Laporan Praktikum Mikrobiologi [PDF]

Citation preview

LAPORAN PRAKTIKUM MIKROBIOLOGI PEMERIKSAAN KUALITAS MAKANAN DENGAN METODE TOTAL PLATE COUNT



Nadia Afifah 1518011078 Tutorial 24



FAKULTAS KEDOKTERAN UNIVERSITAS LAMPUNG 2019



BAB I PENDAHULUAN



1.1 Latar Belakang



Pangan merupakan kebutuhan yang paling mendasar bagi manusia, sehingga ketersediaan pangan perlu mendapat perhatian yang serius baik kuantitas maupun kualitasnya. Perhatian pemerintah terhadap ketersediaan pangan diimplementasikan melalui program ketahanan pangan, agar masyarakat memperoleh pangan dalam jumlah yang cukup, aman, bergizi, sehat, dan halal untuk dikonsumsi (Depkes, 1991)



Makanan sangat berperan dalam mempertahankan kesehatan tubuh manusia, tetapi makanan juga dapat sebagai perantara penyebaran pennyakit dan keracunan makanan. Hal itu terjadi karena makanan dapat dijadikan sebagai tempat perkembangbiakan mikroogramisme baik yang patogen maupun yang tidak patogen yang dapat menularkan penyakit pada manusia . dalam hubungannya dengan penyakit atau keracunan, makanan dapat berperan sebagai



agent



(penyebab),



vechile



(pembawa)



dan



sebagai



media



(Anwar,1989).



Adanya mikroorganisme yang tumbuh di suatu makanan sangat berpengaruh pada kualitas produknya. Secara spesifik dikatakan bahwa makanan yang terkontaminasi bakteri akan berpengaruh terhadap kualitas produk olahannya. Hal tersebut akan menyebabkan penurunan kualitas (Pratiwi dan Anjarsari, 2002).



Proses perhitungan sel bakteri dapat dilakukan dengan beberapa metode baik secara langsung maupun tidak langsung. Metode yang dapat digunakan untuk



menghitung jumlah mikrobia di dalam bahan pangan adalah metode hitungan cawan. Prinsip dari metode hitungan cawan adalah jika sel yang masih hidup ditumbuhkan pada medium agar, maka sel tersebut akan berkembang biak dan membentuk koloni yang dapat dilihat langsung dan dihitung dengan mata tanpa menggunakan mikroskop. (Fardiaz,1992). Metode ukur kekeruhan (Turbidimetri) menggunakan spektrophotometer dan metode jumlah perkiraan terdekat (Budiharjo dkk, 2015)



Metode yang digunakan dalam praktikum kali ini menggunakan metode hitung koloni di cawan petri (total plate count method).



1.2 Tujuan 1.



Mengetahui dan melakukan cara penentuan jumlah mikroba dengan metode TPC (total plate count) dimulai dari preparasi sampel, teknik pengenceran sampel, sampai dengan perhitungan jumlah koloni.



2.



Mengetahui dan melakukan identifikasi dan karakterisasi bakteri melalui uji biokimia.



BAB II METODE



2.1 Alat dan Bahan Alat a. Tabung reaksi b. Labu erlenmeyer c. Pipet tetes d. Batang pengaduk e. Ose bulat f. Ose jarum g. Cawan petri h. Object glass i. Bunsen j. Korek api k. Mortir l. Stamper m. Mikropipet n. Neraca analitik o. Mikroskop p. Rak pewarnaan gram q. Inkubator



Bahan a. Makanan (telur gulung) b. Larutan NaCl c. Alkohol d. Aluminium foil e. Nutrient broth f. Bahan pewarnaan gram g. Media cair dan padat untuk uji biokimia h. Minyak emersi



2.2 Cara Kerja 2.2.1



Preparasi dan Pengenceran Sampel 1. Setelah dikeluarkan dari wadahnya, bahan telur gulung ditumbuk sampai halus atau homogen dengan menggunakan mortar dan stamper. Preparasi sampel dilakukan secara aseptis yaitu dengan menggunakan alat yang steril. 2. Sampel yang telah dihaluskan ditimbang seberat 1 gram. 3. Untuk pengecenceran, buat larutan sampel sebanyak 10 ml (campuran 1 ml/1 gr sampel dengan 9 ml NaCl/larutan fisiologis). 4. Dari larutan tersebut diambil sebanyak 1 ml dan masukkan ke dalam 9 ml larutan fisiologis (NaCl) sehingga didapatkan pengenceran 10-2. 5. Dari pengenceran 10-2 diambil lagi 1 ml dan dimasukkan ke dalam tabung reaksi berisi 9 ml larutan fisiologis sehingga didapatkan pengenceran 10-3. 6. Sampel yang telah diencerkan sampai pengenceran 10-3 diambil sebanyak 1 ml menggunakan mikropipet dan diteteskan pada cawan petri, kemudian dituangi media NB cair. 7. Gerakkan cawan petri perlahan supaya sampel dan NB cair tercampur, setelah itu masukkan ke dalam inkubasi dan diamkan selama 24 jam.



2.2.2



Perhitungan Jumlah Koloni 1. Setelah diinkubasi, jumlah koloni bakteri dapat dihitung. 2. Satu koloni dihitung 1 koloni, dua koloni yang bertumpuk dihitung 1 koloni, dan beberapa koloni yang berhubungan dihitung 1 koloni. 3. Kemudian total perhitungan jumlah koloni dikalikan dengan faktor pengenceran dengan contoh sebagai berikut. 159 (plate count) x 103 (dilution factor) = 1,59 x 105 koloni/gr



2.2.3



Identifikasi Bakteri dengan Pewarnaan Gram 1. Object glass disterilkan dengan dilewatkan pada api bunsen. 2. Jarum ose bulat dipijarkan kemudian ditunggu hingga dingin, lalu bakteri diambil dari media lalu diratakkan di atas object glass. 3. Fiksasi bakteri dengan cara melewatkannya pada api bunsen 4. Mulai pewarnaan dengan meneteskan larutan zat warna kristal violet sebanyak 2-3 tetes dan didiamkan selama 1 menit. 5. Preparat diberikan akuades mengalir dan dikeringkan. 6. Larutan iodin diteteskan dan dibiarkan selama 1 menit lalu dicuci dengan air mengalir dan keringkan. 7. Larutan ethanol diberikan selama 30 detik, lalu dicuci dengan air mengalir dan dikeringkan. 8. Larutan safranin diberikan selama 20 detik. 9. Dicuci dengan air mengalir dan dikeringkan 10. Kaca preparat diamati menggunakan mikroskop dengan perbesaran 10x100



2.2.4



Identifikasi Bakteri dengan Uji Biokimia 1. Uji Indol Uji indol dengan meneteskan reagen indole dan melihat hasil apakah timbul cincin merah pada permukaan media. Media yang dipakai adalah pepton 1% indol digunakan untuk mengetahui



apakah kuman mempunyai enzim triptophanase



sehingga kuman tersebut mampumengoksidasi asam amino tryptophan membentuk indol. Hasil : o Negative jika tidak terbentuk lapisan cincin berwarna merah pada permukaan biakan, artinya bakteri ini tidak membentuk indol tryptophan sebagai sumber karbon o Positif jika terdapat lapisan cincin berwarna merah pada permukaan biakan, artinya bakteri ini membentuk indol tryptophan sebagai sumber karbon 2. Uji Motalitas Uji SIM, dilakukan dengan mengambil sampel kultur bakteri koloni gram negative dengan ose jarum lalu tusukkan tegak lurus ditengah media SIM, lalu inkubasi selama 1 hari. Observasi hasil uji dengan melihat ada atau tidaknya garis motilitas bakteri. Media yang dipakai adalah media yang bersifat semi solid dengan kandunganagar-agar 6,5-6,7%. Tujuan dari uji ini adalah untuk mengetahui gerak kuman, bisa memakai media MO (Motilitas Ornitin) atau SIM (Sulfida Indol Motility).Pada media SIM selain untuk melihat motilitas bisa juga untuk test indol dan pembentukan H2S. Interpretasi hasil : o Negatif (-) : terlihat adanya penyebaran yang berwarna putihseperti akar hanya pada bekas tusukan inokulasi. o Positif (3) : terlihat adanya penyebaran yang berwarna putih seperti akar disekitar inokulasi. Hal ini menunjukan adanya pergerakan dari bakteri yang diinokulasikan, yang berarti bahwa bakteri ini memiliki flagel. 3. Uji TSIA Uji TSIA, dilakukan dengan mengambil sampel kultur bakteri koloni gram negative dengan ose jarum lalu tusukkan tegak lurus ditengah media TSIA hingga dasar tabung, kemudian tarik ose keluar dan oleskan zig-zag pada permukaan media, inkubasi selama 1 hari dan observasi hasil.



Tujuan dari



tes ini adalah



untuk mengetahui kemampuan



kuman untuk memfermentasikan karbohidrat. Pada media TSIA berisi 3 macam karbohidrat yaitu glukosa, laktosa dan sukrosa. Indikatornya adalah phenol red yang menyebabkan perubahan warna dari merah orange menjadi kuning dalam suasana asam. Glukosa berada di dasar media sedangkan laktosa dan sukrosa berada di bagian lereng. Media TSIA juga dapat digunakan untuk mengetahuipembentukan H2S yaitu melihat apakah kuman memfermentasi



metionin



dan



sistein



(Asam



amino



yang mempunyai gugus S). Pada media TSIA terdapat asam amino metionin dan sistein, jika kuman memfermentasi kedua asam amino inimaka gugus S akan keluar dan gugus S akan bergabung dengan H2O membentuk H2S. Selanjutnya H2S bergabung dengan Fe2+ membentuk FeS berwarna hitam dan mengendap. 4. Uji Glukosa Uji ini digunakan untuk mengetahui apakah kuman memfermentasi masing-masing gula dan membentuk asam. Interpretasi hasil : o Negatif (-) : Tidak terjadi perubahan warna media dari merah menjadi kuning, artinya kuman tidak memfermentasi gula o Positif (+) : Terjadi perubahan warna media dari merah menjadi kuning. Atinya kuman memfermentasi gula ditandai dengan tinta pada tutup kapas yangberbeda-beda 5. Uji Katalase Uji katalase, ambil sampel kultur koloni bakteri gram positif menggunakan ose bulat apuskan pada object glass yang sebelumnya telah dibersihkan, lalu tambahkan H2O2, kemudian observasi timbulnya gelembung.



BAB III HASIL DAN PEMBAHASAN



3.1 Hasil a. Hasil perhitungan jumlah mikroba



Pengenceran 3 kali Jumlah koloni 200 koloni Perhitungan jumlah bakteri dalam media PCA dapat dihitung menggunakan rumus sebagai berikut



Jadi, pada sampel telut gulung seberat 1 gram pada pengenceran 10-3 ditemukan sejumlah 200.000/ml atau 20  104 cfu/ml.



b. Hasil Pewarnaan Gram



Hasil yang di dapatkan gram positif (+) Berbentuk batang



c. Hasil Uji Biokimia No



Pemeriksaan



Hasil



1.



Uji SIM



(-)



2



Uji Gula-gula



(-)



3



Uji TSIA



(-)



4



Uji Sitrat



(-)



5



Uji Katalase



(+)



3.2 Pembahasan a. Penghitungan Jumlah Koloni Plate count/viable count didasarkan pada asumsi bahwa setiap sel mikroorganisme hidup dalam suspensi akan tumbuh menjadi satu koloni setelah ditumbuhkan dalam media pertumbuhan dan lingkungan yang sesuai. Setelah diinkubasi, jumlah koloni yang tumbuh dihitung dan merupakan perkiraan atau dugaan dari jumlah mikroorganisme dalam suspensi tersebut. Berdasarkan hal tersebut digunakan istilah Colony Forming Units (CFU’s) per ml. Koloni yang tumbuh berasal dari suspensi yang diperoleh menggunakan pengenceran bertingkat dari sebuah sampel yang ingin diketahui jumlah bakterinya. Untuk melaporkan hasil analisis mikrobiologi dengan cara hitungan agar cawan digunakan suatu standard yang disebut Standard Plate Count (SPC).



Metode hitungan cawan yang digunakan dilakukan dengan mengencerkan sampel suspensi bakteri ke dalam media PCA. Pengenceran dilakukan agar setelah inkubasi, koloni yang terbentuk pada cawan tersebut dalam jumlah yang dapat dihitung dimana jumlah terbaik adalah antara 30 sampai 300 sel mikroba per ml, per gram atau per cm permukaan. Prinsip pengenceran adalah menurunkan jumlah sehingga semakin banyak jumlah pengenceran yang dilakukan, semakin sedikit jumlah mikroba, dimana suatu saat didapat hanya satu mikroba pada satu tabung (Winarno, 2002). Larutan yang digunakan untuk pengenceran harus memiliki sifat osmotik yang sama dengan keadaan lingkungan asal mikroba untuk menghindari rusaknya sel, selain itu juga dijaga agar tidak terjadi perbanyakan sel selama pengenceran. Pengenceran yang dilakukan dalam percobaan ini adalah pengenceran decimal yaitu 10-1, 10-2, dan 10-3 dan yang diplating dan diamati adalah pengenceran 10-3. Selanjutnya dari tabung reaksi pengenceran 10-3 dituang ke dalam cawan petri media PCA (penanaman atau plating) menggunakan mikropipet secara aseptik. Plating atau penanaman bakteri adalah proses pemindahan bakteri dari medium lama ke medium baru (Dwijoseputro, 2005). Pada penanaman bakteri dibutuhkan kondisi aseptik atau steril, baik pada alat maupun proses, untuk menghindari kontaminasi, yaitu masuknya mikroba yang tidak diinginkan. Kemudian cawan petri diinkubasi selama 24 jam, waktu selama ini merupakan waktu yang bagus karena mikroba yang tumbuh tidak memenuhi cawan apabila terlalu lama dan tidak terlalu sedikit apabila terlalu singkat. Setelah proses inkubasi, dilakukan penghitungan jumlah bakteri pada media PCA. Pada cawan petri dengan pengenceran 10-3 diperoleh penghitungan jumlah koloni bakteri sebanyak 200 koloni dan menurut syarat SPC hasil ini masuk dalam range yang telah ditentukan yaitu jumlah koloni bakteri 30-300 koloni. Berdasarkan hasil pengamatan dapat disimpulkan bahwa hasil pada sampel telur gulung seberat 1 gram pada pengenceran 10-3 ditemukan sejumlah 200.000 bakteri/ml atau 200x 103 cfu/ml.



b. Pewarnaan Gram Pada proses pewarnaan gram didapatkan hasil bakteri gram positif (+) karena berwarna ungu. Pada bakteri gram positif dinding selnya terdehidrasi dengan perlakuan alkohol, pori – pori mengkerut, daya rembes dinding sel dan membran menurun sehingga pewarna safranin tidak dapat masuk sehingga sel berwarna biru atau ungu. Perbedaan dasar antara bakteri gram positif dan negatif adalah pada komponen dinding selnya. Kompleks zat iodin terperangkap antara dinding sel dan membran sitoplasma organisme



gram



positif,



sedangkan penyingkiran zat lipida dari dinding sel organisme gram negatif dengan pencucian alkohol memungkinkan hilang dari sel. Bakteri gram positif memiliki membran tunggal yang dilapisi peptidohlikan yang tebal (25-50nm) sedangkan bakteri negatif lapisan peptidoglikogennya tipis (1-3 nm) (Dwidjoseputro, 2005). Faktor-faktor yang mempengaruhi pewarnaan bakteri yaitu fiksasi, peluntur warna, substrat, intensifikasi pewarnaan dan penggunaan zat warna penutup (Dwidjoseputro, 2005).



c. Uji Biokimia Uji biokimia bakteri merupakan suatu cara atau perlakuan yang dilakukan untuk mengidentifikasi dan mendeterminasi suatu biakan murni bakteri hasil isolasi melalui sifat-sifat fisiologinya. Proses biokimia erat kaitannya dengan metabolisme sel, yakni selama reaksi kimiawi yang dilakukan oleh sel yang menghasilkan energi maupun yang menggunakan energi untuk sintesis komponen-komponen sel dan untuk kegiatan selular, seperti pergerakan. Mikroorganisme dapat tumbuh pada beberapa tipe media yang memproduksi tipe metabolit yang dapat dideteksi dengan reaksi antara mikroorganisme dengan reagen test yang dapat menghasilkan perubahan warna reagen (Cowan, 2004).



d. Uji SIM



Berdasarkan pengamatan dari uji SIM didapatkan hasil uji H2S, Indol, dan Motilitas didapatkan hasil negatif (-). Karena pada uji motilitas tidak terdapat perubahan pola bakteri berupa penyebaran di sekitar tusukan yang menandakan bakteri bergerak atau motil. Pada uji indol juga tidak terbentuk cincin merah ketika diberikan reagen Kovac atau Erlich. Dan pada uji H2S tidak terbentuk endapan hitam di dasar media. Tujuan dari uji motilitas adalah untuk mengetahui gerak bakteri dan jika hasil positif menandakan bakteri memiliki flagel. Uji indol digunakan untuk mengetahui apakah kuman mempunyai enzim triptophanase sehingga kuman tersebut mampu mengoksidasi asam amino triptophan membentuk indol (Cowan, 2004).



e. Uji Gula-gula Tujuan dari pemeriksaan uji gula-gula adalah untuk mengetahui kemampuan organisme memfermentasi karbohidrat. Prinsip dari pemeriksaan ini adalah bakteri akan memecah karbohidrat tertentu yang tergabung dalam medium dasar dengan membentuk asam atau asam dengan gas. Jenis karbohidrat yang digunakan adalah glukosa, laktosa, manitol, maltosa, dan sukrosa, dengan indikatornya adalah phenol red. Berdasarkan pengamatan pada proses uji reaksi fermentasi karbohidrat ini didapatkan hasil interpretasi negatif (-) karena tidak terdapat perubahan warna media dari warna biru menjadi kuning atau hijau yang artinya bakteri tidak memfermentasi karbohidrat (Burrows, 2004).



f. Uji TSIA Berdasarkan pengamatan dari uji TSIA didapatkan hasil interpretasi negatif (-) karena tidak terdapat perubahan warna media dari merah menjadi kuning di dasar maupun di lereng media. Artinya bakteri tidak memfermentasi karbohidrat. Sedangkan jika bakteri hanya memfermentasi glukosa, akan didapatkan hasil pada dasar (butt) media berwarna kuning (bersifat asam) dan lereng (slant) berwarna merah (bersifat basa). Jika



memfermentasi semua karbohidrat, akan didapatkan hasil pada dasar (butt) media berwarna kuning (bersifat asam) dan lereng (slant) berwarna kuning (bersifat asam). Tujuan dari tes ini adalah untuk mengetahui kemampuan bakteri untuk memfermentasikan karbohidrat. Pada media TSIA berisi 3 macam karbohidrat yaitu glukosa, laktosa dan sukrosa. Glukosa berada di dasar media sedangkan laktosa dan sukrosa berada di bagian lereng. Fermentasi pada TSIA juga disertai dengan pembentukan gas CO2 yang dapat dilihat dari pecahnya dan terangkatnya agar. Media TSIA juga dapat digunakan untuk mengetahui pembentukan H2S yaitu melihat apakah kuman memfermentasi metionin dan sistein (Asam amino yang mempunyai gugus S). Pada media TSIA terdapat asam amino metionin dan sistein, jika kuman memfermentasi kedua asam amino ini maka gugus S akan keluar dan gugus S akan bergabung dengan H2O membentuk H2S. Selanjutnya H2S bergabung dengan Fe2+ membentuk FeS berwarna hitam dan mengendap (Ratna, 2012).



g. Uji Sitrat Berdasarkan pengamatan dari uji sitrat didapatkan hasil interpretasi negatif (-) karena tidak terdapat perubahan warna media dari hijau ke biru. Artinya bakteri ini tidak mempunyai enzim sitrat permease yaitu enzim spesifik yang membawa sitrat ke dalam sel. Sehingga kuman tidak menggunakan sitrat sebagai salah satu/satu-satunya sumber karbon. Media yang dipakai adalah sitrat. Tujuan dari uji ini adalah untuk mengetahui apakah kuman menggunakan sitrat sebagai sumber karbon. Pada media sitrat berisi indikator BTB (Brom Tymol Blue) yang berwarna hijau. Apabila bakteri menggunakan sitrat sebagai sumber karbon maka media berubah menjadi basa dan berubah warna menjadi biru. Sedangkan jika hasilnya positif (+) berarti terjadi perubahan warna media dari hijau menjadi biru, artinya kuman menggunakan sitrat sebagai salah satu/satu-satunya sumber karbon (Ratna,2012).



h. Uji Katalase Berdasarkan pengamatan dari uji katalase didapatkan hasil uji katalase positif (+) karena terdapat gelembung pada object glass yang ditetesi H2O2. Uji katalase digunakan untuk mendeteksi adanya enzim katalase. Enzim ini terdapat pada sel-sel yang mempunyai metabolisme aerobik. Bakteri anaerob tidak mempunyai enzim katalase. Enzim katalase akan bereaksi dengan H2O2 (hydrogen peroksida) yang menghasilkan gas (oksigen) (Burrows, 2004).



DAFTAR PUSTAKA



Anwar, S. 1985. Sanitasi Makanan dan Minuman pada Institusi Pendidikan Tenaga Sanitasi. Jakarta: Departemen Kesehatan RI



Budiharjo, Teguh, Sri Hetty Susetyorini, Wiwik Wijaningsih, Didik Widiyanto. 2015. Pedoman Praktikum Mikrobiologi. Semarang: Politeknik Kesehatan Semarang Jurusan Gizi dan Analis Kesehatan



Departemen Kesehatan RI. 1991. Petunjuk Pemeriksaan Mikrobiologi Makanan dan Minuman. Jakarta: Depkes RI Press



Fardiaz, S., 1993. Analisis Mikrobiologi Pangan. Jakarta: Raja Grafindo Persada



Pratiwi, Rika dan Anjarsari.2002. Deteksi Ergosterol sebagai Indikator Kontaminasi Cendawan pada Tepung Terigu. Jurnal Teknologi dan Industri Pangan.



LAMPIRAN



1. Sampel yang sudah diencerkan



2. Sampel telur gulung yang telah di haluskan



3. Proses menghaluskan sampel



4. Hasil pertumbuhan koloni pada cawan petri



5. Uji Katalasi



6. Uji Biokimia



7. Hasil Pewarnaan Gram