Ponco Isolasi DNA [PDF]

Citation preview

LAPORAN PRAKTIKUM BIOTEKNOLOGI “Isolasi DNA“



Nama



: Fildza Abidah



NIM



: 135040200111102



Kelompok



: B-1 (Selasa, 15.05)



Asisten



: Dian Khairatun R.S



PROGRAM STUDI AGROEKOTEKNOLOGI FAKULTAS PERTANIAN UNIVERSITAS BRAWIJAYA MALANG 2014



BAB I PENDAHULUAN 1.1 Latar Belakang Deoxyribonucleic acid atau DNA merupakan senyawa kimia yang paling penting dalam makhluk hidup. DNA merupakan senyawa yang mengandung informasi genetik makhluk hidup dari satu generasi ke generasi selanjutnya. Keseluruhan DNA dalam suatu sel akan membentuk genom. Genom meliputi bagian gen yang fungsional maupun nonfungsional dalam sel organisme. DNA genom meliputi gen dan intergen. DNA adalah asam nukleat yang mengandung materi genetik dan berfungsi untuk mengatur perkembangan biologis seluruh bentuk kehidupan secara seluler. DNA terdapat pada nukleus, mitikondria, dan kloroplas. Perbedaan ketiganya adalah DNA nukleus berbentuk linier dan berasosiasi sangat erat dengan protein histon, sedangkan DNA mitokondria dan kloroplas berbentuk sirkular dan tidak berasosiasi dengan protein histon. Selain itu DNA mitokondria dan kloroplas memiliki ciri khas, yaitu hanya mewariskan sifat-sifat yang berasal dari garis ibu. Sedangkan DNA nukleus memiliki pola pewarisan sifat dari kedua orangtua. Dilihat dari organismenya, struktur DNA prokariot tidak memiliki protein histon dan berbentuk sirkular, sedangkan DNA eukariot berbentuk linier dan memiliki protein histon. Isolasi DNA merupakan langkah mempelajari DNA. Salah satu prinsipisolasi DNA yaitu dengan sentrifugasi. Sentrifugasi merupakan teknik untuk memisahkan campuran berdasarkan berat molekul komponennya. Molekul yang mempunyai berat molekul besar akan berada di bagian bawah tabung dan molekul ringan akan berada pada bagian atas tabung. Hasil sentrifugasi akan menunjukkan dua macam fraksi yang



terpisah, yaitu supernatan pada bagian atas dan pelet pada bagian bawah. 1.2 Tujuan  Mengetahui definisi isolasi DNA  Mengetahui macam metode isolasi DNA  Mengetahui tahapan isolasi DNA  Mengetahui manfaat isolasi DNA 1.3 Manfaat  Dapat memahami definisi isolasi DNA  Dapat memahami macam metode isolasi DNA  Dapat memahami tahapan isolasi DNA  Dapat memahami manfaat isolasi DNA



BAB II



TINJAUAN PUSTAKA 2.1 Definisi isolasi DNA Isolasi DNA adalah memisahkan DNA kromosom atau DNA genom dari komponen-komponen sel lain. Sumber DNA bisa dari tanaman, kultur mikroorganise, atau sel manusia. (Yuwono, 2008). Isolasi DNA merupakan proses untuk mendapatkan DNA murni dari makhluk hidup untuk keperluan bioteknologi. Secara spesifik untuk mengisolasi DNA yang mencangkup gen tertentu dapat dilakukan dengan beberapa teknik (Yuwono, 2008). Isolation of DNA is a process to get pure DNA that can be used for the purposes of examination or diagnosis (Isolasi dna merupakan suatu proses untuk menda-patkan DNA murni yang dapat digunakan untuk ke-perluan pemeriksaan atau diagnosa) (Steven, 2007). 2.2 Macam-macam metode isolasi DNA Teknik atau metode yang dikemukakan oleh Sambrook (1989). Isolasi DNA dari sel maupun jaringan eukariotik, misalnya dari jaringan tumbuhan maupun hewan dilakukan melalui tahap penghancuran sel (lisis), penghilangan RNA dan protein serta pemurnian DNA. isolasi DNA ini membutuhkan alat-alat canggih dan bahan-bahan yang cukup mahal, misalnya EDTA ( Etilendiamin tetra asetat ) yang berfungsi sebagai merusak sel dengan cara mengikat ion Magnesium yang berfungsi mempertahankan integritas sel, SDS ( Sodium dodesil sulfat ) yang dapat melarutkan membrane sel, mendenaturasi protein, enzim proteinase K yang mendegradasi protein, RNAse mendegradasi RNA serta NaCl dan chloroform untuk memurnikan DNA. Modifikasi teknik isolasi DNA telah dilakukan pada beberapa laboratorium, misalnya pada takaran bahan-bahan



yang digunakan atau penguraian/ penggantian jenis bahan yang digunakan sesuai denga sel/ jaringan sumber DNA. Teknik/ metode isolasi DNA yang sangat sederhana adalah metode Kitchen Preparation. Metode isolasi ini memanfaatkan bahan-bahan yang biasanya digunakan ibu rumah tangga yaitu sabun cuci (cair, bubuk atau krim) untuk menggantikan bahan utama yang berfungsi untuk melisis sel, ekstrak buah nanas sebagai sumber enzim protease serta garam dapur. Isolasi DNA metode Kitchen Preparation menggunakan detergen sebagai alternative pengganti EDTA dan SDS, garam dapur sebagai pengganti NaCl analitik dan jus nanas sebagai pengganti enzim protease. Sedangkan bahan yang akan dilihat DNA nya adalah strowberi, hal ini dikarenakan strowberi mudah dihancurkan. Selain itu, strowberi matang menghasilkan enzim pectinase dan selulase yang membantu memecah dinding sel. Strowberi yang umum dibudidayakan adalah octoploid dengan delapan set genom. Hal ini sangat baik untuk menunjukkan ekstraksi DNA karena memiliki delapan dari setiap jenis kromosom yang juga dikatakan bahwa strowberi memiliki DNA yang berlimpah. (smbrook, 1989). 2.3Tahap isolasi DNA Tahap pertama dalam isolasi DNA adalah proses perusakan atau penghancuran membran dan dinding sel. Pemecahan sel (lisis) merupakan tahapan dari awal isolasi DNA yang bertujuan untuk mengeluarkan isi sel (Holme dan Hazel, 1998). Tahap penghancuran sel atau jaringan memiliki beberapa cara yakni dengan cara fisik seperti menggerus sampel dengan menggunakan mortar dan pestle dalam nitrogen cair atau dengan menggunakan metode freezingthawing dan iradiasi (Giacomazzi et al., 2005). Cara lain yakni dengan menggunakan kimiawi maupun enzimatik.



Penghancuran dengan menggunakan kimiawi seperti penggunaan detergen yang dapat melarutkan lipid pada membran sel sehingga terjadi destabilisasi membran sel (Surzycki, 2000). Sementara cara enzimatik seperti menggunakan proteinase K seperti untuk melisiskan membran pada sel darah (Khosravinia et al., 2007) serta mendegradasi protein globular maupun rantai polipeptida dalam komponen sel (Brown, 2010; Surzycki (2000). Tahap kedua: menggunakan cetyl trimethylammonium bromide (CTAB) untuk melisiskan membran sel pada isolasi DNA tumbuhan (Bettelheim dan Landesberg, 2007). Parameter keberhasilan dalam penggunaan CTAB bergantung pada beberapa hal. Pertama, Konsentrasi NaCl harus di atas 1.0 M untuk mencegah terbentuknya kompleks CTAB-DNA. Karena jumlah air dalam pelet sel sulit diprediksi, maka penggunaan CTAB sebagai pemecah larutan harus dengan NaCl dengan konsentrasi minimal 1.4 M. Kedua, ekstrak dan larutan sel yang mengandung CTAB harus disimpan pada suhu ruang karena kompleks CTAB-DNA bersifat insolublepada suhu di bawah 15°C. Ketiga, penggunaan CTAB dengan kemurnian yang baik akan menentukan kemurnian DNA yang didapatkan dan dengan sedikit sekali kontaminasi polisakarida. Dalam penggunaan buffer CTAB seringkali ditambahkan reagen-reagen lain seperti NaCl, EDTA, TrisHCl, dan 2-mercaptoethanol. NaCl berfungsi untuk menghilangkan polisakarida sementara 2-mercaptoethanol befungsi untuk menghilangkan kandungan senyawa polifenol dalam sel tumbuhan (Ranjan et al., 2010). 2-mercaptoethanol dapat menghilangkan polifenol dalam sel tanaman dengan cara membentuk ikatan hidrogen dengan senyawa polifenol yang kemudian akan terpisah dengan DNA (Lodhi et al., 1994). Tahap ketiga : ekstraksi DNA, seringkali menggunakan chelating agent seperti ethylenediamine tetraacetic acid



(EDTA) yang berperan menginaktivasi enzim DNase yang dapat mendenaturasi DNA yang diisolasi, EDTA menginaktivasi enzim nuklease dengan cara mengikat ion magnesium dan kalsium yang dibutuhkan sebagai kofaktor enzim DNAse (Corkill dan Rapley, 2008). DNA yang telah diekstraksi dari dalam sel selanjutnya perlu dipisahkan dari kontaminan komponen penyusun sel lainnya seperti polisakarida dan protein agar DNA yang didapatkan memiliki kemurnian yang tinggi. Fenol seringkali digunakan sebagai pendenaturasi protein. Bettelheim dan Landesberg (2007) menyebutkan bahwa setelah sentrifugasi akan terbentuk 2 fase yang terpisah yakni fase organik pada lapisan bawah dan fase aquoeus (air) pada lapisan atas sedangkan DNA dan RNA akan berada pada fase aquoeus setelah sentrifugasi sedangkan protein yang terdenaturasi akan berada pada interfase dan lipid akan berada pada fase organik. Biasanya pelarut organik yang digunakan adalah fenol atau kloroform yang mengandung 4% isoamil alkohol. Setelah proses ekstraksi, DNA yang didapat dapat dipekatkan melalui presipitasi. Pada umumnya digunakan etanol atau isopropanol dalam tahapan presipitasi. Kedua senyawa tersebut akan mempresipitasi DNA pada fase aquoeus sehingga DNA menggumpal membentuk struktur fiber dan terbentuk pellet setelah dilakukan sentrifugasi (Switzer, 1999).Hoelzel (1992) juga menambahkan bahwa presipitasi juga berfungsi untuk menghilangkan residu-residu kloroform yang berasal dari tahapan ekstraksi. Menurut Surzycki (2000), prinsip-prinsip presipitasi antara lain pertama, menurunkan kelarutan asam nukleat dalam air. Hal ini dikarenakan molekul air yang polar mengelilingi molekul DNA di larutan aquoeus. Muatan dipole positif dari air berinteraksi dengan muatan negatif pada gugus fosfodiester DNA. Interaksi ini meningkatkan kelarutan DNA dalam air. Isopropanol dapat



bercampur dengan air, namun kurang polar dibandingkan air. Molekul isopropanol tidak dapat berinteraksi dengan gugus polar dari asam nukleat sehingga isopropanol adalah pelarut yang lemah bagi asam nukleat; kedua, penambahan isopropanol akan menghilangkan molekul air dalam larutan DNA sehingga DNA akan terpresipitasi; ketiga, penggunaan isopropanol dingin akan menurunkan aktivitas molekul air sehingga memudahkan presipitasi DNA. Pada tahapan presipitasi ini, DNA yang terpresipitasi akan terpisah dari residu-residu RNA dan protein yang masih tersisa. (Mangoendidjojo, 2003) 2.4 Manfaat isolasi DNA  Visualisasi DNA dengan elektroforesis gel.  Peninjauan pola fragmen DNA hasil pemotongan secara enzimatik melalui teknik Hibridisasi Southern  Isolasi DNA genomik dalam rangka pembuatan pustaka genomik.  Isolasi plasmid atau DNA fage dalam prosedur rutin peminakan DNA  Isolasi DNA yang diperlukan sebagai cetakan (template) dalam prosedur perbanyakan DNA secara in vitro melalui teknik PCR (Yuwono, 2008)



BAB III METODOLOGI 3.1 Alat dan Bahan



a. Alat  Gunting: untuk memotong bahan  Mortar dan pistil : untuk menghaluskan daun  Tube: sebagai tempat isolasi  Micro pipet : untuk mengambil larutan  Spatula: untuk mengaduk larutan  Erlenmeyer: untuk tempat larutan  Timbangan analitik : untuk menimbang bahan  Microwave : untuk memanaskan  Oven : untuk memanaskan  Vortex : untuk menghomogenkan bahan  Stirer : untuk mengaduk  Centrifuge : untuk memisahkan berdasarkan ukuran partikel  Autoclave : untuk mensterilkan bahan  Lemari es :Memperjelas DNA b. Bahan  Daun Kacang tanah : sebagai bahan yang akan diamati  Daun Jagung : sebagai bahan yang akan diamati  Campuran buffer ekstrasi:  CTAB : untuk melisis membrane sel  Mercaptoethanol: menghilangkan kontaminan  Nitrogen cair: untuk menghindari browning  PVP: untuk menghilangkan fenol  Chisam : untuk memisahkan DNA dengan fase organik lain 3.1 Cara Kerja Mempersiapkan alat dan bahan



Campur buffer ekstrasi dengan larutan karbon dan



mercaptoethanol 4µL



Timbang daun 0,1 gr dan digerus dalam mortar, tambahkan Nitrogen cair dan PVP



Masukkan ke dalam tube 1,5 mL



Vortex tube, inkubasi dalam oven 65oC (10 menit) lalu didinginkan



Sentrifuge dengan kecepatan 10000 rpm selama 5 menit



Ambil supernatant, pindahkan ke tube (2mL) baru



Tambahkan 500 µL Chisam lalu Vortex selama 5 detik



Sentrifuge dengan 10000 rpm selama 5 menit



Pindahkan supernatan, tambahkan 300 µL isopropanol dingin



Bolak-balikkan tube secara perlahan lalu inkubasi dalam



frezer selama 15 menit



Sentrifuge kembali dengan 8000 rpm selama 5 menit



Buang supernatant, tambahkan buffer pencuci 500 µL lalu Vortex



Sentrifuge kembali dengan 9000rpm selama 5 menit



Buang supernatant lalu keringkan selama 10 menit



Tambahkan buffer TE 50 µL



Larutkan pellet DNA dengan mengetuk tube perlaha 



Dokumentasi



3.2 Analisa perlakuan Pada praktikum isolasi DNA ini menggunakan daun kacang tanah dan daun. Daun ditimbang seberat 0,1 gr lalu diberi PVP dan N2 cair lalu digerus dengan mortar secara perlahan namun lama kelamaan semakin cepat. Masukkan ke dalam tube lalu Vortex tube, inkubasi dalam oven 65 oC selama 10 menit lalu didinginkan, sentrifuge selama 5 menit dengan 10000 rpm. Pada sentrifuge terdapat tiga perlakuan, yaitu 10000 rpm, 8000 rpm dan 9000 rpm. Setelah di sentrifuge supernatant diambil dengan mikro pipet lalu dipindahkan ke tube yang baru, diberikan 500 µL Chisam lalu diulangi perlakuan Vortex dan sentrifuge. Supernatant diambil lagi dan dipindahkan pada tube yang baru dengan ditambahkan 300 µL Isopropanol dingin, kemudian tube di bolak-balikkan dengan perlahan lalu di inkubasi pada lemari pendingin selama 15 menit, perlakuan sentrifuge dilakukan kembali dengan 8000 rpm selama 5 menit, kemudian supernatant dibuang lalu ditambahkan buffer pencuci 500 µL lalu kembali di Vortex. Perlakuan Vortex kembali diulangi dengan 9000 rpm selama 5 menit, supernatant dibuang dan kemudian ditambahkan buffer TE 50 µL, lalu tube diketuk perlahan utnuk melarutkan pellet DNA.



BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN 4.1 Hasil (DNA terlihat/tidak + dokumentasi hasil) Daun



DNA



Jagung



Terlihat, tetapi tidak jelas



Dokumentasi



Kacang Tanah



Terlihat, tetapi tidak jelas



4.2 Pembahasan Pada praktikum isolasi DNA, hasil isolasi DNA berhasil namun tidak begitu jelas. Menurut Masniawati (2000) berdasarkan penilitian Pratama (2009) memperlihatkan hasil ekstraksi DNA yang kurang optimal baik kualitas maupun kuantitas DNA yang dihasilkan sehingga mempengaruhi intensitas pita DNA hasil amplifikasi yang tidak jelas. Menurut literatur (Syafaruddin, 2011) terdapat tiga faktor penentu dalam ekstraksi dan purifikasi DNA secara optimal yaitu : 1. Penghomogenan jaringan tanaman 2. Komposisi penambahan larutan buffer pada saat penggerusan daun/jaringan tanaman sampel 3. Penghilangan enzim penghambat polikasarida khususnya untuk tanaman tahunan. Mungkin faktor ini yang menjadikan DNA hasil praktikum rendah atau tidak terlihat jelas, hal yang paling mendasari DNA tidak terlihat jelas saat praktikum adalah komposisi penambahan larutan buffer pada saat penggerusan daun jaringan tanaman sampel.



BAB V PENUTUP 5.1 Kesimpulan Pada praktikum isolasi DNA kali ini menggunakan metode isolasi CTAB. Hasil dari praktikum isolasi DNA berhasil namun hasilnya tidak terlalu jelas. Hal ini kemungkinan karena faktor komposisi penambahan buffer pada saat penggerusan daun/jaringan tanaman sampel. 5.2 Saran Untuk praktikum : Untuk praktikum selanjutnya agar lebih baik lagi, alat-alat semoga dapat ditambah agar semua praktikan dapat melakukan praktikum



Untuk asisten : Terima kasih telah berbagi ilmu dengan kami, semoga dapat bermanfaat bagi kita semua. Dan semoga asisten dapat ilmu yang lebih lagi.



DAFTAR PUSTAKA Hendaryono, D. P. S dan Wijayati, A., 2006. Teknik Kultur Jaringan. Kanisius. Jakarta. Jamilah. 2005. Pengaruh Berbagai Macam Detergen, Penambahan Enzim, dan Ekstrak Nanas (Ananas comusus (L) Merr) Terhadap Hasil Isolasi DNA Berbagai Macam Buah Sebagai Topik Praktikum Matakuliah Genetika. Skripsi tidak diterbitkan. Universitas Negeri Malang: Malang Mangoendidjojo, W. 2003. Dasar-Dasar Pemuliaan Tanaman. Kanisius : Yogyakarta Masniawati, A. 2000. Keragaman genetik kelapa dalam mapanget 32 (dmt-32), hasil penyerbukan sendiri berdasarkan penanda molekuler random amplified polymorphic DNA (RAPD). Tesis Pascasarjana. Bogor : Institusi Pertanian Bogor Steven, A. William. 2007. Biology Moleculery. Jones and Bartlett Publishers: America Smbrook J, E. F. Fritcs and Manicitis, T. 1989. Molecular Kloning: A Laboratory Manual. 2nd Edition. Old spring Harbor Laboratory Press. USA. Syafaruddin dan Tri Joko Santoso.2011.OptimasiI Teknik Isolasi dan Purifikasi DNA yang Efisien dan Efektif Pada Kemiri Sunan (Reutalistrisperma (Blanco) AiryShaw).JurnalLittri 17(1), Maret 2011.Hlm. 11 – 17. Yuwono. 2008. Peranan Bioteknologi di Bidang Pertanian. Kanisius : Yogyakarta