Laporan Resmi Acara 6 - 208114056 [PDF]

Citation preview

LAPORAN PRAKTIKUM MIKROBIOLOGI



NAMA LENGKAP



: Evangeline Keisha Annabel



NIM



: 208114056



HARI PRAKTIKUM



: Senin, 22 Maret 2020



GOLONGAN



:B1



KELOMPOK



:1



LABORATORIUM MIKROBIOLOGI FAKULTAS FARMASI UNIVERSITAS SANATA DHARMA 2021



ACARA VI UJI POTESNI SENYAWA ANTIMIKROBA SECARA DIFUSI SUMURAN DAN DIFUSI PAPER DISK 1. TUJUAN Mengetahui ada tidaknya potensi antibakteri dari suatu senyawa antimikroba, misalnya antibiotik, secara difusi sumuran dan difusi paper disk.



2. PERTANYAAN PENUNTUN a) Jelaskan metode difusi sumuran! Jawab : Metode difusi sumuran yaitu langkah difusi dengan media padat. Pada lempeng agar sudah diinokulasikan dengan bakteri uji dibuat lubang dan diisi dengan zat anti mikroba uji. Selanjutnya setiap lubang ditutup dengan zat uji lalu diinkubasi pada suhu kamar dan dengan waktu yang ditentukan dan sesuai dengan mikroba uji. Terakhir diamati ada atau tidaknya zona hambatan di sekeliling lubang (Prayoga, 2013).



b) Jelaskan metode difusi paper disk! Jawab : Termasuk cara paling sering digunakan dalam menentukan kepekaan kuman terhadap suatu obat. Metode ini menggunakan cakram kertas saring untuk menampung zat antimikroba, lalu diletakkan di lempeng agar yang sudah diinokulasi mikroba uji kemudian diinkubasi pada waktu dan suhu yang sesuai dengan kondisi optimum mikroba uji. Terakhir diamati ada atau tidaknya daerah bening yang terbentuk disekeliling kertas cakram yang menunjukkan zona hambat pertumbuhan bakteri (Prayoga, 2013).



c) Jelaskan pengertian mikroba susceptible, intermediet, dan resisten terhadap antibiotik! Jawab : Mikroba susceptible yaitu mikroba yang sensitif terhadap paparan antibiotik. Mikroba resisten yaitu mikroba yang sudah kebal terhadap antibiotik karena sudah



mengenalinya dan bisa beradaptasi dengan antibiotik tersebut. Mikroba intermidiet yaitu diantara kategori mikroba susceptible dan resisten karena mikroba sudah mengenali antibiotik namunbelum 100% kebal terhadap antibiotik (Djide, 2008).



d) Apa yang disebut larutan Mac Farland Jawab : Standar McFarland adalah larutan kimia barium klorida dan asam sulfat, reaksi antara dua bahan kimia ini menghasilkan endapan halus barium sulfat. Ketika dikocok pelan, kekeruhan Standar McFarland visual sebanding dengan konsentrasi suspensi bakteri seperti yang ditunjukkan pada tabel di bawah. Sebelum digunakan standar McFarland harus dikocok dengan baik. Tabung harus tertutup rapat untuk mencegah penguapan terjadi. Sebelum setiap penggunaan, kocok dengan baik untuk memastikan bahwa barium sulfat didistribusikan secara merata di seluruh larutan (Anonim, 2014). Tabel Standar McFarland (Anonim, 2014). Cat



McFarland 1% BaCl2



No.



Standard



(mL)



1%



Approximate



H2SO4



Bacterial



(mL)



Suspension /mL



TM50



0,5



0,05



9,95



1,5 x 108



TM51



1,0



0,10



9,90



3,0 x 108



TM52



2,0



0,20



9,80



6,0 x 108



TM53



3,0



0,3



9.7



9,0 x 108



TM54



4,0



0,4



9,6



1,2 x 109



TM55



5,0



0,5



9,5



1,5 x 109



TM56



6,0



0,6



9,4



1,8 x 109



TM57



7,0



0,7



9,3



2,1 x 109



TM58



8,0



0,8



9,2



2,4 x 109



TM59



9,0



0,9



9,1



2,7 x 109



TM60



10,0



1,0



9,0



3,0 x 109



Tabel Standar McFarland (Anonim, 2014).



3. SKEMA KERJA 1) Uji Potensi Senyawa Antibiotik Secara Difusi Sumuran 1. Alat dan bahan a. Alat gelas : petridish steril, tabung reaksi, erlenmeyer, pipet ukur, pipet tetes, gelas ukur. b. Mikropipet, pelobang gabus no. 4, jangka sorong/penggaris, jarum ose, spidol, kertas label, vortex mixer, spreader. c. Senyawa uji berupa antibiotik (misalnya Amoxycilllin sirup kering) dengan variasi konsentrasi : 25; 12,5; 6,25 dan 3,125 mg/ml d. Kultur murni bakteri ujidalam media NB umur 24 jam e. Media nutrien agar (NA) f. Deret larutan standar Mac Farland g. Nutrient Broth (NB) untuk pembuatan suspensi bakteri uji h. Aquadest steril sebagai pelarut senyawa uji i. Alkohol 70 %



2. Cara kerja a. Preparasi Senyawa Uji



Preparasi senyawa uji dilakukan sesuai petunjuk dalam kemasan.  Dibuat berbagai variasi konsentrasi senyawa uji. Pada praktikum ini dibuat 4 variasi konsentrasi senyawa uji (konsentrasi 25; 12,5; 6,25 dan 3,125 mg/ml



b. Preparasi Mikroba Uji



Disiapkan kultur murni bakteri uji.  Disiapkan deret larutan standard Mac Farland.  Dibuat sebanyak 2 tabung @10 ml suspensi bakteri uji menggunakan media BPW dan disetarakan kekeruhannya dengan larutan standar Mac Farland II (konsentrasi mikroba 6. 108 CFU/ml).



c. Pengujian potensi antibiotik secara difusi sumuran



1. Disiapkan beberapa petri berisi 20 ml media nutrient agar (NA), 15 ml NA dan 5 ml NA steril 2. Dibuat kontrol kontaminasi media Petri berisi 20 media NA dibuka, secara aseptis dibuat sumuran pada petri 1) dengan pelobang gabus no. 4. Diambil bulatan NA pada sumur yang dibuat dengan jarum ose secara hati-hati sehingga NA di sekelilingnya tidak tergores/rusak. Bulatan NA tersebut dimasukkan dalam beker glass berisi alkohol.  Dasar petri diberi label : kel. prakt/tgl/perlakuan 3. Pembuatan kontrol pertumbuhan bakteri uji secara double layer 5 ml NA steril dituang ke dalam cawan petri steril, biarkan memadat sebagai base layer agar.  1 ml suspensi bakteri uji diambil, diinokulasikan ke dalam 15 ml media NA secara pour plate, kemudian dituangkan secara merata sebagai seed layer agar di atas base layer agar, dibiarkan memadat.  Dibuat 1 sumuran dengan menggunakan pelubang gabus No. 4. Pembuatan sumuran dilakukan sampai dasar seed layer agar dan tidak menembus base layer agar yang berfungsi sebagai dasar sumuran.  dasar petri diberi label : kel. prakt/tgl/perlakuan/nama bakteri uji. 4. Pembuatan kontrol negatif dan pengujian potensi antibiotik secara difusi sumuran Dibuat media base layer agar dan seed layer agar seperti pada tahan 3). Bagian dasar petri dibuat garis dengan spidol untuk membaginya menjadi 4 bagian.  Dibuat sumuran pada bagian tengah ke-4 bidang petri tersebut dengan cara yang sama dengan no. 3). c).



 Dengan menggunakan mikropipet, pada masing-masing sumuran tersebut diinokulasikan 50 μl senyawa uji dengan kontrol negatif/pelarut dan 4 variasi konsentrasi senyawa uji.  Diberi label pada dasar petri secara benar.



Diinkubasikan selama 24 jam. Perhatian : inkubasi tidak dilakukan secara terbalik! Amati zona keruh dan jernih di setiap petri.  Diamati, digambar pertumbuhannya. Diukur diameter zona jernih di sekitar sumuran dengan jangka sorong/penggaris. Dihitung diameter zona hambat yang terbentuk.



2) Uji Potensi Senyawa Antibiotik Secara Difusi Paper Disk 1. Alat dan bahan a. Alat-alat : petridish , pinset, pipet volume steril b. Kultur murni bakteri uji dalam media NB umur 24 jam c. Disk antibiotik (paper disk yang mengandung antibiotik penisilin/ampisilin) sebagai kontrol positif d. Disk blank e. Senyawa uji berupa antibiotik (misalnya Amoxycilllin sirup kering) dengan variasi konsentrasi : 25; 12,5; 6,25 dan 3,125 mg/ml f. Media nutrien agar (NA) g. Deret larutan standar Mac Farland h. Buffered Pepton Water (BPW) untuk pembuatan suspensi bakteri uji i. Aquadest steril sebagai pelarut senyawa uji j. Alkohol 70 %



2. Cara kerja a. Preparasi Mikroba Uji Disiapkan kultur murni bakteri uji.  Disiapkan deret larutan standard Mac Farland.



 Dibuat 10 ml suspensi bakteri uji menggunakan media BPW dan setarakan kekeruhannya dengan larutan standar Mac Farland II (konsentrasi mikroba 6. 108 CFU/ml). b. Pengujian potensi antibiotik secara difusi paper disk 1) Dibuat kontrol kontaminasi media Disiapkan 20 ml media NA dan tuang secara aseptis ke dalam petri steril, biarkan memadat.  Diberi label pada dasar petri : kel. prakt/tgl/perlakuan. 2) Dibuat kontrol pertumbuhan bakteri uji Diambil 0,2 ml suspensi bakteri uji, diinokulasikan ke dalam petri berisi media NA secara spread plate (harus merata di seluruh permukaan media) dan dibiarkan permukaan agar mengering.  Diberi label pada dasar petri : kel. prakt/tgl/perlakuan/nama bakteri uji 3) Diuji potensi antibiotik secara difusi paper disk Disiapkan petri berisi 20 ml media nutrien agar (NA)  Diambil 0,2 ml suspensi bakteri uji, inokulasikan ke media NA secara merata dengan cara spread plate dan biarkan permukaan agar mengering.  Secara aseptik, diletakkan 1 disk antibiotik (disk yang mengandung penisilin/ampisilin) dan 4 disk blank (yang mengandung berbagai konsentrasi senyawa uji antibiotik sebanyak 20 μl), serta 1 disk blank kontrol negatif (disk yang mengandung pelarut) pada permukaan media NA.  Setiap paper disk diinokulasikan dengan jarak tertentu secara teratur, agar supaya tidak terjadi overlapping zona hambat yang terbentuk.  Diberi label pada dasar petri secara benar. 



Diinkubasikan selama 24 jam. Diamati zona keruh dan jernih di setiap petri.  Diamati, digambar pertumbuhannya dan diukur diameter zona jernih yang terbentuk di sekitar paper disk dengan jangka sorong/penggaris.



4. HASIL PRAKTIKUM



1) Metode dalam video a. Difusi sumuran Medium disiapkan ↓ Bagian belakang blue tip dilewatkan di atas api bunsen ↓ Blue tip ditempel dan diputar ke kanan dan kek kiri di atas media lalu blue tip dibuang ↓ Media yang terlah dilubangi dengan menggunakan blue tip diambil menggunakan jarum ose yang telah disterilkan ↓ Mueller hinton agar diambil menggunakan mikropipet lalu diletakkan pada lubang yang sudah ada dan ditunggu beberapa menit ↓ Ekstrak ditambahkan, biasanya satu lubang dapat menampung 100 mikroliter sampel ekstrak ↓ Setelah diberi ekstrak, positif kontrol diletakkan di sisi lain media ↓ Diinkubasi pada suhu 35-37oC selama semalam dengan posisi tegak ↓ Setelah diinkubasi dilakukan pengamatan apakah penghambatan dan juga mengukur ukuran suara dan terbebani dengan kontrol



b. Difusi paper disc 1. Video Antibiotic suscepbility testing Hand gloves dipakai ↓ Beri label pada bagian bawah cawan petri (Inisial, tanggal, dan yang lainnya) Swab steril dikeluarkan ( jangan sampai bagian yang terdapat kapas terkontaminasi) ↓ Pada batang swab yang dekat dengan kapas diberi tanda dengan spidol sebagai tanda bagian yang diinokulasi bakteri ↓ Koloni tunggal diambil ↓ Bakteri diinokulasi pada cawan kosong dengan cara menyebarkan bakteri (spreading) ↓ Bakteri dapat disebarkan dengan arah yang tegak lurus ↓ Swab dibuang pada tempatnya ↓ Cawan dibagi menjadi 6 bagian yang dapat memudahkan kita untuk meletakkan paper disk ↓ Antibiotik disk diambil dengan pinset dan diletakkan pada bagiannya masing-masing ↓ Disk sedikit ditekan untuk memastikan bahwa disk menempel pada agar ↓ Pada paper disk terdapat huruf yang menunjukkan insial antibiotik dan angka yang menunjukkan konsentrasi antibiotik ↓ Disk diletakkan sesuai tempat pertama disk tersebut diletakkan dan jangan dipindahkan



↓ Ulangi penempatan disk sampai ada 6 disk dengan konsentrasi yang berbeda ↓ Cawan diinkubasi pada suhu 37



selama 24-48 jam



↓ Setelah bakteri tumbuh, kita dapat melihat bagian yang bening atau biasa disebut zona hambat



2. Video Testing an Antibiotic Using a Disk Diffusion Assay Koloni dipilih dan dilakukan penumbuhan kultur dalam semalam. ↓ Kultur kemudian diencerkan sehingga tumbuh menjadi OD dengan nilai 0,5. ↓ Disk antibiotik disiapkan. ↓ Antibiotik ditambahkan pada setiap disk. ↓ Kemudian disk-disk dikeringkan pada suhu ruangan. ↓ Bakteri disebar secara merata di piring agar atau media agar yang digunakan. ↓ Disk-disk ditempatkan di tengah area media agar. ↓ Diinkubasi selama 16-20 jam, kemudian dilakukan pengukuran pada zona bening yang terbentuk.



2) Ilustrasi dan Pembahasan Gambar Hasil Uji 



Uji Potensi Antimikroba Metode Sumuran



Hasil uji potensi anti mikroba pada gambar ditunjukkan adanya zona jernih disekeliling sumuran yang berisi sampel uji antimikroba. Hal itu menunjukkan bahwa adanya potensi antimikroba dari sampel uji. Pelarut aquadest steril yang digunakan tidak mengandung antimikroba karena tidak membentuk zona jernih disekitar sumuran. Jadi dapat dipastikan bahwa efek antimikroba yang membentuk zona jernih hanya berasal dari sampel uji antimikroba dan pelarut tidak memberikan pengaruh apapun terhadap hasil uji antimikroba tersebut. 



Kontrol Pertumbuhan Metode Sumuran



Dari hasil kontrol pertumbuhan bakteri pada metode sumuran, bakteri tumbuh dengan baik. Pada media hanya dibuat sumuran yang berisi aquadest, sehingga tidak terbentuk zona jernih.







Uji Potensi Antimikroba Metode Paper Disk



Pada uji potensi antimikroba metode paper disk didapatkan adanya zona jernih yang terbentuk disekitar paper disk yang berisi antimikroba. Zona jernih tersebut menunjukkan bahwa sampel uji mengandung efek antimikroba. Namun, pada paper disk yang berisi pelarut aquadest, terbentuk zona jernih yang menandakan bahwa pelarut juga memiliki efek antimikroba. Hal tersebut menandakan bahwa zona jernih yang terbentuk dari sampel uji tidak hanya berasal dari sampel uji antimikroba, tetapi juga berasal dari pelarut aquadest yang digunakan. 



Kontrol Pertumbuhan Metode Paper Disk



Dari hasil kontrol pertumbuhan bakteri pada metode sumuran, bakteri tumbuh dengan baik.







Kontrol Kontaminasi



Pada kontrol kontaminasi didapatkan hasil yang jernih, yang menunjukkan bahwa tidak terdapat kontaminasi dari bahan yang diuji dan pengujian sudah dilakukan secara aseptis.



4) Data simulasi kelompok/meja



Luas zona hambat : 1. Metode sumuran -



25 mg/ml



=



= 3,14 x 2,4 cm x 2,4 cm



= 18,09



cm2 -



12,5 mg/ml



=



= 3,14 x 1,65 cm x 1,65 cm = 8,55 cm2



-



6,25 mg/ml



=



= 3,14 x 1,55 cm x 1,55 cm = 7,54 cm2



-



3,125 mg/ml =



= 3,14 x 1,5 cm x 1,5 cm



= 7,06 cm2



2. Metode paper disk -



25 mg/ml



=



= 3,14 x 1,5 cm x 1,5 cm



= 7,06 cm2



-



12,5 mg/ml



=



= 22/7 x 1,4 cm x 1,4 cm



= 6,16 cm2



-



6,25 mg/ml



=



= 3,14 x 1,5 cm x 1,5 cm



= 7,06 cm2



-



3,125 mg/ml = cm



= 3,14 x 1,25 cm x 1,25 cm = 4, 91



2



-



Ampicillin



=



-



Aquadest



= 0



= 3,14 x 1,0 cm x 1,0 cm



= 3,14 cm2



5. PERTANYAAN DISKUSI a) Apa fungsi dari kontrol yang digunakan dalam pengujian? Jawab : Dalam pengujian ini terdapat tiga kontrol yang digunakan : a) Kontrol kontaminasi media, berfungsi untuk mengetahui sterilitas media yang digunakan. b) Kontrol pertumbuhan uji, berfungsi untuk melihat pertumbuhan normal pada media tanpa perlakuan dan mengecek apakah bakteri uji dapat tumbuh dengan baik dalam media yang digunakan. c) Kontrol negatif, berfungsi untuk melihat apakah pelarut yang digunakan memiliki aktivitas antibakteri. (Sukmaratri, 2014)



b) Jelaskan aplikasi uji kepekaan mikroba di bidang farmasi klinis! Jawab : Aplikasi uji kepekaan mikroba dibidang farmasi klinis yaitu uji resistensi mikroba terhadap antimikroba tertentu. Uji antimikroba ini dilakukan pada isolate mikroba yang didapatkan dari specimen pasien untuk mendapatkan agen antimikroba yang tepat untuk mengobati penyakit infeksi yang disebabkan oleh mikroba tersebut (Soleha, 2015).



c) Apa perbedaan metode difusi sumuran dan paperdisk? Jawab :



Metode difusi sumuran dilakukan dengan membuat lubang pada agar padat yang telah diinokulasikan bakteri uji, sedangkan difusi paper disk menggunakan kertas cakram sebagai media untuk menyerap bahan antimikroba dijenuhkan ke dalam bahan uji (Nurhayati et al., 2020).



d) Carilah satu ketentuan dari CLSI mengenai pengelompokan bakteri terhadap satu antibiotik (susceptible, resisten, intermediete) dilihati dari zona hambat yang terbentuk dari pengujian dengan metode difusi. catatan : screenshoot dicantumkan



(Sariadji dan Sembiring, 2019)



e) Carilah pengertian dari zona hambat radikal dan irradikal Jawab : Zona radikal yaitu suatu daerah disekitar disk atau sumuran yang tidak ditemukan adanya pertumbuhan bakteri. Potensi antibakteri dapat diketahui dengan mengukur diameter zona radikal ini. Sedangkan zona irradikal adalah suatu daerah di sekitar disk atau sumuran dimana pertumbuhan bakteri dihambat oleh senyawa uji, tetapi tidak mematikan. Disini akan terlihat adanya pertumbuhan yang kurang subur atau jarang dibandingkan dengan daerah di luar pengaruh antibakteri tersebut (Yuliawati, 2016).



f) Carilah secara teoritis penggolongan aktivitas antibakteri suatu senyawa (lemah, sedang, kuat) berdasarkan zona hambat yang terbentuk dari pengujian difusi. Jawab :



Secara teoritis, penggolongan aktivitas bakteri dapat dikategorikan sebagai berikut : Diameter (mm)



Kekuatan Daya Hambat



≤ 5 mm



Lemah



6-10 mm



Sedang



11-20 mm



Kuat



≥ 21 mm



Sangat Kuat



(Susanto et al., 2012)



6. DAFTAR PUSTAKA Anonim, 2014. McFarland Standard For In Vitro Use Only. Dalynn Biologicals, 48(2), 35-41. Djide M., Natsir, 2008. Dasar-dasar Mikrobiologi. Universitas Hasanuddin, Makassar, pp. 81-87 Nurhayati, L.S., Yahdiyani, N., Hidayatulloh, A., 2020. Perbandingan Pengujian Aktivitas Antibakteri Starter Yogurt dengan Metode Difusi Sumuran dan Metode Difusi Cakram. Jurnal Teknologi Hasil Peternakan, 1(2), 41-46. Prayoga, E., 2013. Perbandingan efek ekstrak daun sirih hijau (Piper betle L.) dengan metode difusi disk dan sumuran terhadap pertumbuhan bakteri Staphylococcus aureus. Laporan Penelitian, Fakultas Kedokteran dan Ilmu Kesehatan Universitas Islam Negeri Syarif Hidayatullah, Jakarta. Sariadji, K., Sembiring, M., 2019. Kajian Pustaka : Uji Kepekaan Antibiotik pada Corynebacterium diphtheria. Jurnal Biotek Medisiana Indonesia, 8(2), 121133. Soleha, T.U., 2015. Uji Kepekaan Terhadap Antibiotik. JuKe Unila, 5(9), 119-123. Sukmaratri, A. A., 2014. Uji Aktivitas Antibakteri Fraksi N-Henkasa, Kloroform dan Etanol Kulit Buah Manggis (Garcinia mangostana L.) Terhadap Staphylococcus aureus Resisten Amoksisilin. [Skripsi] Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma Yogyakarta. Susanto, D., Sudrajat, Ruga, R., 2012. Studi Kandungan Bahan Aktif Tumbuhan Meranti Merah (Shorea leprosula Miq) Sebagai Sumber Senyawa Antibakteri. Mulawarman Scientifie, 11(2), 181-190.



Yuliawati, K. M., 2016. Pengujian Aktivitas Antibakteri Ekstrak Etanol Selada Air dan Pohphonan terhadap Propionnibacterium Acnes. Kesehatan, 4(1), 6–11.



Yogyakarta, 22 Maret 2020



Asisten praktikum



Tanggal ACC:



Praktikan



22 maret 2021



( benedicta vicka )



( Evangeline Keisha Annabel )