Laporan ENzim Retriksi [PDF]

Citation preview

LAPORAN PRAKTIKUM BIOLOGI MOLEKULER ENZIM RETSRIKSI DAN POLYMERASE CHAIN REACTION (PCR)



Nama : Nur Afni Helia Dewi NIM : 191810401002



Laboratorium Bioteknologi Jurusan Biologi Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam Universitas Jember 2020



I.



Judul : Enzim Retsriksi Dan Polymerase Chain Reaction (PCR)



II. Tujuan Praktikum : 1. Mahasiswa mampu melakukan pemotongan DNA dengan menggunakan enzim retsriksi. 2. Mahsiswa mampu melakukan replikasi DNA secara enzimatik dan in vitro menggunakan mesin PCR.



III. Alat dan Bahan 3.1 Enzim Restriksi Alat :



1. Pipet mikro 20µl 2. Pipet mikro 200µl 3. Tabung mikro 1,5mL 4. Erlenmeyer 125mL 5. Elektroforesis gel mini 6. UV-transilluminator



Bahan :



1. Plasmid enzim restriksi dan buffernya 2. ddH2O steril atau 1x TE pH 8.0 dan RNA-ase 3. Standar ukuran molekul DNA 4. Agarose 5. 1x TBE 6. Sample buffer 7. Larutan ethidium bromide 3g/ml



3.2 Polymerase Chain Reaction (PCR) Alat :



1. Mesin PCR



Bahan :



1. DNA template hasil isolasi bakteri 2. Primer: 27F (5’ AGA GTT TGA TCM TGG CTG AG 3’) 533F (5’ GTG CCA GCM GCC GCG GTA A 3’) 907R (5’ CCG TCA ATT CMT TTG AGT TT 3’)



1492R (5’ GGT TAC CTT ACG AT T3’) 3. PCR master mix 4. TBE 1x 5. Agarose Gel Elektroforesis (AGE 1%).



IV. Skema Kerja 4.1 Enzim Restriksi Dimasukkan DNA plasmid, 10x Buffer, Enzim restriksi, ddH2O steril, RNA-ase ke dalam eppendorf



Diinkubasi pada 37ºC, 2 jam



Disiapkan gel agarose 1%



Dituangkan (setelah dingin) pada cetakan gel mini



Dimasukkan dalam wadah elektroforesis



Ditambahkan buffer TBE (menggenangi permukaan agarose)



Dirunning pada 100 mA ±30 menit



Divisualisasikan dengan UV transilluminator



Hasil



4.2 Polymerase Chain Reaction (PCR) Direaksikan 15 µl aquades steril, 25 µl 2x PCR Master Mix, 1,25 µl forward primer dan reverse primer dan 2 µl ekstrak DNA



Dikondisikan PCR yaitu initial denaturation 94ºC 5 menit, 9 siklus pada 94ºC 5



menit, annealing 56ºC 1 menit, extention 72ºC 1 menit, 24 siklus pada 94ºC 1 menit, annealing 53ºC 1 menit, extention 72ºC 10 menit.



Dirunning PCR



Hasil



V. Hasil dan Pembahasan 5.1 Hasil Hasil yang didapat pada acara enzim retsriksi adalah berupa fragmen-fragmen DNA dan Polymerase Chain Reaction (PCR) berupa fragmen DNA spesifik dengan panjang dan sekuen yang telah ditentukan.



5.2 Pembahasan Praktikum kali ini dengan acara enzim retsriksi dan Polymerase Chain Reaction (PCR) yang akan membahas mengenai proses pemotongan sekuen DNA dengan enzim restriksi dan proses replikasi DNA secara enzimatik dan in vitro serta fungsi dari setiap perlakuan. Larutan yang digunakan pada acara enzim retsriksi adalah enzim restriksi, buffer, ddH2O steril dan RNA-ase. Bahan yang digunakan pada acara Polymerase Chain Reaction (PCR) yaitu PCR master mix, primer forward dan primer reverse. Menurut Loodish dkk (2004), Restriksi DNA merupakan suatu proses pemotongan DNA dengan penggunaan enzim restriksi pada sisi yang spesifik atau sisi pengenalan (recognition site). Menurut Yuwono (2005), Enzim restriksi merupakan suatu enzim yang berperan dalam memperoleh urutan DNA dengan cara memotong genom DNA menjadi fragmen-fragmen pada ikatan fosfodiester untaian DNA. Enzim restriksi yang diproduksi oleh bakteri disebut sebagai endonuclease yang mampu membaca atau mengenali 4 hingga 8 pb urutan nukleotida secara spesifik. Urutan nukleotida yang spesifik tersebut disebut restriction sites. Restriction sites merupakan sekuen polindromic yang ukurannya pendek dengan pola urutan sekuen sama ketika dibaca pada arah 5’ menuju 3’.



Menurut Loodish dkk (2004), Terdapat empat jenis enzim nuclease restriksi yang digolongkan berdasarkan komposisi, jenis kofaktor dan target DNA yang akan dipotong yaitu Enzim Tipe I, Tipe II, Tipe III dan Tipe IV. Enzim Tipe I dimana struktur lebih kompleks dan membutuhkan ATP dan S-adenosyl-Lmethionine sedangkan Enzim Tipe II dapat memotong DNA pada siklus pengenalannya dan membutuhkan magnesium. Enzim Tipe III dimana membutuhkan ATP tetapi tidak menghidrolisisnya dan S-adenosyl-L-methionine untuk merangsang reaksi sedangkan pada Enzim Tipe IV dimana enzim ini berfokus pada proses metilasi DNA. Menurut Yuwono (2008), Terdapat dua jenis enzim restriksi berdasarkan lokasi pemotongan yaitu sticky end dan blunt end. Hasil pemotongan enzim restriksi yang menghasilkan ujung lancip disebut sticky end dan yang menghasilkan ujung tumpul disebut blunt end. Menurut Allison (2007), Mekanisme kerja enzim restriksi yaitu dilakukan proses scanning pada untaian DNA dalam menemukan restriction sites yang spesifik. Melakukan proses sliding dimana terjadi pergerakan sepanjang lekukan DNA. Enzim restriksi yang telah mengenali daerah restriction sites akan merubah konformasinya sehingga akan dilakukan pemotongan. Pemotongan dilakukan pada dua ikatan gula deoksiribosa dengan fosfat dari double helix DNA yang berbeda. Hasil pemotongan yaitu gugus 3’ hidroksil dan gugus 5’ fosfat. Tahap selanjutnya DNA akan menjadi fragmen-fragmen yang telah sesuai dengan daerah pemotongannya. Enzim restriksi dapat memotong DNA menjadi fragmen dengan ujung simetris (blunt end) atau dengan ujung asimetris (sticky end). Pencampuran komponen-komponen yang terdiri dari DNA plasmid, buffer, enzim restriksi, ddH2O steril dan RNA-ase memiliki fungsi masing-masing. Menurut Farmawati dkk (2015), Penggunaan larutan buffer berperan dalam menjaga keseimbangan atau pH larutan selama proses digesti dan untuk menyesuaikan kondisi yang sesuai bagi enzim sehingga akan bekerja dengan maksimal. Menurut Ferniah dan Pujiyanto (2013), Penambahan RNA-ase dilakukan agar dapat mendegradasi RNA yang masih mengotori DNA yang telah didapatkan. Menurut Iqbal dkk (2013), ddH2O adalah air yang sangat murni yang



berfungsi sebagai pelarut semua komponen yang tidak akan digunakan dalam proses restriksi serta dapat meresuspensikan endapan DNA. Perlakuan inkubasi pada suhu 37ºC selama 2 jam juga memiliki tujuan tertentu. Menurut Syafaruddin dkk (2011), Inkubasi dilakukan agar menjaga DNA pada larutan sehingga tetap bisa bertahan dengan mengatur suhu dan waktu tertentu. Suhu yang digunakan yaitu 37ºC dan waktu yang dibutuhkan adalah 2 jam hal ini dilakukan agar aktivitas dari enzim restriksi dapat bekerja secara optimal. Menurut Suparningtyas dkk (2018), Hasil elektroforesis pada enzim restriksi yang telah dianalisis dengan gel agarose berupa molekul-molekul atau fragmen DNA dengan berbagai ukuran sesuai dengan marka (ukuran pb). Menurut Innis (1990), Polymerase Chain Reaction (PCR) merupakan suatu teknik sintesis serta amplifikasi DNA secara in vitro. Teknik PCR dapat digunakan dalam mengamplifikasi segmen DNA dalam jumlah yang banyak dengan waktu beberapa jam. Menurut Newton dan Graham (1994), PCR salah satu teknik yang melibatkan beberapa tahap yang berulang dimana terjadi duplikasi pada jumlah target DNA untai ganda. Prinsip kerja PCR melalui tahap mekanisme perubahan suhu. Siklus reaksi PCR terdiri atas 3 tahap perubahan suhu yaitu denaturasi, annealing dan polimerasi. Menurut Watson dkk (1992), Proses PCR terdapat beberapa tahap yaitu pradenaturasi DNA template, denaturasi DNA template, penempelan primer pada template (annealing), pemanjangan primer (extention) dan pemantapan (postextention). Pada tahap denaturasi DNA template sampai dengan tahap pemanjangan primer merupakan tahapan berulang dimana akan terjadi duplikasi jumlah DNA. Menurut Newton dan Graham (1994), Untai ganda DNA template akan dipisahkan dengan denaturasi thermal dan akan didinginkan hingga mencapai pada suhu tertentu dalam memberi waktu pada penempelan primer pada daerah tertentu (target DNA). Polymerase DNA digunakan dalam pemanjangan primer. Umumnya siklus ini dilakukan antara 20-40 skilus. Target DNA akan meningkat eksponensial setelah tahap pemenjangan primer (extention). Komponen-komponen yang dibutuhkan pada saat PCR yaitu DNA template, primer dan PCR master mix (nukleotida, Taq polymerase, mix buffer) memiliki



fungsi masing-masing. Menurut Yuenleni (2019), DNA template berperan sebagai cetakan untuk pembentukan molekul DNA baru. Menurut Yustinadewi dkk (2018), Primer berfungsi sebagai pembatas fragmen DNA target yang akan diamplifikasi serta untuk menyediakan gugus hidroksil ujung 3’ yang dibutuhkan untuk proses eksistensi DNA. Komponen PCR master mix yang terdiri atas nukleotida, Taq polymerase, mix buffer memiliki fungsi tertentu Menurut Innis (1990), Mix buffer berfungsi untuk menjaga PH medium selama proses replikasi dan Taq polymerase berfungsi sebagai katalis dalam reaksi polimerasi DNA. Menurut Newton dan Graham (1994), Tahap-tahap PCR meliputi tiga tahapan besar yaitu denaturasi DNA pada suhu tinggi sekitar 94ºC dimana akan menjadikan untai tunggal, tahapan penempelan (annealing) primer pada segmen DNA sekitar 55ºC dan tahap pemanjangan (extention) rantai DNA oleh Taq polymerase pada suhu 72ºC. Denaturasi DNA template dilakukan selama 30-90 detik sesuai dengan DNA templatenya. Waktu denaturasi yang lama akan menyebabkan rusaknya DNA template serta menurunkan aktivitas polimarase DNA dan waktu denaturasi yang pendek akan mengakibatkan proses denaturasi yang tidak sempurna. Penentuan waktu proses annealing sangat berkaitan dengan panjang primernya. Panjang primer 18-22 pb cukup dengan waktu 30 detik dan panjang primer lebih dari 22 pb dibutuhkan waktu 60 detik. Pemilihan waktu extention primer tergantung pada panjang fragmen DNA. Dalam mengamplifikasi setiap satu kilo basa DNA dibutuhkan waktu 30-60 detik. Menurut Yuenleni (2019), Hasil PCR akan menghasilkan banyak copy untai DNA. Analisis produk PCR dapat dilakukan analisis lebih lanjut dengan elektroforesis gel agarose dengan penggunaan larutan EtBr sebagai pewarna sekaligus penanda sebagai perbandingan marker DNA dalam menentukan panjang produk. Keberadaan DNA berupa pita terang dibawah pendaran sinar UVtrasilluminator. Perpindahan molekul DNA pada gel agarose dipengaruhi oleh ukuran DNA dimana Menurut Syahputra dkk (2016), Ukuran fragmen DNA yang lebih pendek akan mudah bermigrasi dimana paling jauh dari sumuran sedangkan ukuran fragmen DNA yang lebih besar akan sulit dalam bermigrasi sehingga akan terletak di dekat sumuran.



VI. Kesimpulan Praktikum kali ini dengan acara acara enzim retsriksi dan Polymerase Chain Reaction (PCR) dapat ditarik kesimpulan bahwa dalam melakukan melakukan pemotongan DNA dengan menggunakan enzim retsriksi diperlukan wakru 2 jam dengan suhu 37º hal ini dilakukan agar kerja dari enzim restriksi menjadi leih optimal. Hasil elektroforesis pada enzim restriksi dengan menggunakan gel agarose didapatkan fragmen DNA dengan berbagai ukuran. Replikasi DNA secara enzimatik dan in vitro menggunakan mesin PCR terdapat beberapa tahapan yaitu pra-denaturasi DNA template, denaturasi DNA template, penempelan primer pada template (annealing), pemanjangan primer (extention) dan pemantapan (postextention). Hasil dari PCR akan diperoleh banyak copy untai DNA. Analisis produk PCR dapat dilakukan analisis lebih lanjut dengan elektroforesis gel agarose dengan penggunaan larutan EtBr sebagai pewarna.



DAFTAR PUSTAKA



Allison, L. A. 2007. Fundamental Molecular Biology. Malden: Blackwell Publishing. Farmawati, A. D. dkk. 2015. Perbandingan Kualitas DNA Dengan Menggunakan Metode Boom Original Dan Boom Modifikasi Pada Isolat Mycobacterium tuberculosis 151. Jurnal Kimia,(9) 1: 41-46. Ferniah, S. dan Pujiyanto, S. 2013. Optimasi Isolasi DNA Cabai (Capsicum annuum L.) Berdasar Perbedaan Kualitas Dan Kuantitas Daun Serta Teknik Penggerusan. Jurnal Bioma, (156) 1: 14-19. Innis, M. A. 1990. PCR Protocols a Guide to Methods And Applications. California: Academic Press Inc. Iqbal, A. dkk. 2013. An Efficient DNA Extraction Protocol For Medicinal Plants. International Journal of Biosciences, (3) 7: 30-35. Lodish, H. dkk. 2004. Molecular Cell Biology 5th ed. New York: W. H. Freeman. Newton, C. R. dan A, Graham. 1994. PCR. UK: Bios Scientific Publisher. Suparningtyas, F. J. dkk. 2018. Analisis Filogenetik Beberapa Klon Karet Dengan Marka



AFLP



(Amplified



Fragment



Length



Polymorphism).



Jurnal



Bioteknologi dan Biosains Indonesia, (5) 1: 8-19. Syafaruddin, dkk .2011. Efektivitas Dan Efisiensi Teknik Isolasi Dan Purifikasi DNA Pada Jambu Mete. Buletin RISTRI, (2) 2: 151-160. Syahputra, A. dkk. 2016. Komparasi Metode Isolasi DNA Patogen Antraknosa dan Bulai untuk Deteksi PCR. Jurnal Fitopatologi Indonesia, (12) 4: 124132. Watson, J. D. dkk. 1992. Recombinant DNA. USA: Scientific American Books. Yuenleni. 2019. Langkah-Langkah Optimasi PCR. Indonesia Journal of Laboratory, (1) 3: 51-56.



Yustinadewi, D. P. dkk. 2018. Teknik Perancangan Primer Untuk Sekuen Gen MDR-1 Varian 1199 Pada Sampel Buffy Coat Pasien Anak Dengan LLA. Jurnal Metamorfosa, (5) 1: 105-111. Yuwono, T. 2005. Biologi Molekuler. Jakarta: Erlangga. Yuwono, T. 2008. Bioteknologi Pertanian. Yogyakarta: Gadjah Mada University Press.