Laporan Praktikum Farmakokinetik Lod Loq [PDF]

Citation preview

LAPORAN PRAKTIKUM FARMAKOKINETIK PENGEMBANGAN METODE ANALISIS OBAT DALAM SAMPEL BIOLOGIS (Limit Of Detection, Limit Of Quantification, Linieritas)



Disusun Oleh: Nama



: Risma Niswatin Ulya



NPM



: 191FF04064



Kelas



: Matrikulasi FA-2



LABORATORIUM FARMAKOKINETIK FAKULTAS FARMASI PROGRAM STUDI MATRIKULASI FARMASI (S1)



2020



I.



Tujuan Melakukan validasi metode analisis sampel, penentian kalibrasi dengan spektrofotometri untuk memastikan bahwa metode tetap yang digunakan sudah sesuai dengan tujuan penggunaannya dan selalu memberikan hasil yang dapat dipercaya.



II.



Prinsip Mengembangakan metode analisis obat dalam sampel biologis.



III.



Dasar Teori Metode pengukurana obat dalam media biologis semakin penting untuk banyak kelompok sosial. Masalah-masalah yang berhubungan dengan bioavailabillitas, bioekivalensi, pengembangan obat baru, penyalahgunaan obat, farmakokinetik klinik dan penelitian obat yang sangat bergantung pada metode analisis (Smith, 1981). Untuk sebuah analisis obat dalam sampel biologis ada hal-hal yang penting dalam rangka penelitian farmakokinetika yang digunakan sebagai parameterparameter, antara lain: 1. Tetapan (laju) invasi atau tetapan absorpsi 2. Volume distribusi menghubungkan jumlah obat di dalam tubuh dengan konsentrasi obat (c) di dalam darah atau plasma 3. Ikatan permanen 4. Tetapan (laju) eliminasi dan waktu paruh dalam plasma (t1/2) 5. Klirens renal, ekstra renal dan total 6. Luas di bawah kurva dalam plasma (AUC), dan 7. Ketersediaan hayati



Metode



analisi



yang



umum



digunakan



dalam



penelitian



farmakokinetik adalah: 1. Metode



kimia,



contoh



:



HPLC



(High



Pressure



Liquid



Chromatography), GC (Gas Chromatography), GC-MS (Gas Chromatography Mass Spechtrofotometry), LC-MS (Liquid Chromatography Mass Spechtrofotometry). 2. Metode biologi, yang didasarkan pada prosedur immunoassay, RIA (Radio Immunoassay), eenzim-linked immunosorbien assay (ELISA) dan metode mikrobiologi. Pengembangan metode analisis meliputi evaluasi dan optimasi berbagai tahapan,seperti penyiapan sampel, pemisahan analit (obat yang diteliti), deteksi, dan kuantifikasi. Validasi metode menurut United State Pharmacopeia (USP), dilakukan dengan menjamin bahwa metode analisis yang digunakan adalah akurat, spesifik, reproduksible, dan tahan pada kisaran analit yang aka dianalisis. Suatu metode analisis harus divalidasi untuk melakukan verifikasi bahwa parameter-parameter kinerjanya cukup mampu untuk mengatasi masalah analisis (Gandjar, 2007). Beberapa parameter digunakan untuk mengevaluasi validitas dan metode yang dikembangkan, antara lain: perolehan kembali (recovery) obat dari matriks biologi yang digunakan, presisi dan akurasi, persyaratan yang dituntut untuk suatu metode tersebut agar dapat memberikan nilai perolehan kembali yang tinggi (75-90%), kesalahan acak dan kesalahan sistematik kurang dari 10%, kepekaan dan selektivitas peralatan merupakan kriteria lain yang penting.



Rumus: kadar terukur x 100 % kadar diketahui



 Perolehan kembali



=



 Kesalahan sistematik



= 100 – P%



 Kesalahan acak



=



simpangan baku x 100 % hargarata−rata



Tahapan metode validasi menurut USP: 1. Presisi, merupakan ukuran keterulangan metode analisis dan biasanya diekspresikan sebagai simpangan baku relative dari sejumlah sampel yang berbeda signifikan secara statistic, presisi harus dilakukan pada 3 tingkatan yaitu: repeatability; intermediate precision dan reproducibility (RSD = 1-2%). 2. Akurasi,



merupakan



pengujian



senyawa



ketelitian obat



metode



akurasi



analisis.



diperoleh



Untuk dengan



membandingkan hasil pengukuran dengan rujukan standar (standard reference material, SDM). 3. Spesifisitas, kemampuan mengukur analit yang dituju secara tepat dan spesifik dengan adanya komponen-komponen lain dalam matriks



sampel seperti



ketidakmurnian,



produk



degradasi dan komponen matriks. 4. Batas deteksi (Limit of detection, LOD). Btas deteksi didefinisikan sebagai konsentrasi analit terendah dalam sampel yang masih dapat dideteksi. LOD dapat dihitung berdasarkan



pada



standar



deviasi



(SD)



respond



dan



kemiringan (slope,s) kurva baku pada level mendekati LOD sesuai dengan rumus, LOD = 3(SD/S). Selain itu ada 2 metode lain, yaitu: metode non-instrumental visual digunakan dengan



metode perhitungan. Metode non-instrumental digunakan pada teknik kromatografi lapis tipis pada metode titrimetric. 5. Batas kuantifikasi (Limit of quantification, LOQ). Batas kuantifikasi didefinisikan sebagai konsentasi analit terendah dalam sampel yang dapat ditentukan dengan presisi dan akurasi yang dapat diterima pada kondisi operasional metode



yang



digunakan.



Dua



metode



pilihan



untuk



menentukan LOQ yaitu: a. Metode non-instrumental visual b. Metode perhitungan yang didasarkan pada standar deviasi respon; LOQ = 10 (SD/S) 6. Linieritas Linieritas merupakan kemampuan suatu metode untuk memperoleh hasil-hasil uji yang secara langsung proporsional dengan konsentrasi analit pada kisaran yang diberikan 7. Kisaran (Range) 8. Kekasaran (Ruggedness) 9. Ketahanan (Robutness) 10. Stabilitas 11. Keseuaian system IV.



Tugas Pendahuluan 1. Tuliskan pembuatan dapah fosfat pH 7,4 dan perhitungannya Jawab: a. Pembuatan dapar fosfat pH 7,4 dibuat dengan mencampur 50 ml KH2PO4 0,2 M dengan 39,1 ml NaOH 0,2 N, diencerkan dengan air bebas karbondioksida P secukupnya hingga 200 mL



b. Perhitungan -



-



V. KH2PO4 =



500 ml × 50 ml = 12,5 ml 200 ml



M KH2PO4 =



gr 1000 × Mr V



0,2



=



gr 1000 × 136,09 12 ,5



gr



=



0,2× 136,09× 12, 5 1000



gr



= 0,3402 gram KH2PO4 0,2 M



V. NaOH



=



500 ml × 39,1ml = 97,75 ml 200 ml



M NaOH



=



gr 1000 × Mr V



0,2 N



=



gr 1000 × 40 97,75



gr



=



0,2× 40 × 97,75 1000



gr



= 0,782 gram NaOH 0,2 N



2. Jelaskan perhitungan dan pembuatan larutan induk paracetamol 1000 bpj sebanyak 100 mL! Jawab : 1000 bpj



= 1000 ppm = 1000 µg/ml = 1000 µg/ml x 100 ml/ 100 ml = 100000 µg / 100 ml = 100 mg dalam 100 ml



⁘ dimasukkan 100 mg paracetamol, ad 100 ml. 3. Jelaskan perhitungan 1 seri set pengenceran larutan induk dengan konsentrasi 2,4,6,10, dan 12 ppm sebanyak 50 ml! Jawab :



V.



-



100 ppm V2.N2 50 mL. 100 ppm 5 ml dalam labu ukur 50 ml



-



V1.N1 = V1.1000 ppm = V1 = 2 ppm = = =



V2.N2 50 mL. 2 ppm 1 ml dalam labu ukur 50 ml



-



V1.N1 V1.100 ppm V1 4 ppm



= = =



V2.N2 50 mL. 4 ppm 2 ml dalam labu ukur 50 ml



-



V1.N1 V1.100 ppm V1 6 ppm



= = =



V2.N2 50 mL.6 ppm 3 ml dalam labu ukur 50 ml



-



V1.N1 V1.100 ppm V1 10 ppm



= = =



V2.N2 50 mL.10 ppm 5 ml dalam labu ukur 50 ml



-



V1.N1 V1.100 ppm V1 12 ppm V1.N1 V1.100 ppm V1



= = =



V2.N2 50 mL.12 ppm 6 ml dalam labu ukur 50 ml



Alat dan Bahan



Alat : 1. Mikropipet 500u 2. Sentrifugas 3. Tabung sentrifuga 4. Vortex 5. HPLC 6. Spektrofotometer UV-Vis Bahan: 1. Plasma 2. Asetonitri atau methanol 3. Diklorometan 4. Etil asetat 5. Eluen 6. Triklorasetat (TCA) 7. Hydrogen chloride (HCl) 8. NaNO2 9. Asam sulfamat 10. NaOH 11. Es batu



VI.



Prosedur Kerja



a. Pembuatan Larutan Baku Dapar Phosphat pH 7,4 Kalibrasi wadah 2L dan hitung jumlah volume larutan KH2PO4 dan NaOH yang diperlukan Hitung penimbangannya



0,3402 g KH2PO4 dilarutkan dengan aquadest



0,782 g NaOH dilarutkan dengan aquadest



Campurkan, lalu tambahkan aquadest sebelum batas



Ukur pH hingga ± 7,4 ± 0,05 Tambahkan aquadest sampai tanda batas, kocok. b. Pembuatan Kurva Kalibrasi Sampel Simulasi Buat larutan induk PCT 1000 bpj sebanyak 50 mL Pengenceran larutan induk PCT 1 mL sebanyak 10 mL (menjadi 100 ppm)



2 ppm



4 ppm



6 ppm



10 ppm



Tambahkan dapar fosfat pH 7,4 mL @10 mL



12 ppm



Ukur A dengan λ 243 nm dengan spektrofotometer UV-Vis c. Pembuatan Kurva Kalibrasi Paracetamol 2 Buat larutan induk PCT 1000 bpj sebanyak 50 mL



20 ppm



40 ppm



60 ppm



100ppm



120 ppm



Tambahkan dapar fosfat pH 7,4 mL @10 mL Ambil 1 mL , masukkan ke dalam tabung reaksi



Ukur A dengan λ max 435 nm dengan Spektrofotometer UV – Vis d. Pembuatan pereaksi warna: -



Tambahkan 0,5 mL HCl 6 N



-



Tambahkan 1,0 mL NaNO3 10%, vortex selama 1 menit, diamkan selama 5 menut



-



Tambahkan 1 mL asam amidosulfonat 15%



-



Tambahkan 2,5 mL NaOH 10%, diamkan selama 3 menit di dalam es batu



VII.



Hasil Pengamatan



a. Absorbansi Paracetamol λ 243 nm Konsentrasi(bpj) (x) 2 4 6 8 10 12



Absorban (y) 0,098 0,255 0,323 0,506 0,558 0,724



y' 0,1091 0,2297 0,3503 0,4709 0,5915 0,7121



y-y' -0,0111 0,0253 -0,0273 0,0351 -0,0335 0,0119 Ʃ SD



y = bx + a y = 0,0603 x 0,0115 r = 0,9845



LOD LOQ



(y-y')^2 0,0001232 0,0006401 0,0007453 0,001232 0,0011223 0,0001416 0,0040045 0,0283 1,4079 4,6932



b. Absorbansi Parasetamol λ 435 nm Konsentrasi(bpj) (x) 20 40 60 80 100 120 y = bx + a y = 0,0039 x 0,0164 r = 0,9931



VIII. Perhitungan



Absorban (y) 0,057 0,135 0,225 0,311 0,391 0,438



y' 0,0616 0,1396 0,2176 0,2956 0,3736 0,4516



y-y' -0,0046 -0,0046 0,0074 0,0154 0,0174 -0,0136 Ʃ SD LOD LOQ



(y-y')^2 0,00002116 0,0000212 0,0000548  0,00023716 0,00030276 0,00018496 0,000822 0,0128 9,8461 32,8205



1. Parasetamol λ 243 nm a. Simpangan baku SD



=



√



Ʃ ( y− y ' )2 n−1



=



√



0,00400 6−1



= 0,0283 b. Batas Deteksi (Limit Of Detection/LOD) LOD



=



3 × SD Slope(b)



=



3× 0,0283 0,0603



= 1,4079 c. Batas Kuantitasi (Limit of Quatification/LOQ) LOQ



=



10 × SD Slope(b)



=



10× 0,0283 0,0603



= 4,6932 2. Parasetamol λ 435 nm a. Simpangan baku SD



=



=



√



Ʃ ( y− y ' )2 n−1



√



0,0008220 6−1



= 0,0128 b. Batas Deteksi (Limit of Detection/LOD)



LOD



=



3 × SD Slope(b)



=



3× 0,0128 0,0039



= 9,8461 c. Batas Kuantitasi (Limit of Quatification/LOQ) LOQ



=



10 × SD Slope(b)



=



10× 0,0128 0,0039



= 32,8205 IX.



Pembahasan Pada praktikum kali ini dilakukan validasi metode analisis dengan parameter LOD, LOQ, Linieritas, akurasi dan presisi. Parameter LOD, LOQ dan linieritas ditentukan secara kuantitatif dengan melihat sejumlah analit terkecil dalam sampel. Parameter akurasi (ketepatan) dan presisi (ketelitian) ditentukan secara kuantitatif dengan melihat jumlah analit dalam sampel menggunakan spektrofotometer UV-Visible. Validasi metode menurut United State Of Pharmacopeia (USP) dilakukan untuk menjamin bahwa metode analisis yang digunakan adalah akurat, spesifik, reprodusible dan tahan pada kisaran analit yang akan dianalisis. Suatu metode analisis harus divalidasi untuk melakukan verifikasi bahwa parameter-parameter kinerjanya cukup mampu untuk mengatasi problem analisis (Gandjar, 2007). Praktikum kali ini dilakukan menggunakan sampel paracetamol. Langkah pertama yaitu dibuat larutan paracetamol 1000 bpj pada labu ukur 50 mL, lalu diencerkan hingga 100 bpj pada labu ukur 50 mL. setelah itu dibuat seri konsentrasi 2, 4, 6, 8, 10 dan 12 bpj. Kemudian



diukur absorbansinya di spektrofotometer UV-Vis pada panjang gelombang 243 nm. Selain seri konsentrasi tersebut, dibuat juga seri konesntrasi 20, 40, 60, 80, 100 dan 120 bpj dari larutan induk parasetamol 1000 bpj. Selanjutnya dilakukan reaksi warna dengan menambahkan 0,5 ml NaOH 6N dan 1 ml NaNO2 10%, lalu divortex selama satu menit dan didiamkan selama lima menit. Selanjutnya ditambahkan 1 ml asam amidasulfonat dan 2,5 ml NaOH, lalu didiamkan pada suhu dingin atau di dalam es batu selama 3 menit dan diukur absorbansinya pada panjang gelombang 435 nm. Digunakan panjang gelombang 435 nm karena larutan sampel yang digunakan berwarna. Nilai absorbansi yang didapat pada konsentrasi 2-12 bpj adalah 0,098; 0,255; 0,323; 0,506; 0,558; 0,724. Sedangkan untuk konsentrasi 20-120 bpj yaitu 0,057;0,135; 0,225; 0,311; 0,391; 0,438. Berdasarkan data yang diperoleh, konsentrasi 20 bpj – 120 bpj memiliki regresi linier yang lebih baik karena nilai r yang lebih mendekati 1 yaitu 0,9931. Sedangkan nilai r pada konsentrasi 2-12 bpj yaitu 0,9845. Data absorbansi yang didapat dihitung hingga didapatkan nilai y’ dan (y-y’)2 yang selanjutnya nilai tersebut digunakan untuk mencari nilai SD, LOD dan LOQ. Nilai SD didapatkan dengan rumus yang sudah dijelaskan pada perhitungan, hasilnya adalah 0,0283 dan 0,0128. Nilai slope (b) yang digunakan diambil dari nilai b pada regresi nilai tiap seri konsentrasi yaitu 0,0603 dan 0,0039. Selanjutnya dicari nilai LOD (Limit Of Detection) yang didefinisikan sebagai konsentrasi analit terendah dalam sampel yang masih dapat dideteksi, meskipun tidak selalu dapat dikuantifikasi. LOD merupakan batas uji yang secara spesifik menyatakan apakah analit diatas atau di



bawah nilai tertentu. LOD juga dapat dihitung berdasarkan pada standar deviasi (SD) respond dan kemiringan (slope/s) kurva baku pada level yang mendekati LOD sesuai dengan rumus: LOD = 3 x (SD/ S). Hasil perhitungan yang didapat adalah 1,4079 dan 9,8461 (Gandjar, 2007). Selanjutnya dicari nilai LOQ (Limit Of Quantification), yang didefinisikan sebagai konsentrasi analit terendah dalam sampel yang masih dapat ditentukan dengan presisi dan akurasi yang dapat diterima pada kondisi operasional metode yang digunakan. Metode perhitungan didasarkan pada standar deviasi respon (SD) dan Slope (s) dengan rumus: LOQ = 10 x (SD/ S). Hasil yang diperoleh berdasarkan perhitungan adalah 4,6932 dan 32,8205 (Gandjar, 2007). Berdasarkan hasil yang didapat menunjukkan bahwa spektrofotometri yang digunakn memiliki kemampuan untuk mendeteksi sampel dengan konsentrasi tersebut jika konsentrasi sampel dibawah konsentrasi tersebut, maka



spektrofotometer



tidak



dapat



mendeteksi



adanya



sampel



paracetamol pada sampel. Selain itu, jika konsentrasi sampel diatas konsentrasi tersebut tetapi dibawah nilai LOQ nya, mak spektrofotometer dapat mendeteksi parasetamol, tetapi dengan presisi dan akurasi yang kurang baik dan tidak dapat dipertanggungjawabkan. Begitupun untuk nilai LOQ, spektrofotometer yang digunakan memiliki kemampuan untuk mendeteksi dan menghitung konsentrasi sampel yang mengandung paracetamol dari konsentrasi tersebut. Jika konsentrasi sampel dibawah konsentrasi pada data yang didapat maka spektrofotometer dapat mendeteksi adanya paracetamol dengan presisi dan akurasi yang kurang baik. X.



Kesimpulan



Berdasarkan data hasil pengamatan, didapatkan nilai LOD pada panjang gelombang 243 nm adalah 1,4079 dan pada panjang gelombang 435 nm adalah 9,8461. Sedangkan nilai LOQ yang diperoleh pada panjang gelombang 243 nm adalah 4,6932 dan pada panjang gelombang 435



nm



adalah



32,8205.



Hal



tersebut



menunjukkan



bahwa



spektrofotometer UV-Vis dapat medeteksi dan menghitung kadar paracetamol yang ada pada sampel. XI.



Daftar pustaka Gandjar, Ibnu Kholil dan Abdul Rohman. 2007. Kimia Farmasi Analisis. Yogyakarta: Pustaka Pelajar Mutschler, Ernst. 1991. Dinamika Obat Farmakologi dan Toksikologi Edisi 5. Bandung : Institut Teknologi Bandung Smith, J.M. 1981. Chemical Engineering Kinetics. 3rd edition. Mc. Grow Hill Book Company Inc : New York. Lampiran



Kurva baku paracetamol λ243 nm Konsentrasi (bpj)



XII.



0.8 0.7 0.6 0.5 0.4 0.3 0.2 0.1 0



f(x) = 0.06 x − 0.01 R² = 0.98



0



2



4



6



8



Absorban



10



12



14



Kurva Baku Paracetamol λ 435 nm Konsentrasi (bpj)



0.5 f(x) = 0 x − 0.02 R² = 0.99



0.4 0.3 0.2 0.1 0



0



20



40



60



80



Absorban



100



120



140