p8 Lapter Kelompok 1 [PDF]

Citation preview

LAPORAN PRAKTIKUM BIOKIMIA BIOINFORMATIKA



Lailatul Izzah Maghfiroh



24030117120035



Diah Ayu Safitri



24030117120037



Ema Cahyaningrum



24030117120038



Setiya Rahayu



24030117120039



Anita Zulfa Nurhidayatin



24030117120040



Hari, Tanggal



:



Rabu, 30 Oktober 2019



Asisten



:



Fina Fatimatuz Zahro



LABORATORIUM BIOKIMIA DEPARTEMEN KIMIA FAKULTAS SAINS DAN MATEMATIKA UNIVERSITAS DIPONEGORO 2019



i



DAFTAR ISI



DAFTAR ISI .......................................................................................................... ii HALAMAN PENGESAHAN ................................................................................ iv ABSTRAK .............................................................................................................. v I.



TUJUAN .......................................................................................................... 1



II.



TINJAUAN PUSTAKA .............................................................................. 1 2.1



DNA ......................................................................................................... 1



2.2



Gen 16s rRNA .......................................................................................... 2



2.3



Bioinformatika .......................................................................................... 3



2.4



Analisa filogenetika .................................................................................. 3



2.5



NCBI ........................................................................................................ 4



2.6



BLAST-n .................................................................................................. 4



2.7



Metode Bootstrap ..................................................................................... 5



2.8



Pseudomonas alcaligenes......................................................................... 6



III.



METODE PERCOBAAN ............................................................................ 8



3.1



Alat dan Bahan ......................................................................................... 8



3.1.1



Alat .................................................................................................... 8



3.1.2



Bahan................................................................................................. 8



3.2



Skema Kerja ............................................................................................. 9



IV.



DATA PENGAMATAN ............................................................................ 12



V.



PEMBAHASAN ........................................................................................ 16



5.1



Metode Likelihood ................................................................................. 21



5.1.1



Metode Alignment Clustal W ........................................................ 22



5.1.2



Metode Alignment MUSCLE ........................................................ 22



5.2



Metode NJ (Neighbor-Joining Tree) ...................................................... 23



5.2.1



Metode Alignment Clustalw .......................................................... 24



5.2.2



Metode Alignment MUSCLE ........................................................ 24



5.3



Metode Parsimony .................................................................................. 25



5.3.2



Metode Alignment MUSCLE ........................................................ 26



ii



5.4 VI.



Data Percobaan Semua Kelompok ......................................................... 27 PENUTUP .................................................................................................. 28



6.1



Kesimpulan ............................................................................................. 28



6.2



Saran ....................................................................................................... 28



DAFTAR PUSTAKA ........................................................................................... 29 LAMPIRAN .......................................................................................................... 31



iii



HALAMAN PENGESAHAN Judul Praktikum : Bioinformatika Nama Praktikan : 1. Lailatul Izzah Maghfiroh



( 24030117120035 )



2. Diah Ayu Safitri



( 24030117120037 )



3. Ema Cahyaningrum



( 24030117120038 )



4. Setiya Rahayu



( 24030117120039 )



5. Anita Zulfa N.



( 24030117120040 ) Semarang, 2 November 2019 Praktikan



Diah Ayu Safitri



Lailatul Izzah Maghfiroh



NIM. 24030117120037



NIM. 24030117120035



Setiya Rahayu



Ema Cahyaningrum



NIM. 2403011712003



NIM. 24030117120038



Anita Zulfa Nurhidayatin NIM. 24030117120035 Mengetahui, Asisten Laboratorium Biokimia



Fina Fatimatuz Zahro NIM. 24030116130089



iv



ABSTRAK



Telah dilakukan percobaan yang berjudul “Bioinformatika”. Percobaan ini bertujuan untuk mengolah data urutan nukleotida gen 16S rRNA dengan metode filogenik : Neighbour Joining, Likeli-Hood, dan Maximum Parximony, dan meneentukan hubungan kekerabatan antar organisme (bakteri) melalui konstruksi pohon filogeni. Prinsip dari percobaan ini adalah pemasukan (input) data berupa urutan atau sekuen DNA (nukleotida) dan penerjemahan kode-kode genetik yang berfungsi untuk memahami susunan asam amino dalam sekuen DNA-nya. Metode yang digunakan adalah metode Blast-n (Basic Local Aligment-Nucleotide) dan bootstrap. Sampel yang digunakan berupa gen 16S rRNA dari bakteri Pseudomonas Alcaligenes. Metode penjajaran (alignment) yang digunakan Clustal-W dan Muscle serta beberapa metode analisis filogeni atau analisis genotipik diantaranya Neighbour Joining, Likeli-Hood, dan Maximum Parximony. Hasil yang diperoleh berupa pohon filogeni yang menunjukan kekerabatan bakteri sampel dengan dua spesies bakteri yaitu Pseudomonas alcaliphila dan Pseudomonas songnenenis. Hasil analisis filogeni metode neighbor-joining dan likelihood menunjukan bahwa bakteri sampel memiliki kekerabatan terdekat dengan bakteri Pseudomonas songnenenis, sedangkan untuk metode Maximum Parsimony bakteri sampel memiliki kekerabatan terdekat dengan bakteri Pseudomonas alcaliphila.



Kata Kunci : Analisis filogeni, gen 16S-rRNA, penjajaran



v



PERCOBAAN 8 BIOINFORMATIKA I. TUJUAN 1.1 Mengolah data urutan nukleotida gen 16s rRNA dengan metode filogenetik : Neighbor Joining, Maximum Likeli-hood, dan Maximum Parsimony. 1.2 Menentukan hubungan kekerabatan antar organisme (bakteri) melalui konstruksi pohon filogeni. II. TINJAUAN PUSTAKA 2.1 DNA Deoxyribonucleic acid (DNA) adalah suatu materi yang terdapat pada tubuh manusia dan semua makhluk hidup yang diwarisi secara turun menurun. Semua sel pada tubuh memiliki DNA yang sama dan sebagian besar terdapat pada nukleus. DNA juga dapat ditemukan pada mitokondria (Campbell et al. 2004)



Gambar 2.1 Struktur DNA 2.1.1



Gen 1



Gen merupakan sebuah unit informasi genetik yang tersandi dalam genetika. Gen adalah unit molekul DNA atau RNA yang membawa informasi mengeni urutan asam amino lengkap suatu protein, atau yang menentukan struktur lengkap suatu molekul rRNA (RNA ribosom) atau tRNA (transfer RNA). Terlibat dalam mengkode protein dan mewariskan keturunan. Fungsi gen yaitu mengatur perkembangan dan proses metabolisme serta menyampaikan informasi genetika dari suatu generasi ke generasi berikutnya (Murray et al., 2009) 2.1.2



Basa nukleotida DNA merupakan polimer linier (polinukleotida) yang tersusun dari subunit atau monomer nukleotida. Komponen penyusun nukleotida terdiri dari tiga jenis molekul, yaitu gula pentosa (deoksiribosa pada DNA atau ribosa pada RNA), basa nitrogen, dan gugus fosfat (Gambar 2.1). Basa yang ditemukan pada nukleotida adalah basa purin (adenin = A, guanin = G) dan basa pirimidin yaitu cytosin = C, tymin = T, urasil = U (Ahmad, 2013)



2.2 Gen 16s rRNA Gen 16S rRNA juga sering disebut sebagai 16S rDNA (16S ribosomal deoxyribose nucleatic acid), namun menurut konsensus dari American Society for Microbiology (ASM), istilah 16S rRNA dinilai lebih tepat . Gen pengkode RNA ribosomal (rRNA) adalah gen yang paling lestari (conserved). Porsi sekuens rRNA dari tiap organisme yang secara genetik umumnya sama, dengan demikian setiap organisme yang memiliki jarak kekerabatan tertentu dapat disejajarkan sehingga lebih mudah untuk menentukan perbedaan dalam sekuens yang menjadi ciri khas organisme tersebut. Daerah yang lestari (conserved) menyebabkan gen 16S rRNA dapat digunakan sebagai primer universal yang digunakan dalam Polymerase Chain Reaction (PCR) serta dapat ditentukan urutan 2



nukleotidanya melalui sekuensing. Gen 16S rRNA biasanya digunakan untuk



menentukan



taksonomi,



filogeni



(hubungan



evolusi)



serta



memperkirakan jarak keragaman antar spesies (rates of species divergence) bakteri (Rinanda, 2011). Gen 16S rRNA digunakan untuk analisis filogeni karena gen ini terdapat pada semua organisme, selain itu juga Gen 16S rRNA memiliki daerah konservatif yang tidak mengalami perubahan atau evolusi. 2.3 Bioinformatika Bioinformatika, sesuai dengan asal katanya yaitu “bio” dan “informatika” adalah gabungan antara ilmu biologi dan teknik informasi (TI). Bidang ini masih tergolong relatif baru sehingga masih banyak kesalahpahaman mengenai definisinya. Secara umum, bioinformatika dapat digambarkan sebagai segala bentuk penggunaan komputer dalam menangani masalah-masalah biologi. Tetapi dalam prakteknya, definisi yang digunakan lebih bersifat terperinci. Bioinformatika itu sendiri mempunyai pengertian suatu teknologi pengumpulan, penyimpanan, analisis, interpretasi, penyebaran dan aplikasi dari data-data biologi molekul (Sukmawati, 2014). 2.4 Analisa filogenetika Analisis filogenetika molekuler merupakan proses bertahap untuk mengolah data sekuen DNA atau protein sehingga diperoleh suatu hasil yang menggambarkan estimasi mengenai hubungan evolusi suatu kelompok organisme. Ada sejumlah asumsi yang harus diperhatikan sebelum menggunakan data sekuen DNA, diantaranya yaitu : 1. Sekuen berasal dari sumber yang spesifik 2. Sekuen bersifat homolog (diturunkan dari satu nenek moyang). 3. Sekuen memiliki sejarah evolusi yang sama ( bukan campuran DNA inti dan mitokondria). 4. Setiap sekuen berkembang secara bebas (Hidayat, 2006).



3



2.5 NCBI Adapun NCBI (National Centre for Biotechnology Information) merupakan suatu institusi yang konsen sebagai sumber informasi perkembangan biologi molekuler. NCBI membuat database yang dapat diakses



oleh



publik,



merangsang



riset



biologi



terkomputasi,



mengembangkan software penganalisis data genome dan menyebarkan informasi biomedical yang kesemuanya diharapkan mengarah pada pemahaman yang lebih baik tentang proses-proses molekuler yang mempengaruhi manusia dan kesehatannya. Pada NCBI GenBank, kita dapat menemukan rangkaian-rangkaian DNA yang terdapat dalam tubuh makhluk hidup, baik itu rangkaian yang mengkodekan warna kulit, warna mata, bentuk hidung, bentuk bibir, bentuk telinga, bentuk mata, dan banyak lainnya. Semua itu dapat kita dapatkan di NCBI GenBank dengan cara memasukkan nomor akses yang telah disahkan (Guchanon, 1992) 2.6 BLAST-n Salah satu tools yang tersedia dalam situs NCBI adalah BLAST (Basic Local Alignment Search Tool), yaitu suatu alat pencari yang dapat menyesuaikan dan mencari sekuens yang mirip dengan sekuen meragukan yang kita miliki melalui perbandingan sekuen melalui GenBank DNA database dalam waktu singkat. Perangkat bioinformatika yang berkaitan erat



dengan



penggunaan



pangkalan



data



sekuens



Biologi



ialah BLAST (Basic Local Alignment Search Tool). Penelusuran BLAST (BLAST search) pada pangkalan data sekuens memungkinkan ilmuwan untuk mencari sekuens baik asam nukleat maupun protein yang mirip dengan sekuens tertentu yang dimilikinya. Hal ini berguna misalnya untuk menemukan gen sejenis pada beberapa organisme atau untuk memeriksa keabsahan hasil sekuensing atau untuk memeriksa fungsi gen hasil



4



sekuensing. Algoritma yang mendasari kerja BLAST adalah penyejajaran sekuens. BLAST (Basic Local Alignment Search Tool) merupakan suatu alat pencari yang dapat mencari sekuen yang mirip dengan sekuen meragukan yang kita miliki melalui perbandingan sekuen melalui GenBank DNA database (Dhiantika,2010). Ada 5 program utama dalam BLAST, yaitu: 1. Nucleotide blast (BLAST-n) Membandingkan suatu sekuen nukleotida yang kita miliki dengan database sekuen nukleotida. 2. Protein blast (BLAST-p) Membandingkan suatu sekuen asam amino yang kita miliki dengan database sekuen protein. 3. BLAST-x Membandingkan produk translasi konsep 6-frame sebuah sekuen nukleotida (translated nucleotide) yang kita miliki dengan database sekuen protein. 4. Tblastn Membandingkan suatu sekuen protein yang kita miliki dengan database sekuen nukleotida yang secara dinamis ditranslasi pada semua pembacaan 6 frame. 5. Tblastx Membandingkan suatu translasi 6 frame dari nukleotida. 2.7 Metode Bootstrap Analisis filogenetika set sekuen yang menjejerkan dengan baik adalah jelas sebab posisi yang bertanggung jawab dalam sekuen dapat diidentifikasi dalam multiple sequence alignment dari sekuen. Tipe perubahan dalam penjejeran posisi atau jumlah yang berubah dalam penjejeran antara pasangan sekuen menyediakan dasar untuk menentukan hubungan filogenetika diantara sekuen berdasarkan metode analisis filogenetika. Penentuan perubahan sekuen yang telah terjadi menjadi sulit



5



sebab multiple sequence alignment mungkin tidak optimal dan sebab perubahan yang banyak terjadi pada penjejeran posisi sekuen. Pilihan metode multiple sequence alignment tergantung pada tingkat variasi diantara sekuen. Jika alignment yang cocok telah ditemukan, pertanyaannya adalah bagaimana prediksi filogenetika didukung oleh data dalam multiple sequence alignment. Dalam metode bootstrap, data dilakukan resampled, dengan secara random memilih kolom vertikal dari sekuen yang dijejerkan untuk menghasilkan penjejeran, dan dalam pengaruh sebuah penjejeran baru dengan panjang yang sama. Masing masing kolom digunakan lebih dari satu kali dan beberapa kolom mungkin tidak digunakan pada semua penjejeran yang baru. Pohon-pohon kemudian diprediksi dari beberapa penjejeran ini dari resampled sekuen. Untuk cabang-cabang dalam topologi filogenetika yang diprediksi menjadi signifikan jika set data resampled seharusnya berulangkali (sebagai contoh > 70%) memprediksi cabang-cabang yang sama. Analisis bootstrap adalah metode yang menguji seberapa baik set data model. Sebagai contoh validitas penyusunan cabang dalam prediksi pohon filogenetik dapat diuji dengan resampled dari kolom dalam multiple sequence alignment untuk membentuk beberapa penjejeran baru. Penampakan cabang dalam pohon dari sekuen resampled ini dapat diukur. Alternatifnya, sekuen kemungkinan harus dikeluarkan dari analisis untuk menentukan berapa banyak sekuen yang mempengaruhi hasil dari analisis. Bootstrap analysis didukung oleh sebagian besar paket software menguji cabang-cabang yang dapat dipercaya 2.8 Pseudomonas alcaligenes Merupakan bakteri hidrokarbonoklastik yang mampu mendegradasi berbagai jenis hidrokarbon. Keberhasilan penggunaan bakteri Pseudomonas dalam



upaya



bioremediasi



lingkungan



akibat



6



pencemaran hidrokarbon membutuhkan pemahaman tentang mekanisme interaksi



antara



bakteri



Pseudomonas



alcaligenes



dengan



senyawa hidrokarbon. Kemampuan bakteri Pseudomonas alcaligenes dalam mendegradasi hidrokarbon dan dalam menghasilkan biosurfaktan menunjukkan bahwa isolat bakteri Pseudomonas sp berpotensi untuk digunakan dalam upaya bioremediasi lingkungan akibat pencemaran minyak, zat - zat pestisida, dan zat - zat kimia tertentu. (Madigan, 2009). Taksonomi : Kingdom : Bacteria Filum



: Protobacteria



Kelas



: Gamma Protobacteria



Ordo



: Pseudomonadales



Famili



: Pseudomonadaceae



Genus



: Pseudomonas



Spesies



: Pseudomonas alcaligenes



Gambar 2.2 Bakteri Pseudomonas alcaligenes



7



III. METODE PERCOBAAN 3.1 Alat dan Bahan 3.1.1 Alat 1. Laptop 2. Koneksi internet atau jaringan internet. 3.1.2 Bahan 1. Data sekuen gen 16S rRNA sampel bakteri (Pseudomonas Alcaligenes) 2. Software Notepad ++ 3. Software MEGA 4. Software BioEdit



8



3.2



Skema Kerja



3.2.1 Preparasi Gen 16s rRNA Bakteri Masuk web NCBI



(www.ncbi.nlm.gov)







Klik “Nucleotide” disebelah kanan tampilan NCBI







Ketik “nama bakteri 16s rRNA” cari yang mempunyai panjang gen 900-1500 bp







Klik FASTA, copas ke Notepadd++







Mengganti nama setelah tanda “>” dengan nama kamu







Save dengan format.FASTA dan pilih all types



Hasil



3.2.2 Mencari Kekerabatan (Blast-n) Masuk web NCBI



(www.ncbi.nlm.gov)







Pilih BLAST di sebelah kanan tampilan NCBI







Pilih “Nucleotide BLAST”







Unggah file FASTA di enter query sequence







Pilih other (nr etc) pada choose search set







Pilih 16s ribosomal RNA sequence (Bacteria and Archaea)







Tekan BLAST pada bagian paling bawah







Centang select all, download .FASTA (complete sequence)







Copy-paste sequence dari sampel asli (FASTA) ke seqdump.txt







Buka file seqdump.txt menggunakan Notepadd++







Save as file seqdump dengan format .FASTA



Hasil 9



3.2.3 Membandingkan Urutan Sekuens Buka file seqdump.FASTA pada software BioEdit







Seleksi beberapa sequence







Save as Seqdump2.FAS







Pada tab file, klik “Graphic View” pilih title on left, id/sim shading sequence bold dan show ruler







Pastikan therss hold 50%







Klik “Redraw”



Hasil



3.2.4 Proses Penjajaran Buka file seqdump2.FAS - Pilih “Align” - Pilih “Export Alignment” pada tab data, pilih “Mega Format” - Save dalam format .MEG - Klik “Cancel” pada dialog box - Klik “NO” pada dialog box “Protein Coding Nucleotide Sequence Data” - Pilih “Align” by “ClustalW/Muscle” pada tab alignment - OK, pada dialog box parameters klik ok - Running proses penjajaran Hasil



10



3.2.5 Konstruksi Pohon Filogeni



Buka Software Mega 7 - Pilih “Phylogeni” - Pilih metode yang akan digunakan. metode Likelihood/ 7



Neighbor Joining/Parsimony - pilih “construct / Test maximum Likelihood Tree(s)/ construct / Test maximum Neigbor Joining Tree(s)/ construct / Test maximum Parsimony Tree(s)” - Buka File Bakteri sampel dalam format .MEG - Klik “ok” - Isikan pada Test of phylogeni pilih Bootstrap method - Pada No. Bootstrap Replication isi angka 50 - Klik Compute - Save file dalam format image .png dan dalam format .pdf Hasil



11



IV.



DATA PENGAMATAN



NO. 1.



PERLAKUAN



HASIL



Preparasi gen sampel  



Klik “Nucleotide” disebelah



 Ditemukan data berupa gen



kanan tampilan NCBI



bakteri Pseudomonas



Ketik “nama bakteri 16s



alicaligenes



rRNA” cari yang mempunyai panjang gen 900-1500 bp 



Klik FASTA, copas ke Notepadd++







Mengganti nama setelah tanda “>” dengan nama kamu







Save dengan format.FASTA



 Diperoleh



file



berbentuk



bakteri.FASTA



dan pilih all types



2.



Blast-n mencari kekerabatan 



Pilih BLAST di sebelah kanan tampilan NCBI







Pilih “Nucleotide BLAST”







Unggah file FASTA di enter query sequence







Pilih other (nr etc) pada choose search set







Pilih 16s ribosomal RNA sequence (Bacteria and Archaea)







Tekan BLAST pada bagian paling bawah



12







Centang select all, download



 File seqdumpt.txt



.FASTA (complete sequence) 



Buka file seqdump.txt menggunakan Notepadd++







Copy-paste sequence dari sampel asli (FASTA) ke seqdump.txt







 File bernama “sampel.FASTA”



Save as file seqdump dengan format .FASTA



3.



Bioedit



membandingkan



urutan



sekuens 



Buka file seqdump.FASTA pada software BioEdit







Seleksi beberapa sequence







Save as Seqdump2.FAS







Pada tab file, klik “Graphic







File



dengan



format



seqdump.fast



View” pilih title on left, id/sim shading sequence bold dan show ruler 



Pastikan therss hold 50%







Klik “Redraw”



Proses penjajaran 4. 



Buka file seqdump2.fast







Pilih “Align”







Pilih



“Export



Alignment”



pada tab data, pilih “Mega Format”



13







Save dalam format .MEG







Klik “Cancel” pada dialog box







Klik “NO” pada dialog box “Protein Coding Nucleotide Sequence Data”











Pilih



“Align”



by







File



dengan



format



“ClustalW/Muscle” pada tab



seqdump.meg dengan aligment



alignment



metode (muscle, clustal w)



OK,



pada



dialog



box



parameters klik OK 



Running proses penjajaran



Konstruksi pohon filogeni 5. 



Pilih file .MEG







Pilih phylogenetic analysis pada menu data







Pilih exit pada dialog box







Pada dialog box protein— coding nucleotide sequence data pilih “NO”







Memilih construct test maximum likehood tree/neighbor joining/ maximum parsimony pada menu pilihan di software MEGA







Muncul dialog box “none” diganti boottrap method dan



14



ganti no bootstraps dengan angka 50 



Klik compute







Save as JPG/PNG dan PDF



 Didapatkan filogeni



gambar



pohon



kekerabatan



mengunakan metode neighborjoining, maximum likeli-hood, dan maximum parsimony



15



V. PEMBAHASAN Percobaan ini berjudul “Bioinformatika”. Percobaan ini bertujuan untuk mengolah data urutan nukleotida gen 16s rRNA dengan metode filogenetik :Neighbor Joining, Maximum Likeli-hood dan Maximum Parsimony serta menentukan hubungan kekerabatan antar organisme (bakteri) melalui konstruksi pohon filogeni. Prinsip dari percobaan ini adalah pemasukan (input) data berupa urutan atau sekuen DNA (nukleotida) dan penerjemahan kodekode genetik yang berfungsi untuk memahami susunan asam amino dalam sekuen DNA-nya. Metode yang digunakan adalah Blast-n (Basic Local Aligment-Nucleotide) dan bootstrap. Metode bootstrap adalah metode berbasis resampling data sampel dengan syarat pengembalian pada datanya dalam menyelesaikan statistik ukuran suatu sampel dengan harapan sampel tersebut mewakili data populasi sebenarnya, biasanya ukuran resampling diambil secara ribuan kali agar dapat mewakili data populasinya (Sopana, 2003). Metode bootstrap adalah mtode yang menguji seberapa baik set data model.Metode Blast-n digunakan untuk mengidentifikasi spesies berdasarkan urutan pencarian homolog (Vardivalagan, 2012) dan membandingkan urutan basa nukleotida DNA sampel dengan database Gen Bank. Pada percobaan ini, untuk mengidentifikasi spesies bakteri digunakan gen 16S rRNA, karena gen 16S rRNA memiliki daerah konservatif yang berarti tidak mudah mengalami perubahan atau evolusi Sifat spesifik dari 16S rRNA yang bebas ini dimiliki oleh setiap spesifik bakteri. Sifat spesifik dari gen 16S rRNA ini adalah memiliki daerah konservatif yang tidak mengalami perubahan atau evolusi.Oleh karena itu, gen yang mengkode pembentukan 16s rRNA bisa dijadikan alat identifikasi bakteri tertentu. Selain bakteri juga bisa digunakan pada kelompok archaea termofilik (misalnya Thermoproteales) Penggunaan gen 16S rRNA sebagai acuan identifikasi bakteri secara molekuler memiliki keunggulan dimana gen ini relatif konstan dan tidak berubah dalam jangka waktu yang sangat lama atau dengan kata lain laju mengalami mutasinya sangat kecil.



16



Gen 16S rRNA memiliki panjang antara 1500 – 1550 dan terdapat basa nitrogen seperti guanin dan sitosin. Pada gen 16S rRNA terdapat 2 daerah , yaitu daerah variabel dan daerah lestari (conserved area). Sebagian atau seluruh urutan basa pada daerah inilah yang akan menjadi urutan basa yang disebut oleh primer gen 16S. Daerah Lestari (conserved area) pada gen 16S rRNA umumnya memiliki ukuran sekitar 540 pb. Langkah pertama yang dilakukan dalam analisis filogeni atau biasa disebut identifikasi genotipik yaitu preparasi sampel. Preparasi sampel bertujuan untuk mempersiapkan sampel berupa gen 16S rRNA suatu bakteri. Pada tahap ini menggunakan website National Centre for Biotechnology Information (NCBI). Pada penelitian biasanya gen 16S rRNA dapat didapatkan dengan tahapan teknik amplified ribosomal DNA restriction analysis (ARDRA). Analisis ini dilakukan dengan cara mengamplifikasi gen 16S rRNA dengan primer yang disesuaikan dengan sampel DNA yang akan diamplifikasi (Bornerman et al. 1996). Marchesi et al. (1998) dan Lane (1991) telah mendesain primer untuk amplifikasi gen 16S-rRNA yang memungkinkan untuk melakukan studi keragaman bakteri secara genetik. Hasil amplifikasi gen 16SrRNA ini kemudian dipotong dengan enzim restriksi. Pola hasil pemotongan dengan enzim restriksi ini dapat digunakan untuk memperkirakan keragaman jenis bakterinya. Metode ini didasarkan pada prinsip pemotongan enzim restriksi yang spesifik pada bagian tertentu dari gen 16SrRNA sehingga dapat menunjukkan pohon filogenetika yang berbeda untuk setiap jenis prokariota (Deya et al. 1995). Sifat metabolisme bakteri dalam fisiologis dan uji biokimia biasanya dilihat dari interaksi metabolit-metabolit yang dihasilkan dengan reagen-reagen kimia. Selain itu dilihat kemampuannya menggunakan senyawa tertentu sebagai sumber karbon dan sumber energi (Waluyo, 2004). Dalam percobaan ini, sampel diperoleh dari website National Centre for Biotechnology Information (NCBI), merupakan suatu lembaga terkait informasi perkembangan biologi molekuler. File data diambil dari NCBI karena NCBI membuat database yang dapat diakses oleh publik, merangsang riset biologi



17



terkomputasi, mengembangkan software penganalisis data genome dan menyebarkan informasi biomedical yang kesemuanya diharapkan mengarah pada pemahaman yang lebih baik tentang proses-proses molekuler yang mempengaruhi manusia dan kesehatannya. Pada NCBI GenBank, kita dapat menemukan rangkaian-rangkaian DNA yang terdapat dalam tubuh makhluk hidup, baik itu rangkaian yang mengkodekan warna kulit, warna mata, bentuk hidung, bentuk bibir, bentuk telinga, bentuk mata, dan banyak lainnya. Semua itu dapat kita dapatkan di NCBI GenBank dengan cara memasukkan nomor akses yang telah disahkan (Guchanon, 1992).Salah satu tools yang tersedia dalam situs NCBI adalah BLAST (Basic Local Alignment Search Tool), yaitu suatu alat pencari yang dapat menyesuaikan dan mencari sekuen yang mirip dengan sekuen meragukan yang kita miliki melalui perbandingan sekuen melalui GenBank DNA database dalam waktu singkat. Fungsi penelusuran blast pada data sekuens adalah mencari sekuens yang baik dari asam nukleat, DNA maupun protein yang mirip dengan sekuens tertentu yang ada pada sampel. Hal ini berguna untuk memeriksa keabsahan hasil sekuens atau untuk memeriksa fungsi gen hasil sekuennya. Algoritma yang mendasari blast adalah penyejajaran sekuens (Kuncoro, 2011). Hasil preparasi sampel berupa file dengan bentuk .fasta yang berisi data DNA sequence. Tahap selanjutnya adalah proses mencari kekerabatan dengan cara BLASTn. Tujuan dari tahap ini adalah untuk mencari kekerabatan bakteri sampel dengan database bakteri pada NCBI. Urutan basa nukleotida bakteri sampel yang tersimpan dalam bentuk .fasta tersebut kemudian dilakukan pencarian kekarabatan dengan bakteri yang terdapat di database genbank dengan menggunakan program Blast-n yang terdapat dalam NCBI. Hasil yang diperoleh dari proses BLAST ini adalah file dalam bentuk .txt yang isinya berupa 100 data spesies bakteri yang mungkin sama dengan sampel. Kemudian dilakukan penggabungan antara file bakteri sampel dengan file data 100 spesies bakteri tersebut yang dilakukan menggunakan notepad++. Hasil akhir berupa file dengan



18



format .fasta yang berisi gabungan urutan basa nukleotida bakteri sampel dengan urutan data basa nukleotida 100 spesies bakteri yang mungkin sama dengan sampel. Tahap selanjutnya adalah pembandingan urutan sekuens. Tujuan dilakukannya tahap ini adalah untuk membandingkan urutan sekuens bakteri sampel dengan bakteri pada database. Program yang digunakan pada tahap ini adalah Bioedit. Boedit digunakan untuk membandingkan urutan sekuens. Kemudikan masuk tahapan membandingkan urutan basa nukleotida dengan menggunakan program bioedit. Dengan cara mengambil bebarapa urutan basa nukleotida teratas dari gabungan gen 16S rRNA sampel dan bakteri hasil pencarian kekrabatan sesuai database. BioEdit merupakan software editor untuk penjajaran (alignment) sekuense biologi (Julian,sri.2015). Hasil akhir dari tahap ini file dengan format .fas yang berisi beberapa urutan basa nukleotida bakteri sampel yang terpilih. Selanjutnya proses penjajaran (alignment), bertujuan untuk menyejajarkan urutan sekuens agar tampak nyata dengan cara mencocokan karakter yang homolog, yaitu karakter yang mempunyai nenek moyang yang sama, sehingga bisa diidentifikasi . Program yang digunakan adalah MEGA. MEGA merupakan perangkat lunak yang dapat digunakan untuk menganalisis sekuens biologis secara komparatif, menjalankan proses penyejajaran, mengestimasi laju dan pola evolusi molekuler, menguji hipotesis evolusioner, dan membuat pohonfilogenetik (Kumar, Vinay, & Cotran, 2007). File yang digunakan pada tahap ini file dengan format .fas dari hasil pembandingan. Input dari data sekuens yang terkumpul diuji kesamaannya untuk melihat kedekatannya satu sama lain. Hasil penyejajaran sekuens menggunakan algoritma komputasional dapat digunakan sebagai data untuk membentuk pohon filogenetik (Emerson et al., 2008). Penyejajaran sekuen (Sequence Alignment) adalah proses penyusunan atau pengaturan dua atau lebih sekuens, sehingga proses persamaan sekuen-sekuen tersebut tampak nyata (Krane & Raymer, 2003). Sedangkan sekuen itu sendiri adalah sederatan pernyataan-



19



pernyataan yang urutan dan pelaksanaan eksekusinya runtut, yang lebih dahulu ditemukan (dibaca) akan dikerjakan (dieksekusi) terlebih dahulu, dan apabila urutan tersebut pernyataannya dibalik, maka maknanya akan berbeda (Kuncoro, 2011). Metode yang digunakan pada tahap ini ada 2 yaitu metode Muscle dan Clustal W. Metode Muscle adalah algoritma berbasis matriks, yang dimulai dengan konstruksi pohon panduan, di mana langkah dasarnya adalah penjajaran berpasangan. Dalam menentukan ukuran jarak untuk pasangan sekuens, metode ini menggunakan jarak kmer (untuk pasangan yang tidak sejajar) dan jarak Kimura (untuk pasangan yang sejajar). Muscle memiliki keunggulan kecepatan yang signifikan dibanding algoritma lainnya (YU et al., 2009). Metode Clustal W merupakan sistem yang digunakan secara luas dalam meyejajarkan sekuens nukleotida dengan metode progresif. Sekuens homolog dengan nilai terbaik disejajarkan terlebih dahulu, diikuti sekuens yang berjarak kemiripan lebih jauh hingga penyejajaran global diperoleh (Tamura et al, 2008). Metode Clustal W digunakan untuk alignment multipel, yaitu alignment beberapa sekuens sekaligus. Metode ini terdiri dari 2 yaitu pairwise (pasangan DNA) dan multiple (banyak). Penggunaan metode multiple alignment tersebut bergantung pada panjang urutan, jika sampel Anda memiliki panjang urutan yang agak berbeda, metode Muscle akan berkerja lebih baik daripada metode Clustal W.



Setelah didapatkan hasil penjajaran dengan metode alignment,



kemudian data tersebut disave dengan format .Meg. Tahapan selanjutnya adalah kontruksi pohon filogeni. Basa nukleotida hasil alignment yang disimpan dalam format .meg dilakukan analisis filogeni dengan menggunakan software Mega. Pada tahap ini dihasilkan pohon filogeni yang dapat digunakan untuk mengidentifikasi kekerabatan bakteri. Metode yang yang dapat digunakan untuk membuat pohon filogeni, antara lain maximum likelihood tree (ML), neighbor-joining tree (NJ), minimum-evolution tree (ME), UPGMA tree, dan maximum parsimony tree (MP). Berdasarkan jenis data, metode UPGMA, NJ, dan ME menggunakan data berupa matriks distance; sedangkan metode MP dan ML menggunakan data character state. Dalam



20



percobaan ini, hanya menggunakan 3 metode yaitu likelihood tree (ML), neighbor-joining tree (NJ), dan maximum parsimony tree (MP). Hasil akhir berupa pohon filogeni dengan metode alignment dan analisis filogeni tertentu. 5.1 Metode Likelihood Maximum Likelihood (ML) merupakan metode statistik berbasis karakter yang membandingkan seluruh sekuens dalam penyejajaran untuk memperhitungkan nilai kemungkinan pada setiap pohon (Yang dan Rannala, 2012).



Metode



ini



mempertimbangkan



semua



kemungkinan



jumlah



perubahan/mutasi pada sekuens untuk setiap pohon, oleh sebab itu cocok dalam mengkonstruksi filogeni dengan sekuens berjumlah kecil. Digunakan tes filogeni berupa metode bootstrap yang melakukan resampling berulang kali untuk melihat tingkat validitas susunan pohon, dengan jumlah replikasi sebanyak 50x agar mempersingkat waktu konstruksi (Dharmayanti, 2011). Metode Maximum Likelihood adalah bagaimana menerapkan konsep “Likelihood” yang didasari pada suatu model evolusi tertentu ( JC69,K80,dll) untuk menganalisis likelihood setiap topologi pohon dari setiap nukleotida yang ada pada sekuens yang sudah disejajarkan sehingga algoritma Maximum Likelihood dapat menentukan pohon seperti apa yang dapat dibentuk dari sekuens nukleotida yang sudah disejajarkan tadi (Edgar,2004). Metode ML memiliki beberapa kelebihan yaitu model berdasarkan statistic dan evolusi, paling konsisten dari model yang ada, dapat digunakan untuk analisis karakter dan tingkat analisis, dapat digunakan untuk kesimpulan sekuens nenek moyang yang telah punah, dapat membantu menghitung pengaruh panjang cabang pohon tidak seimbang , dapat diketahui nilai evolusi nya dan dapat diterapkan pada urutan nukleotida dan asam amino serta jenis data lain. Kelemahan metode ML adalah tidak sederhana atau intuitif, sangat intens dengan komputasi (membatasi jumlah taksa dan panjang sekuens), dapat tertipu oleh tingginya homoplassy (tapi tidak semudah parsimony) dan kesimpulan tergantung pada model (Toha.2011).



21



5.1.1



Metode Alignment Clustal W



Gambar 5.1 Pohon filogeni alignment clustal w dengan metode maximum likelihood tree (ML) Pohon filogeni di atas diperoleh dengan menggunakan metode alignment ClustalW dan metode kontruksi pohon filogeni Maximum likelihood. Berdasarkan gambar 5.1 bakteri Pseudomonas Alicaligenes memiliki kekerabatan paling dekat dengan bakteri Pseudomonas Songnenensis strain NEAU-ST5 NR 148295. 5.1.2



Metode Alignment MUSCLE Pohon filogenetika dari bakteri sampel yang telah diperoleh dengan Alignment Muscle dengan metode maximum likelihood tree (ML) sebagai berikut.



22



Gambar 5.2 Pohon filogeni alignment muscle dengan metode maximum likelihood Hasil yang diperoleh bahwa pohon filogeni diatas yang menggunakan metode alignment muscle dan metode konstruksi pohon filogeni maximum likelihood bakteri sampel memiliki kekerabatan terdekat dengan NR 148295. 1 Pseudomonas songnenensis strain NEAU-ST5-5.Hal ini dapat dilihat dari nilai bootstrapnya yang memiliki kedekatan yang tinggi pada bakteri tersebut dengan nilai bootstrap 90% pada nenek moyang sama. 5.2 Metode NJ (Neighbor-Joining Tree) Metode NJ (Neighbor-Joining Tree) akan menunjukkan matrix jarak yang menentukan jarak antara setiap pasangan taksa. Algoritma dimulai dengan sebuah pohon yang benar-benar belum terselesaikan dan sampai pohon benarbenar diselesaikan dan semua cabang panjang diketahui. Metode neighborjoining sangat cocok ketika rata-rata evolusi dari pemisahan lineage adalah di bawah pertimbangan yang berbeda-beda. Ketika panjang cabang dari pohon yang diketahui topologinya berubah dengan cara menstimulasi tingkat yang bervariasi dari perubahan evolusi, metode neighbor joining adalah yang paling



23



cocok untuk memprediksi pohon dengan benar (Tamura, Dudley, Nei, & Kumar, 2008). 5.2.1



Metode Alignment Clustal w



Gambar 5.3 Pohon filogeni alignment clustal w dengan metode neighbor joining tree (NJ) Hasil yang diperoleh bahwa pohon filogeni diatas yang menggunakan metode alignment Clustal W dan metode konstruksi pohon filigeni Neighbor Joining sampel memiliki kekerabatan terdekat dengan NR 148295 Pseudomonas songnenenis strain NEAU-ST5 16s ribosomal RNA partial sequence. Hasil tersebut sama seperti pada saat menggunakan Alignment Clustal W dengan Metode Maximum Likelihood. Bakteri sampel memiliki nilai bootstrap sebesar 82% yang merupakan kekerabatan yang dekat dengan bakteri tersebut dari nenek moyang yang sama. 5.2.2



Metode Alignment muscle



24



Gambar 5.4 Pohon filogeni alignment muscle dengan metode neighbor joining tree (NJ) Dari pohon filogeni di atas, dapat dinyatakan bahwa bakteri sampel memiliki kerabat terdekat dengan Pseudomonas Songnenenis NEAU-ST5 16s ribosomal RNA partial sequence. Hasil tersebut sama seperti pada saat menggunakan Alignment Clustal W dengan Metode Maximum Likelihood dan Neighbor Joining . Bakteri sampel memiliki nilai bootstrap sebesar 82% yang merupakan kekerabatan yang dekat dengan bakteri tersebut dari nenek moyang yang sama (Indi, N, L, P, 2011) 5.3 Metode Parsimony Metode Parsimony atau metode minimum evolution. Metode Maximum Parsimony Tree(s) adalah salah satu jenis pohon filogenetik yang meminimalkan jumlah total perubahan dan pohon secara optimal akan meminimalkan jumlah homoplasy (meliputi evolusi konvergen, evolusi paralel, dan pembalikan evolusi). Pohon filogenetiknya yang singkat menjelaskan data yang diperoleh dianggap terbaik. Kekurangan dari metode ini yaitu metode ini cukup membutuhkan banyak waktu dan tidak berguna untuk data sekuen dalam jumlah besar dan asumsi lain harus dibuat untuk root pohon yang diprediksikan 5.3.1



Metode Alignment Clustal w



25



Gambar 5.5 Pohon filogeni alignment clustal w dengan metode maximum parsimony tree (MP) Pohon filogeni diatas diperoleh dengan menggunakan metode alignment Custal w dan metode kontruksi pohon filogeni Maximum Parsimony Tree. Berdasarkan gambar diatas bahwa bakteri sampel mempunyai kekerabatan paling dekat dengan bakteri Pseudomonas alcaliphila strain AL1521 16S rRNA partial sequence , yang ditunjukkan dengan pendeknya garis yang memberikan jarak antara kedua bakteri tersebut. 5.3.2



Metode Alignment Muscle



Gambar 5.6 Pohon filogeni alignment muscle dengan metode maximum parsimony tree (MP) Pohon filogeni diatas diperoleh dengan menggunakan metode alignment Muscle dan metode kontruksi pohon filogeni Maximum Parsimony Tree. Dari gambar tersebut dapat dinyatakan bahwa bakteri sampel memiliki kerabat terdekat yaitu Pseudomonas Alcaliphila AL15-21 16S rRNA. Dua sekuen yang sangat mirip ditunjukkan dengan pendeknya garis yang memberikan jarak antara kedua bakteri tersebut.



26



5.4 Data Percobaan Semua Kelompok



Bakteri Sampel



Clustal W



Likehood



Muscle



NeighborJoining



Parsimony



Likehood



Pseudomon as plecoglossi cida



Pseudomonas Songnenenis



Pseudomon as stutzeri



Pseudomonas stutzeri



Pseudomon as Putida



Pseudomon as plecoglossi cida



Pseudomonas plecoglossicid a



Pseudomona s plecoglossici da



Pseudomon as Pseudomon plecoglosici as montelii da



Pseudomon as aeruginosa



Pseudomonas alcaligenes



Thermococ cus litoralis



Thermococcus litoralis



Anoxybacill us beppuensis



Anoxybacillus voinovskiensis



Chloroflexu s aurant



Chloroflexus aurantiacus



Thermus aquaticus



NeighborJoining



Parsimony



Pseudomona s plecoglossici da



Thermos Aquaticus



27



Berdasarkan hasil percobaan dari beberapa semua kelompok semua bakteri sampel memberi hasil kekerabatan bakteri yang sama kecuali pada kelompok 3 hasilnya bakteri sampel mempunyai kekerabatan yang erat antara 2 spesies bakteri. Hal ini berarti bakteri sampel kelompok 3 memiliki kekerabatan dengan 2 spesies bakteri. VI. PENUTUP 6.1



Kesimpulan



6.1.1 Metode yang digunakan ada dua yaitu metode Muscle dan metode Clustal W dengan menggunakan beberapa konstruksi yaitu Test Maximum Likelihood Tree, Test Neighbor-Joining Tree, dan Test Maximum Parsimony Tree (s). 6.1.2 Bakteri Pseudomonas alcaligenes memiliki kekerabatn yang erat dengan bakteri Pseudomonas songnenensis strain NEAU-ST5-5 16S rRNA dan bakteri Pseudomonas alcaliphila strain AL15-21 16S rRNA. 6.2 Saran 6.2.1 Laptop yang digunakan sebaiknya tidak memakan waktu lama untuk melakukan running. Sebaiknya memakai laptop yang 64 bit. 6.2.2 Koneksi internet diperlukan dengan kuat agar analisis berjalan lancar 6.2.2



Dapat menggunakan bakteri yang lain.



28



DAFTAR PUSTAKA



Ahmad,M.2013. Disertasi Edit Harun. [http://repository.unhas.ac.id/bitstream/ handle/123456789/5706/NEW%20DIS ERTASI%20EDIT%20HARUN.pdf?s equence=1]. Bornemann et al. 1996.molecular microbial diversity of an agricurtural soil in wissconsil. Appl environ microbial 16 : 1935-1943. Campbell, Neil A. 2004. Biologi. Edisi Kelima Jilid 3. Jakarta : Erlangga Edgar, R.C. (2004) MUSCLE: Multiple Sequence Alignment with High Accuracy and High Throughput. Nucleic Acids Research, 32, 1792-1797. http://dx.doi.org/10.1093/nar/gkh340 Damayanti R, Mulyono. 2003. Khasiat & Manfaat Daun Sirih: Obat Mujarab dari Masa ke Masa. Jakarta: Agromedia Pustaka. [7/11 23.43] Ema Baru: Kurang 2 Dhiantika. 2010.“Pengenalan NCBI.” Yogyakarta: Universitas Gadjah Mada. http://dhiantika.staff.ugm.ac.id/files/2010/11/BUKU-PETUNJUKDRYLAB-BIOSEL-2010.pdf Emerson, S., et al. (2008). The social context of parenting 3 years old children with Development delay in the UK. Child : care, health and Development, 35 (1), 63-70. Guchanon, E.. dan E. . G. (1992). ”Bergeys Manual of Deteminate Bacteriology,8th Edition”. New York.: The Willians and Wilkins Company. Hidayat, T. dkk. (2006). Kajian Filogenetika Molekuler dan Peranannya dalam Menyediakan Informasi Dasar untuk Meningkatkan Kualitas Sumber Genetik Anggrek. Jurnal AgroBiogen 4(1):35-40. Indi, N, L, P, D. (2011). Filogenetika Molekuler: Metode Taksonomi Organisme Berdasarkan Sejarah Evolusi. Jl. R.E. Martadinata No. Bogor, 30(16114), 1– 10. Krane, D., & Raymer, M. (2003). Fundamental concepts of bioinformatics. Bejamin Cummings. Kumar, Vinay, & Cotran. (2007). Buku Ajar Patologi Anatomi Edisi 7 Vol. 2. Jakarta: EGC. Kuncoro, M. (2011). Metode Kuantitatif. Yogyakarta: Sekolah Tinggi Ilmu Manajemen, YKPN.



29



Marchesi, J.R., T. Sato, A.J. Weightman, T.A.Martin, J.C. Fry, S.J. Hiom, & W.G. Wade. 1998.Design and Evaluation of Useful Bacterium Spe-cific PCR Primer that Amplify Genes Coding forBacterial 16S-rRNA. Applied and Environmental Microbiology 64: 795–799. Murray, R. K., Granner, D. K., & Rodwell, V. W. Biokimia harper (27 ed.). Jakarta: Buku Kedokteran EGC; 2009 Rinanda, T. (2011). Analisis Sekuensing 16S rRNA Di Bidang Mikrobiologi. Jurnal Kedokteran Syiah Kuala, 11(3), 172–177. Shengyuan Yu, et al. 2009. Body Mass Index and Migraine: a survey of the Chinese adult population. J Head Pain, 13:531–536 Sopana 2003. Estimasi Interval Konfidensi Nonparametrik dengan Metode Bootstrap. Skripsi Jurusan Matematika FMIPA Universitas Sebelas Maret (UNS), Surakarta.) Guchanon, E.R., and E.N. Gibsons. 1992. Bergeys Manual of Deteminate Bacteriology. 8th ed. New York: The Willians and Wilkins Company. Sukmawati, N. M. S. (2014). BIOINFORMATIKA, 1–45. Tamura, K., Dudley, J., Nei, M., & Kumar, S. (2008). MEGA: A biologist-centric software for evolutionary analysis of DNA and protein sequences. Briefings In Bioinformatics, 9, 299–306. Vardivalagan, 2012, Panduan Lengkap untuk Belajar Komputasi Statistik, Erlangga, Jakarta Wade. 1998. Design and Evaluation of Useful Bacterium Specific PCR Primer that Amplify Genes Coding for Bacterial 16S-rRNA. Applied and Environmental Microbiology 64: 795–799.



30



LAMPIRAN



GAMBAR KELOMPOK 2 Muscle-Parsimony dan Muscle-Neighbor Joining



Muscle-Maximum Likehood



31



Clustal W-Maximum Parsimony dan Clustal W-Neighbor Joining



32



Clustal W-Maximum Likehood



GAMBAR KELOMPOK 3



Gambar 6. Pohon filogeni Alignment Muscle dengan metode Maximum Likelihood. .



Gambar 7. Pohon filogeni Alignment Muscle dengan metode Neighbor Joining



33



Gambar 8. Pohon filogeni Alignment Muscle dengan metode Maximum Parsimony.



Gambar 9. Pohon filogeni Alignment Clustal W dengan metode Maximum Likelihood



34



Gambar 10. Pohon filogeni Alignment Clustal W dengan metode Neighbor Joining



Gambar 11. Pohon filogeni Alignment Clustal W dengan metode Maximum Porsimony



GAMBAR KELOMPOK 4



35



Gambar 5.1 Pohon Filogeni dengan Metode Maximum likelihood tree (ML)



Gambar 5.2 Gambar pohon filogeni metode Muscle-maximumparsimony



36



Gambar 5.3 Pohon Filogeni metode Muscle-Maximum Likelihood



Gambar 5.4 Pohon filogeni metode maximum parsimony tree



37



Gambar 5.5 Pohon filogeni metode ClustalW-neighbor joining



Gambar 5.6 Pohon Filogeni Metode MuscleW Neighbor Joining GAMBAR KELOMPOK 5 1. Metode Likeli-hood 1.1 Metode Muscle



Gambar 5.1 Gambar pohon filogeni metode Muscle-Likelihood



38



1.2 Metode Clustal W



Gambar 5.2 Gambar pohon filogeni metode Clustal W-Likelihood



2. Metode Parsimoy 2.1 Metode Muscle



Gambar 5.1 Gambar pohon filogeni metode Muscle-Parsimony



39



2.1 Metode Clustal W



Gambar5.4 Gambar pohon filogeni metode Crustall W-Parsimony 3. Metode NJ 3.1 Metode Muscle



Gambar 5.1 Gambar pohon filogeni metode Muscle-Neighbor



3.2 Metode Clustal W



40



Gambar5.4 Gambar pohon filogeni metode Crustall W-Parsimony



Gambar 5.3 GambarpohonFilogenimetode Clustal W-NeighBorjoining



41



GAMBAR KELOMPOK 6



Gambar 5.1 Gambar pohon filogeni metode Muscle-Likelihood



42



Gambar 5.2. Gambar pohon filogeni metode ClustelW-likelihood



Gambar 5.4. Gambar pohon filogeni metode ClustelW-Neighbor-Joining



43



Gambar 5.5. Gambar pohon filogeni metode ClustelW-maximumparsimony



44



Gambar 5.6 Gambar pohon filogeni metode Muscle-Neighbor-Joining



Gambar 5.7 metode muscle dengan metode maximum parsimony GAMBAR KELOMPOK 7



Gambar 5.1 Pohon Filogeni dengan metode Muscle dan Test Maximum Likelihood Tree.



45



Gambar 5.2 Pohon Filogeni dengan metode Muscle dan Test NeighborJoining Tree.



Gambar 5.3 Pohon Filogeni dengan metode Muscle dan Test Maximum Parsimony Tree (s).



46



Gambar 5.4 Pohon Filogeni dengan metode Clustal W dan Test NeighborJoining Tree.



Gambar 5.5 Pohon Filogeni dengan metode Clustal W dan Test Maximum Parsimony Tree (s).



47



Gambar 5.6 Pohon Filogeni dengan metode Clustal W dan Test Maximum Likelihood Tree.



48



GAMBAR KELOMPOK 8



Gambar 5.1 Pohon Filogeni dengan Metode Likelihood Tree (Custal W)



49



Gambar 5.2 Pohon Filogeni dengan Metode Neighbor-Joining (Custal W)



Gambar 5.3 Pohon Filogeni dengan Metode Parsimony (Alignment CustalW)



50



Gambar 5.4 Pohon Filogeni dengan Metode Muscle



Gambar 5.5 Pohon Filogeni dengan metode Neighbor-Joining Tree



51



Gambar 5.6 Pohon Filogeni dengan Metode Parsimony



52