Fluorescent in Situ Hibridisasi1 [PDF]

Citation preview

Fluorescent in situ hibridisasi Oleh: Dedy Kurniawan



Sebuah sel metafase positif bagi BCR / ABL penataan ulang (berhubungan dengan myelogenous leukemia kronis) dengan menggunakan IKAN. Kromosom dapat dilihat dengan warna biru. Kromosom yang dilabeli dengan bintik-bintik hijau dan merah (kiri atas) adalah salah satu tempat penataan ulang hadir. FISH (fluorescence in situ hibridisasi) adalah sebuah cytogenetic teknik yang digunakan untuk mendeteksi dan melokalisasi keberadaan atau ketiadaan spesifik DNA sekuens pada kromosom. IKAN menggunakan lampu fluorescent probe yang mengikat hanya bagian-bagian kromosom yang mereka menunjukkan tingkat tinggi urutan kesamaan. Fluorescence microscope dapat digunakan untuk mencari tahu di mana neon probe terikat pada kromosom. IKAN sering digunakan untuk menemukan fitur-fitur tertentu pada DNA untuk digunakan dalam konseling genetik, obat-obatan, dan identifikasi spesies. IKAN juga dapat digunakan untuk mendeteksi dan melokalisir spesifik mRNA dalam sampel jaringan. Dalam konteks ini, dapat membantu menentukan spasial-temporal pola ekspresi gen dalam sel dan jaringan.



Isi 







1 Probe o Hibridisasi 1,1 Persiapan dan Proses o



Fiber 1,2 IKAN



o



Variasi 1,3 probe dan analisis



o



1,4 Q-IKAN



o



1,5 Flow-IKAN



Kedokteran 2 aplikasi o



Spesies 2,1 identifikasi



o



2,2 Lab-on-a-chip dan IKAN



o



Virtual 2,3 kariotipe







3 Lihat pula







4 Galeri







5 Referensi







6 Pranala luar



Probe Sel Urothelial ditandai dengan empat probe yang berbeda. Probe sering berasal dari fragmen-fragmen DNA yang terisolasi, disucikan, dan diperkuat untuk digunakan dalam Proyek Genom Manusia. Ukuran genom manusia begitu besar, dibandingkan dengan panjang yang dapat diurutkan secara langsung, karena itu perlu untuk membagi genom menjadi fragmen-fragmen. (Dalam analisis akhir, adalah fragmen-fragmen ini dimasukkan ke dalam order by mencerna salinan dari setiap fragmen ke fragmen yang lebih kecil masih menggunakan urutan endonuklease khusus, mengukur ukuran masing-masing fragmen kecil dengan menggunakan kromatografi ukuran-pengecualian, dan menggunakan informasi tersebut untuk menentukan di mana fragmen besar tumpang tindih satu sama lain.) Untuk melestarikan fragmen dengan sekuens DNA individu mereka, fragmen ditambahkan ke dalam sistem populasi bakteri mereplikasi terus-menerus. Populasi klon bakteri, masing-masing populasi mempertahankan satu kromosom buatan, disimpan di berbagai laboratorium di seluruh dunia. Kromosom buatan (BAC) dapat tumbuh, diekstrak, dan diberi label, dalam laboratorium. Fragmen ini berada di urutan 100 ribu basis-pasangan, dan merupakan dasar bagi sebagian besar IKAN probe.



Persiapan dan Hibridisasi Proses



Skema prinsip Percobaan IKAN pelokalan sebuah gen dalam inti. Pertama, probe dibangun. Penyelidikan harus cukup besar untuk berhibridisasi khusus dengan target tetapi tidak terlalu besar untuk menghambat proses hibridisasi. Penyidikan ini ditandai langsung dengan fluorophores, dengan target untuk antibodi atau dengan biotin. Penandaan dapat dilakukan dengan berbagai cara, seperti nick terjemahan, atau PCR menggunakan tagged nukleotida. Kemudian, sebuah interfase atau metafase kromosom persiapan dihasilkan. Kromosom yang melekat erat pada substrat, biasanya kaca. DNA sekuens berulang harus diblokir dengan menambahkan potongan-potongan pendek DNA sampel. Penyidikan ini kemudian diterapkan pada kromosom DNA dan diinkubasi selama sekitar 12 jam sementara hybridizing. Beberapa langkah-langkah mencuci menghapus semua atau sebagian-unhybridized probe hibridisasi. Hasil kemudian divisualisasikan dan dihitung menggunakan mikroskop yang mampu menarik cairan dan merekam gambar.



Jika neon sinyal lemah, amplifikasi sinyal mungkin diperlukan dalam rangka untuk melampaui ambang deteksi mikroskop. Fluorescent kekuatan sinyal tergantung pada banyak faktor seperti label probe efisiensi, jenis probe, dan jenis pewarna. Fluorescently-tagged antibodi atau streptavidin terikat ke molekul pewarna. Komponen sekunder ini dipilih sehingga mereka memiliki sinyal yang kuat. IKAN eksperimen yang dirancang untuk mendeteksi atau pelokalan ekspresi gen dalam sel dan jaringan bergantung pada penggunaan gen reporter, seperti satu mengungkapkan green fluorescent protein, untuk memberikan sinyal fluoresensi.



Fiber IKAN Dalam teknik alternatif untuk interfase atau metafase persiapan, serat IKAN, interfase kromosom melekat pada suatu slide dalam sedemikian rupa sehingga mereka berbaring dalam garis lurus, bukannya melingkar erat, seperti dalam IKAN konvensional, atau mengadopsi konformasi acak , seperti dalam interfase IKAN. Hal ini dicapai dengan menerapkan mekanik geser sepanjang slide, baik untuk sel-sel yang telah diperbaiki ke slide dan kemudian lysed, atau larutan DNA dimurnikan. Suatu teknik yang dikenal sebagai menyisir kromosom semakin digunakan untuk tujuan ini. Konformasi perluasan kromosom resolusi yang lebih tinggi memungkinkan secara dramatis - bahkan sampai ke beberapa kilobases. Persiapan serat IKAN sampel, meskipun secara konseptual sederhana, adalah seni yang cukup terampil, dan hanya khusus menggunakan teknik laboratorium secara rutin.



[Sunting] Variasi probe dan analisis



Sel interfase positif untuk sebuah kromosom t (9; 22) penataan ulang. IKAN adalah teknik yang sangat umum. Perbedaan antara berbagai teknik IKAN biasanya disebabkan oleh variasi dalam urutan dan pelabelan dari probe, dan bagaimana mereka digunakan dalam kombinasi. Beberapa modifikasi ini memungkinkan semua teknik IKAN. Ukuran probe penting karena probe lagi berhibridisasi lebih spesifik daripada probe pendek. Tumpang tindih mendefinisikan resolusi fitur dideteksi. Misalnya, jika tujuan percobaan adalah untuk mendeteksi breakpoint dari translokasi, maka tumpang tindih dari probe - sejauh mana suatu urutan DNA terdapat dalam yang berdekatan probe - mendefinisikan jendela minimum di mana breakpoint dapat dideteksi . Penyelidikan campuran menentukan urutan jenis fitur probe dapat mendeteksi. Probe bahwa berhibridisasi sepanjang seluruh kromosom digunakan untuk menghitung jumlah kromosom tertentu, menunjukkan translokasi, atau ekstra-kromosom mengidentifikasi fragmen kromatin. Hal ini sering disebut "seluruh-kromosom lukisan." Jika setiap kemungkinan probe yang digunakan, setiap kromosom, (seluruh genom) akan ditandai fluorescently, yang tidak akan sangat berguna untuk menentukan urutan masing-masing fitur. Namun, campuran probe yang lebih kecil dapat dibuat yang khusus untuk wilayah tertentu (lokus) DNA; campuran ini



digunakan untuk mendeteksi mutasi penghapusan. Ketika dikombinasikan dengan warna tertentu, suatu lokus campuran probe khusus digunakan untuk mendeteksi translokasi sangat spesifik. Lokus khusus campuran probe spesifik sering digunakan untuk menghitung kromosom, dengan cara mengikat ke centromeric daerah kromosom, yang cukup unik untuk mengidentifikasi setiap kromosom (dengan pengecualian Kromosom 13, 14 21, 22.) Berbagai teknik lain menggunakan campuran dari probe berwarna berbeda. Berbagai warna dalam campuran dari pewarna fluorescent dapat dideteksi, sehingga setiap kromosom manusia dapat diidentifikasi dengan karakteristik warna seluruh-kromosom menggunakan probe campuran dan rasio berbagai warna. Meskipun ada lebih kromosom mudah-dibedakan dari celupan berpendar warna, rasio campuran penyelidikan dapat digunakan untuk menciptakan warna sekunder. Serupa dengan genomik komparatif hibridisasi, pesawat untuk campuran warna sekunder dibuat dengan mencampur rasio yang benar dari dua set berwarna berbeda probe untuk kromosom yang sama. Teknik ini kadang-kadang disebut M-IKAN. Fisika yang sama yang membuat berbagai warna mungkin untuk M-IKAN dapat digunakan untuk mendeteksi translokasi. Yaitu, warna yang berdekatan tampak tumpang tindih; warna sekunder diamati. Beberapa tes yang dirancang sedemikian rupa sehingga warna sekunder akan hadir atau tidak ada dalam kasus-kasus yang menarik. Contoh adalah deteksi BCR / ABL translokasi, di mana warna sekunder menunjukkan penyakit. Variasi ini sering disebut double-fusion IKAN atau D-IKAN. Dalam situasi yang berlawanan --- di mana tidak adanya warna sekunder patologis --diilustrasikan oleh assay digunakan untuk menyelidiki translokasi di mana hanya satu dari breakpoints diketahui atau konstan. Locus-probe khusus dibuat untuk satu sisi breakpoint dan yang lainnya kromosom utuh. Dalam sel-sel normal, warna sekunder diamati, tetapi hanya warna primer adalah translokasi diamati bila terjadi. Teknik ini kadang-kadang disebut "breakselain IKAN".



Q-IKAN Q-IKAN IKAN mengkombinasikan dengan PNAS dan perangkat lunak komputer untuk mengukur intensitas fluoresensi. Teknik ini digunakan secara rutin dalam telomer penelitian panjang.



Aliran-IKAN Flow-IKAN menggunakan flow cytometry untuk melakukan IKAN secara otomatis menggunakan per-sel fluoresensi pengukuran.



Medical aplikasi Seringkali orangtua anak-anak dengan keterlambatan perkembangan ingin tahu lebih banyak tentang kondisi anak mereka sebelum memilih untuk memiliki anak lagi. Keprihatinan ini dapat diatasi dengan analisis dari orang tua dan anak DNA. Dalam kasus-kasus di mana perkembangan anak penundaan itu tidak dipahami, penyebab dapat ditentukan dengan menggunakan IKAN dan cytogenetic teknik. Contoh penyakit yang didiagnosis dengan menggunakan IKAN termasuk Prader-Willi syndrome, sindrom Angelman, Sindrom delesi



22q13, myelogenous leukemia kronis, akut Velocardiofacial sindrom, dan sindrom Down.



lymphoblastic



leukemia,



Cri-du-chat,



Dalam kedokteran, IKAN dapat digunakan untuk membentuk sebuah diagnosis, untuk mengevaluasi prognosis, atau untuk mengevaluasi pengampunan dari penyakit, seperti kanker. Perawatan dapat disesuaikan secara khusus. Ujian tradisional yang melibatkan analisis kromosom metafase sering tidak dapat mengenali fitur-fitur yang membedakan satu penyakit dari yang lain, karena kromosom halus fitur; IKAN dapat menjelaskan perbedaan-perbedaan ini. IKAN juga dapat digunakan untuk mendeteksi sel-sel yang sakit lebih mudah daripada standar Cytogenetic metode, yang membutuhkan sel-sel membagi dan membutuhkan tenaga kerja dan waktu persiapan manual intensif dan analisis slide oleh teknolog. IKAN, di sisi lain, tidak memerlukan sel-sel hidup dan dapat diukur secara otomatis, komputer akan menghitung jumlah titik-titik lampu neon sekarang. Namun, teknologi yang terlatih diperlukan untuk membedakan perbedaan-perbedaan yang halus dalam pola banding membungkuk dan memutar kromosom metafase.



[Sunting] Spesies identifikasi IKAN sering digunakan dalam studi klinis. Jika seorang pasien yang diduga terinfeksi dengan patogen, bakteri, dari pasien jaringan atau cairan, biasanya tumbuh di agar untuk menentukan identitas patogen. Banyak bakteri, namun, bahkan terkenal spesies, tidak tumbuh baik di bawah kondisi laboratorium. IKAN dapat digunakan untuk mendeteksi secara langsung keberadaan tersangka sampel kecil jaringan pasien. IKAN juga dapat digunakan untuk membandingkan dua biologis genom spesies, untuk menyimpulkan evolusi hubungan. Teknik hibridisasi serupa disebut noda kebun binatang. IKAN bakteri probe sering primer untuk rRNA 16s daerah. IKAN secara luas digunakan dalam bidang ekologi mikroba, untuk mengidentifikasi mikroorganisme. Biofilm, misalnya, terdiri dari kompleks (sering) multi-spesies bakteri organisasi. Menyiapkan DNA probe untuk satu spesies dan melakukan IKAN dengan probe ini memungkinkan seseorang untuk memvisualisasikan distribusi spesies spesifik ini dalam biofilm. Mempersiapkan probe (dalam dua warna yang berbeda) selama dua spesies memungkinkan untuk memvisualisasikan / belajar bersama-lokalisasi kedua spesies dalam biofilm, dan dapat berguna dalam menentukan arsitektur halus biofilm.



Lab-on-a-chip dan IKAN



Microfluidic chip yang mengotomatisasi prosedur IKAN interfase. The microchip ditampilkan hanya memerlukan waktu beberapa menit dari setup oleh teknisi, sebagai lawan dari jam atau hari kerja yang diperlukan untuk melakukan IKAN dengan peralatan konvensional. Meskipun interfase fluorescence in situ hibridisasi (IKAN) adalah alat diagnostik yang sensitif digunakan untuk mendeteksi kelainan kromosom pada sel-sel dengan dasar, biaya-per-test dan



kompleksitas teknis protokol IKAN saat ini telah menghambat penggunaan yang luas. Lab-on-achip atau perangkat microfluidic, menggabungkan jaringan microchannels yang dapat miniaturize, mengintegrasikan dan mengotomatisasi teknik analisis konvensional ke chip-style platform. Sejak microchannels izin tingkat canggih kontrol fluida (turun ke picolitres), perangkat ini dapat mengurangi waktu analisis, reagen rendah konsumsi, dan meminimalkan campur tangan manusia. Saat ini, IKAN telah dilakukan pada platform yang microfluidic kaca membakukan banyak protokol berulang menawarkan hasil yang akurat, biaya efektif dan lebih mudah diperoleh dalam pengaturan klinis. Dibandingkan dengan metode IKAN konvensional, implementasi pertama ini on-chip IKAN menyediakan 10 kali lipat lebih tinggi throughput dan 10 kali lipat pengurangan biaya pengujian, yang memungkinkan penilaian secara simultan dari beberapa kelainan kromosom atau pasien. [1] Hal ini semakin penting bahwa tes diagnostik menentukan jenis dan tingkat kelainan kromosom untuk lebih banyak informasi diagnosis dan pilihan yang tepat strategi pengobatan. Sejak onchip teknik IKAN sekitar 10-20 kali lebih hemat biaya daripada metode konvensional, dan dapat sepenuhnya terintegrasi dan otomatis [2], teknologi ini akan membuat pengujian genetik luas pasien lebih mudah dalam pengaturan klinis.



Virtual kariotipe Virtual karyotyping biaya lain yang efektif, klinis tersedia alternatif untuk menggunakan panel IKAN ribuan sampai jutaan probe pada satu array untuk mendeteksi perubahan nomor menyalin, genom-lebar, di resolusi belum pernah terjadi sebelumnya.



Lihat pula  



In situ hibridisasi Molecular Sitogenetika







Virtual kariotipe







Happy pemetaan



Galeri



Microfluidic chip yang menurunkan biaya-per-tes IKAN sebesar 90%. Lain skematis dari proses IKAN.



Dual label IKAN; Bifidobacteria Cy3 & Total bakteri FITC.



Referensi 1.



^ Sieben, VJ; CS Debes marun, AM Pilarski, GV Kaigala, LM Pilarski, CJ Backhouse (200706). "IKAN dan keripik: analisis kromosom microfluidic platform". Iet Nanobiotechnology 1 (3): 27-35. Doi : 10.1049/iet-nbt: 20.060.021. http://link.aip.org/link/?NBT/1/27/1. Diperoleh 2009/01/26. 2. ^ Sieben, VJ; Debes CS-marun, LM Pilarski, CJ Backhouse (2008-11). "Microfluidic terpadu kromosom chip untuk enumerasi dengan menggunakan fluorescence in situ hibridisasi". Lab on a Chip 8 (12): 2151-2156. Doi : 10.1039/b812443d. http://www.rsc.org/publishing/journals/LC/article.asp?doi=b812443d. Diperoleh 2009/03/24. 



Annelie Pernthaler, Jakob Pernthaler, Rudolf Amann (2002): Fluorescence In Situ Hibridisasi dan dikatalisis Reporter Endapan untuk Kelautan Identifikasi Bakteri, Mikrobiologi Terapan dan Lingkungan, hal 3.094-3.101 Vol. 68, No 6 DOI: 10.1128/AEM.68.6.3094-3101.2002







Michael Wagner, Matthias Horn dan Holger Daims (2003): Fluorescence in situ hibridisasi untuk identifikasi dan karakterisasi dari prokariota. Current Opini di Mikrobiologi 2003, 6:302-309 DOI: 10.1016/S1369-5274 (03) 00054-7