Bundelan Biokim Ami [PDF]

Citation preview

Praktikum Biokimia Tahun Akademik 2015/2016



BAB I. PENDAHULUAN 1.1 Latar Belakang Bakteri merupakan salah satu jenis mikroorganisme yang bentuk tubuhnya dipengaruhi oleh medium dan massa. Untuk membandingkan bentuk serta besarnya ukuran bakteri, harus diperhatikan bahwa kondisi bakteri harus sama. Untuk memudahkan pemeriksaan maka perlu dilakukan pembiakan bakteri dalam suatu media yang mengandung nutrisi untuk pertumbuhan bakteri tersebut. Medium merupakan suatu bahan yang terdiri dari campuran nutrien atau zat makanan yang digunakan untuk menumbuhkan mikroorganisme mikroba. Medium yang digunakan sesuai dengan kebutuhan mikroorganisme. Untuk dapat tumbuh dengan baik mikroorganisme membutuhkan nutrien yang meliputi air, sumber energi, sumber karbon, sumber akseptor elektron, sumber mineral, faktor pertumbuhan, dan sumber nitrogen. Dengan mengetahui sifat, kebutuhan, makanan dari mikroorganisme maka kita dapat membuat medium yang cocok untuk menumbuhkan mikroorganisme tersebut secara laboratorium. Pembiakan mikroorganisme dalam laboratorium memerlukan medium yang berisi zat hara serta lingkungan pertumbuhan yang sesuai dengan mikroorganisme. Pembuatan medium tumbuh mikroorganisme bukanlah hal yang mudah, karena medium mudah terkontaminasi. Selain itu untuk memindahkan biakan bakteri ke dalam medium juga dibutuhkan keterampilan agar bakteri bisa tumbuh merata, meningkat sesuai targetan. Untuk menghindari kegagalan atau terjadinya kontaminasi dalam pengembangan mikroorganisme, maka praktikum pembuatan media pertumbuhan mikroba dan pemindahan secara aseptik dilakukan agar dapat meningkatkan keterampilan bekerja secara aseptik. 1.2 Rumusan Masalah 1. Bagaimana cara pembuatan medium pertumbuhan bakteri bebentu cair? 2. Bagaimana cara pembuatan medium pertumbuhan bakteri bebentuk padat? 3. Apakah bakteri dapat ditumbuhkan dalam medium yang telah dibuat? 1.3



Tujuan 1. Mampu membuat media pertumbuhan mikroba yang berbentuk cair dan padat 2. Melakukan inokulasi mikroba ke dalam medium pertumbuhan cair dan padat 3. Melatih keterampilan bekerja secara aseptik.



1.4 Manfaat 1. Mengetahui cara pembuatan media pertumbuhan bagi mikroba yang berbentuk cair dan padat



Pembuatan Media Pertumbuhan Mikroba Dan Pemindahan Secara Aseptik



1



Praktikum Biokimia Tahun Akademik 2015/2016



2. Mengetahui cara melakukan inokulasi mikroba ke dalam medium pertumbuhan cair dan padat 3. Melatih keterampilan bekerja secara aseptik.



Pembuatan Media Pertumbuhan Mikroba Dan Pemindahan Secara Aseptik



2



Praktikum Biokimia Tahun Akademik 2015/2016



BAB II. TINJAUAN PUSTAKA 2.1 Bakteri Bakteri merupakan makhluk hidup uniseluler, pada umumnya tidak berklorofil, ada beberapa yang fotosintetik dan produksi aseksualnya secara pembelahan dan bakteri mempunyai ukuran sel kecil dimana setiap selnya hanya dapat dilihat dengan bantuan mikroskop. Bakteri pada umumnya mempunyai ukuran sel 0,5 1,0 μm kali 2,0-5,0 μm, dan terdiri dari tiga bentuk dasar yaitu bentuk bulat atau kokus, bentuk batang atau Bacillus, bentuk spiral [1]. Bakteri memiliki 2 pembagian struktur yaitu: Struktur dasar (dimiliki oleh hampir semua jenis bakteri) meliputi: dinding sel, membran plasma, sitoplasma, ribosom, DNA, dan granula penyimpanan. Struktur tambahan (dimiliki oleh jenis bakteri tertentu) meliputi: kapsul, flagelum, pilus (pili), klorosom, Vakuola gas dan endospora [1]. Escherichia coli merupakan bakteri Gram negatif berbentuk batang pendek yang memiliki panjang sekitar 2 µm, diameter 0,7 µm, lebar 0,4-0,7µm dan bersifat anaerob fakultatif. E. coli membentuk koloni yang bundar, cembung, dan halus dengan tepi yang nyata (Smith-Keary, 1988 ; Jawetz et al., 1995. Gram negatif yang resistensi terhadap panas, dimana media tumbuh optimumnya sekitar 30-37 °C. E.coli hanya dapat tumbuh pada konsentrasi HgCl 20mg/2100ml [1]. Staphylococcus aureus merupakan bakteri Gram positif berbentuk bulat berdiameter 0,7-1,2 μm, tersusun dalam kelompok-kelompok yang tidak teratur seperti buah anggur, fakultatif anaerob, tidak membentuk spora, dan tidak bergerak. Bakteri ini tumbuh pada suhu optimum 37 ºC, tetapi membentuk pigmen paling baik pada suhu kamar (20-25 ºC). Koloni pada perbenihan padat berwarna abu-abu sampai kuning keemasan, berbentuk bundar, halus, menonjol, dan berkilau. Lebih dari 90% isolat klinik menghasilkan S. aureus yang mempunyai kapsul polisakarida atau selaput tipis yang berperan dalam virulensi bakteri [1]. 2.2 Faktor-faktor yang Mempengaruhi Pertumbuhan Bakteri Faktor intrinsik yang mempengaruhi pertumbuhan bakteri menurut Gamar dan Sherrington (1994) yaitu : 1. Waktu Laju perbanyakan bakteri bervariasi menurut spesies dan kondisi pertumbuhannya. Pada kondisi optimal hampir semua bakteri memperbanyak diri dengan pembelahan biner sekali setiap 20 menit. 2. Makanan Semua mikroorganisme memerlukan nutrien yang akan menyediakan: a) Energi, biasanya diperoleh dari substansi mengandung karbon. b) Nitrogen untuk sintesa protein. c) Vitamin dan yang berkaitan dengan faktor pertumbuhan. 3. Kelembaban



Pembuatan Media Pertumbuhan Mikroba Dan Pemindahan Secara Aseptik



3



Praktikum Biokimia Tahun Akademik 2015/2016



Semua organisme memerlukan air untuk mempertahankan hidupnya. Banyaknya air dalam pangan yang tersedia untuk digunakan dapat di diskripsikan dengan istilah aktivitas air (Aw) 4. Suhu Mikroorganisme dapat diklasifikasikan menjadi tiga kelompok berdasarkan suhu pertumbuhan yang diperlukannya yaitu Psikrofil (organisme yang suka dingin) dapat tumbuh baik pada suhu dibawah 20C, kisaran suhu optimal adalah 10C sampai 20oC, Mesofil (organisme yang suka pada suhu sedang) memiliki suhu pertumbuhan optimal antara 20C sampai 45C, Termofil (organisme yang suka pada suhu tinggi) dapat tumbuh baik pada suhu diatas 45C, kisaran pertumbuhan optimalnya adalah 50C sampai 60C. 5. Oksigen Tersedianya oksigen dapat mempengaruhi pertumbuhan mikroorganisme, bakteri diklasifikasikan menjadi tiga kelompok menurut keperluan oksigennya yaitu Aerob Obligat (hanya dapat tumbuh jika terdapat oksigen yang banyak), Aerob Fakultatif (tumbuh dengan baik jika oksigen cukup, tetapi juga dapat tumbuh sacara anaerob), Anaerob Fakultatif (tumbuh dengan baik jika tidak ada oksigen, tetapi juga dapat tumbuh secara aerob) 6. pH Pada umumnya bakteri tumbuh dengan baik pada pH sekitar 7, meskipun dapat tumbuh pada kisaran pH 5-8 [2]. 2.2 Media Pertumbuhan Bakteri Media pertumbuhan mikroorganisme adalah suatu bahan yang terdiri dari campuran zat-zat makanan (nutrisi) yang diperlukan mikoorganisme untuk pertumbuhannya. Mikroorganisme memanfaatkan nutrisi media berupa molekulmolekul kecil yang dirakit untuk menyusun komponen sel. Dengan media pertumbuhan dapat dilakukan isolasi mikroorganisme dengan memanipulasi komposisi media pertumbuhannya [3]. Susunan dan kadar nutrisi suatu medium untuk pertumbuhan mikroba harus seimbang agar mikroba dapat tumbuh optimal. Hal ini perlu dikemukakan mengingat banyak senyawa yang menjadi zat penghambat atau racun bagi mikroba jika kadarnya terlalu tinggi (misalnya garam dari asam lemak, gula, dan sebagainya). Banyak alga yang sangat peka terhadap fosfat anorganik. Disamping itu dalam medium yang terlalu pekat aktivitas metabolisme dan pertumbuhan mikroba dapat berubah. Perubahan faktor lingkungan menyebabkan aktivitas fisiologi mikroba dapat terganggu, bahkan mikroba dapat mati. Medium memerlukan kemasaman (pH) tertentu tergantung pada jenis bakteri yang ditumbuhkan. Aktivitas metabolisme mikroba dapat mengubah pH, sehingga untuk mempertahankan pH medium ditambahkan bahan buffer. Beberapa komponen penyusun medium dapat juga berfungsi sebagai buffer [3]. Nutrient Agar adalah medium kultur direkomendasikan untuk budidaya mikroorganisme non-kritis. Mikroorganisme membutuhkan nutrisi, sumber energi Pembuatan Media Pertumbuhan Mikroba Dan Pemindahan Secara Aseptik



4



Praktikum Biokimia Tahun Akademik 2015/2016



dan kondisi lingkungan tertentu untuk tumbuh dan mereproduksi. Media kultur yang digunakan di laboratorium untuk budidaya mikroorganisme mengandung nutrisi yang dibutuhkan untuk pertumbuhan dan pemeliharaan. Nutrient agar adalah media yang umum digunakan untuk tumbuh bakteri di laboratorium. Ini adalah sebuah media dasar terdiri dari pepton sederhana dan ekstrak daging sapi [4]. 2.1.1 Jenis Media Berbedanya nutrisi yang dibutuhkan oleh setiap mikroba harus diimbangi dengan berbagai macam media sehingga dapat dilakukan kultivasi. Agar mikroba dapat tumbuh dan berkembang dengan baik di dalam media, diperlukan persyaratan tertentu, yaitu : 1. Media mengandung semua unsur hara yang diperlukan untuk pertumbuhan dan perkembangbiakan mikroba. 2. Media mempunyai tekanan osmosis, dan pH yang sesuai untuk mikroba. 3. Media harus dalam keadaan steril [4]. Ditinjau dari bantuknya, jenis media dapat dikelompokkan menjadi tiga, yaitu: 1. Media padat Media padat yaitu media yang mengandung agar. Jumlah agar yang ditambahkan tergantung kepada jenis atau kelompok mikroba yang ditumbuhkan. 2. Media cair Umumnya media cair digunakan untuk menambah biomassa sel. Jika ke dalam media tidak ditambahkan zat pemadat. Media cair dipergunakan untuk pertumbuhan bakteri, ragi dan mikroalga. 3. Media semi padat Jika penambahan zat pemadat hanya setengah atau kurang dari seharusnya. Ini umumnya diperlukan untuk pertumbuhan mikroba yang banyak memerlukan kandungan air dan hidup anaerobik atau fakultatif untuk menambah biomassa sel [4]. Berdasarkan susunan bahan yang digunakan, media kultivasi dapat dibedakan menjadi : 1. Media alami Media alami yaiu media yang disusun oleh bahan-bahan alami seperti kentang, telur, dan daging. Pada saat ini media alami yang banyak digunakan adalah dalam bentuk kultur jaringan tanaman atau hewan. Contoh penggunaan media alami adalah telur yang digunakan untuk pertumbuhan dan perkembangbiakan virus. 2. Media sintetik Media sintetik yaitu media yang disusun oleh senyawa kimia. Misalnya media untuk pertumbuhan dan perkembangbiakan Clostridium.



Pembuatan Media Pertumbuhan Mikroba Dan Pemindahan Secara Aseptik



5



Praktikum Biokimia Tahun Akademik 2015/2016



3. Media semi sintetik Media semi sintetik yaitu media yang tersusun oleh campuran bahan-bahan alami dan bahan-bahan sintesis. Misalnya kaldu nutrisi, wortel agar [5]. Berdasarkan tujuannya media dapat dibedakan menjadi: 1. Media untuk isolasi, media ini mengandung semua senyawa esensial untuk pertumbuhan mikroba, misalnya Nutrient Brotha, Blood Agar. 2. Media selektif/penghambat, media yang selain mengandung nutrisi juga ditambah suatu zat tertentu sehingga mediatersebut dapat menekan pertumbuhan mikroba lain dan merangsang pertumbuhanmikroba yang diinginkan. Contohnya adalah Luria Bertani medium yang ditambah Ampisilin untuk merangsang E.coli resisten antibotik dan menghambat kontaminanyang peka, Ampisilin. Salt broth yang ditambah NaCl 4% untuk membunuh Streptococcus agalactiae yang toleran terhadap garam. 3. Media diperkaya (enrichment), media diperkaya adalah media yang mengandung komponen dasar untuk pertumbuhan mikroba dan ditambah komponen kompleks seperti darah, serum, kuning telur. Media diperkaya juga bersifat selektif untuk mikroba tertentu. Bakteri yang ditumbuhkan dalam media ini tidak hanya membutuhkan nutrisi sederhana untuk berkembang biak, tetapi membutuhkan komponen kompleks, misalnya Blood Tellurite Agar, Bile Agar, Serum Agar, dll. 4. Media untuk peremajaan kultur, media umum atau spesifik yang digunakan untuk peremajaan kultur 5. Media untuk menentukan kebutuhan nutrisi spesifik, media ini digunakan unutk mendiagnosis atau menganalisis metabolisme suatu mikroba. Contohnya adalah Koser’s Citrate medium, yang digunakan untuk menguji kemampuan menggunakan asam sitrat sebagai sumber karbon. 6. Media untuk karakterisasi bakteri, media yang digunakan untuk mengetahui kemampuan spesifik suatu mikroba. Kadang-kadang indikator ditambahkan untuk menunjukkan adanya perubahan kimia. Contohnya adalah Nitrate Broth, Lactose Broth, Arginine Agar. 7. Media diferensial, media ini bertujuan untuk mengidentifikasi mikroba dari campurannya berdasar karakterspesifik yang ditunjukkan pada media diferensial, misalnya TSIA (Triple Sugar Iron Agar) yang mampu memilih Enterobacteria berdasarkan bentuk, warna, ukuran koloni dan perubahan warna media di sekeliling koloni [5]. 2.3 Teknik Inokulasi



Pembuatan Media Pertumbuhan Mikroba Dan Pemindahan Secara Aseptik



6



Praktikum Biokimia Tahun Akademik 2015/2016



Bakteri hidup dalam suatu koloni, baik bersimbiosis, bebas, ataupun parasit pada makhluk hidup.Diperlukan suatu usaha untuk mengembakbiakkan bakteri dalam skala laboratorium untuk mempelajari kehidupan dan keragamannya. Pengembangbiakkan dilakukan dengan menumbuhkan bakteri dari sumber isolat seperti tanah, udara, sisa makanan, dan lain-lain dalam media yang mengandung nutrisi. Mikroorganisme harus dipisahkan terlebih dahulu agar bisa dipelajari sifat pertumbuhan masing-masing jenis mikroorganisme sehingga didapatkan kultur murni. Kultur murni adalah suatu biakan yang terdiri dari sel-sel satu spesies. Kultur murni diperoleh dengan cara isolasi menggunakan metode tuang maupun gores [5]. Isolasi mikroorganisme adalah memisahkan mikroorganisme tersebut dari lingkungannya dan menumbuhkannya sebagai biakan murni dalam medium buatan. Pertumbuhan mikroorganisme dapat dilakukan dalam medium padat, karena dalam medium padat sel-sel mikroorganisme akan terbentuk suatu koloni sel yang tetap pada tempatnya [5]. Ada beberapa teknik isolasi mikroba, yaitu: 1. Spread plate Spread plate adalah teknik isolasi bakteri dengan cara menginokulasikan suspensi bahan yang mengandung bakteri ke atas medium agar dan diratakan menggunakan trigalski. 2. Pour plate Teknik pour plate dilakukan dengan menaburkan agar yang belum padat bersamaan dengan suspensi bakteri ke dalam cawan petri. 3. Streak plate Streak plate adalah cara pengisolasian bakteri yang inokulasinya dilakukan dengan cara menggoreskan suspensi bahan yang mengandung bakteri pada permukaan medium dengan kawat ose. Setelah inkubasi, akan ada bekas goresan yang ditumbuhi koloni-koloni terpisah yang mungkin berasal dari satu sel bakteri. Ada 4 macam cara penggoresan yang dapat dilakukan, yaitu quadrant streak metode A, quadrant streak metode B, radiant streak, dan continuous streak [5]. Biakan mikroorganisme dipindahkan dari satu medium ke medium lainnya dengan teknik subkultur secara aseptik. Sebelum melakukan percobaan, tempat dan alat-alat yang akan digunakan harus steril. Caranya yaitu dengan menggunakan desinfektan untuk meja yang bertujuan untuk membunuh sel vegetatif, memijarkan jarum inokulasi, membakar mulut tabung sebelum dan sesudah dimasukkan jarum inokulasi, dan membakar sisi-sisi cawan petri. Ada 3 cara transfer pada teknik ini, yaitu; 1. Transfer dari medium cair ke medium cair lain 2. Transfer dari medium agar miring ke medium agar miring lain 3. Transfer dari medium agar plate ke medium agar miring [6]. 2.3 Kerja Aseptik



Pembuatan Media Pertumbuhan Mikroba Dan Pemindahan Secara Aseptik



7



Praktikum Biokimia Tahun Akademik 2015/2016



Teknik aseptik adalah cara kerja yang menjaga sterilitas ketika menangani pengkulturan mikroorganisme untuk mencegah kontaminasi terhadap kultur mikroorganisme yang diinginkan. Dasar digunakannya teknik aseptik adalah ada banyaknya partikel debu yang mengandung mikroorganisme yang mungkin dapat masuk ke dalam cawan, mulut erlenmeyer, atau mengendap di area kerja. Pertumbuhan mikroba ini dapat mempengaruhi hasil percobaan. Oleh karena itu, dibutuhkan teknik aseptik untuk meminimalisir terkontaminasinya material yang digunakan [5]. Teknik aseptik seharusnya digunakan saat kita bekerja dengan mikroorganisme hidup dan dengan segala media pertumbuhannya. Selain itu, digunakan saat kita bekerja menggunakan agen atau senyawa yang berbahaya seperti bahan kimia beracun atau bahan radioaktif. Ada beberapa cara yang dapat diterapkan saat melakukan teknik aseptis, yaitu: 1. Minimalisasi gerak 2. Minimalisasi jarak 3. Minimalisasi keterpaparan [5]. Kontaminan asal udara sering terdapat dalam medium, karena udara selalu mengandung partikel debu tempat komunitas mikroba. Transfer aseptik suatu biakan dari satu tabung medium ke tabung lainnya biasa dilakukan dengan menggunakan jarum inokulasi atau ose yang disterilkan dengan cara membakar di atas api. Biakan juga dapat dipindahkan dari permukaan lempeng agar, sebagai tempat perkembangan koloni dimana sel mengalami pertumbuhan dan pembelahan. Metode utama yang digunakan untuk memperoleh kultur murni dari komunitas mikroba yang mengandung beberapa mikroba yang berbeda dilakukan dengan memilih koloni koloni yang terpisah dan menggoreskan pada lempeng agar dengan metode gores, sehingga diperoleh koloni mikroba yang murni [6].



Pembuatan Media Pertumbuhan Mikroba Dan Pemindahan Secara Aseptik



8



Praktikum Biokimia Tahun Akademik 2015/2016



BAB III. METODOLOGI PENELITIAN 3.1 Tempat dan Waktu Praktikum Praktikum ini dilaksanakan dilaboratorium pendidikan III jurusan Kimia, fakultas MIPA, Universitas Andalas pada hari Senin, 7 September 2015. 3.2 Alat dan Bahan 3.2.1 Alat No Alat 1 Autoclave 2 Petridish 3 Tabung reaksi 4 Kapas & kasa steril 5 Aluminium Foil 6 Magnetik stirrer 7 Jarum ose 8 Kaca arloji 9 Lampu spiritus 10 Erlenmeyer 250 mL 11 Erlenmeyer 100 mL 12 Spatula 13 Hot plate 14 Pinset steril 15 Sarung tangan 16 Pipet tetes 17 Turbidimeter/spektrofotometer 18 Tabung eppendorf 2 mL



Fungsi Untuk memanaskan pada suhu tertentu Sebagai wadah medium Sebagai wadah cair dan padat Sebagai penutup tabung reaksi Sebagai pembungkus Seabagai alat pengaduk Sebagai alat metode gores Sebagai wadah saat penimbangan Sebagai pemanas (penjaga steril) Sebagai wadah media Sebagai wadah media Sebagai alat untuk mengambil Sebagai pemanas Alat untuk mengambil Alat pelindung Untuk memipet Untuk mementukan kadar Sebagai tempat mikroba



3.2.2 Bahan No Bahan Fungsi 1 Aquades Sebagai pelarut 2 Agar Sebagai bahan pembuat media 3 Tripton/pepton Sebagai bahan dasar media 4 Ekstrak kahmir (Yeast) Sebagai bahan dasar media 5 NaCl Sebagai bahan dasar media 6 0,18 M H2SO4 Sebagai bahan standard Mcfarland 7 0,048 M BaCl2 Sebagai bahan standard Mcfarland 8 CaCl2 Pengkeruh 9 Isolat E.Coli Mirkoba yang diinokulasi 10 Isolat Staphylococcus aureus Mirkoba yang diinokulasi 3.3 Skema Kerja 3.3.1 Pembuatan medium Pertumbuhan Padat dan Cair 1 g pepton; 0,5 g ekstrak khamir dan 1 g NaCl Pembuatan Media Pertumbuhan Mikroba Dan Pemindahan Secara Aseptik



9



Praktikum Biokimia Tahun Akademik 2015/2016



-



dimasukkan ke dalam beaker 100 ml ditambahkan aquades sampai 100 ml diaduk sampai larut dan diatur pH 7,5 dengan NaOH



Media LB cair



30 ml LB cair -



70 ml LB cair



ditutup rapat dengan aluminium foil disterilkan selama 20 menit pada suhu 1210C dibagi ke dalam 4 tabung reaksi



Media LB cair di 4 tabung reaksi



-



ditambahkan 2,5 g agar dididihkan diautoclave dengan erlenmeyer 250 ml, ditutup rapat



-



Media LB padat didinginkan



-



5 ml LB padat ke 4 tabung reaksi -



3.3.2



ditutup dengan kapas-kaca steril dimiringkan



10-15 ml media LB ke 6 cawan petridish -



dibiarkan mengeras



Teknik Pemindahan Mikroorganisme secara Aseptik dengan Metoda Streaking Biakan E.coli dan S.aureus



- Dan dipanaskan danSecara ditutup Pembuatan Media Pertumbuhan Mikroba Pemindahan Aseptik



- jarum ose dipoijarkan lagi -- lakukan hal yangjarum samaose pada tabung diambil dengan Tabung agar berisi bakteri - lainnya diinokulasikan ke medium steril



10



Praktikum Biokimia Tahun Akademik 2015/2016



diinokulasi pada agar miring dan cawan petridish



-



-



dipegang tabung berisi biakan dan tabung agar steril dengan tangan kiri dipijarkan jarum ose diangkat kedua penutup tabung dipanaskan kedua mulut tabung pada api



Biakan murni



Mulut tabung



Medium cawan -



-



3.3.3



cawan berisi biakan dipegang dengan tangan kiri dibuka tutupnya dan dipanaskan biakan diambil dengan cara menarik garis lurus dan sebarkan dengan gerakan tunggal ditutup cawan petri, dipanaskan lagi diinkubasi biakan, diamati dan difoto



Inokulasi Mikroba pada Media Cair Tabung agar berisi biakan -



ditambahkan 1 ml aquades, kerik dengan jarum ose dipindahkan ke tabung LB cair, diaduk perlahan



Pembuatan Media Pertumbuhan Mikroba Dan Pemindahan Secara Aseptik



11



Praktikum Biokimia Tahun Akademik 2015/2016



Media LB cair + biakan -



diinokulasi pada suhu 370C selama 12-24 jam diamati pertumbuhan Kultur cair bakteri disimpan dalam tabung eppendorf 2 ml dengan ditambahkan 0,5 ml gliserol



-



Stok gliserol bakteri



3.3.4



Pembuatan Standard McFarland 99,5 ml 0,18 M H2SO4



-



dicampurkan dengan 0,5 ml 0,048 M BaCl2 diukur kekeruhan Standard McFarland 0,5 (absorban 0,08-0,1) menunjukkan suspensi homogen E.coli mengandung 1,5 x 108 sel per ml



Hasil



3.4



Skema Alat



3 1



2



Pembuatan Media Pertumbuhan Mikroba Dan Pemindahan Secara Aseptik



12



Praktikum Biokimia Tahun Akademik 2015/2016



4



5



Keterangan : 1. Erlenmeyer 2. Autoclave 3. Hot plate 4. Petridish 5. Jarum ose



BAB IV. HASIL DAN PEMBAHASAN 4.1



Hasil Pengamatan No Gambar



1



Keterangan E.coli pada medium LB padat dalam petridish setelah inkubasi. Koloni E.coli berbentuk halus, bulat, mengkilap, besar, menonjol, berwarna kuning pudar.



Pembuatan Media Pertumbuhan Mikroba Dan Pemindahan Secara Aseptik



13



Praktikum Biokimia Tahun Akademik 2015/2016



2



S.aureus pada medium LB padat dalam petridish setelah inkubasi. Koloni S.aureus berbentuk halus, menonjol, berwarna kuning pudar.



3



E.coli dan S.aureus pada agar miring (media pertumbuhan padat) setelah inkubasi. Koloni berbentuk halus, berwarna kuning pudar.



4



E.coli dan S.aureus pada media pertumbuhan cair setelah inkubasi. Koloni kedua bakteri berbentuk seperti gumpalan yang terapung berwarna kuning pudar.



Pembuatan Media Pertumbuhan Mikroba Dan Pemindahan Secara Aseptik



14



Praktikum Biokimia Tahun Akademik 2015/2016



4.2 Pembahasan Pembuatan media untuk pertumbuhan mikroba, telah dibuat dengan 2 jenis media yaitu media padat dan media cair. Dalam proses pembuatannya kedua media, digunakan nutrien yang sama yaitu 1 gram pepton, 1 gram NaCl dan 0,5 gram ekstrak khamir. Ekstrak khamir yang digunakan mengandung karbohidrat yang merupakan nutrisi utama yang harus ada pada medium. Tripton atau pepton digunakan sebagai sumber protein bagi mikroba yang merupakan salah satu senyawa metabolit primer yang dibutuhkan makhluk hidup setelah karbohidrat. Selain itu, NaCl digunakan sebagai sumber mineral bagi mikroba. Pada tahapan awal pembentukan media pH diatur dengan menambahkan NaOH. Pelarutan dan pengadukan seluruh nutrient berfungsi untuk menghomogenkan nutrien tersebut sehingga media cair dihasilkan. Sedangkan media padat merupakan media cair yang dipadatkan dengan menggunakan agar-agar. Agar yang diberikan tidak boleh terlalu banyak karena media yang terlalu padat sangat rentan untuk terkontaminasi. Setiap nutrien yang digunakan merupakan sumber nutrisi bagi pertumbuhan mikroba. Media cair dan media padat disterilkan didalam autoclave selama 20 menit, bertujuan membunuh bakteri atau mikroba yang tidak diinginkan didalam media, sehingga cara ini disebut pembuatan media secara aseptik. Autoclave merupakan cara mensterilkan dengan menggunakan alat yang dapat memberikan uap panas (steam), sehingga mikroba yang ada dapat dimatikan. Semua pengerjaan yang dilakukan selama percobaan ini harus aseptik. Sterilisasi dilakukan pada suhu 121oC karena jika digunakan suhu yang lebih tinggi dapat merusak nutrisi pada medium tersebut.



Pembuatan Media Pertumbuhan Mikroba Dan Pemindahan Secara Aseptik



15



Praktikum Biokimia Tahun Akademik 2015/2016



Pemindahan bakteri atau inokulasi bakteri atau mikroba kedalam media juga dilakukan secara aseptik, inokulasi mikroba kedalam media menggunakan jarum ose yang disterilkan. Tidak hanya itu teknik aseptik juga diaplikasikan pada tempat media yaitu tabung reaksi dan petridish. Alat-alat proses inokulasi disterilkan dengan dipanaskan pada api sehingga mencegah kontaminasi. Inokulasi bakteri sumber ke media dilakukan secara streaking atau penggoresan. Metoda penggoresan yang dilakukan yaitu continuous streak. Penggoresan bakteri dilakukan secara zigzag sehingga bakteri yang ditumbuhkan tersebar merata pada media. Inokulasi bakteri dilakukan secara aseptik sehingga dilakukan didalam entkas sehingga media tidak terkontaminasi. Jarum Ose dipanaskan untuk membunuh bakteri atau kontaminan yang ada pada jarum Ose. Inokulasi dilakukan jika jarum ose telah dingin, karena jarum ose yang masih panas dapat menyebabkan bakteri yang akan diinokulasi juga mati. Selain pensterilan alat, media dan penggunaan entkas. Teknik lain yang termasuk dalam teknik aseptik yaitu pencucian tangan dengan menggunakan alkohol, sehingga tangan steril dalam melakukan proses inokulasi bakteri. Inkubasi bakteri dilakukan setelah proses inokulasi sehingga, setelah inkubasi bakteri pada media dapat dihasilkan. Setelah diinkubasi dilakukan dedukasi yaitu suatu cara untuk merusak atau menghancurkan bakteri yang tidak digunakan lagi. Berfungsi agar bahan tersebut tidak menimbulkan bahaya bagi lingkungan yang dikenai atau dikontaminasi olehnya.



Pembuatan Media Pertumbuhan Mikroba Dan Pemindahan Secara Aseptik



16



Praktikum Biokimia Tahun Akademik 2015/2016



BAB V. PENUTUP 5.1



Kesimpulan Berdasarkan percobaan yang telah dilakukan dapat disimpulkan: 1. Media pertumbuhan mikroba yang dibuat yaitu medium Luria Bertani (medium LB) dengan komposisi yaitu tripton atau pepton, ekstrak khamir, dan NaCl yang sesuai dengan kebutuhan nutrisi mikroba sehingga mikroba dapat tumbuh dan berkembang biak dengan baik. 2. Mikroba diinokulasi dari biakan ke media padat maupun media cair secara aseptik dengan metoda Continuous Streaking. 3. Media padat datar dan miring bertujuan untuk menumbuhkan dan meremajakan bakteri sedangkan media cair bertujuan untuk mengembang biakan bakteri.



5.2



Saran Agar hasil percobaan selanjutnya lebih baik maka disarankan: 1. Teliti dalam melakukan penimbangan bahan sumber nutrien bagi mikroba. Pastikan nutrien yang diberikan cukup untuk pertumbuhan dan perkembang biakan mikroba. 2. Lakukan proses sterilisasi dengan sempurna agar biakan yang ditumbuhkan tidak terkontaminasi oleh mikroorganisme lain. 3. Lakukan pengerjaan secara aseptik



Pembuatan Media Pertumbuhan Mikroba Dan Pemindahan Secara Aseptik



17



Praktikum Biokimia Tahun Akademik 2015/2016



DAFTAR PUSTAKA 1. Agustiani, Dwi dkk. Pengaruh pH dan Substrat Organik Terhadap Pertumbuhan dan Aktivitas Bakteri Pengoksidasi Amonia. 2004 2. Dwidjoseputro, D. 1994. Dasar-dasar Mikrobiologi. Jakarta: Djambatan 3. Pelczar, Michael J.Jr dan E.Cs Chan. 1986.Dasar-dasar Mikrobiologi 1. Penerbit Universitas Indonesia : Jakarta. 4. Ratna, Siti Hadioetomo. Mikrobiologi Dasar Dalam Praktek. Jakarta : Gramedia. 5. http://artikelteknikkimia.blogspot.co.id/2012/02/tes-jurnal-praktikum mikrobiologi-jilid_25.html Jum’at 4 September 2015, 21.00 WIB. 6. https://sketsaistjourney.wordpress.com/2013/03/28/pembuatan-media mikroorganisme/ Jum’at 4 September 2015, 21.00 WIB.



Pembuatan Media Pertumbuhan Mikroba Dan Pemindahan Secara Aseptik



18



Praktikum Biokimia Tahun Akademik 2015/2016



Lampiran 1. Tugas Sebelum Percobaan 1. Jelaskan cara mengisolasi bakteri dan jamur dari alam Jawab: a. Cara penggoresan - Penggoresan yang sempurna akan menghasilkan koloni terpisah - Bakteri anaerob tidak dapat tumbuh b. Cara penanaman - Spread plate: menyebarkan suspensi bakteri di permukaan agar diperoleh kultur murni - Pour plate: menggunakan agar yang belum padat untuk dituangkan bersama suspensi bakteri keadaan cawan petri untuk dihomogenkan c. Teknik pengenceran bertingkat untuk memperkecil jumlah mikroba yang tersuspensi. 2. Jelaskan dan tuliskan contoh jenis jenis media kultur mikroba Ditinjau dari bentuknya, jenis media dapat dikelompokkan menjadi tiga, yaitu : 1. Media padat Media padat yaitu media yang mengandung agar. Jumlah agar yang ditambahkan tergantung kepada jenis atau kelompok mikroba yang ditumbuhkan. 2. Media cair Umumnya media cair digunakan untuk menambah biomassa sel. Jika ke dalam media tidak ditambahkan zat pemadat. Media cair diperguakan untuk pertumbuhan bakteri, ragi dan mikroalga. 3. Media semi padat Jika penambahan zat pemadat hanya setengah atau kurang dari seharusnya. Ini umumnya diperlukan untuk pertumbuhan mikroba yang



Pembuatan Media Pertumbuhan Mikroba Dan Pemindahan Secara Aseptik



19



Praktikum Biokimia Tahun Akademik 2015/2016



banyak memerlukan kandungan air dan hidup anaerobik atau fakultatif untuk menambah biomassa sel. Berdasarkan susunan bahan yang digunakan, media kultivasi dapat dibedakan menjadi : 1. Media alami Media alami yaiu media yang disusun oleh bahan-bahan alami seperti kentang, telur, dan daging. Pada saat ini media alami yang banyak digunakan adalah dalam bentuk kultur jaringan tanaman atau hewan. Contoh penggunaan media alami adalah telur yang digunkan untuk pertumbuhan dan perkembangbiakan virus. 2. Media sintetik Media sintetik yaitu media yang disusun oleh senyawa kimia. Misalnya media untuk pertumbuhan dan perkembangbiakan Clostridium. 3. Media semi sintetik Media semi sintetik yaitu media yang tersusun oleh campuran bahanbahan alami dan bahan-bahan sintesis.Misalnya kaldu nutrisi, wortel agar. Berdasarkan tujuannya media dapat dibedakan menjadi: 1. Media untuk isolasi, media ini mengandung semua senyawa esensial untuk pertumbuhan mikroba, misalnya Nutrient Broth, Blood Agar. 2. Media selektif/penghambat, media yang selain mengandung nutrisi juga ditambah suatu zat tertentu sehingga mediatersebut dapat menekan pertumbuhan mikroba lain dan merangsang pertumbuhanmikroba yang diinginkan. Contohnya adalah Luria Bertani medium yang ditambah Amphisilin untuk merangsang E.coli resisten antibotik dan menghambat kontaminan yang peka Amphisilin. Salt broth yang ditambah NaCl 4% untuk membunuh Streptococcus agalactiae yang toleran terhadap garam. 3. Media diperkaya (enrichment), media diperkaya adalah media yang mengandung komponen dasar untuk pertumbuhan mikroba dan ditambah komponen kompleks seperti darah, serum, kuning telur. Media diperkaya juga bersifat selektif untuk mikroba tertentu. Bakteri yang ditumbuhkan dalam media ini tidak hanya membutuhkan nutrisi sederhana untuk berkembang biak, tetapi membutuhkan komponen kompleks, misalnya Blood Tellurite Agar, Bile Agar, SerumAgar, dll. 4. Media untuk peremajaan kultur, media umum atau spesifik yang digunakan untuk peremajaan kultur 5. Media untuk menentukan kebutuhan nutrisi spesifik, media ini digunakan unutk mendiagnosis atau menganalisis metabolisme suatu mikroba.



Pembuatan Media Pertumbuhan Mikroba Dan Pemindahan Secara Aseptik



20



Praktikum Biokimia Tahun Akademik 2015/2016



Contohnya adalah Koser’s Citrate medium, yang digunakan untuk menguji kemampuan menggunakan asam sitrat sebagai sumber karbon. 6. Media untuk karakterisasi bakteri, media yang digunakan untuk mengetahui kemempuan spesifik suatu mikroba. Kadang-kadang indikator ditambahkan untuk menunjukkan adanya perubahan kimia. Contohnya adalah Nitrate Broth, Lactose Broth, Arginine Agar. 7. Media diferensial, media ini bertujuan untuk mengidentifikasi mikroba dari campurannya berdasar karakterspesifik yang ditunjukkan pada media diferensial, misalnya TSIA (Triple Sugar IronAgar) yang mampu memilih Enterobacteria berdasarkan bentuk, warna, ukuran koloni dan perubahan warna media di sekeliling koloni. 3. Jelaskan perbedaan dan kegunaan metoda inokulasi bakteri a. Metoda Gores Teknik ini lebih menguntungkan dari segi ekonomi dan waktu, tetapi memerlukan keterampilan. Cara penggoresan dilakukan pada medium pembiakan padat bentuk lempeng untuk meremajakan kultur ke medium baru. b. Pour plate Teknik ini membutuhkan agar yang kurang padat c. Spread plate Menyebarkan suspense bakteri di permukaan agar diperoleh kultur murni



Pembuatan Media Pertumbuhan Mikroba Dan Pemindahan Secara Aseptik



21



Praktikum Biokimia Tahun Akademik 2015/2016



Lampiran 2 . Respon Analisa Masalah 1. Jelaskan judul, tujuan dari praktikum ! Jawab: Judul dari praktikum kali ini adalah Pembuatan Media Pertumbuhan Mikroba dan Pemindahan Secara Aseptik, dengan tujuannya adalah: a. Mampu membuat media pertumbuhan mikroba yang berbentuk cair dan padat. b. Melakukan inokulais mikroba kedalam medium pertumbuhan cair dan padat. c. Melatih keterampilan bekerja secara aseptic. 2. Jelaskan jenis-jenis media berdasrkan fasanya ! Jawab: Berdasarkan bentuk media, dapat pula dikelompokkan menjadi tiga bentuk: a. Media padat Media padat merupakan media yang mengandung agar. Adanya penambahan karagen atau agar,gelatin,silica gel yg di tempatkan pada plate atau tabung bahan agar yg utama ada galaktan (komplek karbohidrat yg diekstrak dari alga genus gelidium) agar akan larut atau cair pada suhu hampir 100⁰c dan akan cair apabila kurang lebih 43⁰c b. Media cair Media cair digunakan untuk menambah biomassa sel. Jika ke dalam media tidak ditambahkan zat pemadat. Media cair dipergunakan untuk pertumbuhan bakteri, ragi dan mikroalga. c. Media setengah padat ( semisolid )



Pembuatan Media Pertumbuhan Mikroba Dan Pemindahan Secara Aseptik



22



Praktikum Biokimia Tahun Akademik 2015/2016



Penambahan jumlah agar separuh dari komposisi,di tempatkan pada tabung tegak untuk melihat motilitas ( pergerakan ) mikrobia, contohnya: cary,blair. 3. Jelaskan jenis-jenis media utk bakteri! Jawab : a. Media Alami: media yang disusun oleh bahan-bahan alami (kentang, touge, daging, umbi-umbian dan sebagainya). Pada saat ini media alami yang banyak digunakan adalah dalam bentuk kultur jaringan. Contoh media alami yang paling banyak digunakan adalah penggunaan telur untuk pertumbuhan dan perkembang biakan virus. b. Media Sintetik/buatan: Media yang disusun oleh senyawa-senyawa kimia baik organik maupun anorganik.Contoh media sintetik bagi pertumbuhan bakteri Clostridium. K2HPO4 (0,5 gram), KH2PO4 (0,5 gram), MgSO4 (0,1 gram), NaCl (0,1 gram), dan CaCO3 secukupnya c. Media Semi Sintetik: Media yang tersusun oleh campuran bahan-bahan alami dan bahan-bahan sintetik. Seperti kaldu nutrisi untuk pertumbuhan bakteri(Pepton10 gram, Ekstrak daging 10 gram, NaCl 5 gram, dan Aquades1 liter) 4. Jelaskan perbedaan komponen dan kegunaan media yg digunakan (padat dan cair) ! Jawab: a. Media padat: menggunakan tepung agar, jumlah tepung agar yang ditambahkan tergantung kepada jenis mikroba yang dibiakkan. Bila mikroba memerlukan kadar air tinggi maka jumlah tepung agar harus rendah/sedikit, tetapi bila kadar air harus rendah makan penambahan tepung agar harus lebih banyak. Media padat umumnya dipergunakan untuk bakteri, ragi, jamur dan akadang-kadang mikroalgae. Media ini terdiri dari tiga macam bentuk, yaitu bentuk lempeng (media dibekukan di dalam cawan petridish), dan bentuk miring (media dibekukan dalam keadaan miring di dalam tabung rFXeaksi). b. Media cair: ke dalam media tidak ditambahkan zat pemadat. Umumnya dipergunakan untuk pembiakan mikroalgae, kadang-kadang bakteri dan ragi. 5. Jelaskan teori-teori mengenai kerja optik dan kontaminasi! Jawab: Teknik aseptik merupakan cara kerja yang menjaga sterilitas ketika menangani pengkulturan mikroorganisme untuk mencegah kontaminasi terhadap kultur mikroorganisme yang diinginkan. Dasar teknik aseptik adalah ada banyaknya partikel debu yang mengandung mikroorganisme yang mungkin dapat masuk ke dalam cawan, mulut erlenmayer, atau mengendap di area kerja. Pertumbuhan mikroba ini dapat mempengaruhi hasil percobaan. Teknik aseptis digunakan saat bekerja dengan mikroorganisme hidup dan dengan segala media pertumbuhannya. Selain itu, digunakan saat bekerja



Pembuatan Media Pertumbuhan Mikroba Dan Pemindahan Secara Aseptik



23



Praktikum Biokimia Tahun Akademik 2015/2016



menggunakan agen atau senyawa yang berbahaya seperti bahan kimia beracun atau bahan radioaktif. Ada beberapa saran yang dapat diterapkan saat melakukan teknik aseptis, yaitu: minimalisasi gerak, minimalisasi jarak, minimalisasi keterpaparan. 6. Jelaskan teknik-teknik inokulasi dan teknik apa yang dipraktikumkan? Jawab: a. Metode gores: Penggoresan yangsempurna akan menghasilkan koloni yang terpisah. Inokulum digoreskan di permukaanmedia agar nutrien dalam cawaan petri dengan jarum pindah (lup inokulasi). Di antaragaris-garis goresan akan terdapat sel-sel yang cukup terpisah sehingga dapat tumbuhmenjadi koloni.Cara penggarisan dilakukan pada medium pembiakan padat bentuk lempeng. b. Pour plate Teknik ini membutuhkan agar yang kurang padat c. Spread plate Menyebarkan suspense bakteri di permukaan agar diperoleh kultur murni Pada praktikum yang digunakan adalah metoda gores. 7. Jelaskan tujuan penambahan gliserol Jawab: Sebagai sumber makanan dari bakteri yang akan dibiakkan.



Pembuatan Media Pertumbuhan Mikroba Dan Pemindahan Secara Aseptik



24