Laporan Isolasi Dna [PDF]

Citation preview

LAPORAN PRAKTIKUM BIOMOLEKUL ISOLASI DNA PLASMID



Disusun Oleh : Kelompok



:6



Nama Anggota : -Nadila Anggraini S.



(171810301001)



-Muhammad Qosim A. H. (171810301018) -R. Aj. Irma K. A



(171810301026)



-Nurul Afifah F.



(171810301030)



-Leyla Novita B.



(171810301037)



LABORATORIUM BIOKIMIA JURUSAN KIMIA FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM UNIVERSITAS JEMBER 2019



BAB I. PENDAHULUAN



1.1



Latar Belakang Deoxyribonucleic acid (DNA) adalah asam nukleat yang mengandung



materi genetik dan berfungsi untuk mengatur perkembangan biologis seluruh bentuk kehidupan secara seluler, sehingga DNA ini sangat penting dalam kehidupan manusia. DNA mengandung informasi genetik makhluk hidup dari satu generasi ke generasi selanjutnya. DNA secara keseluruhan dalam sel akan membentuk genom (Suryo, 2004). DNA terdapat pada nukleus, mitikondria, dan kloroplas. DNA nukleus berbentuk linier dan berasosiasi sangat erat dengan protein histon, sedangkan DNA mitokondria dan kloroplas berbentuk sirkular (DNA plasmid) dan tidak berasosiasi dengan protein histon. DNA mitokondria dan kloroplas hanya dapat mewariskan sifat-sifat yang berasal dari garis ibu. DNA Plasmid atau plasmid sebagai DNA ekstrakromosomal merupakan molekul DNA pada sel bakteri, berbentuk bulat kecil yang berbeda dan merupakan tambahan dari molekul DNA utama pada kromosom bakteri (Glick, 2005). Molekul DNA dalam suatu sel dapat diekstraksi atau diisolasi untuk berbagai macam keperluan seperti amplifikasi dan analisis DNA melalui elektroforesis. Isolasi DNA dilakukan dengan tujuan untuk memisahkan DNA dari bahan lain seperti protein, lemak, dan karbohidrat. DNA memiliki beberapa fungsi sekaligus yaitu sebagai pembawa informasi genetik, berperan dalam menduplikasi diri dan dalam pewarisan sifat, sebagai ekspresi informasi genetik, pengarah sintesis RNA pada sebuah proses kimia atau transkripsi, kode untuk pengaktifan protein dan penonaktifan gen serta untuk membuat protein. Teknik isolasi DNA ini perlu dilakukan agar DNA yang akan digunakan sebagai penelitian dalam keadaan yang lebih murni, sehingga dapat menganalisis sifat atau karakter dari DNA yang diisolasi. Isolasi DNA saat ini banyak digunakan dalam medis yaitu analisis genetik dan forensik, selain itu isolasi DNA juga dapat digunakan dalam bidang kultur tanaman dan pertanian untuk menghasilkan varietas baru dan unggul.



Prisnsip utama dalam isolasi DNA ada tiga yakni penghancuran (lisis), ektraksi atau pemisahan DNA dari bahan padat seperti selulosa dan protein, serta pemurnian DNA. Isolasi DNA juga dapat dilakukan melalui sentrifugasi, dimana teknik ini dilakukan berdasarkan berat molekul komponennya. Molekul yang memiliki berat molekul ringan akan berada pada bagian atas tabung, sedangkan molekul yang berat molekul lebih besar akan berada pada bagian bawah tabung. Hasil sentrifugasi akan menghasilkan dua macam fraksi yaitu supernatan pada bagian atas dan pelet pada bagian bawah (Glick, 2005). Metode yang dilakukan untuk mengisolasi DNA tidak boleh mengubah struktur dan fungsi molekul DNA juga harus menghasilkan DNA tanpa adanya kontaminan seperti protein dan RNA (Surzycki, 2000).



1.2



Tujuan Adapun rumusan masalah dari percobaan ini adalah:



1.



Melatih kemampuan mahasiswa untuk mengisolasi DNA Plasmid



2.



Memahami dan mengetahui berat molekul DNA Plasmid.



1.3



Manfaat Adapun manfaat dari percobaan ini adalah:



1.



Mahasiswa dapat melatih kemampuan untuk mengisolasi DNA plasmid.



2.



Mahasiswa dapat mengetahui berat molekul DNA plasmid.



BAB II. TINJAUAN PUSTAKA



2.1



Asam Nukleat Asam nukleat merupakan suatu polinukleotida, yaitu polimer linier yang



tersusun dari monomer-monomer nukleotida yang berikatan melalui ikatan fosfodiester. Asam nukleat yang paling umum adalah asam deoksiribonukleat (DNA) dan asam ribonukleat (RNA). Asam nukleat ditemukan pada semua sel hidup serta pada virus. Asam nukleat dibedakan menjadi dua, berdasarkan jenis gula yang terdapat pada rantai asam nukleat. Asam nukleat yang pertama yaitu DNA yang memiliki gula deoksiribosa, sedangkan asam nukleat yang kedua yaitu RNA yang memiliki gula ribosa. Basa nitrogen yang ditemukan pada kedua jenis asam nukleat tersebut juga memiliki perbedaan yaitu basa nitrogen pada DNA diantaranya adalah adenin, guanin, sitosin, dan timin, sedangkan basa nitrogen pada RNA diantaranya adalah adenin, guanin, sitosin, dan urasil (Muladno, 2002). Asam nukleat berfungsi sebagai tempat penyimpanan dan pemindahan informasi genetik. Informasi ini diteruskan dari sel induk ke sel anak melalui proses replikasi. Asam nukleat terdapat pada semua sel hidup dan bertugas untuk menyimpan dan mentransfer genetik, kemudian menerjemahkan informasi ini secara tepat untuk mensintesis protein yang spesifik bagi masing-masing sel. Asam nukleat memiliki peranan penting, diantaranya adalah: 1.



Menyimpan, mentransmisi, dan mentranslasi informasi genetik;



2.



Metabolisme antara dan reaksi-reaksi informasi energi;



3.



Koenzim pembawa energi;



4.



Koenzim pemindah asam asetat, zat gula, senyawa amino dan biomolekul lainnya;



5.



Enzim reaksi oksidasi dan reduksi.



(Goodenough, 1988). 2.2



Deoxyribose Nucleid Acid (DNA) DNA (deoxyribonucleic acid) merupakan tempat penyimpanan informasi



genetik. DNA adalah polimer asam nukleat yang tersusun secara sistematis dan merupakan pembawa informasi genetik yang diturunkan pada keturunannya.



Informasi genetik disusun dalam bentuk kodon yang berupa tiga pasang basa nukleotida dan menentukan bentuk, struktur, maupun fisiologi suatu jasad. DNA organisme prokariot dan eukariot mempunyai perbedaan bentuk. Organisme eukariotik mempunyai DNA berbentuk linier yang terletak dalam inti sel, sedangkan organisme prokariot memiliki DNA berbentuk sirkular dan terletak dalam sitoplasma (Campbell.dkk, 2004). DNA disusun dari nukleotida dimana antara nukleotida yang satu dengan nukleotida yang lain dihubungkan dengan ikatan fosfat. Ikatan fosfat tersebut sangat kuat dan biasanya dikenal sebagai ikatan ikatan ester kovalen, atau ikatan fosfodiester. Residu fosfat (PO4-) pada sepanjang rantai ini bersifat asam, sehingga dinamakan asam nukleat (Goodenough, 1988). DNA dalam organisme hidup, biasanya ditemukan dalam bentuk berpasangan dan terikat kuat. Dua unting DNA saling berpilin membentuk heliks ganda. Heliks ganda ini distabilisasi oleh dua ikatan hidrogen antar nukleotida dan interaksi tumpukan antar nukleobasa aromatik. DNA dalam lingkungan sel yang berair, ikatan π konjugasi antar basa nukleotida tersusun tegak lurus terhadap sumbu pilinan DNA, hal ini meminimalisasi interaksi dengan cangkang solvasi, dan sehingganya menurunkan energi bebas Gibbs (Jack, 1995). DNA dapat mereplikasi diri melalui tiga cara yaitu sebagai berikut



Gambar 2.1 Replikasi DNA (Sumber : Jack, 1995) 1.



Semi konservatif Semi konservatif yaitu apabila dua pita spiral dari “double helix” memisahkan diri dan setiap pita tunggal dari 'double helix' parental membentuk pita pasangan yang baru.



2.



Konservatif Konservatif yaitu rantai double helix parentalnya tetap utuh, dan semuanya dapat mencetak double helix yang baru.



3.



Dispersif Dispersif yaitu kedua pita double helix parental terputus-putus membentuk segmen-segmen. Segmen-segmen DNA parental dan segmen-segmen DNA yang baru saling bersambungan dan membentuk dua double helix baru.



(Jack, 1995). DNA yang menyusun kromosom dan plasmid pada bakteri diselimuti oleh suatu dinding sel dan pada virus diselimuti oleh protein tertentu. Organisme prokariot mengandung satu atau lebih plasmid. Plasmid merupakan mulekul DNA yang bentuknya sirkular dengan ukurannya jauh lebih kecil dibanding dengan kromosom. Plasmid dapat memperbanyak diri dengan cara bereplikasi. Plasmid pada umumnya digunakan dalam rekayasa genetik. Teknologi DNA rekombinan menggunakan E. Coli sebagai host, sehingga dalam rekayasa genetika plasmid sering digunakan sebagai pembawa gen-gen tertentu yang diinginkan ke dalam suatu sel inang (Stanfield, 1996). Plasmid bertindak sebagai DNA ekstrakromosomal, yaitu molekul DNA pada sel bakteri, berbentuk bulat kecil yang berbeda dan merupakan tambahan dari molekul DNA utama pada kromosom bakteri. Plasmid mempunyai titik ori (origin of replication) sehingga mampu mereplikasi diri tanpa pengaturan dari DNA kromosom. Replikasi dimulai dari titik ori hingga semua plasmid tereplikasi, berbagai tipe plasmid telah ditemukan pada sel bakteri. Distribusi plasmid pada bakteri bersifat sporadis karena ada bakteri yang mengandung plasmid tetapi ada juga yang tidak, misalnya pada sel E.coli terdapat plasmid F yang menyebabkan bakteri ini mempunyai sifat konjugatif tertentu. Plasmid F biasa digunakan sebagai vector untuk membawa DNA yang akan disisipkan pada genom



sel



target.



Plasmid



juga



merupakan



alat



yang efisien



untuk



mengamplifikasi klon DNA karena memiliki kopi yang sangat banyak per selnya (Lehninger, 1982).



Plasmid



dibagi



menjadi



beberapa



macam



berdasarkan



fungsinya,



diantaranya adalah sebagai berikut : 1.



Fertility- F plasmids, merupakan plasmid yang dapat ditransfer dari satu sel



ke sel bakteri lain untuk



proses konjugasi. Plasmid ini juaga mempunyai



kemampuan untuk mentransfer DNA atau gen baik yang terdapat dalam plasmid ataupun dalam kromosom. Plasmid ditemukan antara lain pada Eschericia coli, Pseudomonas, dan Streptomyces. 2.



Resistance- R plasmids, mengandung gen yang resisten terhadap antibiotik



atau racun dan inhibitor pertumbuhan lainnya. Plasmid R dapat ditemukan pada Staphylococcus. 3.



Plasmid penyandi bacteriocins. Bacteriocins adalah senyawa yang



diproduksi oleh bakteri untuk menghambat pertumbuhan atau bakteri lain yang spesises atau galurnya berbeda. Plasmid ini mengandung gen struktural bacteriocins ataupun gen yang mengkode protein yang berperan dalam pemrosesan dan transport bacteriocins. Penamaan plasmid ini tergantung pada organisme yang memproduksinya. Misalnya plasmid Col pada bakteri Escherichia coli yang mengkode colicins. 4.



Degradative plasmids, merupakan plasmid yang mampu mencerna substansi



yang tidak biasa, contoh toluen dan asam salisilat. 5.



Virulence plasmids, merupakan plasmid yang menjadikan bakteri tersebut



patogen. (Lehninger, 1982). 2.3



Fungsi dan Struktur DNA Struktur DNA merupakan struktur double helix. Dua rantai nukleotida dari



DNA dihubungkan oleh pasangan basa. Helai memiliki arah yang berlawanan dan dipelintir menjadi bentuk heliks. DNA memiliki fungsi sebagai tempat penyimpanan informasi genetik, memberikan ciri khas dari struktur protein dan struktur RNA pada setiap spesies organisme. DNA merupakan bahan yang bisa diwariskan pada semua sel dan dapat bereplikasi pada setiap generasi sel. DNA berguna untuk membuat program dengan menempatkan biosintesis sel dan jaringan secara teratur. DNA digunakan untuk menentukan aktivitas organisme



sepanjang siklus hidupnya, dan untuk menentukan sifat spesifik dari organisme tertentu. (Lehninger, 1982). Informasi genetik disusun dalam bentuk kodon yang berupa tiga pasang basa nukleotida. Tiga struktur DNA meliputi struktur primer, struktur sekunder, dan struktur tersier. Struktur primer dari DNA disusun oleh urutan linear nukleotida. Nukleotida dihubungkan satu sama lain dengan sambungan fosfodiester (ikatan yg menghubungkan antara gugus hidroksil pada posisi 5 gula pentose dg gugus hidroksil nukleotida berikutnya). Nukleotida terbentuk dari satu gula pentose (2-deoksi-D-ribosa), satu basa nitrogen yang meliputi purin (adenin, guanin) dan pirimidin {sitosin, timin (hadir dalam DNA saja), urasil (hadir dalam RNA saja)} dan satu molekul fosfat. Nukleotida membentuk hubungan fosfodiester antara 5 'dan 3' atom karbon untuk membentuk asam nukleat. Arah rantai DNA dari ujung 5’ bebas menuju gugus hidroksil 3’ bebas (Kusuma, 2010).Struktur sekunder Salah satu sifat biokimia DNA yang menentukan fungsinya sebagai pembawa informasi genetik adalah komposisi basa penyusun. dari DNA berupa double helix, dimana dua untai polinukleotida secara anti parallel berpilin ke kanan dan melingkari sumbu. Nukleotida yang merupakan penyusun DNA terdiri atas tiga gugus molekul yaitu gula dengan 5 karbon (2deoksiribosa), basa nitrogen, dan gugus fosfat. Basa nitrogen penyusun DNA adalah golongan purin dan golongan pirimidin. Basa purin dibagi menjadi dua yaitu adenin (A) dan guanin (G) (Kusuma, 2010).



Gambar 2.2 Struktur basa nitrogen dalam DNA (Sumber: Kusuma, 2010). Struktur tersier dari DNA paling umum ditemukan pada virus dan mitokondria. DNA virus dan DNA mitokondria merupakan molekul lingkar.



Struktur DNA tersier berbentuk lingkaran. Lingkaran terbentuk karena dari kedua untai polinukleotida membentuk struktur tertutup yang tidak berujung. Konformasi ini terjadi karena kedua untai polinukleotida membentuk struktur tertutup yang tidak berujung. Molekul DNA lingkar tertutup yang diisolasi dari bakteri, virus dan mitokondria seringkali berbentuk superkoil, selain itu DNA dapat berbentuk molekul linier dengan ujung-ujung rantai yang bebas (Kusuma, 2010).



Gambar 2.3 Molekul DNA (Sumber: Kusuma, 2010) 2.4



Isolasi DNA Isolasi DNA adalah proses untuk mendapatkan DNA murni dari makhluk



hidup yang berguna untuk keperluan bioteknologi. Isolasi DNA dilakukan dengan tujuan untuk memisahkan DNA dari bahan lain seperti protein, lemak, dan karbohidrat. Isolasi DNA secara spesifik yang mencangkup gen tertentu dilakukan dengan beberapa teknik, yaitu: 1.



Isolasi DNA genom dan dilanjutkan pemotongan DNA genom menggunakan enzim endonuklease retriksi.



2.



Mengisolasi mRNA yang merupakan hasil transkripsi gen yang dimaksud kemudian



dilanjut



dengan



membuat



turunan



(Complementery



DNA/cDNA), 3.



Menyintesis nukleotida yang menyusun gen tersebut (membuat gen sintetik) dengan teknik sintesis kimiawi.



4.



Melakukan implifikasi DNA dengan teknik (Polimerase Chain Reaction).



(Campbell,2004)



Isolasi Dna merupakan proses untuk mendapatkan DNA murni yang dapat digunakan untuk keperluan pemeriksaan atau diagnosa. DNA bisa di isolasi dari berbagai sel yang memiliki inti sel. DNA terletak di dalam inti sel. beberapa sumber DNA yang dapat dipergunakan dalam isolasi DNA dapat menggunakan beberapa sumber DNA yaitu urine, darah, biopsi,rambut, gigi kuku dan lainya (Lehninger,1982) Prinsip utama dalam isolasi DNA ada tiga yakni penghancuran (lisis), ektraksi atau pemisahan DNA dari bahan padat seperti selulosa dan protein, serta pemurnian DNA. Isolasi DNA juga dapat dilakukan dengan menggunakan sentrifugasi, dimana metode ini didasarkan pada berat molekul komponenkomponen yang dipisahkan. Teknik isolasi DNA yang sangat sederhana adalah metode Kitchen Preparation. Metode isolasi ini memanfaatkan bahan-bahan yang biasanya digunakan ibu rumah tangga yaitu sabun cuci (cair, bubuk atau krim) untuk menggantikan bahan utama yang berfungsi untuk melisis sel, ekstrak buah nanas sebagai sumber enzim protease serta garam dapur (Cooper,2000) 2.4.1 Isolasi DNA Plasmid DNA plasmid merupakan tempat untuk kloning gen. Hal yang bharus dilakukan pada isolasi DNA plasmid yaitu DNA plasmid harus dipisahkan dari DNA kromosom bertujuan untuk mempermudah untuk mendapatkannya. DNA plasmid ukurannya sangat kecil, berbeda dengan DNA kromosom yang ukurannya besar. Pemisahan dari DNA plasmid perlakuannya berbeda dengan pemisahan dari DNA kromosom. Membran sel dipecah dengan menambahkan detergen. DNA kromosom akan dibebaskan dalam proses pemecahan ini, serta akan membebaskan DNA plasmid, RNA, protein dan komponen lainnya. Potasium kemudian ditambahkan pada Hasil proses lisis yang bertujuan untuk mengendapkan DNA kromosom dan protein. Pemisahan dari Endapan DNA, protein, dan potasium dilakukan dengan teknik sentrifugasi. Supernatan yang mengandung DNA plasmid, RNA dan protein yang diambil untuk dipisahkan dari DNA plasmid. Degradasi RNA dan protein dilakukan dengan menambahkan Rnase dan protese. Proses terakhir adalah menambahkan etanol untuk mengendapkan DNA plasmid (Cooper, 2000).



Kuantitas dari DNA dicerminkan berdasarkan berat molekul bukan oleh volume. Kuantitas dari DNA diketahui dengan dianalisis menggunakan spektrofotometer UV pada panjang gelombang 256 nm atau 260 nm. Kualitas hasil isolasi dari DNA berhubungan dengan kemurnian terhadap kontaminan protein. Nilai absorbansi dapat diubah menjadi konsentrasi pada panjang gelombang 260 nm (nilai 1 pada OD260 = 50 ug DNA utas ganda tiap ml) (Suharsono dan Widyastuti, 2006). Prinsip dari Elektroforesis gel agrosa berdasarkan pergerakan dari molekul bermuatan pada media penyangga matriks stabil, yaitu gel agarosa atau poliakrilamid. Pergerakan molekul dari proses tersebut di bawah pengaruh medan listrik. Fungsi dari proses ini untuk memisahkan fragmen-fragmen DNA yang ukurannya >100 pb (berjalan secara horizontal). Elektroforesis poliakrilamid merupakan jenis lain dari elektroforesis. Jenis ini biasanya digunakan untuk memisahkan DNA yang berukuran 1 pb (berjalan secara vertikal). Skuens DNA ditentukan dengan elektroforesis poliakrilamid (Muladno, 2002) 2.4



Elektroforesis Elektroforesis DNA merupakan teknik untuk memisahkan sampel DNA



berdasarkan atas ukuran (berat molekul) dan struktur fisik molekulnya. Gel yang biasa digunakan yaitu agarosa, gel agarosa dapat dilakukan pemisahan sampel DNA dengan ukuran dari beberapa ratus hingga 20.000 pasang basa (pb). Molekul DNA bermuatan negatif sehingga di dalam medan listrik akan bermigrasi melalui matriks gel menuju kutub positif (anode). Ukuran molekul semakin besar maka menandakan semakin rendah laju migrasinya. Berat molekul suatu fragmen DNA dapat diperkirakan dengan membandingkan laju migrasinya dengan laju migrasi fragmen-fragmen molekul DNA strandar (marker) yang telah diketahui ukurannya. Visualisasi DNA selanjutnya dilakukan di bawah paparan sinar ultraviolet setelah terlebih dulu gel direndam di dalam larutan etidium bromida. Elektroforesis digunakan untuk memisahkan, mengidentifikasi, dan memurnikan fragmen DNA (Wibowo, 2010). Contoh Pita DNA setelah elektroforesis dapat diamati pada sinar UV :



Gambar 2.1 Pita DNA setelah elektroforesis pada sinar UV (Sumber : Glick dan Pasternak, 2005). Elektroforesis terdiri dari dua jenis yaitu elektroforesis kertas dan elektroforesis gel. Elektroforesis kertas yang terdiri dari kertas sebagai fase diam dan partikel bermuatan yang terlarut sebagai fase gerak, terutama ialah ion-ion kompleks. Pemisahan ini terjadi akibat adanya gradasi konsentrasi sepanjang sistem pemisahan. Pergerakan partikel dalam kertas tergantung pada muatan atau valensi zat terlarut, luas penampang, tegangan yang digunakan, konsentrasi elektrolit, kekuatan ion, pH, viskositas dan adsorpsivitas (penyerapan) zat terlarut. Elektroforesis gel adalah elektroforesis yang menggunakan gel sebagai fase diam untuk memisahkan molekul-molekul. Elektroforesis gel ini awalnya dilakukan dengan medium gel kanji (sebagai fase diam) yang digunakan untuk memisahkan biomolekul yang lebih besar seperti protein-protein. Elektroforesis gel dapat berkembang dengan menjadikan agarosa dan poliakrilamida sebagai gel media (Glick dan Pasternak, 2005)



BAB III. METODELOGI PERCOBAAN



3.1



Alat dan Bahan



3.1.1



Alat



- Mikropipet - Tabung eppendorf - Beaker glass - Erlenmeyer - Sentrifuse - Shaker incubator



3.1.2 -



Bahan Larutan I (Glukosa 50 mM, Tris-HCl 2,5 mM pH 8, Na2EDTA 10 mM pH 8) 100 µL



-



Larutan II (NaOH 0,2 M, SDS 1%, ddH2O steril)200 µL



-



Larutan III (Kalium asetat 5 M, asam asetat glasial, ddH2O dingin)150 µL



-



Campuran fenol: kloroform: isoamil alkohol (25:24:1)



-



Etanol absolut



-



Etanol 70%



-



ddH2O



-



Koloni tunggal transforman E.Coli(inokulum)



-



Gel agarosa 1,5%



-



Buffer TAE



-



Larutan Etidium Bromida (EtBr) 250 µg/mL



3.2



Diagram Alir



3.2.1 Isolasi DNA Plasmid Koloni tunggal



supernatan



pellet



diinokulasi diinkubasi 37oC disentrifugasi Larutan I ditambahkan



Larutan II



Larutan III - disentrifugasi



pellet



ditambahkan



Supernatan



campuran fenol : kloroform:isoamil alkohol



- dikocok dan sentrifugasi



Fase bawah



Fase tengah



Supernatan



Supernatan



Fase atas (cair) -



dipekatkan



-



dinkubasi



-



disentrigugasi



pellet -



dicuci etanol dingin 70%



-



disentrifugasi



pellet Hasil



dilarutkan dalam 20 mL ddH2O



3.2.2 Elektroforesis Agarosa



Buffer TAE



- didinginkan



Sampel DNA - dicampur dengan



- dituangkan



- dipadatkan



buffer BTB dan sukrosa - dimasukkan



Gel Agarosa - dielektroforesis - direndam dalam EtBr - direndam dalam buffer TAE - diamati dengan sinar UV Pita-pita DNA 3.3



Prosedur Kerja



3.3.1 Isolasi DNA Plasmid Koloni tunggal transforman E. Coli diinokulasi ke dalam 5 mL media Luria Bertani cair yang mengandung 2.5 L kanamisin 100mg/ml dan diinkubasi pada shaker incubator pada suhu 37°C dengan kecepatan 150 rpm selama 18 jam. Inokulum disentrifugasi selama 2 menit dengan kecepatan 10.000 rpm pada suhu 4°C, pellet dilarutkan dalam larutan I (Glukosa 50 mM, Tris-HCl 2.5 Mm Ph 8, Na2EDTA 10 mM Ph 8) 100 L dan dihomogenkan lalu didiamkan 5 menit. Ditambahkan 200 L larutan II (NaOH 0.2 M, SDS 1%, ddH2O steril) dan dihomogenkan dengan cara membolak balik tabung eppendorf. Larutan diinkubasi di es selama 15 menit, setelah 15 menit ditambahkan 150 L larutan III (kalium asetat 5M, asam asetat glasial, ddH2O dingin), diinkubasi dalam es selama 10 menit. Campuran tersebut disentrifugasi selama 5 menit dengan kecepatan 12.000 rpm, supernatan yang diperoleh dipindah secara perlahan dengan menggunakan



pipet ke dalam tabung eppendorf baru yang steril dan ditambahkan campuran fenol : kloroform : isoamil alkohol (25:24:1) 1 kali volume total, dikocok sampai terbentuk emulsi kemudian disentrifugasi lagi 12.000 rpm selama 2 menit. Dihasilkan 3 lapis, fasa paling atas adalah fasa cair, fasa cair dipindah dengan cara memipet secara hati-hati ke dalam tabung eppendorf baru yang steril, fasa cair tersebut dipekatkan dengan penambahan etanol absolut dingin 2 kali volume total, dan diinkubasi dalam es selama 1 jam. Campuran disentrifugasi 12.000 rpm selama 5 menit, pellet dicuci dengan etanol dingin 70% dan disentrifugasi lagi dan tabung eppendorf dikeringkan dari etanol dengan cara membalikkan tabung dan didiamkan 5 menit. Kemudian pellet dilarutkan dalam 20 L ddH2O.



3.3.2 Analisis DNA dengan elektroforesis gel agarosa Gel agarosa 1,5% dibuat dengan melarutkan 0,375 gram agarosa dalam 25 mL buffer TAE (Tris-asetat EDTA) pH 8. Setelah agarosa terlarut dan didinginkan sampai kira-kira temperatur 45°C, selanjutnya gel dituangkan pada cetakan dan dibiarkan memadat. Sampel yang akan dielektroforesis dicampur dengan buffer yang mengandung bromofenol biru 0,25% (b/v) dan sukrosa 40% (b/v). Elektroforesis dilakukan dalam buffer TAE pada tegangan 75 Volt. Elektroforesis dihentikan ketika bromofenol biru telah bermigrasi kira-kira 2/3 dari panjang gel. Gel agarosa kemudian direndam dalam larutan buffer EtBr 250 g/mL selama 30 menit, selanjutnya direndam dalam buffer TAE selama 5-10 menit. Hasil elektroforesis dapat diamati dengan sinar UV.



BAB IV. HASIL DAN PEMBAHASAN



4.1



Hasil



No



Perlakuan



Hasil



. 1



Penambahan larutan I Larutan menjadi kental, dan



keruh berwarna



putih



2



3



Didiamkan selama 5 Tidak terjadi menit



perubahan



Penambahan larutan II



Membentuk larutan tidak berwarna dan homogen



4



5



Inkubasi



selama 15 Terdapat lendir



menit



pada larutan



Penambahan larutan



Aroma larutan



III



asam dan larutan tak berwarna



Gambar



6



Larutan membentuk fase



2



dimana



pada bagian atas Inkubasi



selama 10 dan



menit



dan berupa



disentrifugasi



bawah larutan



tidak berwarna dan



bagian



dinding berupa lapisan



tipis



emulsi 7



Ditambah



campuran



fenol;kloroform;isoam il alkohol



Membentuk emulsi



8



Supernatan atas



dan



bagian ditambah



etanol dingin



9



Diingkubasi selama 60 menit



10



Pelet



diambil



ditambah etanol



dan



Larutan homogen



Terdapat pelet Pelet membentuk larutan



larut



homogen 11



Larutan homogen



Disentrifugasi



dan



terdapat sedikit pelet



12



Pelet



diambil



dan Tidak



ditambah ddH2O



terjadi



perubahan



13 Hanya Elektroforesis



ditemukan RNA saja



yang



berjalan



4.2



Pembahasan Percobaan yang telah dilakukan ada praktikum ini yaitu isolasi DNA



plasmid. Plasmid merupakan molekul DNA sirkuler yang berukuran relatif kecil dan berada pada kromosom bagian luar dalam sel prokariot. Plasmid dalam rekayasa genetika dapat digunakan sebagai vektor untuk mentransfer gen-gen tertentu yang diinginkan ke dalam suatu sel inang. Gen ini nantinya yang akan menghasilkan suatu produk komersial seperti insulin. Isolasi DNA plasmid dapat dilakukan dengan sentrifugasi dan presipitasi. Proses ini dilakukan dengan cara memecah dan mengekstraksi jaringan-jaringan hingga membentuk ekstrak sel yang terdiri dari sel-sel jaringan, DNA, dan RNA. Ekstrak sel kemudian dilakukan pemurnian (purifikasi) sehingga dihasilkan pellet sel yang mengandung plasmid. Isolasi DNA bertujuan untuk memperoleh DNA yang murni terbebas dari bahanbahan lainnya seperti protein, lemak, dan karbohidrat. Isolasi DNA memiliki ketelitian yang cukup tinggi sehingga harus dilakukan secara hati-hati. DNA yang akan diisolasi adalah DNA plasmid untuk kemudian dianalisis dengan elektroforesis sel agarosa.



Isolasi dari bakteri E. coli pada praktikum kali ini dilakukan dengan menggunakan cara alkalin lisis. Metode alkalin lisis merupakan suatu metode yang digunakan untuk mengisolasi DNA plasmid yang ada dalam sel bakteri E. coli. Isolasi tersebut dilakukan melalui proses lisis pada membran sel dengan menggunakan Sodium Dedosil Sulfat pada suasana basa. Bakteri E. coli dibiakkan dalam media LB yang sudah ditambahkan kanamisin, kemudian diinkubasi selama ±16 jam pada 37oC dengan kecepatan 150 rpm, dimana tahap ini sudah dilakukan oleh asisten sehingga praktikan melanjutkan tahap berikutnya. Tahap isolasi plasmid berikutnya yaitu diambil 5 ml suspensi sel dan dilakukan sentrifuse 10000 rpm pada suhu 4oC selama 2 menit. Sentrifuse ini bertujuan untuk memisahkan material selular (DNA) dengan cairan yang terdapat dalam sel dan juga media LB sehingga semua material penyusun sel berada dalam pellet. Hasil dari sentrifuse yaitu supernatan dan pellet. Supernatan merupakan substansi hasil sentrifugasi yang memiliki berat jenis yang lebih kecil. Pellet adalah adalah substansi hasil sentrifugasi yang memiliki berat jenis yang lebih besar. Posisi supernatan berada pada lapisan atas dengan warna yang lebih jernih dan pellet berada pada bagian bawah dengan warna yang lebih keruh berupa endapan. Sel dari bakteri Escherichia coli akan berada pada pellet sehingga supernatan harus dipisahkan dan dibuang melalui proses sentrifugasi. Prinsip utama sentrifugasi adalah pemisahan substansi berdasarkan berat jenis molekul dengan cara memberikan gaya sentrifugal sehingga substansi yang lebih berat akan berada di dasar, sedangkan substansi yang lebih ringan akan terletak di atas. Hasil pelletnya diambil dan supernatannya disimpan. Tahap pertama yang dilakukan yaitu pelet disuspensi dengan menggunakan larutan I (campuran dari glukosa 50 mM, Tris-Cl 2.5 mM pH 8, Na-EDTA 10 mM pH 8 sebanyak 100 mL) sebanyak 100 µL dan dihomogenkan lalu didiamkan 5 menit. Penambahan ini berfungsi untuk melarutkan pellet. Pendiaman ini dilakukan dengan tujuan agar reaksi berjalan dengan sempurna, sehingga pellet benar-benar telah larut.Glukosa dapat berperan sebagai buffer yang dapat mempertahankan pH. Larutan EDTA dapat menghambat DNAse. Enzim DNAse merupakan enzim yang dapat mendenaturasi DNA. Larutan EDTA dalam larutan



buffer berperan sebagai agen pengkelat yang digunakan untuk mengikat ion logam Ca2+ dan Mg2+. Logam ini merupakan kofaktor dari DNAse. Kofaktor tersebut akan berikatan dengan EDTA membentuk kompleks. Kofaktor yang berinteraksi dengan EDTA dalam buffer akan mengganggu kerja DNAase. Keberadaan enzim DNAase sangat merugikan karena akan mengganggu proses isolasi DNA pET-endo. Hal tersebut akan memberikan kemungkinan yang sangat kecil untuk terjadinya degradasi pada DNA yang akan diisolasi pada praktikum kali ini. Tris-HCl berfungsi untuk menjaga pH larutan.Pellet dilarutkan atau dihomogenkan dengan cara dikocok kemudian diketuk-ketuk selanjutnya didiamkan agar reaksi atau proses isolasi dapat berlangsung dengan sempurna. Pellet yang telah tersuspensi kemudian ditambahkan larutan II(NaOH 0,2 M, SDS 1%, ddH2O steril) sebanyak 200 µL dan dihomogenkan dengan cara membolak-balik tabung Eppendorf. Penambahan ini dapat digunakan untuk melisiskan dinding sel. SDS dapat merusak membran sel bakteri. Membran sel yang akan dilisis yaitu pada bagian fosfolipid (lemak) dan protein. Komponen penyusun sel akan keluar dari dalam sel ketika membrane sel telah mengalami kerusakan. Penambahan NaOH pada larutan II berfungsi untuk membuat sistem dalam kondisi basa pada kisaran pH 12,0-12,5. Hal ini dikarenakan dengan adanya perubahan pH akan menyebabkan proses denaturasi pada DNA kromosom dan pET-endo dalam sel bakteri E. coli TOP10. Ikatan hidrogen yang ada pada DNA kromosom maupun pET-endo akan terputus dalam suasan pH tersebut. Hal tersebut akan membuat rantai double helix pada DNA akan terbuka dan membentuk single helix. Campuran kemudian dihomogenkan dan diinkubasi selama 15 menit. Inkubasi pada proes tersebut berfungsi untuk melihat pertumbuhan atau perkembangbiakan pada mikroorganisme. pET-endo yang mengalami denaturasi harus direnaturasi karena pET-endo merupakan produk yang akan diisolasi. Proses renaturasi pET-endo dilakukan dengan penambahan larutan III yang terdiri atas kalium asetat, asam asetat glasial, dan ddH2O dingin lalu diinkubasi dalam es selama 10 menit. Penambahan larutan III untuk mempertahankan agar pH DNA plasmid tidak rusak. Kondisi larutan yang awalnya basa kemudian berubah menjadi kondisi netral. Kalium asetat dapat



membantu terjadinya renaturasi plasmid dan mengendapnya single strand DNA karena molekulnya yang besar dan tidak dapat larut dalam larutan dengan kadar garam yang tinggi, kemudian diinkubasi selama 10 menit. Proses renaturasi pada pET-endo berlangsung secara sempurna. Hal ini dikarenakan struktur pET-endo yang merupakan DNA plasmid adalah sirkular. Proses pemisahan pET-endo dapat dilakukan dengan cara sentrifuse. Proses sentrifugasi dilakukan kembali dengan 12000 rpm setelah penambahan larutan III. Hasil yang diperoleh yaitu larutan membentuk 2 fase dimana pada bagian atas (supernatan) dan bawah berupa larutan tidak berwarna (pellet) dan bagian tengan berupa lapisan tipis emulsi. Pemisahan ini dapat terjadi karena adanya perbedaan berat molekul yang signifikan diantara keduanya. Hasil pelletnya disimpan dan supernatannya diambil. Supernatan yang diperoleh tidak berwarna. Hal tersebut menunjukkan bahwa telah terjadi pengendapan secara sempurna sehingga tidak mencemari supernatan. Perlakuaan ini dilakukan pada suhu 4°C karena pada suhu ini proses pemisahan atau proses reaksi berlangsung dengan sempurna. Supernatan dipindahkan secara perlahan dengan menggunakan pipet kedalam tabung Eppendorf baru yang steril dan ditambahkan campuran fenol : kloroform : isoamilalkohol (25:24:1) sebanyak 1 kali volume total. Penambahan ini bertujuan untuk menghilangkan protein dan pengotor-pengotor lain dalam larutan. Pelarut organik akan mengikat, menarik, dan mempresipitasi protein sehingga fase air yang terpisah akan mengandung DNA. Campuran kemudian dikocok sampai terbentuk emulsi kemudian disentrifugasi lagi 12.000 rpm 2 menit menghasilkan 3 lapis. Lapisan fasa paling bawah adalah fasa organik, fasa tengah adalah suatu emulsi putih dan fasa paling atas adalah fasa cair. Bagian atas merupakan supernatan, kemudian dipindahkan dengan cara mempipet secara hatihati dalam tabung eppendorf baru yang steril, kemudian dipekatkan dengan menambahkan etanol absolut dingin. Fungsi penambahan etanol absolut yaitu untuk untuk mengendapkan plasmid karena adanya perbedaan polaritas. Penambahan etanol absolut harus dilakukan pada keadaan dingin dengan tujuan agar banyak DNA plasmid yang mengendap.Prinsip pengendapan dengan menggunakan etanol absolut dingin, yaitu pada saat penambahan garam yaitu Na-



asetat yang berfungsi sebagai penetral muatan pada gula fosfat DNA, maka ionion seperti kation Na+ akan menyelimuti rantai DNA yang bermuatan negatif. Jika di dalam air, gaya elektrostatik antara ion positif (Na+) dan negatif (DNA) masih lemah karena sebagian rantai DNA masih berikatan dengan air. Air memiliki konstanta dielektrik yang tinggi, sehingga penambahan pelarut organik seperti etanol dapat menurunkan konstanta dielektrik tersebut atau memperbanyak ikatan DNA dengan Na+ sehingga membuat DNA lebih mudah terpresipitasi. Langkah yang terakhir adalah proses elektroforesis. Proses elektroforesis merupakan suatu meode yang digunakan untuk memisahkan, mengidentifikasi dan memurnikan fragmen DNA. Agarosa adalah fraksi yang berasal dari agar-agar dan merupakan polimer yang netral serta mengandung sedikit sulfat. Elektroforesis gel agarosa adalah metode pemisahan molekul DNA dan RNA yang didasarkan pada muatan, ukuran dan bentuk juga fungsi dari gel agarosa untuk memisahkan molekul yang berukuran lebih dari 100 bp (sebagai penyaring). Konsentrasi agarosa yang semakin tinggi akan menyebabkan ruang antar molekul pada gel lebih kecil sehingga mempersulit pergerakan molekul yang melewatinya. Penambahan EtBr berfungsi untuk mengikat molekul DNA dan dapat mengangkat sinar UV. Keberhasilan percobaan isolasi DNA ditunjukkan dari pendaran pita yang cukup jelas, namun pada percobaan yang kami lakukan tidak ditunjukkan adanya pendaran tersebut. Hasil yang terlihat adalah warna pendaran yang berwarna oranye yang menandakan terdapat RNA. Kesalahn ini terjadi karena kurang lamanya gel agarosa saat direndam dengan larutan buffer TAE.



BAB V. PENUTUP



5.1



Kesimpulan Kesimpulan dalam praktikum isolasi DNA plasmid yaitu :



1.



Isolasi DNA plasmid dapat dilakukan dengan penambahan beberapa reagen larutan. Larutan ini dapat digunakan untuk merusak (lisis) sel dan mengekstrak DNA dari dalam sel. DNA yang telah diisolasi kemudian diuji dengan menggunakan teknik elektroforesis gel agarosa dan selanjutnya diamati dengan sinar UV, dimana menunjukkan DNA plasmid yang dihasilkan buram atau tidak terlihat jelas.



2.



Berat molekul DNA plasmid yang diisolasi tidak dapat diuji karena proses isolasi tidak berhasil mendapatkan DNA plasmid.



5.2



Saran Saran untuk praktikum isolasi DNA plasmid adalah praktikan harus lebih



disiplin selama melakukan percobaan di laboratorium dan pada saat proses elektroforesis jangan menggerak-gerakkan alat karena dapat mempengaruhi proses elekroforesis. Proses elektroforesis sebaiknya dilakukan dengan terus menerus tanpa adanya jeda. Praktikan juga harus memastikan proses pemisahan saat tiga fase terbentuk terpisah secara maksimal agar sampel yang dihasilkan lebih murni dan dapat dilakukan elektroforesis secara maksimal sehingga DNA dapat terlihat sehingga dapat menentukan berat molekulnya. Praktikan harus mengusai materi dan prosedur kerja dengan baik untuk mendapatkan hasil praktikum yang sesuai dan baik serta dapat meminimalisir terjadinya keasalah. Praktikan harus menggunakan lab safety use dan memperhatikan SOP untuk menghindari kesalahan dan kecelakaan kerja serta untuk mendapatkan data yang benar.



DAFTAR PUSTAKA



Campbell, Jane B. Reece & Lawrence G. Mitchell. 2004. Biology- 10th I'd. USA:Pearson Eduaction Inc. Cooper. 2000. The Tools of Biochemistry. USA: John Wiley and Sons. Glick, B.R. and J.J. Pasternak. 2005. Molekuler Biotechnology, Principles and applications of Recombinan DNA. Washinton D.C : ASM Press. Goodenough.1988. Understanding DNA. Amsterdam: Academic Press. Jack, R.C. 1995. Basic Biochemical Laboratory and Computing. New York: Oxford University Press. Kusuma, S.R.F. 2010. PCR. Makalah Fak. Farmasi. Bandung: Universitas Padjadjaran. Lehninger. 1982. Dasar-Dasar Biokimia Edisi pertama. Jakarta: Erlangga. Muladno. 2002. Teknik Rekayasa Genetika. Bogor: Pustaka Wirausaha Muda. Sambrook J., E. F. Fritcs and Manicitis, T. 1989. Molecular Kloning: A Laboratory Manual. 2nd Edition. Old spring Harbor Laboratory Press. USA. Standfield W.D., Jaime S.C., Raul J.C. 2006. Schaum’s Easy Outline Biologi Molekuler dan sel. Penerjemah: Varian Fahmi, terjemahan dari: Schaum’s Easy Outline Molecular and Cell Biology. Jakarta: Erlangga. Suharsono dan Widyastuti, U. 2006. Penuntun Praktikum Pelatihan Teknik Pengklonan Gen. Pusat Penelitian Sumber Daya Hayati dan Bioteknologi, IPB. Suryo, 2004. Genetika Manusia.Yogyakarta: Gadjah Mada University Press. Surzycki, S.J. 2000. Basic Techniques in Molecular Biology. Springer-Verlag Publisher ISBN 3-540-66678-8. Wibowo, M. S. 2010. Elektroforesis. Bandung: Institut Teknologi Bandung.