tidak dapat mengesampingkan aglutinin Rh yang hanya bereaksi pada suhu 37OC. Lagi pula untuk menentukan anti Rh sebaiknya digunakan cara Crossmatch dengan high protein methode. Ada beberapa cara untuk menentukan reaksi silang yaitu reaksi silang dalam larutan garam faal dan reaksi silang pada objek glass. Serum antiglobulin meningkatkan sensitivitas pengujian in vitro. Antibodi kelas IgM yang kuat biasanya menggumpalkan eritrosit yang mengandung antigen yang relevam secara nyata, tetapi antibodi yang lemah sulit dideteksi. Banyak antibodi kelas IgG yang tak mampu menggumpalkan eritrosit walaupun antibodi itu kuat. Semua pengujian antibodi termasuk uji silang tahap pertama menggunakan cara sentrifugasi serum dengan eritrosit. Sel dan serum kemudian diinkubasi selama 15-30 menit untuk memberi kesempatan antibodi melekat pada permukaan sel, lalu ditambahkan serum antiglobulin dan bila pendertita mengandung antibodi dengan eritrosit donor maka terjadi gumpalan. Uji saring terhadap antibodi penting bukan hanya pada transfusi tetapi juga ibu hamil yang kemungkinan terkena penyakit hemolitik pada bayi baru lahir. Pemeriksaan Crossmatch di UTD dan BDRS saat ini menggunakan metode gel dalam cup kecil yang lebih mudah dan praktis, metode ini telah menggantikan metode tabung yang lebih sulit dan memerlukan banyak peralatan untuk pemeriksaan. Namun begitu metode tabung yang saat ini telah menggunakan teknik yang lebih ketat yaitu menggunakan beberapa fase pemeriksaan dan medium pemeriksaan yang lebih banyak, misal menggunakan bovine albumin, serum coombs dan inkubasi pada suhu 37°C yang akan menambah sensitivitas pemeriksaan. XXXII.2 METODE PEMERIKSAAN XXXII.2.1 Reaksi Silang dalam Tabung Prinsip : Sel donor dicampur dengan serum penerima (Mayor Crossmatch) dan sel penerima dicampur dengan serum donor dalam bovine albumin 20% akan terjadi aglutinasi atau gumpalan dan hemolisis bila golongan darah tidak cocok. Tujuan : untuk menentukan cocok tidaknya darah donor dengan darah penerima untuk persiapan transfusi darah. Alat dan Reagensia : 1. Tabung reaksi 5. Bovine albumin20% 2. Pipet tetes 6. Mikroskop 3. Sentrifuge 7. NaCl 0,9 % 4. Tabung sentrifuge 8. Serum Coombs Bahan Pemeriksaan : Serum dan Eryhtrosit 5 %



113



Teknik Kerja : a. Pembuatan suspensi Eryhtrosit 5 % 1. Kedalam tabung 12 x 75 mm diisi dengan larutan NaCl 0,9 % sebanyak 5 ml. 2. Tambahkan 5 tetes darah EDTA dan campur. 3. Putar pada sentrifuge pada 1500 rpm selama 5 menit. 4. Cairan dibuang dan pada endapan ditambahkan larutan NaCl 0,9 % sebanyak 5 ml. Campur dan putar lagi, ulangi langkah tadi sebanyak 3 kali. 5. Terakhir pada penambahan NaCl 0,9 % yang ke-4 kalinya sebanyak 5 ml merupakan suspensi eryhtrosit 5 %. b. Pemeriksaan reaksi silang fase I 1. Sediakan dua buah tabung reaksi kecil dalam rak, yang sebelah kiri untuk mayor test dan sebelah kanan untuk minor test. 2. Tabung kiri diisi dengan 2 tetes serum penerima dan 2 tetes suspensi erythrosit donor 5 % dalam larutan NaCl 0,9 % dan 2 tetes bovine albumin 20%. 3. Tabung kanan diisi dengan 2 tetes serum donor dan 2 tetes suspensi erythrosit penerima 5 % dalam larutan NaCl 0,9 % 2 tetes bovine albumin 20%. 4. Masing-masing tabung dicampur dan diputar disentrifuge pada 1000 rpm selama 1 menit. 5. Goyangkan hati-hati dan periksa adanya aglutinasi dan hemolisis. 6. Bila hasil Mayor dan minor negatif, pemeriksaan dilanjutkan ke fase II 7. Bila hasil Mayor dan minor positif, pemeriksaan tidak dilanjutkan (tidak cocok) c. Crossmatch Fase II 1. Tabung tadi diinkubasi pada suhu 370C selama 15 menit 2. Putar selama 1 menit pada 1000 rpm disentrifuge. 3. Baca adanya aglutinasi dan hemolisis dengan menggoyang perlahan-lahan sama dengan fase I, bila negatif dilanjutkan ke fase III d. Crossmatch Fase III 1. Sel darah merah dicuci dengan NaCl 0,9% 3-4 kali 2. Tambahkan 2 tetes serum Coombs pada kedua tabung mayor dan Minor test. 3. Putar pada sentrifuge 1000 rpm selama 1 menit. 4. Baca adanya aglutinasi dan hemolisis dengan menggoyang perlahan-lahan sama dengan fase I secara makroskopis. Penafsiran :  Bila aglutinasi dan hemolisis negatif (-) maka darah dapat ditransfusikan  Bila aglutinasi dan hemolisis positif (+) maka darah tidak dapat ditransfusikan (tidak cocok) XXXII.2.2 Reaksi Silang Standar BDRS-UDD Prinsip : Sel donor dicampur dengan serum penerima (Mayor Crossmatch) dan sel penerima dicampur dengan serum donor dalam bovine albumin 20% akan terjadi aglutinasi atau gumpalan dan hemolisis bila golongan darah tidak cocok. Tujuan : untuk menentukan cocok tidaknya darah donor dengan darah penerima untuk persiapan transfusi darah. Alat dan Reagensia : 1. Tabung reaksi 5. Bovine albumin20% 2. Pipet tetes 6. Mikroskop 3. Sentrifuge 7. NaCl 0,9 % 4. Tabung sentrifuge 8. Serum Coombs Bahan Pemeriksaan : Serum dan Eryhtrosit 5 % 114



Teknik Kerja : 1. Memisahkan serum/plasma bebas eritrosit. a. Darah dalam tabung 1-5 ml disentrifuge 3000 rpm selama 2 menit. b. Pisahkan serum/plasma dari eritrosit ke tabung lain yang diberi label “serum”. c. Beri label “serum donor” dan “serum penerima”. d. Didapatkan = serum/plasma bebas eritrosit 2. Eritrosit Pekat 100% a. Sisa eritrosit dipipet 8 tetes ke dalam tabung, tambahkan NaCl 0,9% 5 ml b. Kocok dengan pipet tetes dan sentrifuge 3000 rpm selama 2 menit. c. Buang cairan dengan pipet tetes sampai habis cairan (pekat). d. Ulangi pencucian sebanyak 2 kali, buang supernatan hingga cairan pekat (100%) e. Didapatkan = eritrosit pekat 100% 3. Suspensi eritrosit Pasien 5% a. Siapkan tabung reaksi dan diberi tanda sesuai sampel b. Masukkan 1 tetes eritrosit pekat 100% + 19 tetes NaCl 0,9% (perbandingan 1+19), Kocok c. Didapatkan = eritrosit 5% 4. Pembuatan Test Sel A 5% a. Disiapkan darah golongan darah A. b. Dibuang plasma dengan pipet tetes hingga bersih. c. Di tambahkan NaCl hingga ¾ bagian tabung. d. Dikocok dengan pipet tetes dan sentrifuge 3000 rpm selama 2 menit. e. Buang cairan dengan pipet tetes sampai habis cairan (pekat). f. Ulangi pencucian sebanyak 2 kali, buang supernatan hingga cairan pekat (100%). g. Diambil sebanyak 5 tetes dipindahkan ke botol dan di tambah 95 tetes larutan Alserver. Kocok hingga tercampur merata. 5. Pembuatan Test Sel B 5% a. Disiapkan darah golongan darah B. b. Dibuang plasma dengan pipet tetes hingga bersih. c. Di tambahkan NaCl hingga ¾ bagian tabung. d. Dikocok dengan pipet tetes dan sentrifuge 3000 rpm selama 2 menit. e. Buang cairan dengan pipet tetes sampai habis cairan (pekat). f. Ulangi pencucian sebanyak 2 kali, buang supernatan hingga cairan pekat (100%). g. Diambil sebanyak 5 tetes dipindahkan ke botol dan di tambah 95 tetes larutan Alserver. Kocok hingga tercampur merata. 6. Pembuatan Test Sel O 5% a. Disiapkan darah golongan darah A. b. Dibuang plasma dengan pipet tetes hingga bersih. c. Di tambahkan NaCl hingga ¾ bagian tabung. d. Dikocok dengan pipet tetes dan sentrifuge 3000 rpm selama 2 menit. e. Buang cairan dengan pipet tetes sampai habis cairan (pekat). f. Ulangi pencucian sebanyak 2 kali, buang supernatan hingga cairan pekat (100%). g. Diambil sebanyak 5 tetes dipindahkan ke botol dan di tambah 95 tetes larutan Alserver. Kocok hingga tercampur merata. 7. Pembuatan Reagent Coombs Control Cell (CCC) a. Disiapkan darah golongan darah O rhesus positif (+). b. Dibuang plasma hingga menjadi sel darah merah pekat 100%. c. Diencerkan dengan larutan saline hingga menjadi konsentrasi 50%. 115



d. Ke dalam tabung reaksi dimasukkan 3 tetes anti-D IgG dan 45 tetes saline (NaCl 0,9%), kocok. e. Tambahkan 24 tetes sel darah merah golongan O Rhesus positif suspensi 50%, kocok hingga homogen. f. Inkubasi selama 30 menit pada suhu 37°C dalam inkubator. g. Lakukan pencucian dengan menambahkan NaCl hingga ¾ bagian tabung. h. Dikocok dengan pipet tetes dan sentrifuge 3000 rpm selama 2 menit. i. Buang cairan dengan pipet tetes sampai habis cairan (pekat). j. Ulangi pencucian sebanyak 2 kali, buang supernatan hingga cairan pekat (100%). k. Diambil sebanyak 5 tetes dipindahkan ke botol dan di tambah 95 tetes larutan Alserver. Kocok hingga tercampur merata. 8. Pemeriksaan Golongan Darah ABO dan Rhesus a. Lakukan pemeriksaan golongan darah ABO dan Rhesus menggunakan cara tabung. b. Baca hasilnya. 9. Reaksi Silang Serasi ( 1 Donor) a. Phase I (Suhu kamar dan Medium NaCl 0,9%) - Siapkan 3 tabung reaksi kecil. - Tabung I (Mayor Test) : 2 tetes serum pasien + 1 tetes sel donor 5% - Tabung II (Minor Test) : 2 tetes plasma donor + 1 tetes sel pasien 5% - Tabung III (Kontrol) : 2 tetes serum pasien + 1 tetes sel pasien 5% - Kocok dan sentrifuge 3000 rpm selama 15 menit. - Baca hasil hemolisis dan aglutinasi - Bila positif : tidak cocok dan diganti dengan darah donor lain. - Bila tidak ada (-), dilanjutkan ke Phase II b. Phase II (Bovine Albumin 22% dan suhu 37°C) - Tambahkan 2 tetes Bovine Albumin 22% dan kocok. - Inkubasi 37°C selama 15 menit dan sentrifuge 3000 rpm 15 detik. - Baca hasil aglutinasi dan hemolisis. - Bila hasil positif : ulangi pemeriksaan dengan donor lain - Bila hasil negatif, lanjut ke Phase III c. Phase III (AHG) - Cuci eritrosit dalam tabung 3 kali (atau pakai eritrosit untuk AHG yang sudah dicuci) - Tambahkan 1 tetes Coombs serum pada masing-masing tabung. - Kocok dan sentrifuge 3000 rpm 15 detik. - Baca hasilnya secara makroskopik dan mikroskopik. - Hasil : (+) Aglutinasi, tidak cocok - Hasil : (-), cocok, lanjutkan ke CCC d. Test Coombs Control Cells (CCC) - Tambahkan 1 tetes CCC dan kocok - Sentrifuge 3000 rpm selama 15 detik - Baca hasil aglutinasi secara makroskopik - Aglutinasi : Hasil pemeriksaan benar - Tidak Aglutinasi : Hasil pemeriksaan salah 10. Reaksi Silang Serasi ( lebih dari 1 donor) a. Phase I (Suhu kamar dan Medium NaCl 0,9%) - Siapkan tabung 6 buah. - Tabung I (Mayor I) : 2 tetes serum pasien + 1 tetes sel donor I 5% 116



-



Tabung II (Mayor II) : 2 tetes serum pasien + 1 tetes sel donor II 5% Tabung III (Mayor III) : 2 tetes serum pasien + 1 tetes sel donor III 5% Tabung IV (Minor I) : 2 tetes plasma donor I + 1 tetes sel pasien 5% Tabung V (Minor II) : 2 tetes plasma donor II + 1 tetes sel pasien 5% Tabung VI (Minor III) : 2 tetes plasma donor III + 1 tetes sel pasien 5% Tabung VII (Kontrol) : 2 tetes serum pasien + 1 tetes sel pasien 5% Tabung VIII (Pool) : 2 tetes pool plasma donor I, II, III + 1 tetes pool sel donor I, II, III 5% Kocok dan sentrifuge 3000 rpm 15 menit. Baca : aglutinasi dan hemolisis



b. Phase II (Bovine Albumin 22% dan suhu 37°C) - Tambahkan masing-masing 2 tetes Bovine Albumin 22% dan kocok. - Inkubasi 37°C selama 15 menit dan sentrifuge 3000 rpm 15 detik. - Baca hasil aglutinasi dan hemolisis. - Bila hasil positif : ulangi pemeriksaan dengan donor lain - Bila hasil negatif, lanjut ke Phase III c. Phase III (AHG = Anti Human Globulin) - Cuci eritrosit dalam tabung 3 kali (atau pakai eritrosit untuk AHG yang sudah dicuci) - Tambahkan 1 tetes Coombs serum pada masing-masing tabung. - Kocok dan sentrifuge 3000 rpm 15 detik. - Baca hasilnya secara makroskopik dan mikroskopik. - Hasil : (+) Aglutinasi, tidak cocok - Hasil : (-), cocok, lanjutkan ke CCC d. Test Coombs Control Cells (CCC) - Tambahkan 1 tetes CCC dan kocok - Sentrifuge 3000 rpm selama 15 detik - Baca hasil aglutinasi secara makroskopik - Aglutinasi : Hasil pemeriksaan benar - Tidak Aglutinasi : Hasil pemeriksaan salah Mayor test : sel donor dicampur dengan serum penerima Mayor test Serum penerima Serum gol. Darah A Serum gol. Darah B Serum gol. Darah O Serum gol. Darah AB



Sel donor Gol.darah A (-) (+) (+) (-)



Sel donor Gol. Darah B (+) (-) (+) (-)



Sel donor Gol. Darah O (-) (-) (-) (-)



Sel donor Gol. Darah AB (+) (+) (+) (-)



Minor test : sel penerima dicampur dengan serum donor Minor test Serum donor Serum gol. Darah A Serum gol. Darah B Serum gol. Darah O Serum gol. Darah AB



Sel penerima Gol.darah A (-) (+) (+) (-)



Sel penerima Gol. Darah B (+) (-) (+) (-)



117



Sel penerima Gol. Darah O (-) (-) (-) (-)



Sel penerima Gol. Darah AB (+) (+) (+) (-)



Pemeriksaan Uji Cocok Serasi



Fase



Mayor I



Mayor II



Mayor III



2 tts serum Os



2 tts serum Os



2 tts serum Os



1 tts sel dnI 5%



I



Fase



2 tts B. Alb 22%



II



2 tts AHG Fase III



Minor I



Minor II



Minor III



Auto Kontrol 2 tts serum Os



2 tts 2 tts 2 tts plasma plasma plasma donor I donor II donor III 1 tts sel 1 tts sel 1 tts sel 1 tts sel 1 tts sel 1 tts sel dn.II 5% dn III 5% Os 5% Os 5% Os 5% Os 5% Kocok—kocok hingga tercampur rata Putar 3000 rpm selama 15 – 20 detik  baca reaksi 2 tts 2 tts 2 tts 2 tts 2 tts 2 tts B. Alb B. Alb B. Alb B. Alb B. Alb B. Alb 22% 22% 22% 22% 22% 22% Kocok-kocok hingga tercampur rata, inkubasi 37 °C selama 15 menit Putar 3000 rpm selama 15 – 20 detik  baca reaksi Cuci dengan saline sebanyak 3 x 2 tts AHG 2 tts AHG 2 tts 2 tts 2 tts 2 tts AHG AHG AHG AHG Kocok-kocok hingga tercampur rata Putar 3000 rpm selama 15 – 20 detik  baca reaksi



Auto pool



Jam



2 tts pool plasma donor 1 tts pool sel dn5%



2 tts B. Alb 22%



2 tts AHG



Bila Hasil Negatip  Tambahkan 1tetes CCC, kocok-2 Putar 3000 rpm 15-20 detik  Baca reaksi



Nama pemeriksa : Tanggal : No. Lot /ED Test Sera A : No. Lot /ED Test Sera B : No. Lot /ED Test Sera D : No. Lot /ED B. Albumin : No.Lot .A.H.G. : Dicek oleh



Validasi



:



Test sera : Test sera : Test sera : Test sera : A. H. G. : Penanggung jawab :



:



Test sel A : Test sel B : Test sel O : C.C.C :



Pemeriksaan Uji Cocok serasi Identitas Pasien



Fase



My. I



My. II



My. III



Mn I



Mn II



I



II



III



CCC



118



Mn III



A. K



Auto. Pool



Kesimpulan



Pe me riksa



Di cek oleh



BAB XXXIV UJI COOMBS XXXIII.1 PENDAHULUAN XXXIII.1.1 Pengertian Molekul imunoglobulin sendiri bersifat antigenik bila dimasukkan kedalam tubuh spesies lain. Pada tahun 1945, Coombs, Mourant dan Race menyuntikkan serum manusia kepada kelinci. Antiserum yang dihasilkan ternyata berguna sekali sebagai reagent laboratorium. Percobaan Coombs mencari adanya antiglobulin. Jika semacam anti zat yang melekat pada eritrosit yang mengandung antigen maka anti zat yang spesifik terhadap antigen itu mungkin menyebabkan aglutinasi. Ada beberapa macam zat anti yang tidak menyebabkan aglutinasi, biarpun anti zat itu melekat pada eritrosit. Beberapa jenis anti zat pada konsentrasi tinggi melapisi eritrosit tetapi tidak dapat mengaglutinasikannya dalam lingkungan saline anti zat itu disebut anti zat penghalang (blocking antibodies) atau anti zat tak lengkap (incomplete) anti zat semacam itu disebut globulin. Hewan percobaan yang disuntik dengan human globulin menyusun anti terhadap globulin tersebut. Jika anti serum tadi (serum Coombs) dicampur dengan eritrosit yang terlapisi anti zat maka akan terjadi aglutinasi. Sebelum test ini dilakukan eritrosit dicuci bersih terlebih dahulu. Percobaan Coombs terbagi dua macam yaitu cara langsung dan tak langsung. Adanya eryhtrosit yang dilapisi globulin selalu merupakan hal yang abnormal. Bila reagent antiglobulin polispesifik menyebabkan aglutinasi eritrosit, perlu dilakukan pengujian dengan reagent monospesifik. Prosedur pengujian bagi antibodi yang sulit dideteksi dan tidak mampu menggumpalkan eritrosit dengan cara melewatkan reaksi silang dalam saline, yang mana serum dan sel diinkubasi selama 15 – 30 menit untuk memberikan kesempatan antibodi melekat pada permukaan sel. Setelah protein bereaksi dan dicuci selnya, dengan penambahan serum antiglobulin. Blia serum penderita mengandung antibodi yang bereaksi dengan eritrosit donor, penambahan serum antiglobulin menyebabkan eritrosit yang dilapisi antibodi menggumpal. Bila tidak terjadi reaksi aglutinasi berarti tidak ditemukan globulin yang melekat. Uji saring terhadap antibodi ini penting untuk keperluan transfusi dan juga untuk menguji wanita hamil terhadap kemungkinan penyakit hemolitik pada bayi baru lahir. Biasanya yang menyebabkan hasil Direct Antiglobulin Test positif pada anemia hemolitik autoimun, suatu kelainan dimana dalam serum penderita terdapat antibodi yang bereaksi dengan eritrosit penderita itu sendiri. Autoantibody ini dapat berupa IgG atau IgM. Hal yang penting bahwa lapisan globulin menyebabkan eritrosit lebih mudah melekat dan difagositosis oleh makrofag didalam jaringan retikuloendotelial. Proses hemolitik autoimun biasanya digolongkan dalam reaktif dingin dan reaktif panas, tergantung suhu optimum bagi antibodi untuk bereaksi dengan baik. Autoantibodi IgM biasanya bekerja pada suhu jauh dibawah 370C, sering hanya melekat sebentar pada eritrosit sehingga hanya sedikit IgM yang melekat pada eritrosit. Jenis autoantibodi ini ditemukan apad orang tua setelah infeksi Mikoplasma. Anemia hemolitik autoimun golongan reaktif panas disebabkan antibodi kelas IgG yang biasanya tetap melekat pada permukaan eryhtrosit selama eritrosit itu dalam sirkulasi. Kelainan ini biasanya idiopatik yang dapat terjadi pada semua umur dan kedua jenis kelamin, juga ditemukan pada keadaan yang menyertai Leukemia, limfoma dan sarkoma. A. Percobaan langsung Prinsip : Suspensi darah diletakkan dalam tabung kemudian ditambahkan serum anti (serum Coombs) akan terbentuk aglutinasi atau penggumpalan. Tujuan : untuk menentukan adanya antiglobulin dalam darah seseorang. 119



Alat dan Reagensia : 1. Tabung reaksi 6. Mikroskop 2. Sentrifuge 7. Waterbath 3. tabung sentrifuge 8. Serum Coombs 4. Tabung serologi 9. NaCl 0,9% 5. Pipet tetes Bahan Pemeriksaan : Darah vena Teknik kerja : 1. Masukkan kedalam tabung sentrifuge 0,5 ml darah 2. Tambahkan NaCl 0,9 % sama banyak dan campur, kemudian disentrifuge. Pisahkan supernatantnya dan ulangi pekerjaan itu 4 kali berturut-turut. 3. Buat suspensi eryhtrosit setelah pemutarn terakahir dengan konsentrasi 2%. 4. Dalam tabung serologi masukkan 2 tetes serum Coombs dan satu tetes suspensi eryhtrosit. 5. Campur dan eramkan suhu 370C selama 30-60 menit. 6. Kocok tabung dengan hati-hati untuk melihat adanya aglutinasi kemudian amati secara mikroskopis. 7. Jika hasilnya negatif putar 1000 rpm selama 1 menitdan periksa adanya aglutinasi secara makroskopis dan mikroskopis. Pembacaan : Terjadinya aglutinasi membuktikan adanya anti zat yang melapisi eryhtrosit.



B. Percobaan Tak Langsung Prinsip : Suspensi sel darah merah golongan darah O kemudian ditambahkan serum yang akan diperiksa akan terbentuk aglutinasi. Tujuan : untuk menentukan adanya antiglobulin dalam darah seseorang. Alat dan Reagensia : 6. Tabung reaksi 6. Mikroskop 7. Sentrifuge 7. Waterbath 8. tabung sentrifuge 8. Serum Coombs 9. Tabung serologi 9. NaCl 0,9% 10. Pipet tetes Bahan Pemeriksaan : Serum Teknik Kerja : 1. Buatlah suspensi eritrosit golongan darah O 2% dalam larutan garam faal. 2. Campur sama banyak dari suspensi tadi dengan serum yang diperiksa. 3. Eramkan pada suhu 370C selama 60 menit. 4. Lanjutkan dengan tindakan yanga sama yang diterangkan pada percobaan langsung dari nomor 1 s/d 8. Penafsiran : Adanya aglutinasi membuktikan bahwa serum yang diperiksa berisi anti zat yang melapisi eritrosit.



120



BAB XXXV VALIDASI REAGENSIA BDRS/UTDRS XXXIV.1 PENDAHULUAN Validasi merupakan kegiatan untuk memastikan reagensia yang digunakan dalam kondisi baik dan bereaksi secara normal sesuai dengan yang diinginkan. Kegiatan ini dilakukan setiap menggunakan kit reagensia yang baru dibuka dan juga suspensi sel yang baru dibuat dan akan digunakan untuk reaksi silang. Kegiatan ini seharusnya dilakukan oleh seorang analis kesehatan yang telah senior dan bekerja di BDRS/UTDRS, namun tidak selalu. Hal ini merupakan kegiatan rutin dalam BDRS untuk menjaga kualitas pemeriksaan yang akan dilakukan. Dalam melakukan validasi harus menggunakan kartu validasi yang di checklist untuk tiap tahapan kerja. Anti – A 1. Disiapkan tabung sebanyak 3 buah pada sebuah rak dan diberi label tabung I, II, dan III 2. Diisi masing-masing tabung dengan : - tabung I : 1 tetes test sel A 5 % - tabung II : 1 tetes test sel B 5 % - tabung III : 1 tetes test sel O 5 % 3. Diteteskan masing-masing 2 tetes anti-A pada tabung I, II dan III 4. Kocok-kocok semua tabung hingga tercampur 5. Di putar 3000 rpm selama 15 detik 6. Di baca hasil reaksi. Pembacaan Hasil : Dibaca reaksi dengan mengocok tabung perlahan-lahan - Pada tabung I terjadi Aglutinasi (Positif) - Pada tabung II tidak terjadi Aglutinasi (Negatif) - Pada tabung III tidak terjadi Aglutinasi (Negatif) Anti – B 1. Siapkan tabung sebanyak 3 buah pada sebuah rak dan diberi label tabung I, II, dan III. 2. Isi masing-masing tabung dengan : - tabung I : 1 tetes test sel A 5 % - tabung II : 1 tetes test sel B 5 % - tabung III : 1 tetes test sel O 5 % 3. Diteteskan masing-masing 2 tetes anti-B pada tabung I, II dan III 4. Kocok-kocok semua tabung hingga tercampur 5. Diputar 3000 rpm selama 15 detik. 6. Di baca hasil reaksi. Pembacaan Hasil : Dibaca hasil reaksi dengan mengocok tabung perlahan-lahan - Pada tabung I tidak terjadi Aglutinasi (Negatif) - Pada tabung II terjadi Aglutinasi (Positif) - Pada tabung III tidak terjadi Aglutinasi (Negatif) Anti – D (Rhesus) 1. Disiapkan tabung sebanyak 2 buah pada sebuah rak dan diberi label tabung I, dan tabung II 2. Diisi masing-masing tabung dengan : - tabung I : 1 tetes test sel O 5 % Rhesus Positif - tabung II : 1 tetes test sel O 5 % Rhesus Negatif 121



3. 4. 5. 6.



Diteteskan masing-masing 2 tetes anti-D pada tabung I dan II Kocok-kocok semua tabung hingga tercampur Diputar 3000 rpm selama 15 detik Di baca hasil reaksi. Pembacaan Hasil Dibaca hasil reaksi dengan mengocok tabung perlahan-lahan - Pada tabung I terjadi Aglutinasi (Positif) - Pada tabung II tidak terjadi Aglutinasi (Negatif)



Test sel A standar 1. Disiapkan tabung sebanyak 2 buah pada sebuah rak dan diberi label tabung I, dan tabung II. 2. Diisi masing-masing tabung dengan : - tabung I : 2 tetes Anti-A - tabung II : 2 tetes Anti-B 3. Diteteskan pada masing-masing 1 tetes test sel A Standar 5 % pada tabung I dan II. 4. Dikocok-kocok semua tabung hingga tercampur 5. Diputar 3000 rpm selama 15 detik 6. Di Baca hasil reaksi Pembacaan Hasil : Dibaca hasil reaksi dengan mengocok tabung perlahan-lahan - Pada tabung I terjadi Aglutinasi (Positif) - Pada tabung II tidak terjadi Aglutinasi (Negatif) Test sel B standar 1. Disiapkan tabung sebanyak 2 buah pada sebuah rak dan diberi label tabung I, dan tabung II 2. Diisi masing-masing tabung dengan : - tabung I : 2 tetes Anti-A - tabung II : 2 tetes Anti-B 3. Diteteskan masing-masing 1 tetes test sel B Standar 5 % pada tabung I dan II 4. Dikocok-kocok semua tabung hingga tercampur 5. Diputar 3000 rpm selama 15 detik 6. Dibaca hasil reaksi Pembacaan Hasil : Dibaca hasil reaksi dengan mengocok tabung perlahan-lahan - Pada tabung I tidak terjadi Aglutinasi (Negatif) - Pada tabung II terjadi Aglutinasi (Positif) Test sel O Standar 1. Disiapkan tabung sebanyak 2 buah pada sebuah rak dan diberi label tabung I, dan tabung II 2. Diisi masing-masing tabung dengan : - tabung I : 2 tetes Anti-A - tabung II : 2 tetes Anti-B 3. Diteteskan masing-masing 1 tetes test sel O Standar 5 % pada tabung I dan II 4. Dikocok-kocok semua tabung hingga tercampur. 5. Diputar 3000 rpm selama 15 menit 6. Dibaca hasil reaksi. Pembacaan Hasil : Dibaca reaksi dengan mengocok tabung perlahan-lahan 122



- Pada tabung I tidak terjadi Aglutinasi (Negatif) - Pada tabung II tidak terjadi Aglutinasi (Negatif) Coomb’s Serum (AHG) 1. Disiapkan tabung sebanyak 4 buah pada sebuah rak dan diberi label tabung I, II, III, dan IV 2. Diisi masing-masing tabung dengan : - tabung I : 1 tetes test CCC - tabung II : 1 tetes test sel A 5 % - tabung III : 1 tetes test sel B 5 % - tabung IV : 1 tetes test sel O 5 % 3. Dicuci keempat tabung dengan saline sebanyak 3 x 4. Diteteskan masing-masing 2 tetes AHG pada tabung I, II, III, dan IV 5. Dikocok-kocok semua tabung hingga tercampur 6. Diputar 3000 rpm selama 15 detik 7. Dibaca hasil reaksi Pembacaan Hasil : Dibaca reaksi dengan mengocok tabung perlahan-lahan - Pada tabung I terjadi Aglutinasi (Positif) - Pada tabung II tidak terjadi Aglutinasi (Negatif) - Pada tabung III tidak terjadi Aglutinasi (Negatif) - Pada tabung IV tidak terjadi Aglutinasi (Negatif) Bovine Albumin 22 % 1. Disiapkan tabung sebanyak 3 buah pada sebuah rak dan diberi label tabung I, II, dan III 2. Diisi masing-masing tabung dengan : - tabung I : 1 tetes test sel A 5 % - tabung II : 1 tetes test sel B 5 % - tabung III : 1 tetes test sel O 5 % 3. Diteteskan masing-masing 2 tetes Bovine Albumin 22 % pada tabung I, II dan III 4. Dikocok-kocok semua tabung hingga tercampur 5. Diputar 3000 rpm selama 15 detik 6. Dibaca reaksi, bila ketiga tabung negatif, lanjutkan Diinkubasi 37 ° C selama 15 detik 7. Diputar 3000 rpm selama 15 detik 8. Dibaca hasil reaksi. Pembacaan hasil : Dibaca hasil reaksi dengan mengocok tabung perlahan-lahan - Pada tabung I tidak terjadi Aglutinasi (Negatif) - Pada tabung II tidak terjadi Aglutinasi (Negatif) - Pada tabung III tidak terjadi Aglutinasi (Negatif) Coomb’s Control Cells (CCC) 1. Disiapkan tabung sebanyak 2 buah pada sebuah rak dan diberi label tabung I, dan tabung II 2. Diisi masing-masing tabung dengan : - tabung I : 2 tetes Coomb’s Serum (AHG) - tabung II : 2 tetes saline 3. Diteteskan masing-masing 1 tetes CCC pada tabung I dan II 4. Dikocok-kocok semua tabung hingga tercampur 5. Diputar 3000 rpm selama 15 detik dan dibaca hasil reaksi



123



Pembacaan hasil : Dibaca hasil reaksi dengan mengocok tabung perlahan-lahan - Pada tabung I terjadi Agglutinasi (Positif) - Pada tabung II tidak terjadi Agglutinasi (Negatif) Catatan : 1. Lembar Kerja validasi reagensia terdapat pada lampiran. 2. Pemeriksaan validasi harus menggunakan lembar validasi dan pengisian checklist setiap melakukan kegiatan tersebut. 3. Setiap spesimen darah yang digunakan harus berhati-hati dan dianggap infeksius, oleh sebab itu harus menggunakan alat pelindung diri. 4. Mengawetkan CCC dengan larutan Alserver dan CCC merupakan SDM yang telah coated dengan antibodi Rhesus IgG (Incomplete antibodi).



124



BAB XXXVI PEMELIHARAAN PERALATAN HEMATOLOGI



XIV.1 KAMAR HITUNG Kamar hitung setelah digunakan harus dibersihkan dengan cara mencuci menggunakan air suling dan digosok perlahan menggunakan tissue halus agar tidak tergores bidang garis baginya. Kamar hitung yang sering digunakan, terutama apabila untuk menghitung trombosit menggunakan metode Rees Ecker, akan kotor dan warna biru agak sulit dibersihkan. Sebaiknya direndam dalam detergen atau dalam larutan natrium hipoklorit 5% semalam dan dicuci seperti biasa. Sebaiknya menggunakan detergen khusus untuk laboratorium dan sewaktu pembilasan harus bersih agar tidak tertinggal bekas detergen atau hipoklorit pada permukaan garis bagi. XVI.2 PIPET THOMA DAN SAHLI Untuk membersihkan pipet Thoma dan Sahli sebaiknya diisapkan bergantian ke dalam pipet air kemudian aseton atau campuran alkohol dan eter sama banyak. Apabila sulit dibersihkan harus menggunakan larutan Natrium karbonat dan direndam selama 1 malam. Untuk bekuan dasar yg sulit dihilangkan dapat menggunakan larutan natrium hipoklorit 5% atau larutan yang lebih kuat lagi larutan asam kromat 5% dalam asam sulfat 10%. Setelah itu dicuci kembali dengan air suling dan dikeringkan Darah yang membeku dapat dibersihkan dengan menggunakan rambut kuda, kawat baja halus sebelum pipet di cuci untuk mencegah tersumbat. Jagalah jangan sampai ujung pipet pecah karena kesalahan memasukkan kawat baja halus. XVI.3 HEMOGLOBINOMETER Alat pembanding yang terbuat dari plastik dan logam harus dicegah termasuki cairan dan harus segera dikeringkan. Permukaan standar harus bersih, tidak tercemar atau berdebu. Tabung pengencer sahli harus dibersihkan dengan air suling dan HCl, namun dapat juga menggunakan detergen. XVI.4 TABUNG WESTERGREN DAN WINTROBE Tabung untuk pemeriksaan LED harus segera dicuci dan dibersihkan setelah menggunakan. Tabung wintrobe dibersihkan dengan memutarbalikkan hingga mulut mengarah ke bawah. Ujung pipet dialiri dengan air sehingga bagian dalam terbilas dengan air dan mempercepat pengeluaran sisa darah. Tabung westergren setelah digunakan harus segera direndam dalam air suling di gelas ukur panjang sehingga akan larut sisa darah yang ada dalam tabung. Bila perlu dicuci menggunakan detergen apabila sangat kotor. XVI.5. PIPET TETES DAN ALAT GELAS LAINNYA Pipet tetes dan alat gelas lainnya yang digunakan harus segera dibilas dengan air suling untuk membersihkan noda bekas pengambilan reagensia atau spesimen. Prinsip pembersihana alat gelas ini sama halnya seperti pada alat gelas pada umumnya. Khusus kuvet fotometer harus segera dicuci setelah dipakai dan hanya dibilas dengan air suling, kemudian dikeringkan langsung, agar tidak tergores. XVI.6 TOURNIQUETE ATAU STUWING Alat pembendungan untuk pengambilan darah sebaiknya dibersihkan dengan alkohol apabila setelah beberapa kali dipakai atau terkontaminasi darah. Untuk hasil yang lebih bersih sebaiknya dibersihkan dengan menggunakan sikat dan detergen.



125



BAB XXXVII PENUTUP Demikian uraian mengenai Penuntun Praktikum Hematologi Untuk Siswa SMK Program Studi Analis Kesehatan dalam buku ringkas ini telah selesai dibuat. Pemeriksaan hematologi saat ini telah memasuki perkembangan otomatis sehingga dapat dilakukan pemeriksaan yang lebih cepat dan teliti. Namun semua alat otomatis mengacu pada teknik sederhana yang konvensional sehingga alat otomatis tidak harus selalu benar dan justeru perlu dikontrol kembali dengan teknik manual. Walaupun metode manual tergolong sudah tua dan banyak ditinggalkan, namun di puskesmas terpencil dan kabupaten tetap merupakan metode terpilih yang murah dan mudah dikerjakan. Keterampilan dan kecakapan seorang analis kesehatan dalam bekerja secara manual lah yang memberikan nilai tambah dalam bekerja di laboratorium dibandingkan tenaga lainnya. Dalam lampiran pada lembar lampiran, digunakan untuk memberikan gambaran lebih lanjut beberapa parameter pemeriksaan hematologi terutama mengenai sitologi darah dan kartu validasi reagensia bank darah. Sebagai ucapan penutup dalam buku penuntun praktikum yang sederhana ini, maka penulis ucapkan semoga bermanfaat bagi kita semua analis kesehatan yang bekerja di laboratorium. Semoga di edisi yang akan datang akan disempurnakan dan ditambahkan lagi pengetahuan yang lebih terbaru dan lebih lengkap bidang hematologi. [email protected]



126



LAMPIRAN KARTU VALIDASI REAGENSIA BANK DARAH FORM 1 Anti-A Identitas Antisera



Anti - B Identitas Antisera



Anti - D Identitas Antisera



1 tts test sel A 5 % + 2 tetes anti-A



1 tts test sel B 5 % 1 tts test sel O 5 % + + 2 tetes anti-A 2 tetes anti-A Kocok-kocok hingga tercampur rata Putar 3000 rpm 15 detik Baca reaksi



1 tts test sel A 5 % + 2 tetes anti-B



1 tts test sel B 5 % 1 tts test sel O 5 % + + 2 tetes anti-B 2 tetes anti-B Kocok-kocok hingga tercampur rata Putar 3000 rpm 15 detik Baca reaksi



1 tetes sel O 5% Rhesus 1 tetes sel O 5 % Rhesus Positif Negatif + + 2 tetes anti-D 2 tetes anti-D Kocok-kocok hingga tercampur rata Putar 3000 rpm 15 detik Baca reaksi



Nama Pemeriksa :



Test Validasi :



Tanggal Pemeriksan : Anti-A : Anti-B : Dicek Oleh : Disahkan oleh : :



127



KARTU VALIDASI REAGENSIA BANK DARAH FORM 2



Test Sel A Standar Identitas 2 tetes Anti - A 2 tetes Anti - B Antisera + + 1 tetes sel A Standar 5% 1 tetes sel A Standar 5% Kocok-kocok hingga tercampur rata Putar 3000 rpm 15 detik Baca reaksi Test Sel B Standar Identitas 2 tetes Anti - A 2 tetes Anti - B Antisera + + 1 tetes sel B Standar 5% 1 tetes sel B Standar 5% Kocok-kocok hingga tercampur rata Putar 3000 rpm 15 detik Baca reaksi Test Sel O Standar Identitas 2 tetes Anti - A 2 tetes Anti - B Antisera + + 1 tetes sel O Standar 5% 1 tetes sel O Standar 5% Kocok-kocok hingga tercampur rata Putar 3000 rpm 15 detik Baca reaksi Nama Pemeriksa :



Test Validasi :



Tanggal Pemeriksan : Anti-A : Anti-B : Dicek Oleh : Disahkan oleh : :



128



KARTU VALIDASI REAGENSIA BANK DARAH FORM 3



Coomb’s Serum (AHG) Identitas 1 tts CCC Antisera + 2 tts AHG



Bovine Albumine Identitas Antisera



1 tts sel A 5% 1 tts sel B 5% 1 tts sel O 5% Cuci 3 x dengan saline + + + 2 tts AHG 2 tts AHG 2 tts AHG Kocok-kocok hingga tercampur rata Putar 3000 rpm 15 detik Baca reaksi



1 tts test sel A 5 % + 2 tts Bovine Alb 22 %



1 tts test sel B 5 % 1 tts test sel O 5 % + + 2 tts Bovine Alb 2 tts Bovine Alb 22 % 22 % Kocok-kocok hingga tercampur rata Putar 3000 rpm 15 detik Baca reaksi → Bila negatip Inkubsi 37° C selama 15 menit Putar 3000 rpm 15 detik Baca Reaksi



Coomb’s Control Cells Identitas Antisera 2 tetes AHG



2 tetes saline +



1 tetes CCC



+ 1 tetes CCC Kocok-kocok hingga tercampur rata Putar 3000 rpm 15 detik Baca reaksi



Nama Pemeriksa :



Test Validasi :



Tanggal Pemeriksan : Test Sel standar A : Test Sel standar B :



Dicek Oleh :



Test Sel standar O :



Disahkan oleh :



Test Sel standar CCC :



No lot/Exp A.H.G :



129



LEMBAR TEST VALIDASI REAGENSIA BANK DARAH FORM 4



Anti-A Identitas Antisera



Tabung I



Tabung II



Tabung III



Tgl. Pemeriksaan



Diperiksa oleh



Di cek Oleh



Tabung II



Tabung III



Tgl. Pemeriksaan



Diperiksa oleh



Di cek Oleh



Disahkan oleh : Anti-B Identitas Antisera



Tabung I



Disahkan oleh : Anti-D Identitas Antisera



Tabung I



Tabung II



Tgl. Pemeriksaan



Diperiksa oleh



Di cek Oleh



Tabung II



Tgl. Pemeriksaan



Diperiksa oleh



Di cek Oleh



Tabung II



Tgl. Pemeriksaan



Diperiksa oleh



Di cek Oleh



Disahkan oleh : Test Sel A Standar Identitas Tabung Antisera I Disahkan oleh : Test Sel B Standar Identitas Tabung Antisera I Disahkan oleh :



130



LEMBAR TEST VALIDASI REAGENSIA BANK DARAH FORM 5



Test Sel O Standar Identitas Tabung Antisera I



Tabung II



Tgl. Pemeriksaan



Diperiksa oleh



Di cek Oleh



Disahkan oleh : Coombs Serum Identitas Tabung Antisera I



Tabung II



Tabung III



Tabung IV



Tgl. Pemeriksaan



Diperiksa oleh



Di cek Oleh



Disahkan oleh : Bovine Albumin Identitas Tabung Antisera I



Tabung II



Tabung III



Tgl. Pemeriksaan



Diperiksa oleh



Di cek Oleh



Disahkan oleh : Test Sel O Standar Identitas Tabung Antisera I



Tabung II



Tgl. Pemeriksaan



Disahkan oleh :



131



Diperiksa oleh



Di cek Oleh



DAFTAR PUSTAKA



1. Depkes, Penuntun Praktikum Hematologi, SMAK Depkes Banjarmasin, Departemen Kesehatan RI, Tahun 1990 2. Pusdiknakes, Hematologi, Untuk Siswa SMAK kelas I, II, III, Pusat Pendidikan Tenaga Kesehatan Republik Indonesia, Jakarta 1989 3. Gandasoebrata R, Penuntun Laboratorium Klinik, Bagian Patologi Klinik FKUI/RSCM, Edisi 11, Penerbit Dian Rakyat, Jakarta, 2001 4. Widmann FK, Tinjauan Klinis Atas Hasil Pemeriksaan Laboratorium, J.Latu dkk, Edisi 9, Penerbit Buku Kedokteran EGC, Jakarta, 2000. 5. Kosasih EN, Tafsiran Hasil Pemeriksaan Laboratorium Klinik, Edisi 2, Penerbit Kharisma, Jakarta, 2008 6. Sacher Ronald, Tinjauan Klinis Atas Hasil Pemeriksaan Laboratorium, Penerbit EGC, Jakarta 2005. 7. Hardjoeno, dkk, Interpretasi Hasil Tes Laboratorium Diagnostik, Bagian dari Standar Pelayanan Medik, Penerbit Lephas, Universitas Hasanuddin Press, Makassar, 2004. 8. Analis Kesehatan, Diktat Praktikum Hematologi Klinik, Akademi Analis Kesehatan Depkes Bandung, Budi Martono, 2000 9. Majalah Kedokteran Indonesia, Diagnosis Anemia, volume 45, Nomor 12, tahun 1995, halaman 714-720. 10. Analis Kesehatan, Buku Hematologi Praktikum II, Politeknik Kesehatan Banjarmasin Program Studi Analis Kesehatan, Banjarbaru, 2004 11. Analis Kesehatan, Buku Transfusi Darah Praktikum, Politeknik Kesehatan Banjarmasin Program Studi Analis Kesehatan, Banjarbaru, 2005 12. Mindray, Hematology Analyzer, Manual Instruction, Mindray Suenzhen, Chine, 2000 13. Sysmex, Yukio Takeda, Automated Hematology Analyzer KX 21, Histogram Handbook, Sysmex Corporation, Japan, 2000 14. Laboratorium kesehatan, Masa Tromboplastin teraktivasi, http://labkesehatan.blogspot.com/2010/01/masa-tromboplastin-parsial-teraktivasi.html 15. Laboratorium kesehatan, Fibrinogen, di akses melalui website http://labkesehatan.blogspot.com/2010/01/fibrinogen.html 16. Supandiman, Iman DSPD.H, Prof.dr, Hematologi Klinik, Edisi Revisi, Penerbit Alumni, Bandung, 1997. 17. Wirawan, Riadi, Pemantapan Kualitas Uji Hematologik, Fakultas Kedokteran Universitas Indonesia, Jakarta, 2002 18. Digilab, Sistem Rhesus, Digilab diakses pada tanggal 28 April 2010 pada : digilib.unsri.ac.id/download/RHESUS.pdf 19. Kalbe Farma, Penemuan Para Bombay, Cermin Dunia Kedokteran, http://www.kalbe.co.id/files/cdk/files/11PenemuanParaBombay012.pdf/11PenemuanP araBombay012.html. 20. Golongan O Bombay.ppt, diakses pada : http://www.4shared.com/download/OBombay. diakses terakhir pada : 25 April 2010, jam 20.00 Wita. 21. hh Antigen System, diakses pada Wikipedia : http://www.wikipedia /hh antigen system - Wikipedia , the free encyclopedia.htm. 22. Bhende YM, Deshpande CK, Bhatia HM, Sanger R, Race RR, Morgan WT, Watkins WM. (May 1952). "A "new" blood group character related to the ABO system". Lancet. 1 (6714): 903–4. PMID 14918471 23. Departemen Kesehatan, RI, Pedoman Unit Transfusi Darah Rumah Sakit (UTDRS), Dirjen Bina Pelayanan Medik Dasar, Depkes Jakarta, 2009 24. Departemen Kesehatan, RI, Pedoman Pengelolaan Bank Darah Rumah Sakit (BDRS), Dirjen Bina Pelayanan Medik Dasar, Depkes Jakarta, 2008 25. Sodiycxacun, Pembuatan preparat darah tepi, di akses pada tahun 2010, Agustus, di http://sodiycxacun.blogspot.com/2010/04/cara-pembuatan-preparat-darah-tepi.html 132



26. Sodiycxacun, Hemacytometer, di akses pada tahun 2010, Agustus, di hemocytometer.html 27. Sodiycxacun, Pembuatan preparat darah tepi, di akses pada tahun 2010, Agustus, di http://sodiycxacun.blogspot.com/2010/04/cara-pembuatan-preparat-darah-tepi.html 28. Sodiycxacun, Pemeriksaan Hb menurut Sahli, di akses pada tahun 2010, Agustus, di http://sodiycxacun.blogspot.com/2010/05/pemeriksaan-hb-menurut-sahli.html 29. Sodiycxacun, Cara Pemeriksaan Golongan Darah, di akses pada tahun 2010, Agustus, di http://sodiycxacun.blogspot.com/2010/08/cara-pemeriksaan-golongandarah-slide.html 30. Sodiycxacun, Pemeriksaan Hb Metode Cyanmtehemoglobin, di akses pada tahun 2010, Agustus, di http://sodiycxacun.blogspot.com/2010/07/pemeriksaan-hbhemoglobin-metode.html 31. Sodiycxacun, Pemeriksaan Hematokrit, di akses pada tahun 2010, Agustus, di http://sodiycxacun.blogspot.com/2010/07/pemeriksaan-hematokrit-ht.html 32. PMI, Unit Transfusi Darah Pusat, Kumpulan Prosedur Kerja Standar Praktikum Serologi Golongan Darah, Pelatihan Analis BDRS, Palang Merah Indonesia, Jakarta, Juli, 2011



133



HEMOPOEISIS



134



SEL PENDAHULU SEMUA SERI (STEM CELL) Inti : • Inti lonjong dan besar berwarna merah dengan materi kromatin halus • Nukleoli 1-2 buah biru pucat dan besar Sitoplasma : • Bersifat Basofilik • Warna biru dan relatif lebar Ukuran sel 45-85 mikron. Erythroblast Polikromatofilik (Rubrisit)



Hemositoblast (Stem sel / mesenchym)



SEL SERI ERYTHROSIT : Inti : • Bulat, kromatin terjalin rapat dan halus, agak transparan • Nukleolus, 3 – 5 biasanya tertutupi Sitoplasma : • Warna biru bunga gandum • Perinti berupa bintik-bintik setengah lingkaran • Ukuran sel 18-25 mikron. • Spesifikasi : berdaun telinga kecil



Eryhtoblast asidofilik (Metarubrisit)



Retikulosit



Eritroblast Basofilik (Prorubrisit)



Eritroblast Basofilik (Prorubrisit)



Inti : • Bulat, kromatin kasar dan menebal secara tidak teratur, Terdapat piknotik, inti lebih kecil dari pendahulunya. • Nukleolus tidak ditemukan lagi. Sitoplasma : • Relatif lebih lebar, berwarna merah karena mengandung hemoglobin dan juga tampak warna biru. • Warna merah lebih dominan dibandingkan warna biru. Dalam sumsum tulang normal 10-20 % dari sel berinti.



135



Inti : • Bulat, kecil, kromatin kasar memadat. • Nukleolus tidak ditemukan lagi. Sitoplasma : • Lebih lebar dari seri sebelumnya, berwarna merah karena mengandung hemoglobin. • Warna merah lebih dominan dibandingkan warna biru. Dalam sumsum tulang normal 2-5% dari sel berinti. Inti : Tidak tampak (hilang) Sitoplasma : • Berwarna merah karena mengandung hemoglobin yang lebih banyak, terdapat sisa-sisa RNA dan berbagai fragmen mitokondria dan organel lainnya , (eritrosit polikrom). Dalam darah normal ditemukan 0,5-2,5%



Proeritroblast (Rubriblast) Inti : • Bulat, kromatin tampak kasar, agak transparan • Nukleolus menghilang atau tidak tampak Sitoplasma : • Sedikit mengandung hemoglobin, tampak merah walaupun warna biru mendominasi. • Ukuran kebih kecil dari rubriblast. Normal ditemukan 1-4 % dari seluruh sel berinti.



Inti : • Bulat, kecil, kromatin kasar , padat dan mengalami piknotik, inti lebih kecil • Nukleolus tidak ditemukan lagi. Sitoplasma : • Lebih lebar, berwarna merah karena mengandung hemoglobin yang lebih banyak dan juga tampak warna biru karena ada sisa RNA. • Warna merah lebih dominan dibandingkan warna biru. Dalam sumsum tulang normal 5-10% dari sel berinti.



Erythrosit



Bentuk : • Seperti cakram bikonkaf, diameter 7-8 mikron, tebal 1,5-2,5 mikron. • Bagian tengah lebih tipis dari bagian tepi. • Dengan Wright tampak berwarna merah karena mengandung hemoglobin. • Umur dalam darah 120 hari Dalam darah normal ditemukan 4,5-6,0 juta.



Inti : • Oval / lonjong atau mendatar pada satu sisinya, bentuk kacang, kromatin menebal, tidak homogen. • Nucleloli biasanya tidak tampak (menghilang) Sitoplasma : • Coklat merah muda keabu-abuan dengan granula merah orange agak kecoklatan. • Berisi granula bersifat eosinofilik walau terlihat sedikit basofilik



SEL SERI EOSINOPHIL Inti : • Bulat, kromatin terjalin rapat, agak transparan • Nukleoli : 3 – 5 biasanya tertutupi Sitoplasma : • Biru sedang sampai biru terang • Lebih kecil bila dibandingkan pro eitroblast, juga lonjong (perinuclear) Metamielosit Eosinofil



Inti : • Letaknya sentral / eksentrik, berbentuk batang seperti kacang, berwarna merah keunguan. • Kromatin kasar Sitoplasma : • Coklat merah muda keabu-abuan • granula merah orange • Berisi granula bersifat eosinofilik.



Mieloblast Inti : • Oval, agak bulat, kromatin berkelompok kasar, tidak homogen • Nucleloli tidak tampak Sitoplasma : • Coklat abu-abu muda lembut / coklat merah muda, Granula kasar granula merah orange agak kecoklatan, menutupi inti sebagian inti. Eosinofil batang



Inti : • Biasanya bersegmen ganda 2-3 lobi, berwarna merah keunguan • Letak sentrik / eksentrik • nucleoli tidak ada, kromatin kasar Sitoplasma : • Warna dasar biru muda, relatif sedang, terlindung granula. • Granula banyak sama besar, orange kemerahan



Promielosit Inti : • Bulat, oval seringkali melengkung disatu sisi • Kromatin cukup padat dan teranyam serabut halus • Nucleoli 2 – 3, biasanya hanya terlihat garis-garis besarnya saja Sitoplasma : • Basofil muda bagian-bagian yang lebih terang terletak didekat lekuk inti (sentrosfer) granulasi azurik Mielosit Eosinofil



136



Eosinofil segmen



SEL SERI BASOPHIL Inti : • Bulat, kromatin terjalin rapat, agak transparan • Nukleoli : 3 – 5 biasanya tertutupi Sitoplasma : • Biru sedang sampai biru terang • Lebih kecil bila dibandingkan pro eitroblast, juga lonjong (perinuclear) Metamielosit Basofil Mieloblast Inti : • Oval, agak bulat, kromatin berkelompok kasar, tidak homogen • Nucleloli tidak tampak Sitoplasma : • Coklat abu-abu muda lembut / coklat merah muda , Granula kasar berwarna hitam / biru gelap, menutupi inti.



Inti : • Bulat, kecil, kromatin kasar , padat dan mengalami piknotik, inti lebih kecil • Nukleolus tidak ditemukan lagi. Sitoplasma : • Lebih lebar, berwarna merah karena mengandung hemoglobin yang lebih banyak dan juga tampak warna biru karena ada sisa RNA. • Warna merah lebih dominan dibandingkan warna biru. Dalam sumsum tulang normal 5-10% dari sel berinti. Inti : • Letaknya sentral / eksentrik, berbentuk batang seperti kacang, berwarna merah keunguan. • Kromatin kasar Sitoplasma : • Coklat merah muda keabu-abuan • granula merah orange • Berisi granula bersifat eosinofilik.



Basophil Batang Inti : • Biasanya bersegmen ganda 2-3 lobi, berwarna merah keunguan • Letak sentrik / eksentrik • nucleoli tidak ada, kromatin kasar Sitoplasma : • Warna dasar biru muda, relatif sedang, terlindung granula. • Granula banyak sama besar, orange kemerahan



Promielosit Inti : • Bulat, oval seringkali melengkung disatu sisi • Kromatin cukup padat dan teranyam serabut halus • Nucleoli 2 – 3, biasanya hanya terlihat garis-garis besarnya saja Sitoplasma : • Basofil muda bagian-bagian yang lebih terang terletak didekat lekuk inti (sentrosfer) granulasi azurik Mielosit Basophil



137



Basophil segmen



Inti : • Oval, panjang, juga mirip bentuk kacang, kromatin cukup rapat, tidak homogen • Nucleloli 1 – 2, biasanya tidak tampak Sitoplasma : • Coklat merah muda keabu-abuan dengan granula ungu yang halus, sentrosfer yang kecil terang



SEL SERI NETROPHIL



Mieloblast



Inti : • Bulat, berwarna biru kemerah-merahan kromatin inti halus dan tidak menggumpal, agak transparan • Nukleoli : satu atau lebih Sitoplasma : • Berwarna biru sedang sampai biru muda pada sekitar inti • Lebih kecil bila dibandingkan pro eitroblast, juga lonjong (perinuclear) Dalam sumsum tulang normal kurang 1% dari sel berinti. Inti : • Bulat, oval seringkali melengkung disatu sisi • Kromatin cukup padat dan teranyam serabut halus • Nucleoli 2 – 3, biasanya hanya terlihat garis-garis besarnya saja Sitoplasma : • Basofil muda bagian-bagian yang lebih terang terletak didekat lekuk inti (sentrosfer) granulasi azurik



Metamielosit Neutrofil Inti : • Berbentuk kacang, kromatin rapat, berbutir kasar dengan gumpalan yang terlihat jelas Sitoplasma : • Sama seperti mielosit, tetapi tidak ada sentrosfer Ukuran sel 10-15 mikron dan dalam darah ditemukan ± 300/mm3 variasi : 80-600/mm3



Neutrofil Batang



Promielosit Inti : • Oval, agak bulat, kromatin berkelompok kasar, tidak homogen • Nucleloli tidak tampak Sitoplasma : • Coklat abu-abu muda lembut/ coklat merah muda , Granula halus berwarna ungu kecoklatan ,sentrosfer terdapat dilekuakn inti yang dalam.



Mielosit Neutrofil



138



Neutrofil Segmen



Inti : • Letaknya sentral/eksentrik, bersegmen 2-5 lobi, warna inti biru pucat keunguan, kromatin kasar dan kompak Sitoplasma : • Relatif lebih lebar, warna oksifil, • Granula halus, kecil-kecil, berwarna merah, tersebar didalam sitoplasma (neutrofilik). Ukuran sel 10-15 mikron dan dalam darah ditemukan ± 4000/mm3 variasi : 2000-7000/mm3



SEL SERI THROMBOSIT Inti : • Berwarna kemerahan, berukuran besar dengan kromatin halus • Nukleoli 1-2 buah berwarna biru Sitoplasma : • Besar dan banyak, dan berwarna biru • Tidak terdapat granula



Megakarioblast Inti • • •



: Berukuran besar dengan kromatin halus Inti terbagi menjadi 2 atau 4 lobus Inti sangat poliploid mengandung DNA sampai 30 kali dari sel normal. Sitoplasma : • Berukuran besar, berwarna biru, homogen dan sangat basofilik. • Terdapat granula yang berwarna biru kemerah-merahan Tampak tonjolan-tonjolan sitoplasma seperti gelembung. Promegakariosit Inti : • Berukuran besar dengan lobus tidak terarur, kromatin kasar,Nukleoli tidak tampak. Sitoplasma : • Besar dan banyak, terisi mitokondria, RE kasar, dan aparatus golgi luas. • Terdapat banyak granula berwarna biru kemerah-merahan. Merupakan sel raksasa dengan diameter 30150 mikron.



Megakariosit



139



Metamegakariosit



Inti : • Berukuran besar dengan lobus tidak terarur, kromatin kasar,Nukleoli tidak tampak. Sitoplasma : • Besar dan banyak, terisi mitokondria, RE kasar, dan aparatus golgi luas. • Terdapat banyak granula berwarna biru kemerah-merahan. • Terjadi invaginasi dari membran plasma yang membelah-belah seluruh sitoplasma, membentuk membran dermakasi yang berisi granula-granula dan kemudian lepas dan membentuk Thrombosit. • Dari satu sel ini dapat menghasilkan 10005000 sel trombosit. Merupakan sel raksasa dengan diameter 35150 mikron. Setelah sitoplasma habis,sisa inti yang ada akan dihancurkan oleh makrofag Sel berukuran 3-4 mikron, dikeluarkan dari sitoplasma megakariosit dan memasuki darah perifer. Terdiri dari sitoplasma basofilik yang pucat(hialomer), granulasi azurofil (granulomer). Dengan pewarnaan Romanowsky akan berwarna merah pucat.



SEL SERI LIMFOSIT



SEL SERI MONOSIT Inti • • •



Limfoblast



Prolimfosit



Limfosit



: Cukup bulat dan melengkung Kromatin berjala kasar, transparan Nukleoli 1 – 2, dapat dibedakan dengan jelas berwarna biru terang atau biru pucat. Sitoplasma : • Sama seperti mieloblas, tapi disini plasmanya sedikit lebih luas dan lebih rentan. • Perinuclear lonjong • Bagian yang lebih terang banyak berbintik kecil Inti : • Bulat besar dengan satu atau beberapa anak inti. • Kromatin tipis rata dan tidak menggumpal tapi lebih kasar dibandingkan dengan Limfoblast. • Nukleoli Nukleoli 1 – 2, dapat dibedakan dengan jelas berwarna biru terang atau biru pucat. • Morfologi hampir sama dengan Limfobalst Sitoplasma : • Sama seperti mieloblas, tapi disini plasmanya sedikit lebih luas dan lebih rentan. • Perinuclear lonjong • Bagian yang lebih terang banyak berbintik kecil Inti : • Bulat atau melengkung, pembagian dalam area-area yang kontras lebih sedikit, berpola gumpal-gumpal kasar. • Nucleoli 1 – 4, biasanya tak tampak Sitoplasma : • Biasanya lebih kecil dan berbentuk setengah lingkaran warna basofil sedang terang • Bagian yang lebih terang berbintik berbintik halus, seringkali bergranula azurik



Monoblast



Inti : • Bulat, berwarna merah kromatin inti tampak kasar dan menggumpal, agak transparan • Memiliki lekukan pada inti yang jelas • Nukleoli : 1-2 buah berwarna biru Sitoplasma : • Berwarna biru sedang sampai biru muda pucat pada sekitar inti • Sitplasma relatif lebih lebar dari pendahulunya



Promonosit Inti : • Berlekuk dan melengkung (menyerupai otak), kromatin cukup rapat (piknotik), berjala kasar, transparan • Letak eksentrik, berwarna merah Sitoplasma : • Basofilik terang biru keabu-abuan granulasi azurik halus • Ukuran relatif lebih besar • Besar sel 10-22 mikron



Monosit



140



Inti : • Bulat, berwarna merah kebiru-biruan kromatin inti halus dan tidak menggumpal, agak transparan • Memiliki sedikit lekukan pada inti • Nukleoli : 1-2 buah berwarna biru Sitoplasma : • Berwarna biru sedang sampai biru muda pucat pada sekitar inti • Lebih kecil bila dibandingkan pro eitroblast, juga lonjong (perinuclear)