Metode Pembuatan Nano Kitosan PDF [PDF]

Citation preview

Perbandingan Metode Formulasi untuk Menghasilkan NanoChitosan sebagai Agen Penghambat untuk Pertumbuhan Bakteri Abstrak Abstrak. Kitosan dikenal sebagai agen antibakteri. Rasio luas permukaan efektif kitosan dapat ditingkatkan dengan modifikasi menjadi partikel nano. Nanochitosan dapat dibuat dengan beberapa metode sederhana, yaitu presipitasi, gelasi ionik, atau metode kompleks polielektrolit. Studi ini membandingkan tiga metode ini dalam hal karakteristik produk yang ditargetkan, yaitu stabilitas ukuran nanopartikel rata-rata serta dispersi koloid, dan karakteristik antibakteri. Ketiga metode menghasilkan pembentukan nanopartikel, tetapi dalam metode presipitasi pengurangan potensi zeta signifikan diamati karena adanya ion negatif dari alkali yang menetralkan kelompok amina kitosan. Metode gelasi ion menghasilkan potensi zeta yang lebih tinggi dan penghambatan pertumbuhan bakteri yang lebih tinggi daripada yang dihasilkan oleh metode kompleks polyelectrolyte. Gelasi ionik dan metode kompleks polielektrolit menghasilkan stabilitas dispersi koloid yang jauh lebih baik daripada metode presipitasi, di mana peningkatan ukuran partikel yang signifikan diamati setelah satu minggu penyimpanan. Hasil ini menunjukkan bahwa baik gelasi ionik dan metode kompleks polielektrolit dapat digunakan untuk membentuk nano-kitosan untuk tujuan pengawetan makanan. Namun, untuk produk perikanan disarankan untuk menggunakan metode kompleks polyelectrolyte karena TPP yang biasanya digunakan dalam gelasi ionik tidak diperbolehkan diterapkan pada ikan.



Pendahuluan Perhatian terhadap formulasi dan aplikasi nanopartikel telah berkembang pesat selama dekade terakhir. Nano-kitosan adalah bahan partikel nano yang memiliki potensi tinggi untuk digunakan sebagai pengawet makanan. Nano-kitosan adalah transformasi kitosan menjadi ukuran partikel nano. Chitosan sendiri adalah biopolimer yang aman, tidak beracun dan ramah lingkungan [1]. Perubahan ukuran partikel kitosan tidak mengubah sifat-sifat kitosan yang disebutkan sebelumnya dalam [2,3], tetapi memang mengubah sifat-sifat antibakteri [4]. Nano-kitosan telah terbukti memiliki aktivitas antibakteri yang lebih baik daripada larutan kitosan [5]. Ini mendorong aplikasi nano-chitosan sebagai pengawet makanan. Beberapa studi tentang aplikasi nanochitosan untuk produk perikanan telah dilakukan, termasuk aplikasi pada fillet ikan mas perak [6], udang kaki putih [7] dan jari-jari ikan [8], di mana dampak positif penggunaan nano-chitosan pada perluasan kehidupan rak produk diamati. Menggunakan proses bottom-up adalah pendekatan umum membangun nano-kitosan karena molekul kitosan terlarut mampu berkumpul sendiri di hadapan pengikat silang [9]. Dalam asam asetat encer ke kitosan, kitosan menjadi larut dan terprotonasi. Protonasi menyebabkan ukuran partikel yang sangat besar dalam kitosan karena adanya tolakan elektrostatik [10]. Pengurangan ukuran partikel adalah strategi untuk mengoptimalkan aktivitas kitosan karena meningkatnya daya muatan positif terkonsentrasi dan pembesaran area permukaan kontak. Proses bottom-up seperti modifikasi ukuran dapat dilakukan dengan



menggunakan presipitasi [11], gelasi ion [12,13] atau metode kompleks polielektrolit [14]. Ketiga metode ini banyak digunakan karena sederhana dan murah. Perbedaan antara tiga metode terletak pada bahan kimia yang digunakan untuk mengubah kitosan terlarut menjadi partikel berukuran nano. Metode presipitasi menggunakan sifat fisikokimia spesifik kitosan, yaitu ketidaklarutannya dalam larutan alkali. Dalam penerapan metode ini, larutan kitosan dicampur dengan NaOH atau senyawa alkali lainnya untuk membuatnya diendapkan [11]. Di sisi lain, gelasi ionik dan metode kompleks polielektrolit mengubah kitosan menjadi nanokitosan dengan menciptakan ikatan silang antara gugus amina dari polimer kitosan. Pengikat silang dapat berupa molekul mikro anionik (seperti tripolifosfat) atau molekul anionik makro (oligosakarida seperti gum Arab). Pembentukan partikel nano-kitosan dipengaruhi oleh karakteristik larutan (pH, suhu, rasio kitosan dan crosslinker, dan konsentrasi awal kitosan) dan oleh adanya molekul lain yang mampu menyumbangkan muatan molekulnya [12,16,17 ] Pemanfaatan NaOH mempengaruhi nilai pH, sementara TPP dan Gum Arab dipisahkan ketika dilarutkan dalam air pada pH netral [14,18] sehingga masing-masing pengaruh ini berkontribusi terhadap nanochitosan dengan karakteristik yang berbeda. Penggantian TPP sebagai crosslinker dalam sintesis nano-kitosan diperlukan karena TPP dikenal untuk memanipulasi berat ikan karena retensi air [19]. Sejauh ini, karakteristik nanochitosan yang dibuat menggunakan metode tersebut belum mapan. Penelitian ini bertujuan untuk mengungkap kelebihan dan kekurangan dari masing-masing metode untuk menemukan metode yang paling tepat untuk menghasilkan nano kitosan sebelum diterapkan untuk pengawetan makanan, terutama produk perikanan, yang sangat mudah rusak karena kandungan gizinya yang tinggi.



Material dan Metode Material Bahan yang digunakan untuk persiapan nano-kitosan adalah bubuk kitosan (Bio Chitosan Indonesia), asam asetat (glasial, Ajax Finechem Pty. Ltd.), natrium hidroksida (Merck), tripolifosfat / TPP (Sigma Aldrich), gum Arab (pasar lokal) dan air MiliQ (diperoleh dengan menggunakan peralatan yang dibuat oleh Millipore Corporation). Penghambatan pertumbuhan bakteri diuji dengan menggunakan 4 strain bakteri, yaitu Bacillus subtilis (dari koleksi kultur Laboratorium Kualitas dan Produk Perikanan, UGM), Staphylococcus aureus (FNCC 0047), Escherichia coli (FNCC 0091), dan Vibrio parahaemolyticus (JCM 2147) ). Media selektif, yaitu Agar MRS (agar-agar manusia, Rogosa dan Sharpe agar dari Merck), MSA (Agar Garam Mannitol dari Oksoid), agar-agar EMB (agar-agar Eosin Methylene Blue dari Oxoid) dan agar-agar TCBS (Agar Thiosulfate Citrate Bile Salt Sukrose dari Merck), digunakan untuk menumbuhkan bakteri untuk menguji aktivitas antimikroba dari nano-chitosa.



Metode 1. Persiapan Nano-kitosan Menggunakan Metode Presipitasi, Gelasi Ionik dan Kompleks Polielektrolit. Kitosan (0,08%, m / v) dilarutkan ke dalam 100 ml larutan asam asetat encer encer (1%, v / v) dan kemudian dicampur menggunakan pengaduk magnetik selama 2 jam untuk mendapatkan larutan kitosan. Langkah selanjutnya adalah memodifikasi ukuran partikel menggunakan tiga metode. Metode pertama adalah metode presipitasi, menggunakan larutan NaOH encer (dengan konsentrasi 0,1 N dan 1 N) ditambahkan tetes demi tetes ke dalam larutan kitosan menggunakan pipet sementara larutan terus diaduk. Penambahan basa dihentikan ketika larutan mencapai nilai pH 6,3 [21]. Metode kedua adalah gelasi ionik menggunakan larutan TPP (0,84 g / L) sebagai pengikat silang. TPP ditambahkan ke larutan kitosan dengan rasio volume 5: 2 (kitosan: TPP) dan dihomogenisasi selama 30 menit [22]. Metode terakhir adalah metode kompleks polielektrolit, menggunakan langkah dan rasio yang sama seperti metode gelasi ionik. Satu-satunya perbedaan adalah pada crosslinker yang digunakan, yaitu TPP digantikan oleh 0,3% (m / v) dari larutan berbahasa Arab [14]. Konsentrasi ini diperoleh dari penelitian kami sebelumnya pada optimasi rasio Arab-chitosan-karet. 2. Karakterisasi Ukuran Partikel, Potensi Zeta, dan pH Nano-kitosan The nano-chitosans diproduksi oleh tiga metode masing-masing dalam penelitian ini dikarakterisasi untuk ukuran partikel dan potensi zeta menggunakan penganalisa ukuran partikel (Zetasizer Nano ZSP, Malvern). Kedua parameter juga diukur dalam larutan kitosan untuk perbandingan. Untuk mengevaluasi kontribusi asam asetat pada aktivitas antibakteri nano-kitosan, potensi zeta dari asam asetat diamati juga. Nilai pH dianalisis menggunakan Mettler Toledo pHmeter. 3. Aktivitas Nano-kitosan dalam Menghambat Pertumbuhan Bakteri Semua bakteri ditanam dalam agar selektif, yang disesuaikan dengan jenis bakteri. Ke agar-agar selektif yang telah dipadatkan dalam cawan petri, 100 μl isolat bakteri tertentu dituangkan dan kemudian diratakan menggunakan spatula Drigalsky. Setelah pengeringan, piringan kertas berdiameter 5 mm ditempatkan pada agar-agar selektif, dilanjutkan dengan membasahi cawan kertas dengan 20 μl larutan yang diuji. Sampel kemudian diinkubasi pada suhu 37 ° C selama 24 jam. Zona penghambatan diekspresikan oleh zona bening yang muncul di sekitar disk kertas. Perhitungan zona hambatan dilakukan dengan menghitung perbedaan antara diameter zona bening dan diameter cakram kertas.



Hasil dan Pembahasan 1. Perbedaan antara Formulasi Nano-kitosan dalam Hasil Ukuran Partikel Kitosan memiliki aktivitas multi-sifat karena gugus amina, yang sangat reaktif dengan molekul lain. Chitosan memiliki banyak ikatan hidrogen di tulang belakang, yang membuatnya hidrofobik. Asam memproton kelompok amina kitosan dan mengurangi ikatan hidrogen sehingga kitosan mudah larut dalam air [23]. Protonasi menghasilkan molekul besar karena gaya tolak muatan positif kitosan, seperti yang dibuktikan oleh data pada Gambar 1. Netralisasi gugus amina terprotonasi menyebabkan kitosan menjadi tidak larut dan ini digunakan untuk pembentukan partikel nano. Namun, dalam larutan pH jauh di atas nilai pKa, gel terbentuk [21]. Penambahan pengikat silang berhasil mengurangi ukuran partikel kitosan. Tidak ada perbedaan yang signifikan antara tiga metode persiapan nano-kitosan dalam hal ukuran partikel dan semua metode menghasilkan solusi yang tampak jelas, yang menunjukkan tidak adanya curah hujan (Gambar 2 (A), 2 (C), dan 2 (D) )). Metode kompleks gelasi ionik dan polielektrolit memiliki mekanisme pembentukan yang sama, di mana kerumitan terjadi karena interaksi ionik antara gugus amina terproton kitosan dan pengikat silang terdisosiasi. Tripolyphosphate (TPP) terdisosiasi sebagian ketika dilarutkan pada pH netral [24]. Gugus fosfat yang mengikat gugus amina dengan ikatan ionik mengurangi tolakan elektrostatik sehingga molekul yang membengkak menjadi lebih kecil. Hal yang sama juga terjadi di kompleks Arab chitosan-gum. Gum Arabic adalah polisakarida anionik alami dengan polisakarida bercabang tinggi yang terdiri dari tulang punggung β- (1-3) galaktosa dengan cabang-cabang terkait asam arabinosa, rhamnosa, dan asam glukuronat. Gugus karboksil (dari asam glukoronat) bertanggung jawab atas muatan negatif getah Arab di atas pH 2,2 [25,26]. Asam glukononat mengikat gugus amina terprotonasi, yang menyebabkan ikatan silang dan penyusutan molekul. Konsentrasi NaOH yang digunakan untuk mengendap kitosan mempengaruhi pembentukan nanopartikel. Tidak ada aglomerasi yang diamati ketika pencampuran kitosan dengan 0,1 N NaOH (Gambar 2 (A)), sedangkan aplikasi 1 N NaOH menunjukkan aglomerasi, terlihat sebagai bayangan putih di bagian bawah botol (Gambar 2 (B)). Tidak ada endapan yang jelas diamati dalam kasus TPP dan gum Arab (Gambar 2 (C) dan 2 (D), masing-masing). Perubahan visual (aglomerasi) juga terlihat dalam kitosan-NaOH (0,1 N NaOH) setelah penyimpanan selama satu minggu pada suhu kamar. Nano-kitosan yang dibuat dengan gelasi ionik dan metode kompleks polielektrolit menunjukkan stabilitas yang baik selama satu minggu penyimpanan karena keduanya masih menunjukkan solusi yang jelas. Stabilitas kitosan-TPP dapat diklasifikasikan sebagai sangat stabil karena masih menunjukkan kisaran ukuran partikel yang sama dengan larutan segar setelah penyimpanan 3 bulan pada suhu kamar [22]. Selain itu, penelitian sebelumnya telah menunjukkan bahwa menyimpan nanopartikel kitosan-TPP pada 25 ° C menunjukkan stabilitas tinggi selama 12 bulan, sedangkan penyimpanan pada 40 ° C stabil selama 6 bulan [27].



2. Potensi Zeta dan nilai pH Nano-kitosan Disiapkan dengan Berbagai Metode Meskipun nano-chitosan dihasilkan dari tiga metode yang dibahas sebelumnya tidak menunjukkan perbedaan dalam ukuran partikel, mereka tidak sama sehubungan dengan nilai potensial zeta. Potensi zeta mewakili potensi elektrostatik dari lapisan ganda listrik yang mengelilingi partikel nano dalam larutan [28]. Zeta potensial di atas nilai +30 mV menunjukkan koloid yang stabil, yang mencegah aglomerasi karena adanya tolakan partikel bermuatan, yang memiliki manfaat untuk penyimpanan [29]. Bukti netralisasi muatan kitosan, dan karenanya penurunan nilai potensial zeta, diamati dalam metode presipitasi (Gambar 3). Pengurangan potensi zeta juga terjadi dalam kasus metode ionasi gelasi dan kompleks polielektrolit karena beberapa gugus amina kitosan digunakan untuk berikatan dengan TPP dan getah Arab. Metode gelasi ionik menghasilkan potensi zeta yang lebih rendah daripada metode kompleks polielektrolit. Gum Arabic, ketika dilarutkan pada pH netral, mengalami disosiasi dan berkontribusi pada muatan negatif dalam larutan. Muatan negatif ini berkurang ketika getah Arab dicampur dengan larutan kitosan, yang memiliki pH rendah (2,7). Muatan negatif getah Arab menurun seiring dengan penurunan nilai pH larutan [30] karena protonasi gugus karboksilat getah Arab [31]. Goncalves et al. [32] telah membuktikan bahwa pada kondisi asam, potensi zeta negatif getah Arab menurun dari sekitar -20 pada pH 6 menjadi sekitar -10 pada pH 3, dan ini berlanjut seiring dengan penurunan nilai pH. Oleh karena itu, pengurangan muatan positif kitosan karena akan digunakan dalam proses pengikatan silang, tidak mempengaruhi potensi zeta dari nano-kitosan karena kontribusi getah Arab yang diprotonasikan.



3. Efek Nano-kitosan Disiapkan dengan Berbagai Metode dalam Menghambat Pertumbuhan Bakteri Dalam kasus ikan yang membusuk, kualitas ikan sebagian besar dipengaruhi oleh aktivitas bakteri. Meskipun nano-chitosan juga memiliki aktivitas anti-jamur, ini tidak dibahas dalam makalah ini karena tujuan dari pekerjaan ini adalah untuk mempersiapkan agen pengawet ikan dan karenanya pekerjaan difokuskan pada aktivitas antibakteri. Metode persiapan mempengaruhi kemampuan nano-kitosan untuk menghambat pertumbuhan bakteri. Gambar 5 menunjukkan bahwa ukuran partikel dan potensi zeta kitosan memainkan peran yang saling penting dalam menghambat pertumbuhan bakteri. Kombinasi ukuran partikel yang lebih kecil dan potensi zeta yang lebih tinggi menghasilkan aktivitas penghambatan pertumbuhan bakteri yang optimal, seperti yang ditunjukkan dalam hasil dari metode kompleks polielektrolit dan metode gelasi ionik. Metode presipitasi menghasilkan aktivitas antibakteri terendah karena meskipun ukuran partikel yang sama seperti yang dihasilkan oleh kedua metode lain, potensi zeta dari partikel yang dihasilkan dari presipitasi adalah yang terendah di antara tiga metode yang diuji dalam penelitian ini. Dengan nilai potensial zeta yang rendah, penghambatan yang diinduksi oleh



nanopartikel dari metode presipitasi untuk pertumbuhan E. coli, Staphylococcus aureus, dan Vibrio parahaemolyticus bahkan lebih rendah daripada efek penghambatan 1% larutan asam asetat yang digunakan untuk melarutkan kitosan. . Holappa et al. [33] juga menunjukkan bahwa peningkatan nilai pH di atas 6 menyebabkan penurunan aktivitas nano-kitosan dalam menghambat pertumbuhan bakteri karena netralisasi biaya nano-kitosan seperti ditunjukkan oleh penurunan potensial zeta. Metode gelasi ionik menunjukkan stabilitas yang baik dan efek positif pada pengawetan makanan [6-8] tetapi ada kendala untuk penerapannya pada produk perikanan karena mengarah pada retensi air, menghasilkan kecenderungan untuk memanipulasi berat produk [33]. Kekurangan gelasi ionik nano-kitosan dengan TPP ini dianggap tidak jujur bagi konsumen dan karenanya penerapannya pada produk ikan harus dihindari, meskipun tidak ada masalah toksisitas. Sebaliknya, aplikasi chitosan-Gum Arabic yang kompleks disarankan untuk aplikasi pada produk perikanan. Penerapan kompleks Arab chitosan-gum sejauh ini lebih diarahkan pada pengembangan rekayasa jaringan, pemberian obat [34] dan tujuan lain. Hanya informasi yang sangat terbatas untuk aplikasi dalam pengawetan makanan tersedia. Mengingat potensi yang ditunjukkan oleh penelitian ini, mekanisme pembentukan nanopartikel kompleks Arab-kitosan-gusi dan penerapannya sebagai bahan pengawet makanan perlu diselidiki lebih lanjut.



Kesimpulan Metode persiapan nano-kitosan mempengaruhi ukuran partikel nanochitosan yang dihasilkan dan kemampuannya untuk menghambat pertumbuhan bakteri. Metode alkalipresipitasi dianggap tidak tepat untuk memformulasikan nano-kitosan sebagai pengawet makanan karena meskipun menghasilkan ukuran partikel yang kecil, metode ini juga mengurangi potensi zeta karena efek netralisasi. Partikel yang dihasilkan juga menunjukkan kecenderungan aglomerasi yang lebih tinggi, yang membuatnya tidak stabil selama penyimpanan. Baik metode gelasi ionik (menggunakan TPP sebagai pengikat silang) maupun metode kompleks polielektrolit (menggunakan pengikat gum Arab sebagai pengikat silang) menghasilkan kisaran ukuran partikel nano-kitosan yang diharapkan, menunjukkan stabilitas ukuran yang baik selama penyimpanan, dan menunjukkan aktivitas penghambatan bakteri yang tinggi. Di antara kedua metode tersebut, metode kompleks polielektrolit menyebabkan aktivitas penghambatan tertinggi. Ini menunjukkan potensi tinggi dari metode kompleks polyelectrolyte untuk aplikasi sebagai bahan pengawet makanan alami dan terjangkau. Namun, penelitian ini hanya dimaksudkan sebagai studi awal untuk mengeksplorasi potensi dari tiga metode dan konsekuensi dari masing-masing metode. Metode kompleks polielektrolit perlu diselidiki lebih lanjut dalam kaitannya dengan berbagai aspek pengawetan makanan, terutama yang berkaitan dengan produk perikanan, sehingga potensi getah Arab untuk digunakan sebagai pengikat silang alternatif untuk menggantikan TPP, yang dilarang di industri perikanan, dapat dievaluasi.