Biokim 2 Campuran Literatur [PDF]

Citation preview

Pengukuran kadar protein dapat dilakukan dengan berbagai metode. Metode spektrofotometri merupakan metode yang menggunakan prinsip absorbansi dan transmisi cahaya dalam mengukur konsentrasi suatu senyawa (Lestari 2010). Dasar penggunaan metode spektrofotometri adalah dengan menggunakan metode Lowry dan Bradford. Prinsip metode Lowry adalah terbentuknya warna biru akibat penambahan pereaksi Folin Ciocalteau dan Biuret. Terbentuknya warna biru tersebut disebabkan oleh reaksi ion Cu2+ dengan ikatan peptida dalam larutan alkalis pada saat penambahan pereaksi biuret serta terjadinya reaksi reduksi pereaksi Folin Ciocalteau dengan asam amino dalam protein (Kolakowski 2012). Sedangkan, prinsip metode Bradford adalah adanya ikatan antara protein dengan CBB-G250 (Coomassie Brilliant Blue-G250) dalam keadaan asam. CBB yang awalnya berwarna merah akan berubah warna menjadi biru pada saat berikatan dengan protein sehingga terjadi perubahan panjang gelombang pewarna dari 465 nm menjadi 595 nm (Walker 2002). Dalam



chapso, lubrol, tris, Triton X-100, dll. Ammonium sulfat, lubrol, chaps, chapso, cesium bikarbonat merupakan contoh senyawa pengganggu yang dapat mengendapkan protein. Glisin (lebih besar dari 0,5%) dan EDTA adalah contoh senyawa pengganggu yang menyebabkan tidak terbentuknya warna biru pada reaksi (Walker 2002). Selain itu juga ada merkaptan (2-mercaptoethanol) dan Ditiotreitol



(DTT)



yang



merupakan



senyawa



pengganggu yang mereduksi protein untuk bereaksi dengan pewarna (Owusu 2002). Selain



menggunakan



metode



Lowry,



pengukuran kadar protein juga dapat dilakukan dengan metode Bradford. Metode Bradford merupakan metode



standar,



pewarna Coomassie Brilliant Blue (CBB). CBB akan



absorbansi, maupun konsentrasi protein dalam sampel.



berikatan dengan protein pada sampel larutan dalam



Hal tersebut diakibatkan



suasana asam. Dengan demikian, absorbansinya protein



pada



terdapat



glukosa, EDTA, NaCl, sorbitol, octyl glucoside, chaps,



pengukuran konsentrasi protein total yang melibatkan



baik



ini,



ammonium sulfat, cesium bikarbonat, glisin, sukrosa,



beberapa



kesalahan



percobaan



hasil pengukuran. Contoh senyawa tersebut diantaranya



pembuatan



kurva



Metode Lowry merupakan metode pengukuran 2+



konsentrasi protein dengan prinsip reduksi Cu menjadi



dapat diukur menggunakan spektrofotometri pada panjang gelombang 465-595 nm (Caprette 2005).



+



Cu oleh asam amino (tirosin, triptofan, sistein) yang ada dalam larutan protein. Ion Cu+ bersama dengan fosfotungstat dan fosfolibdat dalam pereaksi FolinCiocalteau akan membentuk warna biru yang dapat menyerap cahaya (Purwoko 2007). Warna biru yang



Gambar 3 Struktur Coomassie Brilliant Blue G-250



muncul akan dideteksi pada panjang gelombang 750 nm



([UA] 2009).



(sensitivitas yang tinggi untuk konsentrasi protein yang Prinsip



kecil) atau 500 nm (sensitivitas yang rendah untuk



spektrofotometri



yaitu



pengukudan



konsentrasi protein yang tinggi). Metode Lowry mampu



absorbsi cahaya yang melalui suatu larutan pada panjang



mengukur kadar protein sampai dengan 5 μg (Nielsen



gelombang tertentu. Melalui nilai absorbansi, dapat



2010). Reagen yang digunakan pada metode Lowry



ditentukan konsentrasi zat terlarut dalam sampel. Jumlah



adalah pereaksi Folin-Ciocalteau dan peraksi Biuret.



cahaya yang diabsorbsi oleh larutan sebanding dengan



Pereaksi



konsentrasi zat terlaut (Lestari 2007). Spektrofotometri



Folin



Ciocalteau



dibuat



dengan



cara



mengencerkan reagen Folin Ciocalteau, sedangkan



berbeda



dengan



kolorimetri.



Kolorimetri



sendiri,



pereaksi Biuret dibuat dengan mencampurkan 50 mL



merupakan metode analisa kimia yang didasarkan pada



reagen A (2 % Na2CO3, 0.4% NaOH) dengan 1 mL



kesamaan besaran warna antara larutan sampel dengan



reagen B (0.5% CuSO4, 1% Na-K tartrat) (Owusu 2002).



sumber cahaya polikromatis dan detektor mata. Metode



Pada metode Lowry terdapat banyak senyawa



ini berdasar pada penyerapan cahaya tampak dan energi



pengganggu yang dapat bereaksi dan mempengaruhi



radiasi lainnya oleh suatu larutan (Amanda 2011). Jadi, kolorimetri merupakan pengukuran warna, yang berarti



sinar yang digunakan adalah sinar daerah tampak.



metode UV-280 nm absorption. Selain itu, metode



Sedangkan, metode spektrofotometri tidak terbatas pada



Lowry lebih spesifik daripada metode lain dan



penggunaan sinar daerah tampak, tetapi dapat juga



relatif sederhana dalam eksekusinya sehingga tidak



menggunakan sinar UV maupun sinar infra merah



membutuhkan waktu terlalu lama, sekitar 1-1,5 jam.



(Natalia 2010).



Turbiditas sampel tidak berpengaruh dalam metode



Pada praktikum ini, digunakan larutan BSA



ini (Nielsen 2010).



dalam pembuatan kurva standar metode Bradford dan



Namun, metode Lowry memiliki beberapa



Lowry. BSA atau Bovine Serum Albumin adalah protein



kelemahan, antara lain variasi warna yang tidak



globular besar yang berukuran kurang lebih 66.000 Dal



terlalu proporsional dengan konsentrasi protein.



(Harper 2003).



Protein ini merupakan turunan dari



Selain itu, reaksi ini dapat mengalami intervensi



darah sapi sehat (Wise & Watters 2010). BSA dijadikan



senyawa-senyawa tertentu seperti sukrosa, lipid,



sebagai protein standar karena mudah didapat dalam



buffer fosfat, monosakarida, dan hexoamine hingga



keadaan murni dan relatif murah (Wrolstad et al. 2005).



mencapai



Selain itu, BSA juga bersifat sangat stabil (Estey et al.



ammonium sulfat dan senyawa sulfidril juga dapat



2006). Secara ideal, seharusnya dalam pembuatan kurva



mengintervensi reaksi pada metode Lowry (Nielsen



standar digunakan bentuk murni protein yang akan diuji.



2010). Kelemahan lain adalah reagen metode Lowry



Namun dalam kenyataannya, hal tersebut sulit dilakukan.



tidak stabil dan membutuhkam preparasi harian



Oleh karena itu, BSA dijadikan sebagai standar relatif



dengan prosedur cukup rumit, sehingga kurang



protein di samping pengembangan warnanya yang lebih



efisien dari segi waktu (Simpson 2004). Selain itu,



baik dibanding protein lain (Kirschner 2007).



warna yang terbentuk pada metode Lowry bervariasi



Pemilihan protein standar merupakan



derajat



tertentu.



Konsentrasi



tinggi



bergantung jenis protein (Nielsen 2010).



hal yang penting dalam suatu tes protein. Selain, BSA



Selain metode Lowry, dalam menentukan kadar



ada protein lain yang dapat dijadikan sebagai standar,



protein, juga dapat digunakan metode Bradford.



yaitu BGG (Bovine Gamma Globulin). BGG menjadi



Kelebihan metode ini adalah reaksinya berlangsung



pilihan yang baik, jika sampel yang diuji memiliki



sangat cepat, yaitu sekitar 2 menit dan data yang



kandungan immunoglobulin. Hal itu disebabkan oleh



dihasilkan dalam metode ini berulang atau dengan



respon



dengan



kata lain bersifat reprodusibel. Metode ini juga



immunoglobulin G (Wrolstad et al. 2005). Akan tetapi,



sangat sensitif, bahkan lebih sensitif daripada



BGG memiliki beberapa kelemahan dibandingkan



metode Lowry. Selain itu, metode ini dapat



dengan BSA. Warna yang dihasilkan oleh BSA lebih



mengukur protein atau peptida dengan massa



baik daripada BSA. BSA merupakan protein standar



molekul sama dengan atau lebih besar dari 4000 Da



yang lebih baik jika sampel yang diuji memberikan



(Nielsen 2010).



warna



BGG



yang



sangat



mirip



respon warna yang sejenis atau sampel memiliki



Namun, sama seperti metode Lowry, metode ini



kandungan utama berupa albumin (Kirschner 2007).



juga memiliki beberapa kekurangan, yaitu variasi



Selain itu, uji Bradford lebih sensitif terhadap BSA



warna yang luas sesuai dengan jenis proteinnya



dibandingkan dengan BGG (Caprette 2006).



mengakibatkan seleksi protein menjadi lebih sulit



1. Jelaskan tentang kelebihan dan kelemahan metode



sehingga harus dilakukan dengan hati-hati. Selain



Lowry dan Bradford dalam mengukur kadar protein!



itu, kompleks protein-pewarna hasil reaksinya dapat



Jawab: Kelebihan metode Lowry adalah metode ini



berikatan dengan kuvet kuartz. Untuk itu, lebih baik



sensitif, 50-100 kali lebih sensitive daripada metode



digunakan kuvet kaca atau kuvet plastik. Kelemahan



Biuret dan 10-20 kali lebih sensitive daripada



lain adalah metode ini dapat mengalami intervensi



deterjen, baik yang ionik maupun anionik seperti Triton X-100 dan Sodium Dodesil Sulfat (SDS). Namun, kesalahan akibat kandungan deterjen kurang dari 0,1% masih dapat diperbaiki melalui control yang tepat (Nielsen 2010). 2. Sebutkan metode pengukuran kadar protein lain yang ada! Jawab: Beberapa metode pengukuran kadar protein lain yaitu sebagai berikut (Nielsen 2010). 1. Metode



Kjeldahl,



yang



meliputi



tahapan



pencernaan, netralisasi, dan titrasi. 2. Metode Biuret, yang banyak digunakan untuk menentukan protein pada sereal atau kacang kedelai. 3. Metode



anionic



dye-binding,



yang



biasa



digunakan untuk menghitung kadar protein dalam susu, tepung gandum, dan daging. 4. Metode UV-280 nm absorption, yang dapat menghitung konsentrasi asam amino triptofan dan tirosin menggunakan hukum Beer. 5. Metode BCA (Bicinchoninic Acid), yang banyak digunakan dalam proses isolasi dan purifikasi protein. 6. Metode Dumas (Nitrogen Combustion)



Amanda M. 2011. Penetapan kadar kromium pada air reservoir secara kolorimetri di PDAM Tirtanadi instalasi pengolahan air sunggal [skripsi]. Medan: Universitas Sumatera Utara. Caprette DR. 2006. Protein assay [terhubung berkala]. http://www.ruf.rice.edu/~bioslabs/methods/protei n/protein.html [11 Mar 2012].. Estey T, Kang J, Schwendeman SP, Carpenter JF. 2006. BSA degradation under acidic solution: a model for protein instability during release from PLGA delivery systems. J Pharm Sci 7(95):1626-1639. Harper JW. 2003. Bovine serum albumin [terhubung berkala]. http://www.fst.ohiostate.edu/people/harper/functionalfoods/milk%20components/bovine%20serum%2 0albumin.htm [10 Mar 2012]. Kirschner MW. 2007. Biorad protein assay [terhubung berkala]. http://kirschner.med.harvard.edu/files/protocols/ BioRad_proteinassay.pdf [10 Mar 2012] Kolakowski E. 2010. Methods of Analysis of Food Components and Additives. Florida: CRC. Lestari F. 2010. Bahaya Kimia Sampling & Pengukuran Kontaminan Kimia di Udara. Jakarta: EGC.



Natalia S. 2010. Penentuan kadar klorin air baku produksi di PT. Cola-Cola bottling Indonesia Medan dengan metode kolorimetri [skripsi]. Medan: Universitas Sumatera Utara Nielsen SS. 2010. Food Analysis. New York: Springer. Owusu RK. 2002. Food Protein Analysis: Quantitative Effects on Processing. New York: Marcel Dekker. Raymond C. 2006. Kimia Dasar. Jakarta: Erlangga. Reynolds EC. 2009. Casein phosphopeptide-amorphous calcium phosphate: the scientific evidence. ADR 21:2529. Saraswati T. 2008. Efek tegdma terhadap protein total dan profil protein sel-sel pulpa gigi (in vitro) [skripsi]. Depok: Universitas Indonesia. Simpson RJ. 2004. Bahaya Purifying Proteins for Proteomics: A Laboratory Manual. New York: Cold Spring Harbore [UA] University of Arizona. 2009. Colorimetric [terhubung berkala]. http://www.biochem.arizona.edu/classes/bioc463a/Info/l ecture_notes/colorimetric.pdf [10 Mar 2012]. [UAD] Universitas Ahmad Dahlan. 2011. Sifat protein [terhubung berkala]. blog.uad.ac.id/primamitha/files/2011/12/SIFATPROTEIN.docx [10 Mar 2012]. Walker JM. 2002. The Protein Protocols Handbook. Totowa: Humana. Wrolstad RE, Decker EA, Schwatz SJ 2005. Handbook of Food Analytical Chemistry: Water, Proteins, Enzymes, Lipids, and Carbohydrates. New Jersey: John Wiley & Sons



.