Instrumen [PDF]

Citation preview

KROMATOGRAFI KERTAS KROMATOGRAFI LAPIS TIPIS



A.RAHMAT SALEH NUR MISRA NANI



PROGRAM STUDI DIPLOMA IV JURUSAN TEKNOLOGI LABORATORIUM MEDIS POLITEKNIK KESEHATAN KEMENKES MAKASSAR 2019



A. PENGERTIAN KROMATOGRAFI Kromatografi berasal dari bahasa Yunani yaitu chromos yang berarti warna dan graphos yang berarti menulis, Kromatografi adalah suatu teknik atau metode pemisahan kimia yang didasarkan pada adanya perbedaan partisi zat pada fasa diam (stationary) dan fasa gerak (mobile) atau dengan kata lain pemisahan molekul berdasarkan perbedaan pola pergerakan antara fase diam dan fase gerak untuk memisahkan komponen (molekul) pada larutan. Kromatografi dikembangkan pertama kali oleh Michael Tsweet yang merupaka seorang ahli botani Rusia pada tahun 1903. Michael Tsweet memisahkan pigmen berwarna dalam tanaman( klorofil) dari pigmen-pigmen lain dalam tanaman dengan cara perkolasi ekstrak petroleum eter dalam gelas yang berisi kalsium karbonat (CaCo3). Saat ini teknik kromatografi sudah banyak dikembangkan dan merupakan teknik yang paling umum dan sering digunakan dalam proses analisa baik secara kualitatif maupun kuantitatif. Dalam Kromatografi , dikenal beberapa istilah, antara lain: 1. Analit. Analit adalah sat yang akan dipisahkan 2. Kromatogram Kromatogram adalah hasil/output visual yang diperoleh dari hasil pemisahan.adanya puncak karakteristik yang berbeda menunjukkan adanya senyawa yang berbeda 3. Eluen Eluen adalah pelarut yang digunakan untuk memisahkan analit 4. Fasa gerak Fasa gerak merupakan fasa zat yang bergerak pada arah tertentu 5. Fasa diam Fasa diam adalah fasa yang tetap pada tempatnya 6. Waktu retensi Waktu retensi adalah waktu yang diperlukan analit untuk melewatisistem 7. Volume retensi Volume retensi adalah volume fasa gerak yang dibutuhkan untukmmengelusimkomponen analit. 8. Adsorbsi Menyerapan pada permukaan 9. Partisi Penyebaran atau kemampuan suatu zat dalam larutan untuk berpisah kedalam pelarut yang digunakan. Dalam kromatografi , ada 3 penggolongan kromatografi yaitu: 1. Kromatografi berdasarkan prinsip atau mekanisme pemisahannya: a. Kromatografi adsorpsi Absorpsi yang penyerapannya pada permukaannya saja(berbeda dengan proses absorbpsi yang berarti penyerapan secara keseluruhan ). Kromatografi jenis ini menggunakan fase diam beripa zat padat dan fase gerak berupa zat cair atau gas. b. Kromatografi partisi Kromatografi ini didasarkan pada partisi pelarut yaitu dua pelarut yang tidak bercampur antara fase dian dan fase gerak c. Kromatografi penukar ion Cara ini didasarkan pada pertukaran (penyerapan) ion antara fase diam dan fase gerak dan titik-titik ion pada kemasan.



d. Kromatografi eksklusi Pemisahan pada teknik ini didasarkan pada ukuran molekul dari sat padat(fase diam) yang merupakan suatu gel dengan permukaan berlubang-lubang sangat kecil yang inert dan fase geraknya yaitu berupa cairan. e. Kromarografi afinitas Biasa juga disebut HPLC (Hight Performance Liquit Chromatography) merupan teknik pemisahan dan pemurnian senyawa tertentu seperti as,amino,as.nukleat dan protein serta cairan fisiologis untuk menentukan senyawa aktif obat dan produk hasil samping prose sintesis. Pada metode kromatografi kertas dan kromatografi lapis tipis perlu diperhatikan tentang factor retrdasi.Faktot retardasi adalah parameter karakteristik pada kromatografi kertas dan kromatografi lapis tipis.Harga Rf merupakan ukuran kecepatan migrasi suatu komponen pada kromatogram dan pada kondisi tetap merupakan besaran karakteristik dan reproduksibel.Rf didefenisikan sebagai perbandingan jarak yang ditempuh komponen terhadap jarak yang ditempuh pelarut(fase bergerak). Faktor-faktor yang mempengaruhi harga RF antara lain: 1. Pelarut Mengingat pentingnya koefisien partisi maka perubahan yang sangat kecil dalam pelarut menyebabkan perubahan harga Rf 2. Suhu Perubahan suhu mengubah koefisien partisi dan kecepatan aliran 3. Ukuran bejana Mempengaruhi homogenitas dari atmosfer sehingga berpengaruh pada kecepatan penguapan dan komponen-komponen pelarut. 4. Kertas Mempengaruhi keseimbangan partisi.Pengaruh utama kertas pada harga Rf muncul dari perubahan ion dan serapan. Cara menghitung harga Rf



Rf = Jarak yang ditempuh senyawa/komponen Jarak yan ditempuh pelarut



5. Sifat dan campuran Berbagai senyawa mengalami partisi diantara volume yang sama dari fase diam dan fase gerak.Sifat dari campuran mempengaruhi karakteristik dari kelarutan satu terhadap yang lainnya sehingga mempengaruhi harga Rf. Berikutnya akan dibahas mengenai Kromatografi adsorpsi yakni kromatografi kertas dan kromatografi lapis tipis. 1. KROMATOGRAFI KERTAS Pada kromatografi kertas penyerap yang digunakan merupakan sehelai kertas dengan susunan serabut dan tebal yang sesuai ( kertas saring) sebagai fase diam dan fase gerak adalah pelarut atau zat cair yang sesuai, seperti aquades dan alcohol.Kertas merupakan selulosa murni yang mempunyai afinitas besar terhadap air atau pelarut polar lainnya . Apabila air(pelarut) diabsorpsikan pada kertas maka akan membentuk lapisa tipis yang dapat dianggap analog dengan kolom. Kromatogram dilakukan dengan merambatkan fase gerak melalui kertas,dapat dilakukan kromatografi naik yaitu pelarut merambat naik pada kertas karna ditarik oleh gaya



kapiler atau kromatogafi menurun yaitu pelarut merambat turun karena ditarik oleh gaya gravitasi. Kromatografi kertas bisa dipakai dalam menganalisa senyawa-senyawa kimia yang terkandung dalam bahan lainnya. Keuntungan utama dari metode ini adalah prosesnya yang mudah dan sederhana karena dalam pelaksanaan pemisahannya hanya pada lembaran kertas saring yang berlaku sebagai media pemisahan dan juga penyangga, selain itu keterulangan bilangan Rf(Faktor Retardasi) yang besar pada kertas memungkinkan bilangan Rf dapat menjadi parameter yang berharga. Pada Kromatografi kertas jika setetes cuplikan diteteskan pada sepotong kertas saring maka akan meluas dan membentuk noda bulat.Kertas saring dimasukkan kedalam bejana tertutup yang berisi pelarut, maka pelarut akan bergerak melalui serat-seratkertas saring.Bila daerah dari noda yang terpisah telah dideteksi,maka perlu mengidentifikasi zat dari senyawa. Hasil analisis Pemisahan dianalisis berdasarkan harga atau nilai Rf pada masing-masing noda,bercak atau spot yang dihasilkan pada pelarut yang sama.Apabila terdapat jarak noda yang sama dengan sampel standar maka sampel yang dianalisis sama dengan sampel standar.Penghitungan nilai Rf dilakukan dengan cara membagi jarak yang ditempuh zar terlarut dengan jarak yang ditempuh pelarut. Prinsip kerja kromatografi kertas : Absorbsi dan kepolaran , dimana absorbs didasarkan pada panjang komponen dalam campuran yang diabsorbsi pada permukaan fase diam dan kepolaran komponen berpengaruh karena komponen akan larut dan terbawah oleh pelarut jika memiliki kepolaran yang sama serta kecepatan migrasi pada fase diam dan fase bergerak. Mekanisme : a. Cuplikan yang mengandung campuran yang akan dipisahkan diteteskan pada daerah yang diberi tanda diatas sepotong kertas saring, dimana ia akan meluasdan membentuk noda yang bulat.Bila kertas telah kering maka dimasukkan kedalam bejana tertutup yang sesuai dengan satu ujung dimana tetesan cuplikan ditempatkan tercelup dalam pelarut(jangan sampai noda tercelup karena senyawa yang akan dipisahkan akan terlarut dari kertas) b. Pelarut bergerak memalui serat dari kertasoleh gaya kapiler dan menggerakkan komponen dari campuran cuplikan pada perbedaan jarak dalam arah aliran pelarut.Bila permukaan pelarut telah bergerak sampai jarak yang cukup jauh atau setelah waktu yang ditentukan, kertas diambil dari bejana dan kedudukan dari permukaan pelarut diberi tanda dan kertas dibiarkan kering.Jika senyawa berwarna maka akan terlihat sebagai pita atau noda yang terpisah.Jika senyawa tidak berwarna maka akan dideteksi dengan menggunakan suatu pereaksi untuk memberikan sebuah warna terhadap beberapa atau semua senyawa tersebut.Bila daerah dari noda tersebut telah dideteksi maka diidentifikasi dari senyawa. Metode identifikasi yang paling mudah adalah dengan menggunakan harga Rf. Cara kerja kromatografi kertas: 1. Ektraksi sampel dengan pelarut yang sesuai sehingga didapat zat yang akan dianalisa 2. Siapkan chamber 3. Siapkan kertas kromarografi dengan cara diberi garis 2 cm dr atas bawah dan 10-12 cm dari bagian bawah 4. Masukkan eluen dan sedikit air serta kertas kromatografi 5. Tutup bejana selama 2-3 jam sampai terjadi kesetimbngan 6. Tambahkan eluen sampai kira-kira kertas dapat tercelup 7. Totolkan sampel pada kertas bagian bawah menggunakan pipa kapiler untuk kromatografi 8. Gantung kertas pada chamber dengan posisi bagian bawah terendam pada eluen , elusi sampai mencapai garis batas atas



9. Keringkan kertas dengan cara diangin-anginkan, hindari dari panas berlebih 10. Setelah timbul bercak tentukan titik tengah bercak 11. Hitung harga Rf



Gambar I. Kromatografi Kertas Fungsi kromatografi kertas : Sebagai metode analitik untuk memisahkan zat atau bahan kimia yang berwarna. Hal-hal yang perlu diperhatikan : a. Jenis kertas - Kertas selulosa murni , kertas ini khusus untuk kromatografi, misalnya kertas whafman no 1 dan 3 - Kertas selulosa yang sudah dimodifikasi dengan zat kimia misalnya kertas diasetil untuk pemisahan steroid dan kertas yang diimpregnase contohnya impregnase dengan minyak untuk pemisahan amina. b. Pemurnian fase gerak fase gerak biasanya campuran dengan sifat netral,asam dan basa b. Penotolan contoh biasanya dengan pipet mikro,agar ukurannya kecil dilakukan pengeringan d. Deteksi



2. KROMATOGRAFI LAPIS TIPIS Kromatografi lapis tipis adalah metode analisia suatu campuran senyawa secara cepat dan sederhana dengan menggunakan menggunakan lapis tipis atau penyerap yaitu absorben yang melekat pada pelat iner , pelat iner adalah tempat melakatnya lapisan adsorben misalnya kaca, aluminium atau pelat polyester dengan ukuran 20 x 20 cm dan 20 x 10 kedua ukuran ini dianggap sebagai ukuran standar.cm dengan ketebalan lapisan 250 mikrometer. Untuk 5ias5ng kualitatif maupun kuantitatif. Pembuatan penyerap yaitu bahan penyerap dicampur dengan air sampai menjadi bubur dengan perbandingan x gram penyerap dan 2x ml air, kemudian diaduk sampai rata dan dituang ke atas plat. Pada Kromatografi Lapis Tipis zat penyerap adalah Lapis tipis serbuk halus yang dilapisi pada lempeng kaca,Plastik atau logam secara merata.Pemisahan yang tercapai didasarkan pada adsorpsi dan partisi atau kombinasi dari kedua efek, tergantung dari jenis penyangga, cara pembuatan dan jenis pelarut yang digunakan.Perkiraan identifikasi diperoleh dengan pengamatan bercak yang 5ias5ng dan 5ias5n sama.Bercak dapat dikerok



dari lempeng kemudian diekstraksi dengan pelarut yang sesuai dan diukur secara spektrofotometri. Cara kerjanya 6ias6n sama dengan kromatografi kertas, namun memiliki beberapa keunggulan : 1. Pemisahan berjalan relative lebih cepat 2. Sentitif. Walaupun konsentrasi zat uji kecil masih dapat di deteksi 3. Daya resolusi yang tinggi sehingga pemisahan lebih sempurna dan terlokalisir dengan baik. Adapun adsorben yang umumnya digunakan antara lain alumina atau silica jel yang bersifat asam digunakan untuk pemisahan komponen atau uji berdasarkan 6ias6ng atau partisi asam, ,tanah diatomeae yang bersifat netral digunakan sebagai penyangga pada kromatografi untuk pemisahan komponen zat ujji berdasarkan partisi. Prinsip kerja Kromatografi Lapis Tipis : Memisahkan sampel berdasarkan perbedaan kepolaran antara sampel dengan pelarut yang digunakan berdasarkan adsorpsi dan partisi. Mekanisme KLT a. Pada proses pemisahan terjadi hubungan kesetimbangan antarafase diam dan fase bergerak, dimana ada interaksi antara permukaan fase diam dan gugus fungsi senyawa organic yang akan diidentifikasi yang telah bereaksi dengan fase geraknya.Proses ini dipengaruhi oleh kepolaran fase diam, kepolaran fase gerak dan kepolaran dan ukuran molekul. b. Pada KLT eluen adalah fase gerak yang berperan penting pada proses elusi bagi larutan umpan (feed) untuk melewati fasediam(adsorben). Interaksi eluen dan adsorben sangat menentukan terjadinya pemisahan komponen sehingga pemisahan komponen ini dipengaruhi olehlaju alir eluent dan jumlah umpan.Suatu pelarut yang bersifat larutan relative polar dapat mengusir pelarut yang tidak polar dari ikatannya dengan alumina( silica gel).Semakin dekat kepolaran antara senyawa dengan eluen maka senyawa akan semakin terbawa oleh fase gerak tersebut. Hal ini berdasarkan prinsip “ like dissolved like” Cara kerja KLT : 1. Sejumlah larutan yang mengandung logam diasamkan dengan asam asetat dengan pH 5 kemudian ditambahkan larutan dithizone dalam kloroform dengan volume yang sama kemudian dikocok dalam corong pisah.lapisan kloroformnya dicuci dengan larutan asam nitrat untuk menghilangkan kelebihan dithizonenya. 2. Totolkan sebanyak 10 ul ektrak kloroform diatas keeping KLT yang telah diaktifir.Sejauh 2 cmdari ujung bawah dan jarak antara titik totolan kira-kira 1,5 cm satu sama lainya. 3. Chamber kromatografi telah dijenuhkan dengan pelarut selama 2 jam.Penjenuhan dapat dipercepat menggunakan kertas saring yang dimasukkan ke dalam chamber. 4. Masukkan 6ias6ng kromatografi yang telah ditotoli zat , biarkan selama beberapa menit sehingga larutan mencapai kira-kira 20 cm dari bawah.Angkat dan keringkan 5. Hitung Rf tiap totolan dengan membagi jarak yang ditempuh oleh zat dengan jarak yang ditempuh oleh pelarut. Kemudian bandingkan dengan Rf pembanding. Fungsi KLT : Sebagai metode analitik untuk memisahkan zat, bahan kimia atau senyawa yang tidak 6ias dilakukan dengan metode kromatografi kertas, misalnya senyawa hidrofobik ( lipid dan hidrokarbon).



Gambar II. Kromatografi Lapis Tipis Hal- yang mempengaruhi hasil : 1. Struktur kimia senyawa yang dipisahkan 2. Sifat dari penyerap dan derajat aktifitasnya Perbedaan penyerap memberikan perbedaan yang besar terhadap Rf 3. Tebal dan kerataan lapisan penyerap Ketidak rataan penyerap menyebabkan aliran pelarut juga tidak rata 4. Pelarut/derajat kemurnian fase bergerak Perbandingan pelarut yang dipakai harus diperhatikan 5. Jumlah cuplikan yang digunakan Penetesan dengan jumlah yang berlebihan menyebabkan penyebaran noda terbentuk ekor sehingga menyebabkan kesalahan pada penghitungan Rf 6. Suhu Suhu yang berubah menyebabkan perubahan komposisi pelarut oleh penguapan atau perubahan fase 7. Kesetimbangan Jika tidak ada kesetimbangan permukaan pelarut cekung dan fase bergerak lebih cepat pada bagian tepi.



Contoh alat yang dipergunakan dalam analisa pada laboratorum kesehatan yang menggunakan metode kromatogafi adalah yakni imunokromatografi yaitu : - Strip / Rapid tes HbSAg - Strip /Rapid tes HCG - Urine Strip - Dll Seiring perkembangan jaman , semakin maju pula teknologi seperti dibidang kesehatan, salah satunya adalah alat diagnostic yang disebut strip ataupun rapid tes. Sebagaimana diketahui tes ini digunakan untuk pemeriksaan atau screening medis awal.Dengan menggunakan alat ini hasil akan diperoleh dalam waktu yang cepat.Metode ini telah dikembangkan oleh pabrikan sehingga sesuai dengan penggunaan peralatan yang diproduksi oleh pabrikan dengan memperhatikan kehandalan dan kemampuan metode tersebut untuk penggunaan dalam



pengujian sehari-hari yang bisa dilihat dari tingkat sensitivitas, akurasi dan presisi yang dihasilkan oleh metode tersebut. STRIP TES HCG Prinsip : Penambahan urine ke peralatan tes dan membiarkannya berjalan disepanjang absorban.Penanda antibody yang menafsirkan warna melekat ke HCG pada daerah tes dan menghasilkan pita berwarna merah ketika konsentrasi HCG sama dengan atau lebih dari 20mIU/ml, saat keadaan tidak ada hormone HCG maka tidak akan terbentuk pita di daerah tes.Reaksi pencampuran berlanjut disepanjang absorban melewati daerah tes dan control menghasilkan pita berwarna merah yang menandakan bahwa reagen dan peralatan masih berfungsi dengan baik. Mekanisme : Urin yang diperiksa akan bergerak dari zona yang satu ke zona yang lain , dimulai dari zona yang terdapat mobile anti HCGI , anti HCGI akan ikut terbawa oleh urin ke zona anti HCG2. Disinilah penentuan positif atau negative suatu tes. Jika pada urin terdapat molekul terdapat HCG maka molekul ini yang sebelumnya sudah berikatan dengan anti HCG1akan berikatan dengan anti HCG2 sehingga akan terbentuk warna atau garis pada strip atau kaset pemeriksaan, jika pada urin tidak terdapat molekul HCG maka anti HCG2 tidak akan terikat.Selanjutnya urin bergerak ke zona anti-anti HCG.Pada zona ini baik urin yang mengandung molekul HCG atau tidak akan membentuk warna karena anti-anti HCG berikatan dengan anti HCG1 yang ikut terbawaholeh urin.Zona ini disebut control. Cara penggunaan alat : 1. Siapkan peralatan dan bahan yang dibutuhkan 2. Keluarkan strip/rapid tes dari bungkusnya dan letakkan pada tempat dengan permukaan yang rata 3. Celupkan strip pada sampel / teteskan sampel pada lubang sampel pada rapid tes 4. Cara mencelupkan strip tes yaitu dengan memegang strip tes secara vertical dengan panah menghadap ke bawah,celupkan sampai batas garis yang telah ditentukan kurang lebih selama 30 detik, angkat dan letakkan pada permukaan yang rata. 5. Baca hasi setelah kurang lebih 5 menit. Interpretasi hasil : -



Negatif bila terlihat satu garis warna, yaitu hanya garis control Positif jika terlihat 2 garis warna yakni garis control dan tes Invalid jika: * tidak terlihat garis warna sama sekali * garis warna hanya terlihat pada garis tes tetapi tidak terlihat pada gari control



Gambar III. Contoh Strip HCG Test Pemeliharaan Alat : 1. Hal-hal yang harus dihindari -mencelupkan urin melewati batas garis yang telah ditentukan -menyimpan reagen/alat pada tempat lembab , basah atau temperature tinggi 2. Perawatan alat - Menyimpan reagen/alat pada suhu yang sesuai - Memperhatikan waktu kadaluarsa alat/reagen



DAFTAR PUSTAKA



Fessenden RJ dan J.S Fessenden., 2003, Dasar – dasar kimia organik. Jakarta, Erlangga Gandjar, Ibnu Gholib dan Abdul Rohman., 2007, Kimia Farmasi Analisis, pustaka pelajar, Yoyakarta Gritter,R,J., 1991, Pengantar Kromatografi Edisi II, Institut Teknologi Bandung, Bandung Soebagio., 2002, Kimia Analitik, Universitas Negeri Makassar Fakultas MIPA, Makassar