Proteomik Metabolomik [PDF]

Citation preview

PROTEOMIK & METABOLOMIK



PROTEOMIK studi skala besar ttg protein, khususnya struktur dan fungsi Protein.



adalah bagian penting dari organisme hidup  adalah komponen utama dari jalur metabolisme fisiologis sel.



Istilah "proteomik" pertama kali diciptakan pada tahun 1997 untuk membuat analogi dengan genomik, penelitian gen. Kata "proteome" adalah campuran dari "protein" dan "genom", dan diciptakan pada dasarnya oleh Marc Wilkins pada tahun 1994 ketika bekerja sebagai mahasiswa PhD



Proteome adalah komplemen seluruh protein, Sekarang diketahui bahwa mRNA tidak selalu diterjemahkan menjadi protein, dan jumlah protein yang dihasilkan untuk suatu jumlah tertentu tergantung pada mRNA gen itu ditranskripsi dari dan pada keadaan fisiologis sel saat ini. Proteomika menegaskan kehadiran protein dan menyediakan ukuran langsung dari jumlah ini. Sebuah mRNA diproduksi dalam jumlah yang berlimpah mungkin akan menurun cepat atau diterjemahkan secara tidak efisien, sehingga dihasilkan sejumlah kecil protein. Banyak protein mengalami post-translasi modifikasi yang sangat mempengaruhi kegiatan mereka, misalnya beberapa protein yang tidak aktif sampai mereka menjadi terfosforilasi.



Metode proteomik 1. Phosphoproteomics 2. Glycoproteomics digunakan untuk studi modifikasi pasca-translasi. Modifikasi pasca-translasi Tidak hanya menyebabkan perbedaan terjemahan dari mRNA, protein banyak juga mengalami berbagai modifikasi kimia setelah translasi. Banyak modifikasi pasca-translasi yang penting untuk fungsi protein.



Fosforilasi Fosforilasi: terjadi pada banyak enzim dan protein secara struktural dalam proses sinyal sel. Penambahan fosfat untuk asam amino tertentu yang paling sering adalah pada serin dan treonin dimediasi oleh serin / treonin kinase, Tidak jarang protein yang dimediasi oleh tirosin kinase menyebabkan menjadi target untuk mengikat atau berinteraksi dengan protein lain yang mengenali domain terfosforilasi.



Karena fosforilasi protein adalah salah satu yang paling banyak dipelajari dlm modifikasi protein "proteomika" , maka upaya diarahkan untuk menentukan set protein terfosforilasi dalam tipe sel atau jaringan tertentu dalam keadaan tertentu.



3. Ubiquitination Ubiquitin adalah protein kecil yang dapat ditempelkan pada substrat protein tertentu dengan enzim yang disebut ligases ubiquitin E3. Menentukan protein poli-ubiquitinated dapat membantu dalam memahami bagaimana jalur protein diatur.



Selain fosforilasi dan ubiquitination, protein dapat berperan dalam proses (antara lain), asetilasi metilasi, oksidasi glikosilasi, dan nitrosylation. Beberapa protein menjalani SEMUA modifikasi ini, sering tergantung waktu dalam kombinasi, yg tepat menggambarkan kompleksitas yang potensial ketika mempelajari struktur dan fungsi protein. Protein berbeda yang dibuat di bawah pengaturan yang berbeda



Proteomics Uses 1. identifikasi potensi obat baru dalam pengobatan



One of the most promising developments to come from the study of human genes and proteins has been the identification of potential new drugs for the treatment of disease. This relies on genome and proteome information to identify proteins associated with a disease, which computer software can then use as targets for new drugs. For example, if a certain protein is implicated in a disease, its 3D structure provides the information to design drugs to interfere with the action of the protein. A molecule that fits the active site of an enzyme, but cannot be released by the enzyme, will inactivate the enzyme.



This is the basis of new drug-discovery tools, which aim to find new drugs to inactivate proteins involved in disease. As genetic differences among individuals are found, researchers expect to use these techniques to develop personalized drugs that are more effective for the individual. A computer technique which attempts(berusaha) to fit (cocok)millions of small molecules to the threedimensional structure of a protein is called "virtual ligand screening". The computer rates the quality of the fit to various sites in the protein, with the goal of either enhancing(peningkatan) or disabling(tidakmampuan) the function of the protein, depending on its function in the cell.



A good example of this is the identification of new drugs to target and inactivate the HIV-1 protease. The HIV-1 protease is an enzyme that cleaves a very large HIV protein into smaller, functional proteins. The virus cannot survive without this enzyme; therefore, it is one of the most effective protein targets for killing HIV.



2. Biomarkers



Understanding the proteome, the structure and function of each protein and the complexities of protein-protein interactions will be critical for developing the most effective diagnostic techniques and disease treatments in the future. An interesting use of proteomics is using specific protein biomarkers to diagnose disease. A number of techniques allow to test for proteins produced during a particular disease, which helps to diagnose the disease quickly. Techniques include western blot, immunohistochemical staining, enzyme linked immunosorbent assay (ELISA) or mass spectrometry. The following are some of the diseases that have characteristic biomarkers that physicians can use for diagnosis.



3. Alzheimer's disease In Alzheimer’s disease, elevations in beta secretase create amyloid/beta-protein, which causes plaque to build up in the patient's brain, which is thought to play a role in dementia. Targeting this enzyme decreases the amyloid/beta-protein and so slows the progression of the disease. A procedure to test for the increase in amyloid/beta-protein is immunohistochemical staining, in which antibodies bind to specific antigens or biological tissue of amyloid/beta-protein. 4. Heart disease Heart disease is commonly assessed using several key protein based biomarkers. Standard protein biomarkers for cardiovascular diseases include interleukin-6, interleukin-8, serum amyloid A protein, fibrinogen, and troponins. Cardiac troponin I (cTnI) increases in concentration within 3 to 12 hours of initial cardiac injury and remains elevated days after an acute myocardial infarction. A number of commercial antibody based assays as well as other methods are used in hospitals as primary tests for acute heart infarctions



Analisisis Metabolomik Analisis semua proses metabolisme jaringan maupun sel yang berfungsi menghasilkan senyawa metabolit untuk setiap spesies, meliputi analisis kimia menggunakan Mass Spektrofotometer, pengembangan struktur kimia, serta bioinformatik untuk mengetahui struktur kimia serta membangun sistem data sehingga dapat menjelaskan sistem biologi bahan alam. Analisis Metabolomik : Analisa kualitatif (Identifikasi)



Metabolomik menggunakan instrumen analisis canggih untuk secara akurat mengukur, secara massal, dengan biokimia (metabolit) yang membentuk suatu organisme. Metabolisme - jaringan kompleks reaksi kimia yang mengubah metabolit ke produk akhir - menentukan cetak biru genetik organisme (genom).



Metode analisis metabolomik Perumpamaan : Metabolomik bagaikan proses memotret keberadaan berbagai objek dalam suatu target sehingga berbagai senyawa yang ada disitu dari yang pendek-tinggi, gemuk-kurus, harus terekam secara Accurate (teliti) dan Precise (tepat). Maka harus di pilih metode instrumentasi yang sesuai kriteria sensitivitas dan selektivitas dan dapat mengakomodasi dan deteksi berbagai senyawa dengan ranger BM rendah ke tinggi sesuai dengan tujuan analisis.



Analisis metabolomik A.metabolomik harus dipastikan senyawa kimia yang ada di dalam tanaman, organ, herba, bahkan jaringan objek analisis. Maka BM (Berat Molekul) harus bisa diungkap oleh metode terpilih itu. Pengetahuan tentang berat molekul tidak cukup karena beberapa senyawa memiliki BM yang sama, maka analisis yang kita pilih selain dapat menggambarkan BM juga harus dapat memberikan gambaran strukturnya.



Metode analisis metabolomik 1. M.sidik jari 2.Penanda kimia



Instrument : 1. analisis menggunakan Mass spectroscopy paling sesuai untuk tujuan ini karena deteksi ini akan memberikan pola fragmentasi, sehingga dapat mengkonstruksi suatu molekul berdasarkan fragmen yang terdeteksi. 2. analisis lain yang reliable adalah NMR (Nuclear Magnetic Resonance) karena senyawa apapun akan memiliki geseran kimia (Chemical Shift) yang khas tidak memiliki oleh senyawa lain, seperti sidik jari pada manusia. 3. Untuk analisis metabolomik yang paling memenuhi syarat ketentuan maka metode tandem/hyphenated method yang memenuhi ketentuan seperti GC-MS, LC-MS, dan NMR.



Salah satu tantangan dari sistem biologi dan genomik fungsional adalah untuk mengintegrasikan proteomik, transcriptomic, dan informasi metabolomic untuk memberikan gambaran yang lebih lengkap dari organisme hidup



Dewasa ini metabolomik dikembangkan ke arah analisis kuantitatif metabolit sekunder total yang berperan dalam aktivitas biologis-farmakologis tertentu dalam suatu sampel obat herbal yang disebut metabonomics



Keuntungan analisa metabolomik 1. Tidak membutuhkan preparasi yang rumit, 2. Sampel yang dibutuhkan sangat kecil, kurang dari 0,1 gram atau bahkan cukup 1 mg 3. Hasil lebih objektif karena menghindari berbagai partisi berkali-kali dan 4. secepat mungkin sampel dianalisis sehingga sangat menguntungkan.



Kendala analisa kuantitatif metabolomik 1.



Pentingnya database yang akurat



2. Penentuan metode penyarian yang efisien dan menarik semua senyawa dan terkait dengan aktivitas farmakologi. 3.



Pemisahan metabolit yang terkandung dalam sampel.



4.



Metode deteksi terpilih yang tepat.



5.



Identifikasi dan kuantifikasi analit yang tepat.



6. Analisis statistic yang sesuai untuk menggambarkan komponenkomponen dalam ekstrak yang berperan.



Contoh penelitian berbasis metabolomik



flatfish



Aplikasi metabolomik untuk mengidentifikasi komponen bioaktif: komponen antibakteri dari ekstrak buah takokak (Solanum torvum Swart Maser, Wahyu Haryati



URI: http://repository.ipb.ac.id/handle/123456789/68038 Date: 2014



Buah takokak (Solanum torvum Swartz.) digunakan sebagai tanaman model. Buah takokak dikeringkan dan tepungkan, kemudian difraksinasi bertingkat menggunakan kombinasi pelarut yang memiliki polaritas yang berbeda-beda. Fraksi yang dihasilkan dianalisa profil metabolitnya secara komprehensive dengan kromatografi cair pada berbagai panjang gelombang. Bioaktivitas yang diukur adalah aktivitas antibakteri terhadap Bacillus cereus dengan metoda difusi sumur. Kedua kelompok data ini kemudian dianalisa secara statistik menggunakan Orthogonal Projection to Latent Sructure (OPLS). Dengan metoda OPLS, waktu retensi pada panjang gelombang tertentu yang berkorelasi positif secara signifikan dengan bioaktivitas dapat diidentifikasi. Puncak kromatogram pada waktu retensi pada panjang gelombang tersebut kemudian dipekatkan dengan teknik kromatografi preparative dan selanjutnya dianalisis dengan LC-MS..



lanjutan Dari data built-in library yang ada pada LC-MS dapat diperkirakan jenis senyawa aktif yang terkandung dalam fraksi tersebut. Fraksi buah takokak menunjukkan aktivitas antibakteri yang cendeung rendah. Aktivtas tertinggi didapat pada fraksi 100% metanol. Hasil pengukuran MIC menunjukkan bahwa pada konsentrasi 10 mg/ml dan 15 mg/ml ekstrak takokak mampu menghambat pertumbuhan bakteri sebesar 89.8% dan 94.0% berturut-turut



Dari hasil uji TLC (Kloroform/metanol: 7:3, UV 245 dan 366 nm, pewarnaan vanilin), diperkirakan fraksi tersebut mengandung flavonoid, alkaloid dan saponin. Analisis profil metabolit dilakukan dengan menggunakan HPLC dengan kolom Symmetri C-18.5 ?m, 150x4.6 mm (Waters), fasa gerak air (pH 3) dan asetonitril dengan sistem gradien dimulai dari 2% air (pH 3) hingga 100% asetonitril selama 12 menit. Analisis dilakukan setiap interval 10 pada panjang gelombang 210 ? 400 nm sehingga total dihasilkan 540 kromatogram. Pada data dari kromatogram dilakukan binning setiap interval waktu retensi 0.04 menit dan untuk setiap puncak dilakukan kuantifikasi secara relatif terhadap total respon. Data kemudian dikonversi kedalam bentuk excel sehingga dapat dijadikan data untuk analisis OPLS.



lanjutan Tahap pengolahan data mentah ini sebenarnya dapat dilakukan secara otomatis menggunakan software seperti AMIX atau OPUS dari Bruker yang sayangnya tidak tersedia di lab tempat melakukan penelitian sehingga dilakukan secara manual. Dengan waktu penelitian yang relatif singkat, target penelitian tidak sepenuhnya tercapai. Matriks data kedua (profil metabolit) belum siap untuk diolah lebih lanjut dengan OPLS sehingga belum dapat diketahui waktu retensi yang berkorelasi signifikan dengan aktifitas antibakteri buah takokak. Tahap terakhir yang direncanakan yaitu pemekatan peak terpilih hasil analisis OPLS dan analisisnya dengan LC-MS juga belum sempat dilaksanakan sehingga belum dapat diketahui jenis senyawa antibakteri yang terdapat dalam ekstrak buah takokak.



Next: Pelajari Produksi human therapeitics