Laporan Resmi Anfar KCKT Roni Setiawan [PDF]

Citation preview

Laporan Resmi Praktikum Analisis Farmasi “High Performance Liquid Chromatography (HPLC)” PIROKSICAM



Dosen Pengampu : Apt. Dwi Lestari, S. Farm.,M.Si Disusun Oleh Nama



: Roni setiawan



NIM



: 1811102415123



Kelas



:B



Kelompok



:5



FAKULTAS ILMU KESEHATAN DAN FARMASI PROGRAM STUDI S1 FARMASI UNIVERSITAS MUHAMMADIYAH KALIMANTAN TIMUR 2020



A. Judul High Performance Liquid Chromatography (HPLC)



B.



Tujuan Adapun tujuan dari praktikum ini adalah untuk mengetahui dan memahami cara aplikasi kromatorafi HPLC untuk penetapan kadar sediaan obat.



C.



Dasar Teori Kromatografi cair kinerja tinggi merupakan tenik analisis dengan alat atau zat-zat terpisah oleh perbedaan kecepatan elusi, karena zatzat ini melewati kolom kromatografi pemisahan solit-solit diatur oleh distribusi dalam fase gerak dan fase diam. KCKT merupakan metode yang tidak destriktif dan dapat digunakan baik unuk analisis kualitatif dan kuantatif serta memiliki kecepatan analisis dan kepekaan yang tinggi (Gandjar dan Rohman, 2015). Alat atau komponen dalam KCKT adalah sebagai berikut: (Agus dkk, 2016) a. Pompa Fase gerak dalam KCKT adalah suatu cairan yang bergerak melalui kolom. Terdapat dua tipe pompa yang digunakan yaitu kinerja konstan (Constant Pressure) dan pemindahan konstan (Constant Diplacement). b. Injector Tempat atau alat yang digunakan untuk memasukkan sampel ke bagian ujung kolom, yang harus dengan distrubansi yang minimum dari material kolom. Terdapat dua macam injector yaitu stopped flow dan solvent flaving c.



Kolom



Adalah jantung kromatografi dalam KCKT. Berhasil atau gagalnya suatu analisis tergantung pada pemilihan kolom dan kondisi percobaan yang sesuai. Kolom dibagi menjadi dua macam yaitu kolom analitik dan kolom preparative. d. Detektor Dibutuhkan untuk mendeteksi adanya komponen sampel didalam kolom (analisis kualitatif) dan menghitung kadarnya (analisis kuantitatif). Detector yang baik memiliki sensitivitas yang tinggi, gangguan yang rendah, kisar respon linier yang halus dan memberi respons untuk semua tipe senyawa. KCKT merupakan salah satu metode kimia dan fisikokimia. KCKT termasuk metode analisis terbaru yaitu suatu tekniik kromatografi dengan fase gerak cairan dan fase diam cairan atau padat (Sweetman, 2017). Beberapa kelebihan yang dimiliki kromatografi HPLC sehingga menjadikannya



sebagai



“the



best



choice”



dalam



dunia



penentuan/pemisahan ion/logam, diantaranya: a. Kecepatan (Speed) Kecepatan dalam analisis suatu sampel menjadi aspek yang sangat penting dalam hal analisis ion yaitu untuk menguangi biaya, bisa menghasilkan data analisis yang akurat dan cepat dan bisa mengurangi limbah (waste) yang dihasilkan dari penggunaan eluen. b. Sensitivitas (Sensitivity) Perkembangan teknologi mikro prosessor yang dikombinasikan dengan efisiensi kolom pemisah mulai ukuran diameter dalam millimeter sampai skala mikro. Membuat pendeteksian ion dalam sampel menjadi lebih baik. c. Selektivitas (Selectivity)



Dengan system ini,



bisa dilakukan pemisaan berdasarkan



keinginan, misalnya kation/anion organic saja atau kation/anion anorganik yang dipisahkan. d. Pendeteksian yang serempak (Simultaneous detection) Teknik pendeteksian sekali injeksi untuk sebuah sampel seperti ini penting untuk dilakukan karena tentunya mempunyai sejumlah kelebihan disbanding pemisahan lain diantaranya dapat menekan biaya



operasional, memperkecil jumlah limbah



berlangsung,



memperpendek



waktu



analisis



saat analisis serta



dapat



memaksimalkan hasil. e. Kestabilan pada kolom pemisah (Stability of the separator coloumn) Kolom pemisah dapat bertahan pada perubahan yang terjadi pada sampel, misalnya konsentrasi suatu ion terlalu tinggi, tidak akan mempengarui kestabilan material penyusun kolom. Selain itu KCKT juga memiliki keunggulan seperti mampu memisahkan molekul-molekul dari suatu campuran, mudah dalam pengoperasian instrumentasinya, memiliki kecepatan analisis dan kepekaan yang tinggi, dapat dihindari terjadinya dekomposisi, memiliki resolusi yang baik, dapat menggunakan bermacam-macam detector, kolom dapat digunakan kembali dan mudah dilakukan “sample recovery” (Ardianingsih, 2009). Kekurangan KCKT antara lain, harga sebuah alat KCKT cukup mahal, sering ada larutan standart yang tertinggal di injector, pada kolom dengan diameter rata-rata partikel fase dian dengan ukuran 5 dan 3 mikrometer sela-sela partikel lebih mudah tertutup oleh kotoran sehingga harus dicuci dan kemurnian larutan harus dijaga (Moffat et al, 2018). Penetapan kadar dilakukan dengan cara menghitung stok larutan baku yang akan digunakan untuk mencari konsentrasi larutan baku pada kandungan mg/mL. Dengan memakai persamaan V1.M1=V2.M2,



atau penetapan kadar juga dapat dilakukan dengan menggunakan analisis instrumental menggunakan metode spektrofotometri UV-Vis. Penetapan kurva baku dapat dilakukan dengan absorbansi sehingga akan didapatkan kurva baku yang akan di ukur pada panjang gelombang maksimum (Harmita, 2018).



D.



Alat dan Bahan a. Alat



E.



b. Bahan



1. Kromatografi HPLC



1. Asetonitril



2. Timbangan analitik



2. Asam asetat 0,05 M



3. Labu takar



3. Tablet parasetamol



4. Corong



4. Econazol



5. Pipet volume



5. Miconazol nitrat



6. Bulk



6. Econazol nitrat



Cara Kerja a. Penetapan kadar tablet parasetamol dengan metode standar eksternal 1. Ditimbang 125 mg parasetanol baku 2. Dimasukkan dalam labu takar 250 ml 3. Diencerkan dengan larutan asam asetat 0,05 M sampai tanda batas (larutan stok) 4. Dibuat seri larutn baku dan larutan stok dengan deret konsentrasi 0,5, 1,0, 1,5, 2,0, dan 2,5 mg/100 mL. 5. Dilakukan penetapan kelima larutan standar diatas dengan HPLC (Timbangan berat 20 tablet parasetamol yang dianalisis adalah 12,1891 gram). 6. Diambil 150,5 mg serbuk tablet



7. Dilarutkan dengan asam asetat 0,05 M dalam labu takar 250 ml, lalu disaring. 8. Dipipet 25 mL alikot diencerkan dengan asam asetat 0,05 M sampai 100 ml dalam labu takar. 9. Diencerkan lebih lanjut dengan mempipet 10 ml ke dalam labu takar 100 ml dengan larutan asam asetat 0,05 M samapai tanda batas. 10. Dilakukan penetapan menggunakan kromatografi HPLC pada kondisi sama pada larutan baku. Adapun asilnya diperoleh luas puncak kromatogram = 45.205. 11. Ditetapkan tablet parasetamol sesuai persyaratan tablet dalam farmakope Indonesia. b. Penetapan kadar krim miconazole dengan metode standar internal econazol 1. Dibuat larutan stok standar miconazol nitrat dan econazol nitrat (standar internal) dengan menimbang masing-masing 200,0 mg 2. Dilarutkan dengan larutan fase gerak sampai 250 ml dalam labu takar. 3. Dipipet 25 ml larutan econazol stok standar masukkan kedalam lima buah labu takar 100 ml 4. Ditambahkan larutan stok standar miconazol masing-masing 15 ml, 20 ml, 30 ml, dan 35 ml pada 5 labu. 5. Diencerkan dengan larutan fase gerak hingga tanda batas 6. Dilakukan pengukuran dengan kromatografi HPLC 7. Ditimbang 201,5 mg krim dilarutkan dengan 25 ml larutan fase gerak dalam corong pisah sambil dikocok selama 5 menit. 8. Diekstraksi



dengan



50



ml



heksan



dan



lapisan



heksan



dikeluarkan/dibuang 9. Dialiri



larutan



fase



gerak



menghilangkan sisa heksan



dengangas



nitrogen



untuk



10. Dimasukkan kedalam labu takar 100 ml 11. Diencerkan sampai batas dengan larutan fase gerak 12. Disaring larutan dan dipipet sebanyak 20 ml untuk dilakukan pengukuran kromatografi HPLC menggunakandetektor UV pada panjang gelombang 220 nm. 13. Dihitung presentase kadar miconazol dalam krim 14. Ditetpkan berdasarkan persyaratan sediaan krim miconazol yang tertera dalam farmakope Indonesia. F.



Hasil



G.



Pembahasan Menurut Departemen Kesehatan Republik Indonesia pada tahun 1995,



piroksikam merupakan salah satu obat analgesik yang mempunyai waktu paruh yang panjang. Piroksikam mempunyai rumus kimia C15H13N3O4S dengan



nama



4-



9



Hidroksi-2-metil-N-2-piridil-2H-1,2-benzoyiazin-3-



karboksamida 1,1-dioksida.



Sifat Fisika Kimia Piroksikam Sifat Piroksikam Wujud Padatan Berat Molekul 331,35 g/mol Warna Putih Titik Leleh 1990C. Piroksikam merupakan serbuk kristalin, tidak berbau, berasa pahit, dalam bentuk monohidrat berwarna kuning. Tidak larut dalam air, dalam asam encer dan sikloheksana, sedikit larut dalam metanol, etanol, isopropanol, dalam dimetil formamid dengan perbandingan 1:10, dimetilsulfoksid (1:50), aseton (1:50), etil asetat (1:80), kloroform (1:20), dan kelarutannya dalam larutan alkali (1:100).



Piroksikam merupakan salah satu turunan oksikam yang umumnya bersifat asam, yang mempunyai efek antiradang, analgesik dan antipiretik. Piroksikam menimbulkan efek samping iritasi saluran cerna yang cukup besar. Piroksikam dapat 10 diserap baik dalam saluran cerna dan 99% obat terikat pada protein plasma (Siswandono, 1995). Efek samping lainnya yaitu tukak lambung, eritema kulit, sakit kepala, dan tinitus. Piroksikam tidak



dianjurkan diberikan kepada wanita hamil dan pasien tukak lambung. Dosis pemakaian piroksikam yaitu mulai 10 mg sampai 20 mg sehari yang diberikan pada pasien. (Lisa Dewi.2013) High Performance Liquid Chromatography (HPLC), merupakan teknik kromatografi cair (LC) yang digunakan untuk pemisahan berbagai komponen dalam campuran. HPLC juga digunakan untuk identifikasi dan kuantifikasi senyawa dalam proses pengembangan obat dan telah digunakan di seluruh dunia sejak beberapa dekade. Efisiensi, kecepatan, peningkatan throughput, dan pengurangan biaya analisis adalah karakteristik penting HPLC. Tujuan penggunaan HPLC adalah memisahkan molekul dalam waktu minimum sehingga penting untuk meningkatkan hasil analisis dan mengurangi waktu analisis. Dengan



adanya



HPLC



tentunya



sangat



membantu



dalam



proses



kromatografi. Berikut merupakan kelebihan dari alat HPLC antara lain: 1. Mampu memisahkan molekul-molekul dari suatu campuran dengan daya memisah yang tinggi. 2. Dapat dihindari terjadinya dekomposisi / kerusakan bahan analisis. 3. Dapat digunakan bermacan-macam detektor dengan kepekaan yang tinggi. 4. Kolom dapat digunakan kembali. 5. Waktu analisa cukup singkat. 6. HPLC dapat digunakan untuk isolasi zat yang tidak mudah menguap dan zat yang tidak stabil. 7. Dapat menganalisis sampel yang kecil kuantitasnya. 8. Teknik HPLC dapat dilakukan pada suhu kamar. Kelemahan dari alat HPLC antara lain: 1. Harga sebuah alat HPLC cukup mahal. 2. Sering ada larutan standar yang tertinggal diinjektor. 3. Pada kolom dengan diameter rata-rata partikel fase diam dengan ukuran 5 dan 3 mikrometer sela-sela partikel lebih mudah tertutup oleh kotoran,



jadi harus seringkali dicuci dan kemurnian larutan harus dijaga. Safira (Annissa.2019) Metode yang digunakan pada penelitian ini yaitu melakukan persiapan larutan sampel yang dikembangkan untuk penentuan piroxicam diterapkan pada pengendalian kualitas produk farmasi. Dua jenis tablet piroksikam tablet yang diproduksi oleh dua produsen berbeda dianalisis. Untuk setiap produk farmasi, sepuluh tablet dihancurkan dan jumlah bubuk yang ditimbang dengan tepat setara dengan 5mg piroxicam dilarutkan dalam 25 mL kloroform menggunakan penangas ultrasonik selama 15 menit. Larutan itu diencerkan dengan mobilephase untuk mendapatkan 50 µ g / mL larutan piroksikam, kemudian disaring menggunakan larutan 0,45µm Milliporemembrane. Tiga larutan sampel untuk setiap produk farmasi dianalisis. Larutan injeksi dari botol 1 mL yang berisi 20 mg piroksikam berturut-turut diencerkan dengan fase gerak untuk mendapatkan larutan sampel 50μg / mL. Tiga larutan sampel tersebut disiapkan untuk masing-masing dari tiga botol yang dianalisis. (ALINA DIANA.2017) Validasi metode ini dilakukan dengan mengikuti norma-norma pedoman Konferensi Internasional tentang Harmonisasi (ICH) untuk selektivitas, linieritas, batas deteksi, batas kuantifikasi, kesesuaian sistem, presisi, akurasi, pemulihan, stabilitas, dan ketahanan. Linearitas diselidiki di 2.5-120 µ Kisaran konsentrasi g / mL dan kurva kalibrasi diperoleh dengan memplot nilai luas puncak terhadap konsentrasi piroksikam menggunakan regresi linier. Sensitivitas metode analisis dievaluasi dengan menentukan batas deteksi (LOD) dan batas kuantitasi (LOQ) menggunakan metode rasio signalto-noise (3: 1 untuk LOD dan 10: 1 untuk LOQ). Ketepatan dan akurasi dinilai dengan menentukan konsentrasi senyawa aktif pada tiga tingkat konsentrasi pada hari yang sama dan hari yang berbeda. Ketepatan metode dievaluasi melalui standar deviasi (SD) dan kovarians (CV) (%). Akurasi dievaluasi melalui pemulihan. Pemulihan ekstraksi tablet untuk tiga konsentrasi piroksikam



ditentukan.



Jumlah



piroksikam



standar



yang



diketahui



ditambahkan ke larutan sampel yang diperoleh dari tablet. Setelah analisis kromatografi, luas puncak dibandingkan dengan yang diperoleh untuk larutan standar piroksikam dengan konsentrasi yang sama. Untuk mengevaluasi kekokohan metode RP-HPLC yang dikembangkan, beberapa variasi kecil yang disengaja dalam parameter metode yang dioptimalkan dibuat. Pengaruh temperatur kolom dan kecepatan aliran modifikasi pada puncak telah dipelajari. Stabilitas dinilai dengan membandingkan luas larutan standar yang dipertahankan selama 8 jam pada suhu kamar dengan luas larutan standar yang baru disiapkan. Uji stabilitas dicapai dalam kondisi stres seperti hidrolitik (asam dan basa), oksidasi, dan kondisi termal. (GEORGE TRAIAN.2015) Sistem HPLC untuk penentuan kadar piroksikam dalam sampel. Kadar piroksikam ditentukan dengan HPLC. Beberapa pustaka menggunakan fase gerak methanol-buffer fosfat pH 2 (45:55) (Amanlou dan Dehpour, 1997) dan methanolamonium asetat 0,1 M (10:9) (Jiang dkk., 1991). Pada percobaan ini akan digunakan HPLC Shimadzu dengan optimasi fase gerak metanolair dalam beberapa perbandingan dan beberapa kecepatan alir, dengan fase diam C18. Detektor yang digunakan adalah detector UV pada panjang gelombang sekitar 341 nm. Preparasi sampel dilakukan dengan menimbang secara seksama sejumlah sampel dalam labu takar 10 mL. Sampel dilarutkan dalam methanol pa sampai tanda. Pengenceran dilakukan dengan mengambil 100 mkroliter larutan tersebut dan dimasukkan dalam labu takar 10 mL. Metanol ditambahkan sampai tanda. (Firdaus Fahdi.2020) Kromatogram HPLC untuk penentuan kadar proksikam pada uji stabilitas kimia. Metode HPLC digunakan untuk menentukan kandungan piroksikam dalam bulk disperse padat maupun rekristal. Metode ini dipilih karena kemampuannya dapat memisahkan produk degradasi piroksikam dari piroksikam, sehingga yang terbaca benar-benar piroksikam (selektif). Kromatogram HPLC menunjukkan hasil yang optimal dengan komposisi fase



gerak methanol air 55:45. Peak larutan standard diukur dengan replikasi 3 kali, kadar piroksikam dalam sampel dihitung dengan membandingan luas area peak. (ALINA DIANA.2017)



kurva baku untuk penentuan kadar piroksikam pada uji dissolusi. Kurva baku piroksikam menunjukkan puncak pada panjang gelombang 341 nm dan 240nm. Panjang gelombang 341 nm dipilih sebagai panjang gelombang maksimum untuk penentuan kadar piroksikam hasil disolusi karena lebih tinggi dan kemungkinan gangguan lebih kecil. Untuk penentuan kadar piroksikam pada uji disolusi digunakan metode spektrofotometri. Metode ini dipilih karena dari hasil uji stabilitas kimia diketahui bahwa dekomposisi kimia piroksikam tidak terjadi. Kurva baku dibuat dengan mengukur absorbansi pada panjang gelombang 341 nm dari satu seri kadar piroksikam. (ALINA DIANA.2017)



H.



Kesimpulan Metode HPLC merupakan metode pengembangan dan validasi metode



cepat, sensitif, dan akurat baru untuk penentuan kuantitatif



Piroxicam dalam formulasi massal dan farmasi. Pengembangan metode HPLC dilakukan dengan menggunakan pendekatan desain BoxBehnken



dan



metodologi



permukaan



respons.



Metode



yang



dioptimalkan sepenuhnya divalidasi sesuai dengan pedoman ICH saat ini dalam hal spesifisitas, linieritas, presisi, dan akurasi, batas deteksi / kuantitasi, dan kesesuaian sistem. Studi stabilitas ekstensif juga mengungkapkan bahwa Piroxicam stabil dalam larutan metanol, serta dalam lingkungan asam (baik dalam fase gerak maupun 0,1H larutan asam HCl), dan kondisi suhu yang diuji (dari 4 hingga 37 ° C) tidak berdampak signifikan terhadap stabilitasnya.



Daftar Pustaka Agus dkk, 2016. Validasi Metode HPLC untuk Penetapan Aspirin dan Asam Salisilat dalam Plasma Klinis Secara Simultan. Fakultas Farmasi Universitas Muhammadiyah Purwokerto. ALINA DIANA,dkk.2017.Fast HPLC Method for the Determination of Piroxicam and its Application to Stability Study. Grigore T. Popa University of Medicine and Pharmacy, Faculty of Pharmacy, 15th University Str., 700115, Iasi, Romania Ardianingsih



Retno,



2009.



Penggunaan



High



Performance



Chromatography (HPLC) Dalam Proses Analisa Deteksi Ion. Jurnal Berita Dirgantara Vol. 10, No. 4 101-104. Firdaus



Fahdi,dkk.2020.



The



Effect



of



Omeprazole



on



the



Pharmacokinetics of Piroxicam Profiles with High Performance Liquid



Chromatography



(HPLC)



Method.



Department



of



Pharmaceutical, Faculty of Pharmacy, Institut Kesehatan Deli Husada Deli Tua, Indonesia



Gandjar dan Rohman, 2015. Kimia Analisis. Pustaka Pelajar : Yogyakarta. GEORGE TRAIAN,dkk.2015. THE DEVELOPMENT AND VALIDATION OF A RAPID HPLC METHOD FOR DETERMINATION OF PIROXICAM. Department of Drug Control, Faculty of Pharmacy, “Carol Davila” University of Medicine and Pharmacy Bucharest, 6 Traian Vuia Street, 020956, Bucharest, Romania. Harmita, 2018. Petunjuk Pelaksanaan Validasi Metode dan Cara Perhitungannya. Majalah Ilmu Kefarmasian. Lisa



Dewi.2013.



ANALISA



KUALITATIF



PIROKSIKAM



DAN



FENILBUTAZON MENGGUNAKAN REAGEN SPESIFIK YANG



DIIMOBILISASI PADA MEMBRAN POLIAMIDA DALAM TES STRIP. JURUSAN KIMIA FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM UNIVERSITAS JEMBER Maffat dkk, 2018. Analysis Drug’s and Poisons in Pharmaceutical, Body Fluid sand Postmortem Material, Volume 1. Pharmaceutical Press: London. Safira Annissa, dkk.2019. PERBANDINGAN METODE ANALISIS INSTRUMEN HPLC DAN UHPLC : ARTICLE REVIEW. Fakultas Farmasi Universitas Padjadjaran Sweetman,



2018.



Martindale:



Pharmaceutical Press: London.



the



Complete



Drug



Reference.