Laporan Praktikum Isolasi Pigmen Tanaman Dengan Kromatografi Kolom [PDF]

Citation preview

LAPORAN PRAKTIKUM ISOLASI PIGMEN TANAMAN DENGAN KROMATOGRAFI KOLOM



Dosen pengampu: Fitria Susilowati, S.Pd, M.Sc



Disusun oleh: Desta Astarina Saputri Toasa 35.2014.7.1.0955



PROGRAM STUDI FARMASI FAKULTAS ILMU KESEHATAN UNIVERSITAS DAUSSALAM GONTOR NGAWI 2018



I. II.



Tujuan 1. Melakukan isolasi tanaman dengan kromatografi kolom 2. Memonitoring fraksi kolom dengan kromatografi lapis tipis Dasar teori Kromatografi kolom adalah suatu teknik pemurnian yang digunakan untuk mengisolasi komponen yang diinginkan dari suatu campuran. Dalam kromatografi kolom, fase diam (absorben padat) ditempatkan secara vertikal dalam kolom gelas dan fase gerak (cairan) ditempatkan pada bagian atas kolom dan bergerak ke bawah melewati kolom (karena gravitasi atau tekanan eksternal). Sampel yang akan dianalisis dimasukkan ke bagian atas kolom. Eluen ditambahkan ke dalam kolom dan bergerak ke bawah melewati kolom. Keseimbangan terjadi antara komponen yang terabsorpsi pada absorben dengan pelarut yang terelusi melewati kolom (Basset, 1994). Kromatografi kolom adalah teknik kromatografi yang menggunakan zat penyerap (fase diam) dalam tabung kaca yang berbentuk buret, fase gerak dituangkan di atas dan menetes di bawah (Pudjaatmaka, 2002). Dalam kromatografi kolom, fase diam ditempatkan dalam kolom yang dilewati fase gerak yang dipengaruhinoleh adanya tekanan gravitasi (Harvey, 2000). Kromatografi kolom memiliki kelebihan dan kekurangan. Kelebihannya adalah dapat digunakan untuk analisis dan aplikasi preparatif, menentukan jumlah komponen campuran, dan untuk memisahkan dan purifikasi. Selain itu metode ini hanya membutuhkan alat dan bahan yang mudah didapat dan



murah, hanya



membutuhkan waktu yang singkat, dan udah pelaksanaannya. Kekurangnnya adalah membutuhkan kemampuan dalam teknik dan manual untuk menyiapkan kolom yang sasuai dengan sampel, dan juga kurang akurat dalam penetapan kuantitaitf komponen dalam senyawa (Gritter, 1991). Kangkung (Ipomoea aquatica) merupakan semak yang kadang-kadang berumur 1 tahun atau menahun. Batangnya menjalar diatas tanah basah atau terapung. Tangkai daun tebal 3-20 cm, helaian daun sangat berbeda dalam bentuk dan ukuran, bulat telur, segitiga, memanjang, bentuk garis/lanset, gundul, rata/bergerigi, hidup ditanam atau liar, tempat lembab, berawa, genangan, parit, sawah, pinggir jalan (Steenis, 1947). Pigmen tanaman ditemukan di dalam plastida dan vakuola. Ada bermacammacam pigmen tumbuhan, misalnya klorofil (pigmen hijau) di dalam kloroplas dan karotenoid (pigmen kuning-merah) di dalam kloroplas yang tidak mempunyai klorofil atau hanya mengandung sedikit klorofil. Kelompok pigmen lain adalah flavonoid



(antosianin dan flavon atau flavonol) yang biasanya terdapat di dalm vakuola, khususnya pada bunga dan buah dengan berbagai warna (Mulyani, 2006). Tanaman memiliki pigmen yang digunakan untuk membantu kelangsungan hidupnya, macam-macam pigemen dalam tanaman adalah: 1. Klorofil: merupakan pigmen fotosintesis yang terdapat pada sebagian besar tumbuhan. Dibagi menjadi klorofil a yang mengandung warna hijau, dan klorofil b yang mengandung warna biru. 2. Karotenoid: merupakan pigmen penyebab warna merah, orange, dan kuning



III.



IV.



pada sayuran. 3. Antosianin: pembei warna merah, merah muda, ungu, dan biru. 4. Xantofil: pigmen berwarna kuning Alat dan bahan A. Alat: 1. Buret 1 buah 2. Statif 1 buah 3. Gelas beker 4 buah 4. Gelas arloji 1 buah 5. Gelas ukur 5 ml 1 buah 6. Gelas ukur 6 buah 7. Mortar dan alu 1 buah 8. Botol kecil 1 buah 9. Spatula 1 buah 10. Pipet tetes plastik 1 buah 11. Corong 1 buah B. Bahan: 1. Silica gel 2. Kangkung 3. Metanol 4. Aseton 5. N-heksan 6. Kapas 7. Aluminium foil



Prosedur kerja A. Penyiapan kolom dan fase diam



Masukkan 3 gram silica gel ke dalam gelas beker



Tambahkan n-heksan secukupnya hingga membentukseperti bubur



Kurangi Masukkan n-heksan silicahinga bentuk 1 cm bubur diatas secara permkaan perlahan silica dandan menyiram sisa ratakan silica di permukaan dinding kolom silica dengan n-heksan Masukkan kapas ke pangkal kolom



B. Ekstraksi daun kangkung Kurangi n-heksan hingga 1 cm diatas permukaan silica dan ratakan permukaan silica



Kurangi n-heksan hingga 1 cm diatas permukaan silica dan ratakan permukaan silica



Kurangi n-heksan hingga 1 cm diatas permukaan silica dan ratakan permukaan silica



C. Elusi dengan kromatografi kolom



Menyiapkan 5 macam palarut, 5ml n-heksana, n-heksanaseton (), 5 ml aseton, aseton-metanol (), 5 ml metanol



masukkan larutan sampel ekstrak kankung secara perlahan



masukkan eluen sesuai urutan non-polar ke polar secara perlahan kedalam kolom



menampung eluen sesuai warna ke botol-botol vial



V.



Hasil dan pembahasan A. Hasil No



Perlakuan



1



Ekstraksi daun kangkung



2



Kromatografi kolom



Pengamatan Larutan ekstrak berwarna hijau pekat 1) 2) 3) 4) 5)



N-heksan : hijau tua N-heksan-aseton : hijau Aseton : hijau muda keekuningan Aseton-metanol : hijau muda pucat Metanol : hijau muda jernih



B. Pembahasan Dalam praktikum ini dilakukan percobaan untuk mengetahui pigmen daun kangkung dengan kromatografi kolom. Yang pertama yang harus dilakukan adalah pembuatan kolom dan fase diam yaitu dengan menyiapkan kolom untuk kromatografi kemudian dimasukkan kapas pada bagian bawah kolom, hal ini bertujuan untuk menahan fase diam agar tidak turun dari kolom, karena kolom masih berpori sehingga ekstrak daun kangkung masih bisa mengalir. Selanjutnya membuat silica gel hingga menjadi bubur dengan pelarut n-heksan, penggunaan n-heksan ini karena n-heksan dapat mengikat kuat dengan silica gel, jadi bubur alumina merupakan fase diam akan lebih homogen, hal ini dilakukan dengan mencampurkan 3 gram silika dengan pelarut n-heksan. Selanjutnya bubur alumina dimasukkan ke dalam kolom sambil mengetuk-ngetuk kolomnya agar tidak terbentuk gelembung udara, kolom harus bebas dari gelembung gas karena bila ada gelembung udara maka proses pemisahan yang terjadi tidak akan sempurna sehingga akan terjadi penyebaran noda ketika hasil kromatografi kolom diuji dengan KLT. Penuangan bubur alumina pada kolom hingga ketinggian 10cm, kemudian membuka kran kolom dan mengeluarkan n-heksan hingga 1cm di atas permukaan silika kemudian kolom ditutup dengan alumunium foil. Prosedur kerja selanjutnya adalah ekstraksi daun kangkung, dengan memotong daun kangkung hingga berukuran kecil kemudian dihaluskan di dalam mortar. Ditambahkan 5ml aseton. Penghalusan ini bertujuan agar senyawa yang terkandung di dalam daun bayam mudah larut dengan pelarut aseton, sebab semakin halus daun maka semakin luas permukaan untuk terjadi kontak dengan pelarut maka semakin banyak zat yang terekstrak. Aseton efektif untuk mengekstrak pigmen tumbuhan karena sebagian besar pigmen tumbuhan seperti klorofil, karoten dan xantofil memiliki sifat diantara polar dan non polar, sehingga dapat larut dalam aseton yang merupakan pelarut semi polar. Namun proses ini harus dilakukan dengan cepat karena enzim klorofilasi yang terkandung dalam daun segar akan mengkatalisis reaksi antara klorofil dengan aseton sehingga jumlah klorofil dalam daun akan berkurang, kemudian menyaring ekstrak dengan corong gelas dilapisi dengan kertas saring dengan memasukkan anhidrat ke dalam kertas saring hal ini bertujuan



untuk mempermudah proses ekstraksi dan kemudian membasahi kertas saring dengan aseton. Dilanjutkan dengan pemisahan ekstrak daun kangkung dengan corong pisah, dengan memasukkan 5ml aquades, 5ml n-heksan, 5ml ekstrak daun kangkung ke dalam corong pisah, kemudian mengocok ke arah dalam dan mendiamkannya agar antara pelarut dan fase organik dapat terpisah kemudian ekstrak daun bayam disimpan di dalam vial. Selanjutnya elusi pigmen daun kangkung dengan kromatografi kolom, setelah kolom kromatografi siap dipakai, ekstrak sampel daun kangkung dimasukkan ke dalam kolom. Lalu memasukkan eluen ke dalam kolom dan membuka krannya. Disini terlihat bahwa pigmen dari sampel daun bayam mulai bergerak turun dan mulai menetes. Tetesan yang keluar dari kolom ini ditampung dalam vial dan mengganti vial ketika warna yang keluar dari kolom berubah. Larutan berwarna ini adalah pigmen dari daun kangkung. Adapun pelarut yang digunakan adalah berdasarkan kepolarannya yang paling kecil yaitu n-heksan, n-heksan : aseton (3,5:1,5), aseton, aseton: metanol (4:1), dan metanol. Pelarut ini digunakan pada kromatografi kolom secara berurutan. Prinsip pemisahan dalam kolom tersebut yaitu dengan memasukkan 5ml n-heksan yang menghasilkan warna hijau tua. Selanjutnya n-heksan : aseton (3,5:1,5) menghasilkan warna hijau biasa. Selanjutnya 5ml aseton menghasilkan warna hijau muda kekuningan yang berarti mengandung xantofil dan aseton : metanol (4:1) menghasilkan warna hijau muda pucat yang berarti mengandung klorofil B. Terakhir 5ml metanol menghasilkan warna hijau muda jernih yang berarti mengandung klorofil B. Dan pada dasarnya kromatografi kolom adalah teknik pemisahan dengan menggunakan fase berupa padatan dan fase gerak berupa cairan. Mekanisme pemisahan komponen dengan kromatografi kolom mempunyai mekanisme yang sama seperti KLT. Pemisahan didasarkan pada perbedaan kekuatan interaksi molekul anatara komponen yang dipisahkan dengan fase diamdan



fase



gerak.



Kromatografi



kolom



dapat



digunakan



untuk



mengidentifikasi suatu komponen yang terdapat dalam suatu cuplikan. kromatografi kolom memiliki kelebihan diantaranya yaitu dapat digunakan untuk analisis dan aplikasi preparatif, dapat digunakan untuk menentukan jumlah komponen campuran, dan dapat digunakan untuk memisahkan dan purifikasi substansi. Selain itu, kromatografi kolom juga



memiliki kekurangan yaitu membutuhkan kemampuan teknik dan manual VI.



untuk menyiapkan kolom dan juga membutuhkan waktu yang lama. Kesimpulan Pada dasarnya kromatografi kolom adalah teknik pemisahan dengan menggunakan fase diam berupa padatan dan fase gerak berupa cairan. Pemisahan dalam kolom pada praktikum kali ini yaitu 5ml n-heksan menghasilkan warna hijau tua yang berarti mengandung klorofil A, n-heksan : aseton (3,5:1,5) menghasilkan warna hijau biasa, 5ml aseton menghasilkan warna hijau muda kekuningan yang berarti mengandung xantofil dan aseton : metanol (4:1) menghasilkan warna hijau muda pucat yang berarti mengandung klorofil B. Terakhir 5 ml metanol menghasilkan warna hijau muda jernih yang berarti mengandung klorofil B.



DAFTAR PUSTAKA Basset.J.1994. Buku Ajar Vogel Kimia Analisis Kuantitatif Anorganik. Penerbit Buku Kedokteran EGC. Jakarta Day. R. A. 1986. Analisis Kimia Kuantitatif Edisi IV. Penerbit Erlangga Jakarta Gritter.R.J.1991. Pengantar Kromatografi. ITB. Bandung Harvey, D. 2000. Modern Analytical Chemistry. Tye McGrow-Hill Campares. Inc.USA. Khopkar.S.M. 2000. Konsep Dasar Kimia Analitik. UI-Press.Jakarta Mulyani, s. 2006. Anatomi Tumbuhan. Penerbit: kanisius. Yogyakarta Pudjaatmaka, A. H. 2002. Kamus kimia. Balai pustaka. Jakarta. Steenis, C.G.G.J. Van, 1947, Flora, PT.Balai Pustaka Persero, Jakarta Timur.