Panduan Praktik Mikrobiologi Lingkungan [PDF]

Citation preview

Panduan Praktek Mikrobiologi Lingkungan Pelindung/Penasehat Direktur Poltekkes Kemenkes Kupang Dr. R. H Kristina, SKM., M.Kes Ketua Program Studi Sanitasi Karolus Ngambut, SKM., M.Kes



Tim Penyusun: 1. Byantarsih Widyaningrum, SKM., M.Si 2. Dr. Kusmiyati, SKM., MPH 3. Ragu Theodolfi, SKM., M.Sc 4. Erika Maria Resi, SKM., M.Si



PRODI SANITASI POLITEKNIK KESEHATAN KEMENKES KUPANG Jl. Piet A. Tallo, Liliba – Kupang Nusa Tenggara Timur Telp. (0380) 8800195 Email: [email protected] http://www.poltekkeskupang.ac.id/prodi/jurusan-kesehatan-lingkungan.html



Page | ii



SAMBUTAN DIREKTUR



Politeknik Kesehatan Kementerian Kesehatan Kupang adalah lembaga pendidikan tinggi milik Kementerian Kesehatan RI yang menyelenggarakan Program Pendidikan Diploma III Bidang Kesehatan yang terdiri dari: Jurusan Keperawatan Kupang, Kesehatan Lingkungan, Kebidanan, Farmasi, Kesehatan Gigi, Gizi dan Analis Kesehatan, Prodi D-IV Keperawatan / Program Profesi Ners, Prodi Keperawatan Ende, Prodi Keperawatan Waingapu, Prodi Keperawatan Waikabubak. Program pendidikan yang diselenggarakan Poltekkes Kemenkes Kupang diarahkan untuk menghasilkan lulusan yang professional, memadai dalam jumlah dan mutu serta jenis yang sesuai untuk pemenuhan kebutuhan pelayanan kesehatan masyarakat. Salah satu unsur penting dalam penyelenggaraan pendidikan adalah kurikulum pendidikan yang sesuai dengan Kerangka Kualifikasi Nasional Indonesia yang sesuai dengan Peraturan Presiden Nomor 8 tahun 2012 tentang Kerangka Kualifikasi Nasional Indonesia (KKNI) dan Peraturan Menteri Pendidikan dan Kebudayaan RI Nomor 73 tahun 2013 tentang penerapan KKNI dalam Pendidikan Tinggi. Sebagai pendidikan vokasi, proses pembelajaran lebih diutamakan pada kegiatan Praktikum baik di laboratorium, bengkel kerja maupun kegiatan praktikum di lapangan. Dalam menunjang pembelajaran praktikum yang berkualitas, maka semua mata kuliah wajib memiliki Panduan Praktikum sebagai acuan bagi Tenaga Pendidik (Dosen) dan Mahasiswa dalam proses pembelajaran. Panduan praktikum merupakan seperangkat prosedur pembelajaran praktikum yang wajib diberikan oleh tenaga pendidik, instruktur dan mahasiswa sehingga proses pembelajaran menjadi lebih maksimal. Kami mengucapkan terima kasih kepada Bapak/Ibu Tenaga Pendidik pada Program Studi Sanitasi Poltekes Kemenkes Kupang yang telah berkarya dalam menghasilkan Panduan Praktikum ini. Teruslah berkarya dalam mengemban amanah mendidik calon tenaga kesehatan di bidang Sanitasi. Kiranya karya dan usaha Bapak/Ibu semunya dianugerahi berkat yang melimpahi dari Tuhan Yang Maha Kuasa Kupang, Agustus 2019 Direktur



Dr. R. H. Kristina, SKM., M.Kes NIP. 19631027 198603 2 001



Page | iii



PENGANTAR KETUA PROGRAM STUDI



Dalam menghadapi tuntutan kebutuhan masyarakat, kurikulum di Prodi Sanitasi Poltekkes Kemenkes Kupang, saat ini mengalami perkembangan dengan mengikuti kebijakan pemerintah, yakni kurikulum pendidikan tinggi (KPT), yang pada hakekatnya merupakan penguat, penyempurna dan koreksi terhadap kebijakan kurikulum sebelumnya yang berbasis tujuan dan bersifat sentralistik. Tujuan dari KPT adalah memandirikan atau memberdayakan Institusi dalam mengembangkan kompetensi, yang sesuai dengan kondisi lingkungannya. Tuntutan pada globalisasi maka kurikulum harus mengacu pada standar Kerangka Kualifikasi Nasional Indonesia (KKNI) yang merupakan kerangka penjenjangan kualifikasi kompetensi yang dapat menyandingkan, menyetarakan, dan mengintegrasikan antara bidang pendidikan dan bidang pelatihan kerja serta pengalaman kerja dalam rangka pemberian pengakuan kompetensi kerja sesuai dengan struktur pekerjaan di berbagai sektor. Program Studi Diploma III Sanitasi sebagai salah satu pendidikan vokasi bidang sanitasi di Provinsi Nusa Tenggara Timur dalam proses pembelajarannya menerapkan sistem pembelajaran Praktikum dengan bobot SKS yang lebih besar dibandingkan dengan pembelajaran teori. Kegiatan pembelajaran praktikum dilakukan di Laboratorium, Bengkel Kerja (Workshop) dan juga kegiatan di lapangan. Dalam menunjang proses pembelajaran, maka Tenaga Pendidik (Dosen) wajib menyusun Panduan Praktikum. Panduan praktikum merupakan acuan bagi Tenaga Pendidik itu sendiri dan juga mahasiswa dalam mencapai kompetensi yang akan dicapai. Dengan adanya panduan praktikum ini, diharapkan proses pembelajarannya menjadi lebih maksimal dan kompetensi pembelajaran dapat tercapai. Ucapan terima kasih dan penghargaan yang setinggi-tingginya bagi semua Tenaga Pendidik yang telah menyusun panduan praktikum demi menyukseskan proses pembelajaran di Prodi Sanitasi Poltekkes Kemenkes Kupang. Kiranya Tuhan Yang Maha Esa senantiasa memberkati Bapak/Ibu sekalian.



Kupang, Agustus 2019 Ketua Program Studi,



Karolus Ngambut, SKM., M.Kes NIP. 19740501 200003 1 001



Page | iv



DAFTAR ISI Halaman HALAMAN JUDUL ………………………………………………………………… SAMBUTAN DIREKTUR . ………………………………………………………… SAMBUTAN KETUA PROGRAM STUDI …………………………………......... DAFTAR ISI ....................................................................................................



ii iii iv v



PENGENALAN ALAT-ALAT LABORATORIUM MIKROBIOLOGI …………….



1



STERILISASI ALAT-ALAT LABORATORIUM ……………………………………



12



PEMBUATAN DAN STERILISASI MEDIA ………………………………………..



18



PEMERIKSAAN BAKTERI COLIFORM PADA SAMPEL AIR MENGGUNAKAN METODE MOST PROBABLE NUMBER (MPN) …………..



26



PEMERIKSAAN MAKANAN/MINUMAN MENGGUNAKAN METODE ANGKA LEMPENG TOTAL (ALT) …………………………………………………………..



38



PEMERIKSAAN JAMUR PADA TANAH ………………………………………….



48



PEMERIKSAAN BAKTERI ESCHERICIA COLI PADA SAMPEL MAKANAN ..



53



PEMERIKSAAN ANGKA LEMPENG TOTAL (ALT) PADA SAMPEL USAP ALAT MAKAN ………………………………………………………………………..



72



PEMERIKSAAN BAKTERI VIBRIO CHOLERA PADA SAMPEL USAP DUBUR (RECTAL SWAB) ………………………………………………………….



81



PEMERIKSAAN SAMPEL UDARA ………………………………………………..



87



DAFTAR PUSTAKA ………………………………………………………………… LAMPIRAN …………………………………………………………………………...



97 98



Page | v



PENGENALAN ALAT-ALAT LABORATORIUM MIKROBIOLOGI



WAKTU PELAKSANAAN



:



TUJUAN PRAKTIKUM



:



Mahasiswa mampu mengenal dan menjelaskan fungsi macam-macam alat Laboratorium Mikrobiologi.



A. PENDAHULUAN Sebelum kita bekerja atau melakukan praktikum di laboratorium mikrobiologi ada baiknya kita terlebih dahulu mengenal alat alat Laboratorium Mikrobiologi beserta fungsinya. Sebagai seorang analis sangat penting mengenal peralatan apa saja yang akan kita butuhkan saat bekerja atau praktik di dalam laboratorium. Misalkan saat kita sedang melakukan analisis (dengan mengacu pada suatu metode tertentu) maka kita harus mengenali alat apa saja yang kita perlukan agar saat melakukan analisis kita tidak terhenti di tengah jalan karena alat yang kita butuhkan tidak ada, Jika sudah terjadi hal seperti itu maka sangat disayangkan sekali waktu dan tenaga kita. Praktikum mikrobiologi merupakan praktikum yang berhubungan dengan mikroba sehingga memerlukan beberapa alat yang mendukung pelaksanaannya seperti autoclave, mikroskop, dan lainnya.



B. ALAT DAN BAHAN 1. Mikroskop stereo (Zoom Stereo Microscope)



1



Mikroskop ini berfungsi untuk melihat objek yang membutuhkan perbesaran tidak terlalu besar. Di Laboratorium Mikrobiologi, mikroskop stereo biasanya digunakan untuk mengamati secara detail bentuk koloni dan jamur.



2. Colony counter



Alat ini berguna untuk mempermudah perhitungan koloni yang tumbuh setelah diinkubasi di dalam cawankarena adanya kaca pembesar. Selain itu alat tersebut dilengkapi dengan skala/ kuadran yang sangat berguna untuk pengamatan pertumbuhan koloni sangat banyak. Jumlah koloni pada cawan Petri dapat ditandai dan dihitung otomatis yang dapat di-reset.



3. Timbangan digital / neraca digital



Neraca digital berfungsi untuk menimbang media dan juga sample atau contoh uji saat preparasi.



2



4. Inkubator (Incubator)



Inkubator adalah alat untuk menginkubasi atau memeram mikroba pada suhu yang terkontrol. Alat ini dilengkapi dengan pengatur suhu dan pengatur waktu.



5. Oven



Oven berfungsi untuk sterilisasi kering. alat-alat yang disterilkan menggunakan oven antaralain peralatan gelas seperti cawan petri, tabung reaksi, dll. serilisasi kerning dengan oven dilakukan dengan cara memanaskan dengan suhu 180oC selama 1 jam.



6. Autoklaf (Autoclave)



3



Autoklaf adalah alat pemanas tertutup yang digunakan untuk mensterilisasi suatu benda menggunakan uap bersuhu dan bertekanan tinggi (1210C, 15 lbs) selama kurang lebih 15 menit. Penurunan tekanan pada autoklaf tidak dimaksudkan untuk membunuh mikroorganisme, melainkan meningkatkan suhu dalam autoklaf. Suhu yang tinggi inilah yang akan membunuh microorganisme. Autoklaf terutama ditujukan untuk membunuh endospora, yaitu sel resisten yang diproduksi oleh bakteri, sel ini tahan terhadap pemanasan, kekeringan, dan antibiotik. Pada spesies yang sama, endospora dapat bertahan pada kondisi lingkungan yang dapat membunuh sel vegetatif bakteri tersebut[1]. Endospora dapat dibunuh pada suhu 100 °C, yang merupakan titik didih air pada tekanan atmosfer normal. Pada suhu 121 °C, endospora dapat dibunuh dalam waktu 4-5 menit, dimana sel vegetatif bakteri dapat dibunuh hanya dalam waktu 6-30 detik pada suhu 65 °C.Perhitungan waktu sterilisasi autoklaf dimulai ketika suhu di dalam autoklaf mencapai 121 °C. Jika objek yang disterilisasi cukup tebal atau banyak, transfer panas pada bagian dalam autoklaf akan melambat, sehingga terjadi perpanjangan waktu pemanasan total untuk memastikan bahwa semua objek bersuhu 121 °C untuk waktu 10-15 menit. Perpanjangan waktu juga dibutuhkan ketika cairan dalam volume besar akan diautoklaf karena volume yang besar membutuhkan waktu yang lebih lama untuk mencapai suhu sterilisasi. Performa autoklaf diuji dengan indicator biologi, contohnya Bacillus stearothermophilus.



7. Hot plate stirrer dan Stirre bar



Hot plate stirrer dan Stirrer bar (magnetic stirrer) berfungsi untuk menghomogenkan suatu larutan dengan pengadukan. Pelat (plate) yang 4



terdapat dalam alat ini dapat dipanaskan sehingga mampu mempercepat proses homogenisasi. Pengadukan dengan bantuan batang magnet Hot plate dan magnetic stirrer seri SBS-100 dari SBS® misalnya mampu menghomogenkan sampai 10 L, dengan kecepatan sangat lambat sampai 1600 rpm dan dapat dipanaskan sampai 425oC.



8. Termometer (thermometer)



Termometer adalah batang kaca yang panjangnya 300 mm, diameter 6-7 mm berisi air raksa dan gas, serta dilengkapi dengan skala derajat Celcius. Berfungsi untuk mengukur suhu suatu larutan atau ruang inkubator. Prinsip kerjanya yaitu mengukur suhu sesuai laju air raksa di dalam thermometer.



9. Cawan Petri (Petri Dish)



Cawan petri berfungsi untuk membiakkan (kultivasi) mikroorganisme. Medium dapat dituang ke cawan bagian bawah dan cawan bagian atas sebagai penutup. Cawan petri tersedia dalam berbagai macam ukuran, diameter cawan yang biasa berdiameter 15 cm dapat menampung media sebanyak 15-20 ml, sedangkan cawan berdiameter 9 cm kira-kira cukup diisi media sebanyak 10 ml.



5



10. Gelas ukur (Graduated Cylinder)



Berguna untuk mengukur volume suatu cairan, seperti labu erlenmeyer, gelas ukur memiliki beberapa pilihan berdasarkan skala volumenya.



11. Beaker Glass



Beaker glass merupakan alat yang memiliki banyak fungsi. Di dalam mikrobiologi, dapat digunakan untuk preparasi media media, menampung akuades dll.



12. Labu Erlenmeyer (Erlenmeyer Flask)



Berfungsi untuk menampung larutan, bahan atau cairan yang. Labu Erlenmeyer dapat digunakan untuk meracik dan menghomogenkan bahanbahan komposisi media, menampung akuades, kultivasi mikroba dalam



6



kultur cair, dll. Terdapat beberapa pilihan berdasarkan volume cairan yang dapat ditampungnya yaitu 25 ml, 50 ml, 100 ml, 250 ml, 300 ml, 500 ml, 1000 ml, dsb.



13. Tabung reaksi (Reaction Tube / Test Tube)



Di dalam mikrobiologi, tabung reaksi digunakan untuk uji-uji biokimiawi dan menumbuhkan mikroba.Tabung reaksi dapat diisi media padat maupun cair. Tutup tabung reaksi dapat berupa kapas, tutup metal, tutup plastik atau aluminium foil. Media padat yang dimasukkan ke tabung reaksi dapat diatur menjadi 2 bentuk menurut fungsinya, yaitu media agar tegak (deep tube agar) dan agar miring (slants agar). Untuk membuat agar miring, perlu diperhatikan tentang kemiringan media yaitu luas permukaan yang kontak dengan udara tidak terlalu sempit atau tidak terlalu lebar dan hindari jarak media yang terlalu dekat dengan mulut tabung karena memperbesar resiko kontaminasi. Untuk alas an efisiensi, media yang ditambahkan berkisar 10-12 ml tiap tabung.



14. Ose / Jarum Inokulum (inoculating loop)



Jarum inokulum berfungsi untuk memindahkan biakan untuk ditanam/ditumbuhkan ke media baru. Jarum inokulum biasanya terbuat dari 7



kawat nichrome atau platinum sehingga dapat berpijar jika terkena panas. Bentuk ujung jarum dapat berbentuk lingkaran (loop) dan disebut ose atau inoculating loop/transfer loop, dan yang berbentuk lurus disebut inoculating needle/Transfer needle. Inoculating loop cocok untuk melakukan streak di permukaan agar, sedangkan inoculating needle cocok digunakan untuk inokulasi secara tusukan pada agar tegak (stab inoculating).



15. Lampu Bunsen (Pembakar Spiritus)



Salah satu alat yang berfungsi untuk menciptakan kondisi yang steril adalah pembakar Bunsen. Api yang menyala dapat membuat aliran udara karena oksigen dikonsumsi dari bawah dan diharapkan kontaminan ikut terbakar dalam pola aliran udara tersebut.Ssterilisasi jarum Ose atau yang lain, bagian api yang paling cocok untuk memijarkannya adalah bagian api yang berwarna biru (paling panas). Lampu Bunsen dapat menggunakan bahan bakar gas, alkohol, spiritus.



8



16. Mortar dan Penumbuk /Pastle



Mortar dan penumbuk (pastle) digunakan untuk menumbuk atau menghancurkan materi cuplikan, misal : daging, roti atau tanah sebelum diproses lebih lanjut.



C. PROSEDUR KERJA 1. Amati berbagai alat alat-alat yang ada di Laboratorium Mikrobiologi! 2. Gambarlah alat-alat yang saudara amati! 3. Tulislah fungsi dari alat-alat tersebut!



9



D. HASIL PRAKTIKUM DAN PEMBAHASAN



NO



NAMA ALAT/GAMBAR



FUNGSI ALAT



10



E. KESIMPULAN



F. SARAN



Cataan Dosen



Hasil Penilaian



a. b.



Mengetahui Penanggung jawab Laboratorium/lapangan,



(….................…………….....) NIP.



Dosen/Instruktur Praktikum/praktik,



(...............……………...……) NIP.



11



STERILISASI ALAT-ALAT LABORATORIUM



WAKTU PELAKSANAAN



:



TUJUAN PRAKTIKUM



:



Mahasiswa mampu melakukan dengan benar sterilisasi alat-alat laboratorium untuk pemeriksaan/uji mikrobiologis



A. PENDAHULUAN Mikroorganisme luar yang tidak dikehendaki dalam suatu kultur dapat masuk melalui kontak langsung dengan permukaan atau tangan orang yang melaksanakan praktikum (praktikan) yang tercemar, tersentuhnya media atau permukaan tabung bagian dalam oleh benda yang belum disterilkan, ataupun melalui aliran udara. Untuk mencegah hal tersebut, perlu digunakan teknik aseptis yang sekaligus akan dapat pula melindungi dari infeksi diri dan melindungi orangorang di sekeliling praktikan dari pencemaran di laboratorium. Selama bekerja untuk mendapatkan kultur murni di laboratorium mikrobiologi, selalu dilakukan secara aseptis dengan maksud untuk menjaga keadaan sekitarnya tetap steril dan mencegah terjadinya kontaminasi sehingga didapatkan kultur yang bebas dari kontaminan. Kultur murni adalah biakan yang hanya terdiri dari populasi mikrobia yang berasal dari satu jenis mikrobia. Setelah diperoleh kultur murin, ada tiga syarat yang sangat penting, yaitu : 1.



Semua bahan yang akan digunakan untuk menyentuh kultur harus disterilisasi terlebih dahulu.



2.



Semua media yang digunakan untuk menumbuhkan sel – sel harus steril.



3.



Masuknya kontaminan ke dalam kultur yang tumbuh harus dicegah. Steril merupakan suatu keadaan bebas dari segala macam bentuk kehidupan



mikrobia. Peristiwa masuknya mikrobia lain ke dalam suatu biakan murni dan tumbuh di dalam biakan tersebut disebut kontaminasi. Jasad penyebab kontaminasi disebut kontaminan. Untuk menciptakan sebuah kondisi steril perlu dilakukan suatu usaha untuk membebaskan bahan – bahan, alat – alat dari semua bentuk kehidupan mikrobia (fungi, bakteri dan virus). Di dalam praktik, terutama praktik di laboratorium alat – alat serta media pertumbuhan mikrobia yang diperlukan selalu dalam keadaan steril sehingga alat dan bahan – bahan tersebut



12



harus disterilisasi terlebih dahulu, dengan maksud agar tidak terjadi pertumbuhan mikrobia lain yang tidak diinginkan. Selama sterilisasi akan terjadi proses kematian mikrobia. Kecepatan kematian mikrobia tergantung pada jenis mikrobia dan faktor – faktor lingkungan. Beberapa hal yang perlu diperhatikan pada waktu sterilisasi ialah macam dan sifat bahan, jenis alat yang akan disterilisasikan serta faktor hidrasi selama sterilisasi. Sterilisasi pada prinsipnya meliputi 3 (tiga) cara yaitu secara mekanik (dengan penyaringan), secara fisik (dengan pemanasan) dan secara kimia (dengan desinfektan). Sterilisasi secara fisik dapat menggunakan beberapa jenis alat seperti autoklaf dan oven. Autoklaf merupakan alat sterilisasi yang menggunakan prinsip pemanasan dengan tekanan uap. Sterilisasi menggunakan autoklaf biasanya diterapkan pada media pertumbuhan dan larutan pengencer. Sterilisasi dengan menggunakan oven biasa diterapkan pada peralatan laboratorium berupa botol – botol/tabung reaksi/Erlenmeyer yang dipergunakan sebagai wadah. Prinsip sterilisasi dengan oven adalah pemanasan kering tanpa tekanan uap air.



B. ALAT DAN BAHAN Alat : -



Handsprayer



-



Pipet Ukur



-



LAF / Enkas



-



Erlenmeyer



-



Gelas Beker



-



Tabung Reaksi



-



Oose



-



Cawan Petri



-



Ball Pipet / Katup Karet



-



Pinset



-



Jarum Preparat



-



Bunsen / Lampu Spiritus



Bahan : -



Akuades



-



Alkohol



-



Korek Api



-



Kertas Coklat



-



Spiritus



-



Tisu



-



Karet Gelang



-



Serbet/lap



-



Alkohol



-



Kapas



Tangan -



Sanitiser



-



Etiket Tempel/ kertas label



13



C. PROSEDUR KERJA 1. Sterilisasi panas kering a. Pemijaran/membakar Jarum ose atau jarum inokulasi dapat disterilkan dengan pemijaran dengan cara: 1) Jarum ose atau jarum inokulasi dipegang tangkainya kemudian ujungnya dikenakan pada lidah api Bunsen sampai membara 2) Dinginkan terlebih dahulu sebelum digunakan untuk memindahkan biakan. Pendinginan kira-kira suhu mencapai 40-45oC.



b. Dengan memakai udara panas Sterilisasi dengan cara ini memakai oven. Alat –alat dari gelas seperti pipet dan cawan petrin cocok disterilkan dengan cara ini. Cara kerja: 1) Alat-alat dari gelas dicuci dan dikeringkan. 2) Untuk tabung-tabung gelas harus ditutup dengan kapas. 3) Bungkus alat-alat tersebut dengan kertas tahan panas kemudian masukkan kedalam oven yang masih dingin. Oven ditutup dan disambungkan kesumber panas. Kemudian atur suhunya. Jika menggunakan suhu 180 oC waktu yang dibutuhkan adalah 1 jam sedangkan untuk suhu 160 oC membutuhkan waktu 2 jam. 4) Matikan sumber panas sampai keadaan oven benar-benar dingin. setelah dingin, barulah alat-alat bisa dikeluarkan dari oven dan disimpan ditempat yang aman.



2. Sterilisasi panas lembab Sterilisasi dengan cara ini biasanya menggunakan uap air panas bertekanan. Alatnya disebut denga autoklaf. Suhu yang digunakan adalah 121oC



dengan tekanan 15 psi (pound per square inchi) atau tekanan 1,5



but selama 15-30 menit. Caranya : a. Autoklaf diisi air sampai batas tertentu (dibawah tempat meletakan bahan). Letakan semua bahan (medium) yang akan disteril. b. Hidupkan pemanas



14



c. Autoklaf ditutup, eratkan dengan sekrup, dan katup pengeluaran udara tetap terbuka. d. Setelah banyak uap yang keluar (sisa udara dalam ruang autoklaf), katup tersebut ditutup. e. Perhatikan pada pencatat suhu, bila suhu suda mencapai 121 oC, 15 psi atau 1,5 but mulai dihitung waktunya 15-30 menit. f.



Matikan pemanas, dan Autoklaf boleh dibuka apabila pencatat tekanan menunjukkan angka 0 (nol).



15



D. HASIL PRAKTIKUM DAN PEMBAHASAN



16



E. KESIMPULAN



F. SARAN



Cataan Dosen



Hasil Penilaian



c. d.



Mengetahui Penanggung jawab Laboratorium/lapangan,



(….................…………….....) NIP.



Dosen/Instruktur Praktikum/praktik,



(...............……………...……) NIP.



17



PEMBUATAN DAN STERILISASI MEDIA



WAKTU PELAKSANAAN



:



TUJUAN PRAKTIKUM



:



Mahasiswa mampu melakukan dengan benar pembuatan dan sterilisasi media pertumbuhan untuk pemeriksaan/uji mikrobiologis.



A. PENDAHULUAN Medium pertumbuhan adalah suatu bahan yang terdiri dari campuran zat makanan (nutrient) untuk menumbuhkan jasad. Dengan medium pertumbuhan, kita juga dapat mempelajari sifat dan aktifitas jasad misalnya dengan melihat perubahan dari medium; kita dapat jasad atau isolat murni dan lain-lainnya. Untuk membuat medium diperlukan bahan-bahan baik berupa bahan jadi maupun bahan alami. Pada dasarnya ada tiga kelompok bahan yaitu : a. Bahan dasar : 1) Air sebagai bahan pelarut. 2) Agar (berasal dari tumbuhan laut) yang tidak terurai oleh jasad renik, membeku pada suhu 15-200 C dan mencair pada suhu 450 C. 3) Gelatin yaitu protein yang dapat diurai oleh jasad renik dan sifatnya seperti agar. 4) Silika–gel yaitu bahan yang mengandung Na-silikat khusus untuk menumbuhkan jasad yang bersifat ototrof-obligat. b. Unsur dan nutrient yang sumbernya dari alam. 1) Sumber karbon dan energi : karbohidrat, lemak, asam organik. 2) Sumber nitrogen : peptone, protein. 3) Garam-garam kimia : K, Na, Fe, Mg. 4) Vitamin. 5) Bahan alami : sari buah, ekstrak sayuran, susu c. Bahan tambahan. Yaitu bahan yang sengaja ditambahkan dengan tujuan tertentu : indikator, antibiotik.



18



Macam-macam Medium Banyak jenis medium yang digunakan untuk menumbuhkan jasad renik. Akan tetapi pada dasarnya dapat dibedakan berdasarkan kriteria tertentu seperti berikut : 1. Berdasarkan fase ( sifat fisik) a. Medium Padat, yang mengandung 12-15 gr agar per liter, misal medium Nutrien Agar (NA) b. Medium Semi Padat, dengan kandungan agar kurang dari 0,5 % per liter. c. Medium Cair, medium tanpa agar, misalnya Nutrien Broth (NB). 2. Berdasarkan komposisi a. Medium Sintesis, yang komposisi zat kimianya diketahui, misal Glukose Agar (GA). b. Medium Semi-sintesis, yang sebagian komposisi zat kimianya diketahui, misal Potato Dextrosa Agar (PDA). c. Medium Non-sintesis, yang komposisi semua zat kimianya tidak diketahui. 3. Berdasarkan fungsi. a. Medium Umum, yang terdiri dari peptone dan ekstrak khamir (yeastextract) untuk menumbuhkan banyak jenis jasad. b. Medium Selektif, yang ke dalamnya ditambahkan zat tertentu sehingga bersifat selektif hanya merangsang pertumbuhan satu jenis dan jenis lainnya mati. Contoh : medium dengan penambahan kristal violet untuk menumbuhkan bakteri gram negatif, sedangkan bakteri gram positif mati. c. Medium Diferensial, yang mengandung suatu komponen menyebabkan pertumbuhan jasad tertentu dengan perubahan khusus yang tidak dapat dilakukan oleh jasad lain. Contoh : medium dengan indikator yang dapat berubah warna pada kondisi pH tertentu akibat aktivitas jasad pada mediumnya ; medium mengandung glukose akan dirombak oleh satu jasad fermentasi produknya asam, dan asam inilah yang mengubah kondisi medium menjadi asam dan merubah warna indikator dan akhirnya warna medium juga berubah. Jasad non fermentatif tidak membentuk asam, dan medium tidak berubah warna. d. Medium Uji (Assay-medium), yang komposisinya tertentu untuk menguji apakah jasad yang ditumbuhkan memenfaatkan zat yang ada dalam medium itu, misal adanya vitamin, asam amino.



19



e. Medium Diperkaya (Enrichment-medium), yang berisi komponen kompleks misalnya darah, serum, kuning telur, untuk menumbuhkan jasad heterotrof. Misal Loefler serum untuk menumbuhkan bakteri basil difteri.



B. ALAT DAN BAHAN 1. ALAT a. Inkubator b. Autoclave c. Timbangan d. Oven e. Kompor gas f.



Waterbath



g. Rak tabung h. Tabung reaksi i.



Erlenmeyar



j.



Becker glass



k. Pipet 10 ml l.



Gelas ukur



m. Gelas pengaduk n. Kertas pH o. Spidol p. Kapas q. Lampu spiritus r.



Tali rami



s. Tabung durham t.



Aluminium foil



2. BAHAN a. Media Lactose Broth (LB) b. Media BGLB c. Media EMBA (Eosin Methylin Blue Agar)



20



C. PROSEDUR KERJA 1. Cara pembuatan media LB1 (Single Strength Lactose Broth) a. Timbang Laktose broth sesuai kebutuhan (Takaran Media dapat dilihat pada label kemasan). Single Strength Lactose Broth berarti konsentrasinya hanya 1 kali. Sehingga konsentrasi yang dibuat hanya dikalikan 1 atau denga kata lain sesuai dengan konsentrasi pada takaran label kemasan. Misalnya : dalam label tertera 13 per 1000 ml. Artinya bahwa tiap 13 gram media pada kemasan harus diencerkan dengan 1000 ml aquadest atau dengan kata lain jika kita ingin membuat 1000 ml larutan LB maka kita harus menimbang sebanyak 13 gram media LB. Karena yang akan dibuat adalah LB1, maka media yang ditimbang untuk 1000 ml LB1 adalah 13 x 1 = 13 gram. Misalnya kita ingin membuat 20 ml larutan LB1, maka perhitungannya menjadi : Jumlah media yang ditimbang = 13 gr



x 20 ml x 1 kons.= 0,26 gr



1000 ml b. Masukkan dalam beker glass c. Ukur aquadest sesuai kebutuhan dengan gelas ukur d. Tuang dalam becker glass sambil diaduk sampai larut sempurna e. Ukur pH (seharusnya 6,9 ± 0,2) f.



Siapkan tabung reaksi yang telah diberi tabung durham dalam kaadaan terbalik.



g. Isi masing-masing tabung dengan 10 ml larutan yang telah dibuat. h. Tutup dengan kapas dan tutup dengan kertas aluminium foil, ikat denga tali rami, sterilkan dengan autoclave suhu 121oC selama 15-30 menit.



2. Cara pembuatan media LB3 (Triple Strength Lactose Broth) a. Timbang Laktose broth sesuai kebutuhan (Takaran Media dapat dilihat pada label kemasan). Triple Strength Lactose Broth berarti konsentrasinya hanya 3 kali. Sehingga konsentrasi yang dibuat hanya dikalikan 1 atau denga kata lain sesuai dengan konsentrasi pada takaran label kemasan.



21



Misalnya : dalam label tertera 13 per 1000 ml. Artinya bahwa tiap 13 gram media pada kemasan harus diencerkan dengan 1000 ml aquadest atau dengan kata lain jika kita ingin membuat 1000 ml larutan LB maka kita harus menimbang sebanyak 13 gram media LB. Karena yang akan dibuat adalah LB1, maka media yang ditimbang untuk 1000 ml LB1 adalah 13 x 3 = 13 gram. Misalnya kita ingin membuat 25 ml larutan LB3, maka perhitungannya menjadi : Jumlah media yang ditimbang = 13 gr



x 25 ml x 3 kons. = 0,975 gr



1000 ml



b. Masukkan dalam becker glass c. Ukur aquadest sesuai kebutuhan dengan gelas ukur d. Tuang dalam becker glass sambil diaduk sampai larut sempurna e. Ukur pH (seharusnya 6,9 ± 0,2) f.



Siapkan tabung reaksi yang telah diberi tabung durham dalam kaadaan terbalik.



g. Isi masing-masing tabung dengan 5 ml larutan yang telah dibuat. h. Tutup dengan kapas dan tutup dengan kertas aluminium foil, ikat denga tali rami, sterilkan dengan autoclave suhu 121oC selama 15-30 menit.



3. Cara pembuatan media BGLB a. Timbang BGLB sesuai kebutuhan (Takaran Media dapat dilihat pada label kemasan). Misalnya : dalam label tertera 40 per 1000 ml. Artinya bahwa tiap 40 gram media pada kemasan harus diencerkan dengan 1000 ml aquadest atau dengan kata lain jika kita ingin membuat 1000 ml larutan BGLB maka kita harus menimbang sebanyak 40 gram media BGLB. Misalnya kita ingin membuat 70 ml larutan BGLB , maka perhitungannya menjadi : Jumlah media yang ditimbang = 40 gr



x 70 ml = 2,8 gram



1000 ml



22



b. Masukkan dalam becker glass c. Ukur aquadest sesuai kebutuhan dengan gelas ukur d. Tuang dalam becker glass sambil diaduk sampai larut sempurna e. Ukur pH (seharusnya 7,4 ± 0,2) f.



Siapkan tabung reaksi yang telah diberi tabung durham dalam kaadaan terbalik.



g. Isi masing-masing tabung dengan 10 ml larutan yang telah dibuat. h. Tutup dengan kapas dan tutup dengan kertas aluminium foil, ikat denga tali rami, sterilkan dengan autoclave suhu 121oC selama 15-30 menit.



4. Cara pembuatan media EMBA (Eosin Methylin Blue Agar) a. Timbang EMBAsesuai kebutuhan (Takaran Media dapat dilihat pada label kemasan). Misalnya : dalam label tertera 50 gram per 1000 ml. Artinya bahwa tiap 50 gram media pada kemasan harus diencerkan dengan 1000 ml aquadest atau dengan kata lain jika kita ingin membuat 1000 ml larutan MC maka kita harus menimbang sebanyak 7 gram media MC. Misalnya kita ingin membuat 140 ml larutan Media EMBA, maka perhitungannya menjadi : Jumlah media yang ditimbang = 50 gr



x 140 ml = 7 gram



1000 ml



b. Masukkan dalam erlenmeyer. c. Ukur aquadest sesuai kebutuhan dengan gelas ukur d. Panaskan diatas api/waterbath supaya larut e. Ukur pH (seharusnya 6,8 ± 0,2) f.



Tutup dengan kapas dan tutup dengan kertas aluminium foil, ikat denga tali rami, sterilkan dengan autoclave suhu 121oC selama 15-30 menit.



23



D. HASIL DAN PEMBAHASAN



24



E. KESIMPULAN



F. SARAN



Cataan Dosen



Hasil Penilaian



c. d.



Mengetahui Penanggung jawab Laboratorium/lapangan,



(….................…………….....) NIP.



Dosen/Instruktur Praktikum/praktik,



(...............……………...……) NIP.



25



PEMERIKSAAN BAKTERI COLIFORM PADA SAMPEL AIR MENGGUNAKAN METODE MOST PROBABLE NUMBER (MPN) WAKTU PELAKSANAAN



:



TUJUAN



:



1. Mahasiswa mampu memilih peralatan dan bahan yang digunakan dalam praktikum dengan benar. 2. Mahasiswa mampu melakukan tahapan pengambilan dan pengiriman sampel air dengan benar. 3. Mahasiswa mampu melakukan tahapan pemeriksaan MPN Coliform pada sampel air dengan benar.



A. PENDAHULUAN Penggunaan air khususnya air minum harus memenuhi syarat antara lain memenuhi syarat mikrobiologis. Hal ini sehubungan dengan air minum merupakan media pembawa penyakit terutama penyakit perut. Kita semua sudah maklum bahwa air merupakan lingkungan amat mudah tercemar, tidak terkecuali bendabenda tinja. Sumber air yang mengandung bakteri coliform diklasifikasikan dengan air yang kualitasnya rendah. Hal ini disebabkan oleh pernyataan bahwa adanya bakteri coliform di dalam air atau bahan lain, berarti air mengandung bakteri pathogen yang berasal dari usus atau yang keluar bersama tinja. Di dalam sumber air tidak hanya terdapat bakteri coliform, akan tetapi banyak jasad renik lain yang termasuk indigenus maupun kontaminan dari suatu sumber. Jasad renik yang berada di dalam air ada yang dapat beradaptasi dan terus hidup pada lingkungan air, tetapi ada sebagian organisme dalam air tidak dapat melangsungkan kehidupannya dan segara mati. Untuk mengetahui kualitas air secara mikrobiologis, air dari suatu sumber harus diuji. Sedangkan sebagian besar jasad renik di dalam air tidak dapat ditumbuhkan pada media laboratorium. Satu hal yang sangat menguntungkan bahwa dalam pemeriksaan air tidak perlu semua jasad renik dalam air itu harus diuji. Jasad renik yang harus diuji dan diketahui karena merupakan faktor penentu dari kualitas air adalah bakteri coliform.



26



Pemeriksaan air secara mikrobiologis diperlukan contoh air minimal 100 ml. Contoh air itu harus segera dibawa ke laboratorium dalam keadaan dingin (letakkan di dalam termos es dan diisi dengan gumpalan es). Apabila contoh air tidak segera dilakukan pengujian (setelah 1 jam), maka contoh air itu boleh disimpan dalam tempat dingin misalnya refrigerator, akan tetapi tidak boleh lebih dari 24 jam. Persyaratan lain yang harus disertakan pada contoh air yang akan diuji adalah keterangan lengkap yang ditulis pada label adalah sebagai berikut: 1. Nama dan alamat pengirim contoh air. 2. Waktu dan tanggal pengambilan contoh air. 3. Alasan perlu diadakannya pemeriksaan. 4. Jenis sumber air (mata air, sumur, sungai, kran dsb). 5. Diolah atau tidak; kalau diolah desinfektan apa yang dipakai dan caranya bagaimana; berapa dosis yang digunakan. 6. Alat transportasinya.



Botol untuk mengambil contoh air yang akan diperiksa secara mikrobiologis harus berukuran besar dan mulut lebar, minimal 250 ml volumenya. Botol harus dalam keadaan steril dan sebelum disteril ditutup dahulu dengan kertas dan disteril dengan oven pada suhu 170-1800 C selama 1 jam. Perlu diperhatikan bahwa air yang mengandung chlor harus diambil dengan botol yang sudah berisi larutan Natrium Thio Sulfat 10% sebanyak 0,1 ml untuk menetralkan sisa chlor sebanyak 15 mg/L air. Jadi sebelum menambahkan larutan itu sisa chlor dalam air harus dihitung dahulu. Pemeriksaan sisa chlor harus dilakukan di tempat pengambilan contoh air. Untuk itu contoh diambil dengan botol yang lain dan bersih yang tidak diberi larutan tersebut.



1. PENGAMBILAN SAMPEL/CONTOH AIR a. ALAT DAN BAHAN 1) Alat : a) Botol sampel steril. b) Bunsen.



27



2) Bahan : a) Sampel air yang berasal dari sumur, sungai, kran, es balok. b) Alkohol. c) Kapas. d) Korek api. e) Kertas label.



b. PROSEDUR KERJA 1) Pengambilan contoh air dari kali/sungai. a) Ambil air dari bagian yang mengalir dan dekat dengan permukaan air, hindari pengambilan contoh air yang tidak mengalir. b) Apabila sungainya lebar dan lurus, air diambil dari tepi dengan jarak paling sedikit 1 meter dari tepi sungai. c) Bersihkan tangan dengan alkohol. d) Pegang bagian bawah botol. Buka mulut botol dan lalukan pada api bunsen. e) Benamkan botol dalam air sungai + 20 cm, mulut botol menghadap ke atas. f)



Isilah botol itu sampai penuh dan diangkat ke udara. Buang sebagian air dalam botol itu (+ 1/3 bagian) sehingga sisanya (+ 2/3 bagian) masih memenuhi syarat contoh air untuk diperiksa secara mikrobiologis.



g) Lewatkan mulut botol pada api bunsen. h) Segera botol itu ditutup dengan penutup yang sudah disediakan (steril). i)



Beri label, dan beri keterangan lengkap.



2) Pengambilan contoh air dari sumur gali, mata air dan reservoir atau sejenisnya. a) Air diambil dengan botol yang diberi pemberat. Botol, tali dan pemberatnya masih dalam keadaan steril (belum dibuka) sebelum akan dipergunakan.



28



b) Bukalah pembungkus pada tempatnya. Pegang botol pada bagian bawah yang masih ada pembungkusnya, sehingga tangan tidak menyentuh botol. c) Tali dipegang, botol diturunkan pelan-pelan dan biarkan masuk sedalam minimal 10 cm dari permukaan air. d) Setelah botol terisi penuh, angkat botol itu ke atas. Buang sebagian air dalam botol itu (+ 1/3 bagian) sehingga sisanya (+ 2/3 bagian) masih memenuhi syarat contoh air untuk diperiksa secara mikrobiologis. e) Lewatkan mulut botol pada api bunsen. f)



Segera botol itu ditutup dengan penutup yang sudah disediakan (steril).



g) Usahakan saat mengambil air , botol di tengah sumber. h) Beri label dan beri keterangan lengkap.



3) Pengambilan contoh air dari pipa (kran) dan sumur pompa. a) Pilih air yang berasal dari pipa parsiil yang berhubungan langsung dengan pipa induk. Ambil air dari kran yang sering digunakan. Jangan mengambil air dari alat tambahan yang dipasang dari kran itu. Jangan pula mengambil air dari kran yang bocor. b) Bersihkan kran yang kotor dengan menggunakan kain lap sebelum mengambil contoh dengan kain lap. c) Kran dibuka sepenuhnya dan biarkan air mengalir 2-3 menit dan segera ditutup. d) Kran dipanaskan sampai cukup panas dengan api bunsen. e) Kran dibuka kembali sepenuhnya dan biarkan air mengalir selama 1 menit. f)



Putar kran perlahan sehingga air mengalir perlahan.



g) Buka tutup botol dan lewatkan mulut botol pada api bunsen. h) Isilah botol sampai penuh dan tuang sebagian contoh air dalam botol itu (+ 1/3 bagian) sehingga sisanya (+ 2/3 bagian) masih memenuhi syarat contoh air untuk diperiksa secara mikrobiologis. i)



Lewatkan mulut botol pada api bunsen.



29



j)



Segera botol itu ditutup dengan penutup yang sudah disediakan (steril).



k) Beri label dan beri keterangan lengkap.



2. PENGIRIMAN SAMPEL Banyak parameter kualitas air berubah dengan cepat pada waktu pengiriman sampel ke laboratorium. Pengetahuan lapangan dapat membantu mengatasi keadaan sampel. Bilamana sampel tidak dapat diperiksa ditempat, maka hams ditempatkan di dalam kotak yang kuat dan dikirim ke laboratorium secepat mungkin.Untuk Pemeriksaan Bakteriologis jika waktu pengiriman lebih lama 3 jam maka media khusus “holding



media”



harus



dipergunakan. Temperatur ideal untuk penyimpanan sampel 4° — 10° C di daerah beriklim panas, pada waktu kotak dikirim kantong-kantong berisi campuran pendingin harus diletakkan disekitar sampel. Untuk menjamin bahwa setiap sampel mempunyai keterangan yang memadai dan jelas, maka harus dilengkapi dengan suatu fomulir detail. Formulir ini harus berisi semua informasi tentang dimana dan bilamana sampel diambil, termasuk keterangan tentang sampel dan nama orang yang mengirim.



3. PEMERIKSAAN BAKTERI COLIFORM PADA SAMPEL AIR BERSIH MENGGUNAKAN METODE MOST PROBABLE NUMBER (MPN) a. UJI DUGA (PRESUMTIF TEST) 1) ALAT DAN BAHAN a) Alat : -



Tabung reaksi steril.



-



Tabung durham steril



-



Rak tabung reaksi.



-



Pipet ukur 10 ml dan 1 ml steril.



-



Bunsen.



-



Bulp/pipet filer/penghisap.



-



Inkubator.



b) Bahan : -



Sampel air.



-



Media LB 1 dan LB 3 steril.



30



-



Alcohol.



-



Kapas.



-



Kertas label.



-



Korek api.



2) PROSEDUR KERJA a) Siapkan alat dan bahan. b) Bersihkan



(aseptiskan)



meja



kerja



dan



tangan



praktikan



menggunakan alkohol. c) Nyalakan bunsen. d) Inokulasikan (masukkan) masing-masing 10 ml sampel air ke dalam 5 tabung yang berisi media LB 3 steril dengan menggunakan pipet ukur steril. e) Inokulasikan (masukkan) masing-masing 1 ml sampel air ke dalam 5 tabung yang berisi media LB 1 steril dengan menggunakan pipet ukur steril. f)



Inokulasikan (masukkan) masing-masing 0,1 ml sampel air ke dalam 5 tabung yang berisi media LB 1 steril dengan menggunakan pipet ukur steril.



g) Beri label pada masing-masing tabung sesuai dengan ml sampel yang dimasukkan yaitu : 10 ml, 1 ml dan 0,1 ml. h) Inkubasikan piaraan di dalam inkubator dengan suhu 370 C selama 2 x 24 jam. i)



Amati piaraan itu setiap 24 jam. Amati juga gas yang terbentuk dalam tabung durham. Timbulnya gas dalam 24 jam menunjukkan uji positif, dan apabila terbentuknya gas setelah waktu 24 jam menunjukkan hasil yang meragukan. Apabila setelah 2 x 24 jam tidak terbentuk gas, maka uji dikatakan hasilnya negatif.



j)



Untuk hasil yang positif dan meragukan maka perlu dilanjutkan ke uji penetapan/penegasan (Confirmed Test). Catatan : Dalam setiap pengerjaan penanaman (inokulasi)



sampel haruslah dilakukan seaseptis mungkin yaitu selalu didekatkan dan dilewatkan pada api bunsen.



31



SKEMA UJI DUGA



Sampel



@ 10 ml



@ 1 ml



LB 3 @ 5 ml



LB 1 @ 10 ml



@ 0,1 ml



LB 1 @ 10 ml



Inkubasikan dalam Inkunbator selama 2 x 24 jam suhu 37 0 C



b. UJI PENETAPAN/PENEGASAN (CONFIRMED TEST) 1) ALAT DAN BAHAN a. Alat : -



Tabung reaksi steril



-



Tabung durham steril



-



Rak tabung reaksi



-



Jarum ose



-



Bunsen



-



inkubator



b. Bahan : -



Hasil uji duga positif/meragukan.



-



Media BGLB steril.



-



Alkohol. 32



-



Kapas.



-



Kertas label.



-



Korek api.



2) CARA KERJA a) Siapkan alat dan bahan. b) Bersihkan



(aseptiskan)



meja



kerja



dan



tangan



praktikan



menggunakan alkohol. c) Nyalakan bunsen. d) Bakar jarum ose sampai merah membara. Dinginkan sebentar. e) Inokulasikan (masukkan) 2-3 mata ose spesimen dari hasil uji duga positif/meragukan ke dalam 10 ml media BGLB steril. f)



Beri label pada tabung sesuai dengan label hasil uji duga positif/meragukan.



g) Inkubasikan piaraan dalam inkubator pada suhu 37o C selama 2 x 24 jam h) Amati gelembung gas yang terjadi. Apabila terdapat gelembung gas dalam tabung durham maka hasilnya positif. i)



Tulis hasil yang positif dan cocokkan dengan tabel kombinasi MPN untuk mendapatkan angka kuman (jumlah Coliform) (Tabel MPN terlampir).



j)



Untuk pemeriksaan dengan hasil positif maka bisa dilanjutkan dengan uji lengkap (Complete Test).



SKEMA UJI PENEGASAN



1-2 mata ose



Uji Duga Positif



BGLBB @ 10 ml



Inkubasikan dalam Inkunbator selama 2 x 24 jam suhu 37 0 C



33



c. UJI LENGKAP (COMPLETE TEST) 1) Alat dan Bahan a) Alat : -



Cawan petri steril.



-



Jarum ose.



-



Bunsen.



-



Inkubator.



b) Bahan : -



Spesimen dari Uji penegasan dengan hasil positif.



-



Media MC steril.



-



Media LB 1 steril.



-



Alkohol.



-



Kapas.



-



Kertas label.



-



Korek api.



2) Cara Kerja a) Siapkan alat dan bahan. b) Bersihkan (aseptiskan) meja kerja dan tangan praktikan menggunakan alkohol. c) Nyalakan bunsen. d) Buat piaraan jasad renik E coli dari uji penegasan positif pada media agar cawan MC dengan cara : piaraan tuang (pour plate), piaraan sebaran (spread plate), piaraan goresan (streak plate), atau penanaman langsung (direct plate). e) Inkubasikan piaraan itu dalam inkubator dengan suhu 37 0 C selama 2 x 24 jam. f)



Amati pertumbuhan koloni pada permukaan agar itu adakah koloni typikal. Apabila tampak koloni typikal maka uji dinyatakan hasilnya positif.



g) Buat piaraan cair dalam media LB 1 dari koloni typikal tersebut dengan cara : mengambil dengan jarum ose steril 2 koloni typikal pada agar MC dan segera dimasukkan ke dalam media LB 1 yang sudah disediakan.



34



h) Inkubasikan piaraan itu dalam inkubator dengan suhu 370 C selama 2 x 24 jam. i)



Amati gas dalam tabung durham setiap 24 jam. Apabila terbentuk gas maka hasilnya positif.



SKEMA UJI LENGKAP Piaraan Goresan (Streak Plate) : 1 ose



Uji Penegasan Positif



Media MC



Inkubasikan dalam Inkunbator selama 2 x 24 jam suhu 37 0 C atau Piaraan Tuang (Pour Plate): 1 ml



Uji Penegasan Positif



15-20 ml



MC cair + 40-500 C



Inkubasikan dalam Inkunbator selama 2 x 24 jam suhu 37 0 C



Kolo LB 1



Inkubasikan dalam inkubator selama 2 x 24 jam dengan suhu370 C



35



B. HASIL DAN PEMBAHASAN



36



C. KESIMPULAN



D. SARAN



Cataan Dosen



Hasil Penilaian



e. f.



Mengetahui Penanggung jawab Laboratorium/lapangan,



(….................…………….....) NIP.



Dosen/Instruktur Praktikum/praktik,



(...............……………...……) NIP.



37



PEMERIKSAAN MAKANAN/MINUMAN MENGGUNAKAN METODE ANGKA LEMPENG TOTAL (ALT) WAKTU PELAKSANAAN



:



TUJUAN



:



1. Mahasiswa mampu memilih peralatan dan bahan yang digunakan dalam praktikum dengan benar. 2. Mahasiswa mampu melakukan tahapan pengambilan dan pengiriman sampel makanan/minuman dengan benar. 3. Mahasiswa mampu melakukan tahapan pemeriksaan ALT pada sampel makanan/minuman dengan benar.



B. PENDAHULUAN Pemeriksaan adanya mikroba pada makanan maupun minuman dapat dilakukan menggunakan metode Angka Lempeng Total (ALT). Metode Angka Lempeng Total (ALT) merupakan metode kuantitatif untuk mengetahui jumlah mikroba yang ada pada suatu sampel. Menurut Rizal (2006) metode ALT merupakan metode perhitungan jumlah koloni mikroba aerob mesofilik. Metode ALT dapat digunakan dengan cara tuang, cara tetes, dan cara sebar. Dalam pemeriksaan tersebut diketahui perkembangan banyaknya bakteri dengan mengatur sampel, di mana total bakteri tergantung atas formasi bakteri di dalam media tempat tumbuhnya dan masing-masing bakteri yang dihasilkan akan membentuk koloni yang tunggal.



1. PENGAMBILAN SAMPEL/CONTOH MAKANAN/MINUMAN a. ALAT DAN BAHAN 1) Alat: a) Wadah sampel steril. b) Bunsen. c) Termos es. d) Alat pengambil sampel (sendok/penjepit makanan/pisau)



38



2) Bahan: a) Sampel makanan dan minuman. b) Alkohol. c) Kapas. d) Korek api. e) Kertas label. f)



Es batu.



g) Formulir h) Alat tulis



b. CARA KERJA 1) Siapkan alat dan bahan. 2) Siapkan formulir pengambilan sampel yang berisi tentang lokasi (nama tempat pengolahan makanan/TPM), alamat TPM, tanggal pengambilan, nama petugas yang mengambil sampel, dan keperluan pemeriksaan laboratorium. 3) Secara aseptis (dekat dengan api bunsen), makanan/minuman dimasukan



dalam



wadah



sampel



steril



dengan



cara



sesuai



keperluaannya yaitu : a) Makanan dimasukkan bersama dalam 1 wadah (dicampurkan) untuk pemeriksaan total b) Makanan



dimasukkan



dalam



wadah



masing-masing



untuk



pemeriksaan tiap jenis makanan. 4) Kita meminta sampel pada TPM (Tempat Pengelolaan Makanan) dengan cara membeli makanan/minuman tersebut seperti pembeli biasa sebanyak 1 porsi. 5) Makanan tersebut dimasukkan kedalam botol/kantung plastik steril sesuai keperluaannya. 6) Pengambilan makanan dari piring dengan menggunakan sedok steril dan untuk makanan yang ukurannya besar digunakan pisau pemotong agar makanan tersebut mudah masuk kedalam wadah. a) Pisau dengan sendok sebelum digunakan dalam keaadaan terbungkus dan bila diperlukan dipanaskan diatas api bunsen



39



beberapa saat dan tunggu sampai pisau kembali dingin baru bisa dipakai.



b) Untuk botol, mulut botol juga harus dipanaskan pada api bunsen. c) Untuk kantung plastik (plastik gula), kantung plastik diatasnya dilipat beberapa lipatan kemudian dihekter. 7) Untuk



membawa



atau mengirim



sampel kelaboratorium, perlu



diperhatikan beberapa hal sbb : 8) Sampel harus sampai di laboratorium dalam waktu kurang dari 24 jam. 9) Bila tidak memungkinkan sampel dibungkus dengan aluminium foil dan ditempatkan pada suhu < 4oC. 10) Gunakan termos es yang dilengkapi dengan es batu untuk membawa sampel. 11) Beri etiket : jenis sampel, tanggal pengambilan dan pengiriman, waktu, lokasi, jenis pemeriksaan dan nama petugas pengambilan. Tapi jika tidak memungkinkan, beri kode yang sesuaikan dengan formulir pemeriksaan. 12) Sampel yang sudah diambil seger dikirimkan ke laboratorium



2. PENGIRIMAN SAMPEL Banyak parameter kualitas air berubah dengan cepat pada waktu pengiriman sampel ke laboratorium. Pengetahuan lapangan dapat membantu mengatasi keadaan sampel. Bilamana sampel tidak dapat diperiksa ditempat, maka hams ditempatkan di dalam kotak yang kuat dan dikirim ke laboratorium secepat mungkin.Untuk Pemeriksaan Bakteriologis jika waktu pengiriman lebih lama 3 jam maka media khusus “holding



media”



harus



dipergunakan. Temperatur ideal untuk penyimpanan sampel 4° — 10° C di daerah beriklim panas, pada waktu kotak dikirim kantong-kantong berisi campuran pendingin harus diletakkan disekitar sampel. Untuk menjamin bahwa setiap sampel mempunyai keterangan yang memadai dan jelas, maka harus dilengkapi dengan suatu fomulir detail. Formulir ini harus berisi semua informasi tentang dimana dan bilamana sampel diambil, termasuk keterangan tentang sampel dan nama orang yang mengirim.



40



3. PEMERIKSAAN ANGKA KUMAN PADA SAMPEL MAKANAN/MINUMAN MENGGUNAKAN METODE ANGKA LEMPENG TOTAL (ALT) a. PREPARASI/PENYIAPAN SAMPEL 1) ALAT DAN BAHAN a) Timbangan Analitik b) Mortal pastel c) Sampel makanan d) Alat pemotong/sendok e) Alcohol. f)



Kapas.



g) Kertas label. h) Korek api.



2) CARA KERJA a) Siapkan alat dan bahan. b) Bersihkan



(aseptiskan)



meja



kerja



dan



tangan



praktikan



menggunakan alkohol. c) Nyalakan bunsen. d) Lakukan homogenisasi sampel: -



Untuk makanan padat: timbang sampel sebanyak 10 gram dengan menggunakan timbangan analitik yang dialasi wadah steril sambil di dekatkan pada api. Haluskan sampel menggunakan mortal dan pastel (ulikan) steril hingga halus, sambil diencerkan dengan 90 ml akuades steril untuk mendapatkan pengenceran 10 kali (pengenceran 10-1).



-



Untuk makanan cair/minuman: pipet sebanyak 10 ml kemudian diencerkan dengan 90 ml akuades steril untuk mendapatkan pengenceran 10 kali (pengenceran 10-1).



e) Diamkan ± 10 menit untuk proses pengendapan



41



b. PEMERIKSAAN ALT SAMPEL MAKANAN/MINUMAN Prinsip : 1. Bahan diencerkan mulai dari 10 -1, 10-2, dan seterusnya dengan perkiraan jumlah kuman yang ada didalam bahan atau specimen. 2. Dari tiap pengenceran diambil 1 cc untuk dimasukkan kedalam petridis steril yang sudah diberi kode pengenceran. 3. Tiap petridis yang sudah diisi specimen, dituangi PCA (Plate Count Agar) steril dengan merata. 4. Setelah membeku, bungkus dengan kertas dan inkubasikan pada suhu 37oC selama 48 jam dengan posisi terbalik. 5. Hitung jumlah koloni yang tumbuh pada media agar tersebut dengan Counter. Apabila perhitugan tidak dapat dilakukan pada akhir 48 jam, dapat ditunda sampai 24 jam dengan syarat didinginkan pada suhu 5oC.



Cara Analisis:



1. Pilih cawan petri dengan pengenceran tertentu yang menunjukkan pertumbuhan koloni antara 30-300 buah. 2. Keloni yang tumbuh berdekatan dan bergabung merupakan kumpulan koloni besar dihitung 1 koloni. 3. Deretan atau rantai koloni yang terlihat sebagai satu garis tebal dihitung 1 koloni. 4. Hasil yang dilaporkan hanya terdiri dari 2 angka yaitu satuan dan persepuluhan. 5. Jika angka persepuluhan sama atau lebih besar dari 5, bualat menjadi persatuan.



Cara Kerja :



1. Lakukan pengenceran sampel dengan menggunakan buffer phospat steril.



42



2. Untuk mendapatkan pengenceran 10x, 100x, 1000x dst, siapkan 6 tabung reaksi steril yang masing-masing berisi 9 ml larutan pengencer dan diberi kode pengenceran 10x, 100x, 1000x, 10.000x dst. 3. Dengan pipet ukur steril ambil 1 ml specimen sampel dan masukkan kedalan petridish steril. Beri kode pengenceran 10x. 4. Kemudian ambil 1 ml lagi untuk dimasukan pada slah stu tabung reaksi steril dengan kode pengenceran 10x. Homogenkan. 5. Dan seterusnya sampai pengenceran 106 kali. 6. Sebagai kontrol, petridish steril diisi 1 ml larutan pengencer. 7. Semua petridish yang sudah diisi dengan spesimen dituangi denga PCA secukupnya (15-20 ml). 8. Setelah beku bungkus dengan kertas dan inkubasikan pada suhu 37oC selama 48 jam dengan posisi terbalik.



Contoh perhitungan :



a. Kontrol



:1



koloni



b. Pengenceran 10-1



: 276



koloni



c. Pengenceran 10-2



: 105



koloni



d. Pengenceran 10-3



: 32



koloni



-4



: 30



koloni



e. Pengenceran 10



Rata-Rata KK = (Jlh koloni per cawan yang memenuhi syarat – Kontrol) x Faktor Pengencer Jlh cawan yang memenuhi syarat perhitungan Jumlah kuman = (276-1) x 10 + (105-1) x 100 + (32-1) x 1000 + (30-1) x 10.000 4 cawan = 72.500 koloni/ cm2 KK/cm2 =



Rata-Rata Kaloni L. Usapan x Jlh Alat yang di usap



43



SKEMA PEMERIKSAAN AGKA KUMAN UNTUK SAMPEL USAP ALAT MAKAN 1 ml



1 ml



1 ml



1 ml



1 ml



1 ml



kontrol



-1



10 sampe l



10-1



10-2



1 ml



1 ml



10-3



1 ml



10-4



1ml



10-5



1 ml



10-6



1 ml



1 ml kontrol



10-1



15-20 ml



10-2



10-3



10-4



10-5



10-6



PCA



Keterangan : 1. Kontrol diisi 1 ml aquades steril atau buffer phospat steril. 2. Media PCA steril dituang sebanyak 15-20 ml pada masing-masing petridis tersebut.



44



3. Homogenkan dengan cara menggoyangkan petridish atau dengan menggerakan petridis membentuk angka 8. 4. Biarkan agar membeku. 5. Bungkus dengan kertas payung. 6. Inkubasi dalam inkubator dalam posisi terbalik dengan suhu 37 oC selama 48 jam.



45



C. HASIL DAN PEMBAHASAN



46



D. KESIMPULAN



E. SARAN



Cataan Dosen



Hasil Penilaian



g. h.



Mengetahui Penanggung jawab Laboratorium/lapangan,



(….................…………….....) NIP.



Dosen/Instruktur Praktikum/praktik,



(...............……………...……) NIP.



47



PEMERIKSAAN JAMUR PADA TANAH



WAKTU PELAKSANAAN



:



TUJUAN



:



1. Mahasiswa mampu memilih peralatan dan bahan yang digunakan dalam praktikum dengan benar. 2. Mahasiswa mampu melakukan pemeriksaan Jamur pada tanah dengan benar.



A. PENDAHULUAN Jamur adalah semua anggota yang termasuk kelompok fungi dan beberapa jenis organisme yang dianggap berkaitan seperti jamur lender dan jamur belah. Arti kedua berkaitan dengan sanitasi dan menjadi sinonim bagi kapang. Kelompok fungi terutama Basidiomycetes yang biasanya muncul dari permukaan tanah atau substrat tumbuhnya. Pengertian ini berkaitan dengan nilai ekonomi jamur sebagai bahan pangan, sumber racun atau bahan pengobatan. Jamur yang tergolong Basidiomycetes dijumpai dalam tanah tahap miselium dan dapat dikenali dari pembentukan buah atau badan buah yang dihasilkannya pada permukaan tanah atau yang melapuk. Berkaitan dengan kemampuannya memanfaatkan selulosa, jamur tanah membentuk kolonisasi tertentu. Penilaian ini bertujuan untuk menginventarisasi jamur tanah yang tumbuh pada tanah dan mengamati bentuk atau pada kolonisasi jamur pada tanah.



B. ALAT DAN BAHAN 1. ALAT a. Beaker gelas b. Tabung erlemeyer c. Autoclave d. Cawan Petri e. Hot plate ( pemanas listrik) f.



Pengaduk



48



2. BAHAN a. Sampel Tanah b. PDA



C. PROSEDUR KERJA 1. Pembuatan Media PDA (Potato Dextros Agar) a. Timbang media PDA 5,46 gram diperoleh dari :



39 gr X 20 ml x 7 cawan petri x 1 spl 1000 ml aquadest



b. Media PDA dilarutkan kedalam 140 ml aquadest kemudian dihomogenkan di hot plate (pemanas listrik) c. Disterilisasikan kedalam autclave dengan suhu 1210C selama 15 menit dengan tekanan 15 psi d. Kemudian media PDA yang sudah disterilkan dituangkan kedalam cawan petri steril sebanyak 20 ml tiap-tiap cawan e. Media siap digunakan untuk penanaman.



2. Cara Pemeriksaan a. Timbang sampel tanah sebanyak 10 gram b. Larutkan pada buffer phosphat 90 ml c. Buat pengenceran bertingkat dari 101 sampai 106, caranya : 1) Siapkan 6 tabung masing-masing diisi 9 ml buffer phosphat 2) Ambil 1 ml larutan sampel masukkan ke tabung pertama, campur sampai homogen. Setelah homogen ambil 1 ml masukkan ke tabung 102 campur sampai homogen. Setelah homogen masukkan ke tabung 103 campur homogeny demikian seterusnya sampai tabung 106 d. Setelah selesai masing-masing pengenceran diambil 1 ml masukkan ke cawan petri dengan kode label yang sama. e. Masing – masing tuangi PDA sebanyak 18 – 29 ml, goyang sebentar biar rata.



49



f.



Biarkan sampai beku



g. Inkubasi selama 7 x 24 jam pada suhu 37 0C dengan posisi cawan terbalik.



3. Kriteria Pembacaan Hasil Koloni jamur yang dihitung adalah 30 koloni sampai 300 koloni/petridish.



Contoh soal :



1. Kontrol



: 2 koloni



2. 101



: 17 koloni



3. 102



: 25 koloni



3



: 31 koloni



5. 104



: 56 koloni



6. 105



: 78 koloni



7. 106



: 124 koloni



4. 10



Perhitungan : Angka Kuman = (31 – 2) 103 + (56 – 2) 104 + (78 -2) 105 + (124 – 2) 106 4



50



D. HASIL DAN PEMBAHASAN



51



E. KESIMPULAN



F. SARAN



Cataan Dosen



Hasil Penilaian



i. j.



Mengetahui Penanggung jawab Laboratorium/lapangan,



(….................…………….....) NIP.



Dosen/Instruktur Praktikum/praktik,



(...............……………...……) NIP.



52



PEMERIKSAAN BAKTERI ESCHERICIA COLI PADA SAMPEL MAKANAN



WAKTU PELAKSANAAN



:



TUJUAN



:



a. Mahasiswa mampu memilih peralatan dan bahan yang digunakan dalam praktikum dengan benar. b. Mahasiswa mampu melakukan tahapan pemeriksaan MPN E. coli pada sampel makanan dengan benar. c. Mahasiswa mampu membedakan koloni tipikal dan atipikal dengan benar.



A. PENDAHULUAN Standar analisis untuk mengetahui adanya bakteri golongan coli adalah melalui beberapa tahap yaitu :



1. Uji duga (presumtived) 2. Uji penegasan (confirmed test) 3. Uji lengkap (completed test) Uji duga dengan media LB (Lactosa Broth) bertujuan menduga adanya bakteri coli yang mempunyai sifat mampu memfermentasi laktosa dengan menghasilkan gas dan asam lakta. Bakteri coli yang diduga meliputi semua bakteri gram negatif tidak membentuk spora, selnya berbentuk batang pendek, bersifat fakultatif anaerob, membentuk gas dalam waktu 24 jam pada suhu 37 oC. Apabila terbentuk gas dalam waktu 24 jam, maka uji duga dinyatakan positif. Apabila gas terbentuk setelah 24 jam ke 2 (48 jam), uji dinyatakan meragukan. Sedangkan pada gas yang tidak terbentuk selama 48 jam maka uji dinyatakan negatif. Jika uji negatif, maka pemeriksaan lanjutan tidak diperlukan lagi karena hampir bisa dipastikan bahwa didalam sampel yang diperiksa tidak terdapat coli.



53



Pada uji penegasan dengan menggunakan media Ec. Broth dibutuhkan untuk memberikan penegasan bahwa hasil benar-benar positif. Pada uji lengkap dengan media EMBA (Eosin Metillin Blue) atau EA (Endo Agar) dilakukan dengan membuat piaraan dari jasad renik yang tumbuh dalam media yang digunakan dalam uji penegasan dengan hasil positif. Terdapat 3 tipe koloni tumbuh pada agar yaitu: 1.



Koloni tipikal, berwarna merah tampak gelap pada bagian tengah dengan atau tanpa kilap logam.



2.



Koloni atipikal, tidak tampak adanya bagian gelap pada bagian tegah koloni setelah diinkubasi selama 24 jam berwarna Hijau metalit.



3.



Koloni yang tidak termasuk dalam keduanya dan merupakan indikator uji negatif. Terdapat 2 seri tabung yang digunakan yaitu seri 5 1 1 (untuk makanan



terolah) dan seri 5 5 5 atau 3 3 3 untuk makanan belum terolah. Seri tabung dapat digambarkan sebagai berikut : 1. Seri 7 tabung (5 1 1 ) untuk makanan atau minuman terolah



LB3 @ 5 ml



LB1 10 ml



LB110 ml



2. Seri 5 tabung (5 5 5) atau 3 tabung (3 3 3) untuk bahan makanan/air belum terolah LB3 5



ml



LB1 10 ml



LB1 10 ml



54



Atau



LB3 5 ml



LB1 10 ml



LB1 10 ml



B. PROSEDUR KERJA 1. PENGAMBILAN SAMPEL MAKANAN a. Alat dan bahan 1) Wadah contoh (kantung plastik) untuk wadah sampel. 2) Sarung tangan steril/ bersih 3) Sendok steril 4) Pisau pemotong steril 5) Petridish steril 6) Formulir pengambilan sampel 7) Kertas selotip 8) Sabun desinfektant 9) Termos es dan es batu



b. Cara kerja 1) Siapkan alat dan bahan 2) Siapkan formulir pengambilan sampel yang berisi, tentang lokasi (nama tempat pengolahan makanan/TPM), alamat TPM, tanggal



55



pengambilan, nama petugas yang mengambil sampel, dan keperluan pemeriksaan laboratorium. 3) Makanan dimasukan dalam botol/ kantong plastik steril dengan cara sesuai keperluaannya yaitu : -



Makanan dimasukkan bersama dalam 1 wadah (dicampurkan) untuk pemeriksaan total



-



Makanan dimasukkan dalam wadah masing-masing untuk pemeriksaan tiap jenis makanan.



4) Meminta ijin kepada pemilik TPM (Tempat Pengelolaan Makanan) dengan cara membeli makanan tersebut seperti pembeli biasa sebanyak 1 porsi. 5) Makanan tersebut dimasukkan kedalam botol/kantung plastik steril sesuai keperluaannya. 6) Pengambilan makanan dari piring dengan menggunakan sedok steril dan untuk makanan yang ukurannya besar digunakan pisau pemotong agar makanan tersebut mudah masuk kedalam wadah. 7) Pisau dengan sendok sebelum digunakan dalam keaadaan terbungkus dan bila diperlukan dipanaskan diatas api bunsen beberapa saat dan tunggu sampai pisau kembali dingin baru bisa dipakai. 8) Untuk botol, mulut botol juga harus dipanaskan pada api bunsen. 9) Untuk kantung plastik (plastik gula), kantung plastik diatasnya dilipat beberapa lipatan kemudian dihekter. 10) Untuk membawa atau mengirim sampel kelaboratorium, perlu diperhatikan beberapa hal sbb :



56



-



Sampel harus sampai di laboratorium dalam waktu kurang dari 24 jam.



-



Bila tidak memungkinkan sampel dibungkus dengan aluminium foil dan ditempatkan pada suhu < 4oC.



-



Gunakan termos es untuk membawa sampel.



11) Beri etiket : jenis sampel, tanggal pengambilan dan pengiriman, waktu, lokasi, jenis pemeriksaan dan nama petugas pengambilan. Tapi jika tidak memungkinkan, beri kode yang sesuaikan dengan formulir pemeriksaan. 12) Sampel yang sudah diambil seger dikirimkan ke laboratorium 13) Masukkan dalam termos es yang sudah diberi es batu. 14) Untuk Sampel kemasan kaleng : -



Ambil/pilih kemasan yang kalengnya menggelembung.



-



Beri etikel : jenis sampel, tanggal pengambilan dan pengiriman, waktu,



lokasi,



jenis



pemeriksaan



dan



nama



petugas



pengambilan. 2. PREPARASI/PENYIAPAN SAMPEL a. ALAT DAN BAHAN 1) Timbangan Analitik 2) Mortal pastel 3) Sampel makanan 4) Alat pemotong/sendok 5) Alcohol. 6) Kapas. 7) Kertas label. 8) Korek api.



57



b. CARA KERJA 1) Siapkan alat dan bahan. 2) Bersihkan (aseptiskan) meja kerja dan tangan praktikan menggunakan alkohol. 3) Nyalakan bunsen. 4) Lakukan homogenisasi sampel: a) Untuk makanan padat: timbang sampel sebanyak 10 gram dengan menggunakan timbangan analitik yang dialasi wadah steril sambil di dekatkan pada api. Haluskan sampel menggunakan mortal dan pastel (ulikan) steril hingga halus, sambil diencerkan dengan 90 ml akuades steril untuk mendapatkan pengenceran 10 kali (pengenceran 10-1). b) Untuk makanan cair/minuman: pipet sebanyak 10 ml kemudian diencerkan dengan 90 ml akuades steril untuk mendapatkan pengenceran 10 kali (pengenceran 10-1). 5) Timbang sampel sebanyak 10 gram dengan menggunakan timbangan analitik yang dialasi wadah steril sambil di dekatkan pada api 6) Haluskan sampel menggunakan mortal dan pastel (ulikan) steril hingga halus, sambil diencerkan dengan 90 ml akuades steril untuk mendapatkan pengenceran 10 kali 7) Diamkan ± 10 menit untuk proses pengendapan.



3. PEMERIKSAAN SAMPEL MAKANAN a. UJI DUGAAN (PRESUMTIVE TEST) SERI TABUNG = 5 1 1 atau 7 Tabung (makanan terolah) 1) ALAT DAN BAHAN a) Alat : -



Tabung reaksi steril.



-



Tabung durham steril



-



Rak tabung reaksi.



-



Pipet ukur 10 ml dan 1 ml steril.



-



Bunsen.



-



Bulp/pipet filer/penghisap.



58



-



Inkubator.



a. Bahan : -



Sampel makanan



-



Media LB 1 dan LB 3 steril.



-



Alcohol.



-



Kapas.



-



Kertas label.



-



Korek api.



2) CARA PEMERIKSAAN a) Beri label pada tabung reaksi yang berisi media LB3 dan LB1 sesuai dengan ml sampel yang akan diinokulasi b) Inokulasikan (masukkan) masing-masing 10 ml sampel ke dalam 5 tabung yang berisi media LB 3 steril dengan menggunakan pipet ukur steril. c) Inokulasikan (masukkan) masing-masing 1 ml sampel ke dalam 1 tabung yang berisi media LB 1 steril dengan menggunakan pipet ukur steril. d) Inokulasikan (masukkan) masing-masing 0,1 ml sampel ke dalam 1 tabung yang berisi media LB 1 steril dengan menggunakan pipet ukur steril. e) Lalu homogenkan dengan cara memutar tabung reaksi hingga f)



Inkubasikan piaraan di dalam inkubator dengan suhu 370 C selama 2 x 24 jam.



g) Amati piaraan itu setiap 24 jam. Amati juga gas yang terbentuk dalam tabung durham. Timbulnya gas dalam 24 jam menunjukkan uji positif, dan apabila terbentuknya gas setelah waktu 24 jam menunjukkan hasil yang meragukan. Apabila setelah 2 x 24 jam tidak terbentuk gas, maka uji dikatakan hasilnya negatif. h) Untuk hasil yang positif dan meragukan maka perlu dilanjutkan ke uji penetapan/penegasan (Confirmed Test).



59



Catatan : Dalam setiap pengerjaan penanaman (inokulasi) sampel haruslah dilakukan seaseptis mungkin yaitu selalu didekatkan dan dilewatkan pada api bunsen.



SKEMA PEMERIKSAAN TAHAP UJI DUGA



10 gram sampel makanan padat dihancurkan dengan Mortal atau dibelender lalu di encerkan dengan aquadest steril 90 ml sampai volume mencapai 100 ml (pengenceran 10 x) Di pipet sesuai dengan ml sampel yang diinokulasi kedalam tiap media LB UJI DUGA @ 10 ml



LB3 @ 5 ml



@ 1 ml



LB1@ 10 ml



@ 0,1 ml



LB1 @ 10 ml



b. UJI PENETAPAN/PENEGASAN (CONFIRMED TEST) 1) ALAT DAN BAHAN a) Alat : -



Tabung reaksi steril



-



Tabung durham steril



-



Rak tabung reaksi



-



Jarum ose



-



Bunsen



-



inkubator



b)



Bahan : -



Hasil uji duga positif/meragukan.



-



Media EC Broth steril.



-



Alkohol.



60



-



Kapas.



-



Kertas label.



-



Korek api.



2) CARA KERJA a) Siapkan alat dan bahan. b) Bersihkan (aseptiskan) meja kerja dan tangan praktikan menggunakan alkohol. c) Nyalakan bunsen. d) Bakar jarum ose sampai merah membara. Dinginkan sebentar. e) Inokulasikan (masukkan) 2-3 mata ose spesimen dari hasil uji duga positif/meragukan ke dalam 10 ml media EC Broth steril. f)



Beri label pada tabung sesuai dengan label hasil uji duga positif/meragukan.



g) Inkubasikan piaraan dalam inkubator pada suhu 44o C – 44,5 o C selama 1 x 24 jam h) Amati



gelembung



gas



yang



terjadi.



Apabila



terdapat



gelembung gas dalam tabung durham maka hasilnya positif. i)



Tulis hasil yang positif dan cocokkan dengan tabel kombinasi MPN untuk mendapatkan angka kuman (jumlah E. coli).



j)



Untuk pemeriksaan dengan hasil positif maka bisa dilanjutkan dengan uji lengkap (Complete Test).



SKEMA UJI PENEGASAN



1-2 mata ose



Uji Duga Positif



EC Broth @ 10 ml



Inkubasikan dalam Inkunbator selama 1 x 24 jam suhu 44 0 C – 44,50 C



61



c. UJI LENGKAP (COMPLETE TEST) 1) ALAT DAN BAHAN a) Alat : -



Cawan petri steril.



-



Jarum ose.



-



Bunsen.



-



Inkubator.



b) Bahan : -



Uji penegasan dengan hasil positif.



-



Media EMBA steril.



-



Media LB 1 steril.



-



Alkohol.



-



Kapas.



-



Kertas label.



-



Korek api.



2) CARA KERJA a) Siapkan alat dan bahan. b) Bersihkan (aseptiskan) meja kerja dan tangan praktikan menggunakan alkohol. c) Nyalakan bunsen. d) Buat piaraan jasad renik E coli dari uji penegasan positif pada media agar cawan EMBA dengan cara : piaraan tuang (pour plate), piaraan sebaran (spread plate), piaraan goresan (streak plate), atau penanaman langsung (direct plate). e) Inkubasikan piaraan itu dalam inkubator dengan suhu 440 C – 44,50 C selama 1 x 24 jam. f)



Amati pertumbuhan koloni pada permukaan agar itu adakah koloni typikal. Apabila tampak koloni typikal maka uji dinyatakan hasilnya positif (koloni E.coli berwarna Hijau Metalit/Hijau Mengkilat).



g) Buat piaraan cair dalam media LB 1 dari koloni typikal tersebut dengan cara : mengambil dengan jarum ose steril 2 koloni



62



typikal pada agar EMBA dan segera dimasukkan ke dalam media LB 1 yang sudah disediakan. h) Inkubasikan piaraan itu dalam inkubator dengan suhu 370 C selama 2 x 24 jam. i)



Amati gas dalam tabung durham setiap 24 jam. Apabila terbentuk gas maka hasilnya positif.



SKEMA UJI LENGKAP Piaraan Goresan (Streak Plate) : 1 ose



Uji Penegasan Positif



Media MC



Inkubasikan dalam Inkunbator selama 2 x 24 jam suhu 37 0 C atau Piaraan Tuang (Pour Plate): 1 ml



Uji Penegasan Positif



15-20 ml



MC cair + 40-500 C



Inkubasikan dalam Inkunbator selama 2 x 24 jam suhu 37 0 C



Kolo LB 1



Inkubasikan dalam inkubator selama 2 x 24 jam dengan suhu370 C



63



d. ANALISIS PENGHITUNGAN BAKTERI Eshericia coli (E. coli) MENGGUNAKAN CARA MPN Cara



menghitung mikroba



dengan metode



MPN



tidak



digunakan media agar, tetapi media cair (broth). Tidak semua jenis mikroba bisa dihitung dengan cara ini. Mikroba yang dapat dihitung dengan cara MPN adalah bakteri yang dapat tumbuh dalam media cair tertentu dan mengubah senyawa dalam media itu dengan indikator tertentu pula sebagai hasil perombakan medianya. Bakteri yang berasal dari sampel ditumbuhkan dalam media cair di tabung reaksi. Sampel boleh diencerkan dalam beberapa tingkat. Banyaknya media untuk menanam sampel 3 buah atau 5 buah tabung untuk satu jenis pengenceran. Apabila memakai 3 tabung, metode MPN itu disebut seri 3 tabung dan apabila 5 tabung disebut cara MPN 5 tabung. Di dalam tabung media cair untuk menanam sampel diberi tabung durham dengan posisi terbalik. Tabung itu berfungsi sebagai tempat penampung gas yang dihasilkan oleh bakteri dalam sampel setelah ditanam dalam media cair itu. Ini adalah salah satu indikator adanya jasad renik yang tumbuh dalam media itu yang asalnya dari sampel. Pengenceran



yang



dibuat



harus



dapat



menghasilkan



pertumbuhan bakteri yang berasal dari satu sel dalam beberapa tabung dan tabung lainnya tidak mengandung satu sel pun. Dengan kata lain, setelah inkubasi ada beberapa tabung yang ditumbuhi baktaeri dengan tanda adanya gas di dalam tabung durham dan lainnya tidak. Tabung yang berisi gas dikatakan hasil positif, sedangkan yang tidak ada gas dikatakan hasil negatif. Media yang disediakan atau yang berada di dalam tabung harus mengandung zat yang dapat dirombak oleh bakteri yang ada di dalam sampel dan menghasilkan indikator tertentu sebagai hasil perubahan. Seperti misalnya dalam pemeriksaan air terhadap bakteri coliform, media yang disediakan adalah ”Lactosa cair”. Media itu akan difermentasi oleh bakteri coliform menghasilkan gas dan media itu akan berubah warna.



64



Banyaknya bakteri coli atau yang sering disebut ”angka coli” dari sampel air dapat dilakukan antara lain dengan menggunakan metode Most Probable Number (MPN) atau Prakiraan Terdekat Jumlah (PTJ). Adapun dasar dari metode ini adalah piaraan cair bakteri coli dalam contoh air dengan media yang mengandung bahan yang dapat difermentasi oleh bakteri asam organik. Metode tersebut merupakan metode standart dalam menentukan angka coli (coliform group) sebagai jasad indikator pencemaran air oleh air buangan rumah tangga. Angka coli yang diperoleh dapat untuk mengetahui tingkat kontaminasi air oleh bahan buangan yang berasal dari tinja atau hewan berdarah panas. Bakteri coli adalah diartikan sebagai bakteri dengan sifat-sifat : selnya berbentuk batang (pendek), aerob atau fakultatif anaerob, tidak membentuk spora, gram negatif dan dapat memfermentasi laktosa dengan menghasilkan gas dalam waktu 2 x 24 jam pada suhu 370C. Untuk mengetahui hasil MPN, tabung yang dipergunakan untuk fermentasi berbeda-beda. Adapun patokan yang dapat dipergunakan adalah sebagai berikut:



a. Seri 5 : 1 : 1 7 tabung dengan susunan : 5 x 10 ml 1 x 1 ml 1 x 0,1 ml Artinya : 5 tabung LB 3 @ 5ml masing-masing diisi 10 ml contoh. 1 tabung LB 1 @ 10 ml masing-masing diisi 1 ml contoh. 1 tabung LB 1 @ 10 ml masing-masing diisi 0,1 ml contoh.



65



b. Seri 3 tabung (3 : 3 : 3) 9 tabung dengan susunan : 3 x 10 ml 3 x 1 ml 3 x 0,1 ml Artinya : 3 tabung LB 3 @ 5ml masing-masing diisi 10 ml contoh. 3 tabung LB 1 @ 10 ml masing-masing diisi 1 ml contoh. 3 tabung LB 1 @ 10 ml masing-masing diisi 0,1 ml contoh.



c. Seri 5 tabung (5 : 5 : 5) 15 tabung dengan susunan 5 x 10 ml 5 x 1 ml 5 x 0,1 ml Artinya : 5 tabung LB 3 @ 5ml masing-masing diisi 10 ml contoh. 5 tabung LB 1 @ 10 ml masing-masing diisi 1 ml contoh. 5 tabung LB 1 @ 10 ml masing-masing diisi 0,1 ml contoh. Besarnya volume contoh air yang diinokulasikan ke dalam masing-masing tabung yaitu : 10 ml, 1 ml, 0,1 ml disebut porsi 10, 1 dan 0,1 ml. Akan tetapi sebenarnya volume contoh yang diinokulasikan ke dalam media dapat menggunakan porsi lain, sebagai contoh : 100 ml, 10 ml dan 1 ml 0,1 ml, 0,001 dan 0,001 ml Hal ini berarti contoh yang telah ditentukan MPN nya masih harus dibagi atau dikalikan dengan factor pengenceran. Di samping



66



itu, apabila digunakan lebih dari 3 pengenceran , nilai MPN tetap dihitung hanya 3 pengenceran. Seri tabung yang lebih baik digunakan untuk menentukan MPN adalah seri 5 tabung. Sedangkan pengenceran contoh tergantung dari keadaannya apakah kira-kira contoh itu mengandung banyak coli atau hanya sedikit. Apabila diperkirakan berjumlah banyak lebih baik contoh itu diencerkan dengan kelipatan 10. Contoh : 1. Dicoba menggunakan seri 3 tabung. 2. Contoh air dari sumber tertentu dipersiapkan. 3. Persiapkan akuades steril dalam tabung-tabung reaksi. 4. media cair laktosa dengan tabung dirham di dalamnya yang sudah steril. 5. Persiapkan 12 tabung laktosa cair dan kelompokkan menjadi 4 seri tabung. 6. Lakukan pengenceran seperti pada gambar. 7. Inokulasikan tiap kelompok tabung dengan volume 10 ml, 1 ml, 0,1 ml dan 0,01 ml. 8. Inkubasikan piaraan itu pada suhu 37 0C selama 2 x 24 jam dalam inkubator. 9. Amati setiap tabung dalam setiap kelompok , apakah hasilnya positif (ada gas dalam tabung durham) atau hasilnya negatif, tanpa ada gas dalam tabung durham. 10. Tulis semua hasil pengamatan itu seperti pada skema berikut : Jumlah ml sampel yang diinokulasikan ke dalam media



Kombinasi MPN yang digunakan



laktosa cair 10 ml



1 ml



0,1



0,01 ml



ml 3



3



2



1



4



2



1



67



11. Kombinasi MPN untuk menentukan angka coli dimulai dari pengenceran terakhir yang semua tabung dalam kelompok hasilnya positif, kemudian diikuti banyaknya hasil positif dari pengenceran berikutnya. Apabila pengenceran berikutnya (setelah 2 pengenceran) hasilnya juga positif, maka banyaknya hasil positif itu ditambahkan pada hasil positif sebelumnya (pengenceran ke-3). MPN dihitung untuk 100 ml contoh air. Apabila akan ditentukan tiap 1 ml maka harus dibagi 100. Dari contoh ini, dengan kombinasi MPN 3 2 1, didapatkan MPN sesuai MPN dalam tabel. Karena digunakan seri 3 tabung, maka nilai MPN yang diperoleh sesuai dengan tabel MPN seri 3 tabung. Akan tetapi sebenarnya tabel MPN ada beberapa macam



disesuaikan



dengan



banyaknya



tabung



yang



digunakan. (Lampiran). Dari MPN yang telah diperoleh dari tabel, kita dapat menentukan nilai MPN sebenarnya yaitu : Dari kombinasi MPN didapatkan : 3 2 1, maka : MPN tabel



=150



MPN sebenarnya



= MPN tabel x



1 Penganceran tabung yang di



tengah dari



kombinasi MPN = 150 x 1 10-1 =150 x 10 = 1,5 x 103



68



Contoh lain : Jumlah ml contoh yang diinokulasi



Kombinasi MPN yang digunakan



ke dalam media laktosa cair 10 ml



1 ml



0,1 ml



0,01 ml



3



1



0



1



3



1



1



0



2



0



0



0



2



2



Setelah dilihat pada tabel MPN kemudian dicari MPN sebenarnya, maka didapatkan : Kombinasi MPN



MPN tabel



MPN sebenarnya



3



1



1



75



7,5 x 10



0



2



2



6,2



0,6 x 10



Cara lain untuk menentukan MPN sebenarnya adalah sbb: Apabila porsi yang digunakan adalah : a. 100 ml, 10 ml, dan 1 ml, MPN sebenarnya adalah MPN tabel kali 0,1 b. 1 ml, 0,1 ml, dan 0,01 ml, MPN sebenarnya adalah MPN tabel kali 10 c. 0,1 ml, 0,01 ml, dan 0,001 ml, MPN sebenarnya adalah MPN tabel kali 100



69



C. HASIL DAN PEMBAHASAN



70



D. KESIMPULAN



E. SARAN



Cataan Dosen



Hasil Penilaian



k. l.



Mengetahui Penanggung jawab Laboratorium/lapangan,



(….................…………….....) NIP.



Dosen/Instruktur Praktikum/praktik,



(...............……………...……) NIP.



71



PEMERIKSAAN ANGKA LEMPENG TOTAL (ALT) PADA SAMPEL USAP ALAT MAKAN WAKTU PELAKSANAAN



:



TUJUAN



:



a. Mahasiswa mampu memilih peralatan dan bahan yang digunakan dalam praktikum dengan benar. b. Mahasiswa mampu melakukan tahapan pengambilan sampel usap alat makan dengan benar. c. Mahasiswa mampu melakukan tahapan pemeriksaan ALT pada sampel usap alat makan dengan benar.



A. PENDAHULUAN Kontaminasi makanan dapat terjadi setiap saat, salah satunya dari peralatan makanan yang digunakan tidak memenuhi syarat kesehatan. Di Indonesia



peraturan



telah



dibuat



dalam



bentuk



Permenkes



RI



No.



1096/Menkes/Per/VI/2011, bahwa untuk persyaratan peralatan makanan tidak boleh bakteri lebih dari 0 koloni/cm2. Peranan peralatan makanan dalam pedagang makanan merupakan bagian yang tak terpisahkan dari prinsip-prinsip penyehatan makanan (Food hygiene). Setiap peralatan makan (piring, gelas, sendok) harus selalu dijaga kebersihannya setiap saat digunakan. Alat makan (piring, gelas, sendok) yang kelihatan bersih belum merupakan jaminan telah memenuhi persyaratan kesehatan, karena didalam alat makan (piring, gelas, sendok) tersebut tercemar bakteri E.coli yang menyebabkan alat makan (piring, gelas, sendok) tersebut tidak memenuhi kesehatan. Untuk itu pencucian peralatan sangat penting diketahui secara mendasar, dengan pencucian secara baik akan menghasilkan peralatan yang bersih dan sehat pula. Dengan menjaga kebersihan peralatan makan (piring, gelas, sendok,dll.), berarti telah membantu mencegah pencemaran atau kontaminasi makanan yang dikonsumsi (Djajadinigrat, 1989 dalam Pohan, 2009).



72



B. ALAT DAN BAHAN 1. Kapas lidi steril 2. Plastik steril 3. Sarung tangan steril 4. Lampu bunsen 5. Korek api 6. Gunting kecil 7. Termos es dan es batu 8. Kapas dan alkohol 9. Alat tulis 10. Blangko/formulir pengambilan sampel 11. Media transpor (cairan buffer dalam botol sebanyak 10 ml)



C. KETENTUAN ALAT MAKAN YANG DIAMBIL SEBAGAI SAMPEL 1. Diutamakan pada alat makan yang siap digunakan. Tapi jika tidak mungkin, dapat diambil yang baru selesai dicuci. 2. Alat makan (diambil 4-5 buah secara acak untuk tiap jenis alat).



D. PROSEDUR KERJA 1. CARA MENGUSAP ALAT MAKAN a. Siapkan sarung tangan steril dari karet. Sebelumnya basahi tangan dengan dengan alkohol. b. Alat makan minum yang akan diperiksa masing-masing diambil secara acak dari tempat penyimpanan. c. Persiapkan formulir pemeriksaan dengan membagi alat makan minum dalam kelompok-kelompok. d. Persiapkan lidi kapas steril, kemudian buka tutup botol yang telah diisi buffer phospat steril dan masukkan lidi kapas kedalamnya. e. Lidi kapas steril dalam botol ditekan-tekan kedinding botol untuk membuang airnya. Stelah itu diangkat dan diusapkan pada setiap alat makan minum. Usapkan sampai 1 kelompok alat selesai diusap. 1) Cangkir/gelas : diusap mengellingi permukaan luar dan dalam bagian bibir setinggi 6mm, dengan pengusapan melingkar sebanyak 3 kali.



73



2) Sendok : permukaan bagian dalam dan luar diusap sebanyak kali. 3) Garpu : permukaan bagian luar dan dalam alat penusuk diusap 3 kali. 4) Piring dan mangkok besar : permukaan dalam tempat makan diletakkan dengan atau tanpa menggunakan alat bantu plastik steril dengan lubang besar 5 x 10 cm2 diusap dengan cara menyilang (diagonal) siku-siku antara garis usapan yang stu dengan garis usapan yang kedua. 5) Alat masak : setiap uasapan seluas 50 cm 2 dan dianggap 1 kelompok setelah silakukan seluas permukaan sebanyak 5 kali. f.



1 lidi kapas digunakan untuk 1 kelompok alat makan yang diperiksa.



g. Untuk setiap selesai mengusap 1 alat dari 1 kelompok alat makan, lidi kapas selalu dimasukkan dahulu kedal buffer phospat, diputar-putar lalu ditekan-tekan ke dinding botol. h. Setelah semua kelompok alat makan minum selesai diusap, lidi kapas dimasukkan kedalam botol dipanaskan dengan bunsen kemudian ditutup kembali. i.



Hasil usapan alat dikirim ke laboratorium dengan menempelkan etiket yang berisi keterangan sbb. : 1) Nama alat yang diusap 2) Lokasi pengambilan 3) Nomor kode sesuai dengan nomor yang ada di formulir 4) Tanggal pengambilan 5) Jenis pemeriksaan yang diminta 6) Nama pengirim/ petugas pengambil



2. PEMERIKSAAN ALT SAMPEL USAP ALAT MAKAN Prinsip : 1. Bahan diencerkan mulai dari 10 -1, 10-2, dan seterusnya dengan perkiraan jumlah kuman yang ada didalam bahan atau specimen. 2. Dari tiap pengenceran diambil 1 cc untuk dimasukkan kedalam petridis steril yang sudah diberi kode pengenceran.



74



3. Tiap petridis yang sudah diisi specimen, dituangi PCA (Plate Count Agar) steril dengan merata. 4. Setelah membeku, bungkus dengan kertas dan inkubasikan pada suhu 37oC selama 48 jam dengan posisi terbalik. 5. Hitung jumlah koloni yang tumbuh pada media agar tersebut dengan Counter. Apabila perhitugan tidak dapat dilakukan pada akhir 48 jam, dapat ditunda sampai 24 jam dengan syarat didinginkan pada suhu 5oC.



Cara Analisis:



1. Pilih cawan petrin dengan pengenceran tertentu yang menunjukkan pertumbuhan koloni antara 30-300 buah. 2. Keloni yang tumbuh berdekatan dan bergabung merupakan kumpulan koloni besar dihitung 1 koloni. 3. Deretan atau rantai koloni yang terlihat sebagai satu garis tebal dihitung 1 koloni. 4. Hasil yang dilaporkan hanya terdiri dari 2 angka yaitu satuan dan persepuluhan. 5. Jika angka persepuluhan sama atau lebih besar dari 5, bualat menjadi persatuan.



Cara Kerja :



1. Lakukan pengenceran sampel dengan menggunakan buffer phospat steril. 2. Untuk mendapatkan pengenceran 10x, 100x, 1000x dst, siapkan 6 tabung reaksi steril yang masing-masing berisi 9 ml larutan pengencer dan diberi kode pengenceran 10x, 100x, 1000x, 10.000x dst. 3. Dengan pipet ukur steril ambil 1 ml specimen sampel dan masukkan kedalan petridish steril. Beri kode pengenceran 10x. 4. Kemudian ambil 1 ml lagi untuk dimasukan pada slah stu tabung reaksi steril dengan kode pengenceran 10x. Homogenkan.



75



5. Dan seterusnya sampai pengenceran 106 kali. 6. Sebagai kontrol, petridish steril diisi 1 ml larutan pengencer. 7. Semua petridish yang sudah diisi dengan spesimen dituangi denga PCA secukupnya (15-20 ml). 8. Setelah beku bungkus dengan kertas dan inkubasikan pada suhu 37oC selama 48 jam dengan posisi terbalik.



Contoh perhitungan :



a. Kontrol



:1



koloni



b. Pengenceran 10-1



: 276



koloni



c. Pengenceran 10-2



: 105



koloni



-3



d. Pengenceran 10



: 32



koloni



e. Pengenceran 10-4



: 30



koloni



Rata-Rata KK = (Jlh koloni per cawan yang memenuhi syarat – Kontrol) x Faktor Pengencer Jlh cawan yang memenuhi syarat perhitungan Jumlah kuman = (276-1) x 10 + (105-1) x 100 + (32-1) x 1000 + (30-1) x 10.000 4 cawan = 72.500 koloni/ cm2 KK/cm2 =



Rata-Rata Kaloni L. Usapan x Jlh Alat yang di usap



Keterangan : 1. Standar maksimum untuk jumlah koloni usap alat makan : 100 koloni/ cm2 . 2. Untuk usap alat masak : 500 koloni/50 cm2 atau 10 koloni/cm2.



76



SKEMA PEMERIKSAAN AGKA KUMAN UNTUK SAMPEL USAP ALAT MAKAN 1 ml



1 ml



1 ml



1 ml



1 ml



1 ml



kontrol



-1



10 sampe l



10-1



10-2



1 ml



1 ml



10-3



1 ml



10-4



1ml



10-5



1 ml



10-6



1 ml



1 ml kontrol



10-1



10-2



15-20 ml



10-3



10-4



10-5



10-6



PCA



Keterangan : 7. Kontrol diisi 1 ml aquades steril atau buffer phospat steril. 8. Media PCA steril dituang sebanyak 15-20 ml pada masing-masing petridis tersebut. 9. Homogenkan dengan cara menggoyangkan petridish atau dengan menggerakan petridis membentuk angka 8. 10. Biarkan agar membeku.



77



11. Bungkus dengan kertas payung. 12. Inkubasi dalam inkubator dalam posisi terbalik dengan suhu 37 oC selama 48 jam.



78



E. HASIL DAN PEMBAHASAN



79



F. KESIMPULAN



G. SARAN



Cataan Dosen



Hasil Penilaian



m. n.



Mengetahui Penanggung jawab Laboratorium/lapangan,



(….................…………….....) NIP.



Dosen/Instruktur Praktikum/praktik,



(...............……………...……) NIP.



80



PEMERIKSAAN BAKTERI VIBRIO CHOLERA PADA SAMPEL USAP DUBUR (RECTAL SWAB) WAKTU PELAKSANAAN



:



TUJUAN



:



1. Mahasiswa mampu memilih peralatan dan bahan yang digunakan dalam praktikum dengan benar. 2. Mahasiswa mampu melakukan tahapan pengambilan sampel usap dubur (rectal swab) dengan benar. 3. Mahasiswa mampu melakukan tahapan pemeriksaan pemeriksaan bakteri Vibrio cholera pada sampel usap dubur dengan benar



A. PENDAHULUAN Menurut Depkes R.I (Th 1990 h. 2 & 12) pengambilan tinja secara langsung sebagai bahan specimen untuk pemeriksaan bakteri infeksi, saluran pencernaan lebih baik dari pada pengambilan swab. Pengambilan recta swab lebih praktis dari pada mengambil dengan segera specimennya, tidak menunggu buang air besar, tidak menimbulkan masalah baik pada waktu pengiriman maupun bila specimen tidak dapat segera diperiksa atau dikirim ke laboratorium. Dengan adanya pengambilan sampel rectal swab pada penjamah makanan akan diketahui kondisi kesehatannya, apakah sebagai carier penyakit cholera atau tidak, disamping itu juga untuk meningkatkan kesehatan penjamah atau karyawan lain yang menjadi karier agar bebas dari penyakit (menular melalui makanan). Kolera merupakan penyakit saluran pencernaan akut, yang disebabkan oleh enterotoksin bakteri Vibrio cholera. Penyakit ini dapat ditularkan melalui makanan atau minuman yang terkontaminasi secara langsung atau tidak langsung oleh tinja atau muntahan orang yang terinfeksi. Beberapa strain tertentu dapat bertahan dalam air atau dalam jangka waktu yang lama.



81



B. PROSEDUR KERJA 1. PENGAMBILAN SAMPEL USAP DUBUR (RECTAL SWAB) 1) ALAT DAN BAHAN 1) Media transport Cary & Blair atau dalam botol Mc. Cartney yang berisikan kira-kira ½ - ¾ botol yang steril (alkali pepton stril 1% 9 ml). 2) Kapas lidi steril (lidi waten), yaitu lidi yang pada ujungnya dililiti kapas. 3) Sarung tangan steril/bersih. 4) Spidol huruf kecil 5) Formulir pengambilan untuk sampel pemeriksaan laboratorium. 6) Gunting kecil 7) Kertas cellotape 8) Lampu sepiritus 9) Termos es 10) Tas pembawa contoh 11) Buku harian pengambilan contoh 12) Sabun disenfektansia.



b. CARA KERJA 1) Menyiapkan alat dan bahan. 2) Mempersiapkan catatan pada formulir pemeriksaan tentang nama yang diperiksa, umur dan tanggal pemeriksaan, serta tempat kerjanya. 3) Persiapkan sarung tangan dan dipakai dengan rapi. 4) Perintahkan dengan cara sopan kepada penderita atau orang yang akan diambil usap duburnya dengan posis menungging. Kedua belah tanganya memegang masing-masing pinggulnya, atau bisa dengan tengkurap. 5) Petugas pemeriksa berdiri disamping kiri (bagi yang kidal sebaliknya) dari penderita. 6) Tangan kira petugas pemeriksa memegang dan melebarkan lubang anus kearah samping kiri kanan dengan cara merenggakan dengan jari tangan kiri. Kemudian tangan kanan bersiap dengan 82



lidi kapas steril dimasukkan kedalam larutan carry & blair (alkali pepton 9 ml) sebagai pelican selanjutnya kedalam anus secara diputar seara jarum jam dengan arah kira-kira sejajar dengan badan penderita, dan kapas lidi harus masuk kedalam kurang lebih 3 cm. 7) Selama memasukkan lidi kapas tetap di putar searah jarum jam dan ditarik dengan terus memutar kearah yang sama sampai keluar. 8) Setelah lidi kapas diluar, segera ambil botol pembawa buku tutup botol dan tenggelamkan lidi kapas ke dalamnya, potong kelebihan lidi kapas sambil memanaskan bibir botol diatas lamu spritus, kemudian tutup botol denga rapat. 9) Tempelkan kertas cellotape yang telah dipersiapkan ke botol dan tulis etiket pakai spidol dengan memberi nama dan nomor kode serta tempat kerja sesuai dalam formulir. 10) Kirimkan segera sampel ke laboratorium.



2. PEMERIKSAAN BAKTERI VIBRIO CHOLERA PADA SAMPEL USAP DUBUR a. ALAT DAN BAHAN 1) ALAT



2)



-



Tabung reksi & rak tabung



-



Cawan petri



-



Pinset



-



Jarum ose



-



Sarung tangan



-



Alkohol & kapas



BAHAN -



Spesimen usap dubur dalam Media carry & blair atau alkali pepton 1%



-



Media TCBS (Thio sulfate Centrate Bile Salt)



-



Anti sera Ogawa, Inaba.



83



b. CARA KERJA 1) Lidi kapas (rectal swab) yang telah mengandung tinja, yaitu ditandai dengan warna pada ujung kapasnya, yaitu ditandai dengan warna kuning pada ujung kapasnya, apabila akan langsung diperiksa dapat dimasukkan ke alkali peptone, apabila diperiksa lebih dari 2 jam maka dimasukkan ke botol yang berisi media steril carry & blair. 2) Apabila berasal dari carry yang mengandung faeces diambil swabnya dan di celupkan ke dalam alkali peptone 1 % di tanam pada suhu 37oC selama 6-24 jam. 3) Dari alkali peptone 1% diambil 1 ose dan ditanamkan dalam media TCBS. Dan di tanam pada suhu 37oC dalam inkubator selama 24 jam.



4) Kemudian bila tumbuh koloni dalam TCBS dengan ciri-ciri, yaitu bulat, warna kuning keping/ke-emasan dan permukaan halus, maka akan dilakukan identifikasi dengan cara mengambil koloni dengan ose kemudian letakkan pada objek glass dengan ditetesi antisera ogawa kemudian diratakan:



-



Jika ada gumpalan, maka ada vibrio cholera jenis ogawa,



-



Jika tidak ada gumpalan: maka ditetesi antisera jenis inaba. Hasilnya: jika terjadi gumpalan maka ada Vibrio cholera jenis inaba, tetapi jika tidak ada gumpalan dan bila diangkat dengan ose separti benang, maka terdapat Vibrio cholera jenis polyva.



84



C. HASIL DAN PEMBAHASAN



85



D. KESIMPULAN



E. SARAN



Cataan Dosen



Hasil Penilaian



o. p.



Mengetahui Penanggung jawab Laboratorium/lapangan,



(….................…………….....) NIP.



Dosen/Instruktur Praktikum/praktik,



(...............……………...……) NIP.



86



PEMERIKSAAN SAMPEL UDARA



WAKTU PELAKSANAAN



:



TUJUAN



:



1. Mahasiswa mampu memilih peralatan dan bahan yang digunakan dalam praktikum dengan benar. 2. Mahasiswa mampu melakukan tahapan pengambilan sampel udara dengan benar. 3. Mahasiswa mampu melakukan tahapan pemeriksaan angka kuman udara pada sampel udara dengan benar



A. PENDAHULUAN Kelompok mikroorganisme yang paling banyak tersebar di udara bebas adalah bakteri, jamur (termasuk di dalamnya ragi) dan juga mikroalga. Belum ada mikroorganisme yang habitat aslinya di udara. Mereka terdapat dalam jumlah yang relatif kecil bila dibandingkan dengan di air atau di tanah. Mikroorganisme udara dapat dipelajari dalam dua bagian, yaitu mikroorganisme udara di luar ruangan dan mikroorganisme udara di dalam ruangan. Mikroorganisme paling banyak ditemukan di dalam ruangan (Waluyo, 2009). Menurut Pelczar (2008), beberapa faktor yang menentukan jumlah dan jenis mikroorganisme yang mendiami udara adalah: a. Sumber mikroorganisme (tanah, laut, bersin dan lain-lain) b. Ketahanan jenis mikroorganisme tersebut terhadap kondisi fisik seperti suhu, kelembaban dan cahaya matahari c. Jumlah dan aktivitasnya.d.Lingkungan luar (kondisi cuaca dan ketinggian tempat) Suhu di dalam ruangan dalam rentang 18 0-24 0 C adalah suhu optimal bagi pertumbuhan kebanyakan jamur, meskipun beberapa jenis jamur dapat hidup juga di rentang suhu yang luas. Sedikit jamur yang mempunyai temperatur optimal diatas 300C yaitu Aspergillus sp. Jamur di dalam lingkungan tidak tumbuh jika suhu di atas 300C. Spora jamur lebih tahan panas daripada miselia dan pada umumnya bertahan lebih lama pada suhu yang lebih luas rentangnya. (Gutarowska & Piotrowska,2007).



87



Pengambilan Sampel Kuman Udara Sampling mikrobiologis udara dapat diperoleh dengan menggunakan metode setting plates (perletakkan lempeng agar) dam metode mekanik volumetric air sampling. 1. Metode setting plates Prinsip metode ini pada peletakkan lempeng agar dalam petri diameter 100 mm yang terbuka akan menampung pengendapan partikel mikroba udara sekitar 1 m3 selama terpapar 15 menit, menggunakan media sampling standar Brain Heart Infusion Agar atau Trypticase Soy Agar. Atau bisa juga menggunakan media agar yang lainnya seperti Plate Count Agar. Metode ini mudah dan tidak mahal tapi hasilnya tidak betul –betul kuantitatif.



2. Metode volumetric air sampling Merupakan metode kuantitatif yang lebih tepat, karena partikel udara yang lebih kecil (3mm) dengan kondisi kelembaban udara akan tetap tersuspensi di udara, tidak turun mengendap di permukaan suatu lempeng agar tetapi dengan metode high-velocity-volumetric air sampling , partikel kecil di udara dapat ditarik dengan kecepatan tinggi ke dalam saluran alat menggunakan suatu pompa (vacuum pump). Selain itu keuntungan pada partikel ukuran besar yang umumnya diudara rumah sakit, rerata 10-15 mm, dapat ditarik masuk ke dalam media cair (collection fluid) dan terjadi gelembung-gelembung udara yang dapat memecahkan partikel besar sehingga semua kandungan sel-sel mikroba yang hidup akan terpencar dan merata



menimpa, menempel pada



permukaan



lempeng



agar yang



mengandung nutrisi (Brain Heart Infusion Agar atau Trypticase Soy Agar atau Mueller Hinton Agar dan Saboroud Glucose Agar), sehingga merefleksi jumlah total mikroba didalam udara per satuan m 3 . Kecepatan aliran udara harus dikalibrasi dengan tepat untuk menjamin hasil yang akurat (KEMENKES, 2002). Mengacu



pada



Keputusan



Menteri



Kesehatan



RI



Nomor:



1335/Menkes/SK/X/2002 Tanggal: 29 Oktober 2002 TENTANG STANDAR OPERASIONAL PENGAMBILAN DAN PENGUKURAN SAMPEL KUALITAS UDARA RUANGAN DI RUMAH SAKIT. Berikut ini adalah cara pengambilan sampel gas / udara ruangan di Rumah Sakit untuk pemeriksaan mikrobiologi: 1. Lokasi pengambilan sampel



88



a. Ruang operasi b. Ruang perawatan c.



Ruang isolasi



d. Ruang cuci e. Dapur



2. Titik pengambilan sampel Jumlah titik Sampel minimal sebesar 10% dari jumlah masing-masing ruangan. 3. Waktu pengambilan sampel Ruang operasi dilakukan menjelang operasi (ruangan siap digunakan ). Ruang perawatan dan isolasi dilakukan setelah dilakukan pembersihan ruangan



B. PROSEDUR KERJA 1. METODE SETTING PLATES a. ALAT DAN BAHAN 1) Media agar cawan steril (BHI/TSA/PCA) ukuran diameter 10 cm 2) Kapas 3) Alkohol 4) Bunsen 5) Label 6) Alat tulis 7) Termos es



b. CARA KERJA 1) Aseptiskan tangan praktikan. 2) Tentukan titik sampling untuk pengambilan sampel (di tengahtengah atau di pojok ruangan) 3) Ambil petri dish yang berisi media agar cawan, tempatkan pada masing-masing titik pengambilan sampel. 4) Buka tutup petri dish, petri dish terbuka menghadap ke atas, dan biarkan kontak dengan udara selama 15 menit. 5) Kemudian tutup petri dish dan aseptiskan tutupan dengan dilalukan pada api Bunsen.



89



6) Beri label untuk keterangan sampel. 7) Masukkan ke dalam termos es dan kirim ke laboratorium. 8) Di laboratorium: masukkan cawan petri yang telah berisi specimen dari udara ke dalam incubator pada suhu 35-370C selama 24 jam. 9) Amati pertumbuhan koloni bakteri pada agar cawan. 10) Hitung jumlah koloni bakteri menggunakan colony counter. 11) Analisis: Jumlah kuman udara/m3 = jumlah koloni bakteri pada petri dish volume ruangan (m3)



Catatan: Jumlah kuman dapat dinyatakan dalam ......./ft³; pemaparan Petridish selama 15 menit menunjukkan jumlah partikel mengendap pada 1 ft3 (= Kecepatan Pengendapan). Volume sampel udara menentukan jumlah total bakteri dalam suatu volume tertentu (kepadatan



bakteri);



Kecepatan



mengendap



tinggi



(>1)



menunjukkan bakteri Dust Borne; Kecepatan mengendap rendah (