Laprak Bioteknologi [PDF]

Citation preview

LAPORAN PRAKTIKUM BIOTEKNOLOGI TANAMAN “UJI KUANTITAS DAN KUALITAS DNA” Diajukan untuk Memenuhi Salah Satu Syarat Mata Kuliah Bioteknologi Tanaman



Disusun oleh : Nama



: Reny Larasati



NIM



: 4442170073



Kelas



: VI C



Kelompok



: 3 (Tiga)



JURUSAN AGROEKOTEKNOLOGI FAKULTAS PERTANIAN UNIVERSITAS SULTAN AGENG TIRTAYASA 2020 BAB I PENDAHULUAN



1.1 Latar Belakang DNA adalah asam nukleat yang mengandung materi genetik dan berfungsi untuk mengatur perkembangan biologis seluruh bentuk kehidupan secara seluler. DNA terdapat pada nukleus, mitikondria, dan kloroplas. Perbedaan ketiganya adalah DNA nukleus berbentuk linier dan berasosiasi sangat erat dengan protein histon, sedangkan DNA mitokondria dan kloroplas berbentuk sirkular dan tidak berasosiasi dengan protein histon. Selain itu DNA mitokondria dan kloroplas memiliki ciri khas, yaitu hanya mewariskan sifat-sifat yang berasal dari garis ibu. Sedangkan DNA nukleus memiliki pola pewarisan sifat dari kedua orangtua. Dilihat dari organismenya, struktur DNA prokariot tidak memiliki protein histon dan berbentuk sirkular, sedangkan DNA eukariot berbentuk linier dan memiliki protein histon (Fatchiyah, 2011). Isolasi DNA adalah prosedur rutin untuk mengumpulkan DNA untuk analisis molekuler atau forensik berikutnya (Anderson, 1993). Isolasi DNA merupakan salah satu teknik yang paling dasar dan penting dalam studi DNA. Ekstraksi DNA dari sel dan pemurnian yang merupakan kepentingan utama untuk bidang bioteknologi dan forensik (Purwantara, 2001). Isolasi DNA dengan teknik sentrifugasi akan mengendapkan DNA. Supaya hasil isolasi berupa DNA murni yang tidak tercampur dengan molekul-molekul lain maka dalam proses isolasinya dicampurkan berbagai macam larutan. Larutan A berfungsi sebagai resuspensi yaitu penggabungan kembali pelet yang telah terbentuk dengan larutan yang dicampurkan. Selain itu larutan A juga berfungsi sebagai buffer dan pengkelat. Pemilihan buffer tersebut dilihat dari kemampuan buffer menghasilhkan arus listrik. Larutan B yang terdiri atas SDS dan NaOH berfungsi sebagai larutan pelisis. NaOH sendiri dapat mendenaturasi protein. Sedangkan larutan C berfungsi untuk merenarutasikan kembali. Etanol 70% yang digunakan dalam proses isolasi berfungsi untuk mengeluarkan endapan garam karena Na+ bermuatan positif dan DNA bermuatan negatif. Larutan ddH2O yang ditambahkan berfungsi agar endapan DNA yang dihasilkan didapat dengan konsentrasi yang cukup tinggi. Larutan di vortex untuk memudahkan bakteri tersuspensi (Purwantara 2001). Analisis kuantitatif merupakan salah saru teknik analisis yang bertujuan untuk menentukan jumlah atau seberapa banyak suatu zat atau komponen zat (Sambrook, 2001). Analisis kuantitatif DNA dapat dilakukan dengan bantuan alat, yaitu spektrofotometer. Spektrofotometer adalah alat yang dilengkapi dengan sumber cahaya (gelombang elektromagnetik), baik cahaya UV (ultra-violet) atau pun cahaya nampak (visible). Komponen utama dari alat ini adalah sumber cahaya, pengatur intensitas, monokromator, kuvet, detector, penguat arus dan indicator atau layar. Sinar UV digunakan untuk mengukur bahan larutan yang terbaca dengan panjang gelombang di bawah 400 nm. Sinar visible light bisa digunakan untuk mengukur bahan dengan panjang gelombang 400-700 nm. Sumber cahaya dari alat tersebut memancarkan seberkas cahaya melalui dua buah lensa dan celah masuk ke suatu sisi difraksi yang akan menyebarkan cahaya menjadi berkas horizontal dengan semua warna spectrum. Cahaya yang mengenai suatu benda dalam larutan contoh akan dihamburkan, sedangkan cahaya yang lolos atau diteruskan akan melawati sampel akan mengaktivasi foto tabung dan akan menampilkan persen transmitan. Biasanya absorban merupakan daya cahaya masuk dan daya cahaya yang diteruskan melewati larutan contoh (Sari at al, 2013). Elektroforesis merupakan teknik yang digunakan untuk memisahkan dan memurnikan fragmen-fragmen DNA ataupun RNA. Prinsip elektroforesis adalah memisahkan molekul berdasarkan muatannya. DNA yang bermuatan negatif karena adanya phosphate akan bergerak kea rah kutub positif selama elektroforesis. Fragmen DNA mempunyai muatan negatif yang sama untuk tiap-tiap ukuran panjang, sehingga pergerakan DNA ini akan memiliki kecepatan yang sama untuk mencapai kutub postif (Sari, 2013).



Pergerakan yang sama antar molekul DNA ini tidak akan dapat digunakan memisahkan DNA berdasarkan ukurannya. Hal inilah yang menyebabkan digunakannya gel untuk memperlambat pergerakan DNA. Gel ini merupakan polymer sehingga akan membentuk semacam jarring-jaring untuk memerangkap DNA. DNA dengan ukuran yang lebih besar akan lebih sulit melewati lubang atau pori dari gel, sehingga DNA dengan sendirinya akan terpisah berdasarkan besarnya ukuran karena kemampuan dari DNA yang berbeda-beda dalam melewati pori dalam gel (Mulyani, 2011). 1.2 Tujuan Adapun tujuan dari praktikum kali ini diantaranya yaitu : 1. Untuk mengetahui kuantitas DNA menggunakan alat nanofotometer. 2. Untuk mengetahui kualitasDNA menggunakan elektroforesis gel agarose1%. BAB II METODE PRAKTIKUM 2.1 Waktu dan Tempat Praktikum uji kualitas dan kuantitas DNA ini dilaksanakan pada hari Kamis, 23 April 2020 pukul 08.00 s.d 14.00 WIB dan bertempat di lantai 3 Laboratorium Bioteknologi Fakultas Pertanian Universitas Sultan Ageng Tirtayasa. 2.2 Alat dan Bahan Alat yang digunakan dalam praktikum analisis kualitas DNA adalah timbangan analitik, alumunium foil, erlenmeyer, gelas ukur, hot plate /dan stirrer, alat elektroforesis (cetakan agar, sisir, stavolt, tangki buffer), GelDoc, pipet mikro 0,5μL-10μL. Sedangkan bahan yang digunakan adalah tips putih, kertas parafil/selotip, agarose, TAE 0,5x, loading dye, gel red, aquadeststeril, Nucleic Acid Stain Water. Adapun alat yang digunakan dalam analisis kuantitas DNA adalah nanophotometer (spektrofotometer NanoDrop), kuvet, pipet mikro. Sedangkan bahan yang digunakan adalah kim wipes, tip, DNA hasil isolasi, buffer TE 2.3 Cara Kerja Adapun cara kerja yang dilakukan pada praktikum kali ini diantaranya yaitu : 2.3.1 Cara kerja uji kuantitas DNA 1. Disiapkan alat nanofotometer. 2. Dibersihkan (kuvet dan lid) dengan menggunakan kim wipes. 3. Kuvet dipasang dan dinyalakan “ON”. 4. Pilih “Nanovolume” → “Nucleic Acid” → dsDNA→ Lidfaktor = 10, Dilution = 5000, Units=ng/μL. 5. Dibersihkan sisid alam kuvet. 6. Diambil1μL buffer TE dengan menggunakan pipet. 7. Diteteskan pada bagian atas kuvet. 8. Ditutup dengan Lid 10 faktor. 9. Ditekan “Blank” hingga konsentrasi 0,000. 10. Lid dibuka, dan dilap menggunakan kim wipes. Bagian bawah dan atas permukaan kuvet ditutup. 11. DNA sampel diambil sebanyak 1μL. 12. Ditekan tombol “sampel”. 13. Dicatat kemurnian (A260/A280), dicatat konsentrasi. 14. Setiap pergantian sampel, kuvet dilap dengan kim wipes. 15. Ditekan “escape” untuk keluar. 2.3.2 Cara kerja uji kualitas DNA



1. Disiapkan alat dan bahan 2. Ditimbang bubuk agarose sesuai kebutuhan =1% Agarose = 1/100 x 40 mL = 0,4 gram 3. Dituang TAE 0,5x sebanyak 40 mL dengan gelas ukur. 4. Dimasukkan bubuk agarose kedalam 40 mL TAE 0,5x. 5. Dilarutkan hingga homogeny dengan menggunakan hotplate 6. Erlenmeyer didinginkan pada air mengalir hingga hangat, ditambahkan 0,5 μL gel red. 7. Dimasukkan larutan kedalam cetakan, ditunggu hingga gel mengeras1520 menit. 8. Cetakkan dipindahkan kedalam tangki yang berisi TAE 0,5x. 9. Diambil loading dye 2 μL dan DNA 8 μL pada alumunium 10. Sampel diresus (dimix), lalu diinjeksikan pada sumurgel. 11. Diset 55 volt dengan waktu 40menit.



BAB III HASIL DAN PEMBAHASAN 3.1 Hasil Hasi Uji Kuantitastas DNA Kelas A



Kelas B



Kelas C



Samp



Konsentr



Kemurni



Samp



Konsentr



Kemurni



Samp



Konsentr



Kemurni



el



asi



an



el



asi



an



el



asi



an



(ng/μL)



(ng/μL)



(ng/μL)



MW1 MW2



-



(A260/28 0) -



IR1 IR2



276



(A260/28 0) 1,542



MW1 MW2



207 -



(A260/28 0) 1,562 -



PG3



-



-



PG3



-



-



MW3



150



2,05



PG4



-



-



PG4



-



-



MW4



-



-



IR5



-



-



IR5



-



-



PG5



136,6



2,074



IR6



190



1,526



IR6



-



-



PG6



104,8



2,15



Hasil Uji Kualitas DNA



Keterangan Sampel: MW1 = Mentik Wangi 1 (Kelas A) IR6 = IR 6 (Kelas A) IR2 = IR 2 (Kelas C) MW3 = Mentik Wangi 3 (Kelas C) PG6 = Pare gajah 6 (Kelas C) L = DNA Ladder Sampel 1-5 adalah DNA sampel tanaman padi hasil PCR Sampel 6-10 adalah DNA sampel tanaman padi setelah diencerkan 10x kemudian di PCR 3.2 Pembahasan Praktikum kali ini adalah praktikum lanjutan sebelumnya. Bahan yang akan di uji DNA nya adalah DNA yang berasal dari daun tanaman padi. Bagian yang digunakan adalah daun karena daun memiliki kloroplas dimana mengandung DNA. Pada praktikum sebelumnya melakukan ekstrasi, isolasi dan purifikasi DNA. Isolasi DNA merupakan cara ataupun metode yang digunakan untuk memisahkan DNA dari sel, baik dari inti, mitokondria maupun kloroplas. Praktikum isolasi DNA diawali dengan proses ekstraksi DNA jaringan tanaman, yaitu daun tanaman padi. Ekstraksi DNA dapat dilakukan dengan berbagai metode, baik konvensional maupun menggunakan kit. Ekstraksi DNA secara konvensional bisa dilakukan antara lain dengan metode CTAB/NaCl (Mulyani dkk., 2011), Menurut Sunarno et al. (2014) DNA yang diekstrak harus terbebas dari senyawa kontaminan seperti polisakarida, polifenol, dan tanin yang seringkali ikut terbawa dan dapat menghambat kerja beberapa enzim dalam kegiatan molekuler. Pada praktikum mengenai uji kuantitas DNA ini menggunakan alat bernama nanophotometer. Alat tersebut dapat digunakan untuk mengetahui nilai absorbansi larutan dari sampel berupa asam nukleat (DNA/RNA), protein, dan sel (OD600). Uji kuantitatif merupakan metode analisis untuk mengukur konsentrasi suatu senyawa berdasarkan kemampuan senyawa tersebut mengabsorbsi berkas sinar atau cahaya. Spektofotometer menghasilkan sinar dari spektrum dengan panjang gelombang tertentu (Fatchiyah, 2011). Pada praktikum uji kuantitas DNA kami menggunakan alat nanofotometer dengan panjang gelombang 260 nm – 280 nm. Dimana menurut Teare (2009) mengatakan bahwa uji kuantitatif DNA merupakan analisis untuk mementukan kandungan atau jumlah DNA yang terdapat di dalam suatu sampel. DNA dan RNA menyerap pada panjang gelombang maksimal 260 nm, sementara protein menyerap kuat pada gelombang 180 nm. Selain itu, asam nukleat dapat menyerap secara signifikan pada panjang gelombang 280 nm dan sebagian protein dapat menyerap kuat pada 260 nm. Sehingga untuk mengukur dengan akurat konsentrasi DNA, RNA, dan protein dalam suatu campuran yang kompleks bukan hal yang mudah. Berdasarkan data hasil praktikum dengan panjang gelombang 260 nm - 280 nm, dari ketiga sampel yang telah dilakukan uji kuantitas DNA memiliki hasil kemurnian DNA yaitu, pada sampel 1 (kelas A) memiliki nilai kemurnian DNA yaitu 1,526 dengan konsentrasi DNA 190 µg/ml, kemudian pada sampel 2 (kelas B) memiliki nilai kemurnian DNA yaitu tidak ada dengan konsentrasi DNA tidak ada. Dan pada sampel 3 (kelas C) memiliki nilai kemurnian DNA yang paling tinggi yaitu 2,15 dengan konsentrasi DNA 104,8 µg/ml. Rendahnya nilai kemurnian DNA yang diukur dapat terjadi karena sampel yang diuji terkontaminasi oleh protein. Hal ini sesuai dengan pendapat Teare (2009), yang mengatakan bahwa, pengukuran absorbansi pada panjang gelombang 260 nm dan 280 nm dapat memberikan validasi kemurnian sampel asam



nukleat dengan nilai 1,8 untuk DNA dan 2,0 untuk RNA yang mengindikasikan sampel murni. Nilai yang rendah akan menunjukkan adanya kontaminan lain atau terdapatnya protein. Kemudian Gardner (1991) mengatakan bahwa absorbansi spektrofotometri adalah teknik yang cepat dan akurat untuk menentukan konsentrasi sampel DNA murni. Hal ini menjadi kurang akurat ketika sampel DNA mengandung protein, RNA, oligonukleotida primer atau nukleotida. RNA, primer dan nukleotida menyerap kuat pada 260 nm dan tidak bisa dibedakan dari DNA. Kontaminan seperti protein dapat menyebabkan kelebihan isi DNA dalam sampel campuran. Masalah ini dapat diatasi dengan menggunakan metode alternatif untuk mengukur DNA saja dalam sampel dan dapat diatasi juga dengan menambahkan suatu senyawa berfluoresensi, yaitu DNA quant 200. Metode pemurnian sampel (DNA) juga dapat dilakukan secara kimiawi, yaitu dengan cara merusak sel kemudian diberi buffer lisis yang berisi senyawa kimia yang dapat merusak integritas barrier dinding sel, senyawa kimia yang dipakai diantaranya lisosom, EDTA (etilen diamin, tetra asetat), Tris-CL atau deterjen, SDS (sodium dosecycle sulphate). Dari hasil praktikum yang didapat dari analisis kuantitatif DNA yaitu, nilai kemurnian DNA berkisar 1,526 hingga 2,15. Sehingga DNA dapat dikatakan memiliki tingkat kemurnian DNA yang rendah. Hal ini menunjukkan bahwa masih banyak terdapat pengotor fenol dan protein. DNA yang murni memiliki rasio 1,8. Apabila nilai rasio lebih dari 1,8 menunjukkan adanya RNA, hal ini karena RNA juga diserap pada panjang gelombang yang sama yaitu λ260 - λ280 nm. Berdasarkan nilai absorbansi pada ʎ =260 nm dari ketiga sampel DNA tersebut, dapat dikatakan DNA kromosomal ketiga sampel yang diisolasi memiliki tingkat kemurnian yang rendah dan kurang bersih. Menurut Tarigan, dkk (2011), secara teoritis sampel DNA yang dianggap cukup murni memiliki perbandingan A260/A280 = 1,8-2,0. Tingkat kemurnian DNA yang rendah dapat dimungkinkan terdapatnya kontaminasi fenol. Rasio OD 260/OD 280 < 1,8 menunjukkan adanya kontaminasi fenol atau protein hasil ekstraksi. Kemudian menurut Mulyani (2011) mengatakan bahwa pada umumnya pemurnian DNA dilakukan dengan penambahan larutan fenol, klorofom, dan isoamil alcohol yang berfungsi untuk menghilangkan senyawa yang dapat mengkontaminasi DNA. Pemurnian DNA dengan penambahan fenol dan kloroform berguna untuk mengendapkan protein dengan melalui proses sentrifugasi dan dihancurkan secara enzimatis dengan protease. DNA yang telah dibersihkan dari protein menggunakan fenol, masih bercampur dengan RNA sehingga perlu ditambahkan RNAse untuk membersihkan DNA dari RNA, karena ekstraksel mengandung protein dan RNA disamping DNA dalam jumlah yang besar (Thermo Scientific, 2009). Praktikum uji kuantitatif DNA tidak menggunakan penambahan enzim RNAse sehingga kemungkinan masih banyaknya RNA yang terkandung di dalam sampel, sehingga menyebabkan nilai kemurnian kedua DNA bakteri tersebut kurang dari 1,8. Pada analisis uji kualitas DNA kita menggunakan alat atau metode yang bernama elektroforsis. Secara singkat, elektroforesis adalah suatu teknik pemisahan molekul selular berdasarkan ukurannya, dengan menggunakan medan listrik yang dialirkan pada suatu medium yang mengandung sampel yang dipisahkan. Teknik ini dapat digunakan dengan memanfaatkan muatan listrik yang ada pada makromolekul, misalnya DNA yang bermuatan negative. Menurut Handoyo (2001) prinsip kerjanya adalah jika molekul yang bermuatan negatif (DNA) dilewatkan melalui suatu medium, misalnya gel agarose, kemudian dialiri arus listrik dari satu kutub ke kutub yang berlawanan muatannya (positif), maka molekul tersebut akan bergerak dari kutub negatif ke kutub positif (Elektroforesis) melalui membran matriks gel agarose tersebut.



Menurut Tarigan (2011) terdapat dua macam teknik elektroforesis yang telah berkembang yaitu, elektroforesis horizontal maupun vertical.Berdasarkan jenisnya ada dua macam elektroforesis yaitu: 1. Elektroforesis bebas (free electrophoresis) merupakan molekul atau partikel yang akan dipisahkan tersebar di seluruh larutan. Pemberian arus listrik pada larutan yang mengandung partikel tersebut akan menyebabkan terbentuknya batas di antara dua larutan. 2. Elektroforesis zona merupakan jenis elektroforesis yang paling banyak digunakan, mempergunakan media penunjang, seperti kertas, selulosa asetat, agarose atau poliakrilamid Dalam praktikum ini jenis elektroforesis yang digunakan adalah elektroforesis zona dan menggunakan teknik elektroforesis horizontal karena menggunakan gel agarose yang diletakkan pada alat elektroforesis secara horizontal dan teknik ini difungsikan untuk analisais DNA. Menurut Sari (2013) kelebihan metode ini adalah mudahnya mengamati reaksi kimia selama proses berlangsung, sampel dapat ditangani dengan baik dan cepat, gel dari hasil percobaan dapat disimpan dalam kantong plastik dan didinginkan setelah percobaan, sehingga dapat dipakai untuk dokumentasi penting yang dapat dipelajari lebih lanjut di lain waktu, dan beberapa kelebihan lainnya. Selain kelebihan, metode ini juga memiliki kekurangan, yaitu rawan terjadi kesalahan pada proses pemindahan campuran sampel ke dalam slot gel, karena slot gel ukurannya sangat kecil. Teknik elektroforesis gel ini dimulai dengan pembuatan gel agarose 1%. Proses pembuatan gel agarose 1% dilakukan dengan cara mencampurkan bubuk agarose dengan larutan buffer TAE 0,5x sebanyak 40 ml, selanjutnya diberikan 0,5 µl gel red dan kemudian dituangkan ke dalam cetakan yang telah disiapkan dengan comb-nya dan tunggu sampai mengeras. Bubuk agarose yang digunakan sebanyak 0,4 gr dan larutan running buffer TAE 0,5x (Trisasetat-EDTA) sebanyak 40 mL yang berperan untuk memudahkan migrasi dari fragmen DNA berdasarkan perbedaan kekuatan ionik (Magdeldin, 2012). Setelah gel mengeras, gel dimasukkan ke dalam ruang elektroforesis dan dilakukan penambahan running buffer. Penambahan running buffer dilakukan dengan tujuan mempermudah pengerasan gel saat dilakukan pemanasan (Gardner, 1991). Tahap selanjutnya adalah mencampurkan DNA dengan loading buffer yang memiliki fungsi membantu sampel turun ke dalam well dan membantu memonitor berapa lama proses elektroforesis telah berlangsung karena memiliki pewarna bromofenol merah (Magdeldin, 2012). Selanjutnya dilakukan penuangan campuran loading buffer dengan produk DNA sebanyak 8µl dan juga larutan marker sebanyak 2µl pada sumur/well yang telah dibentuk pada gel. Sedangkan untuk marker dituang pada dua sisi ujung (atas dan bawah) well yang ada. Proses pemindahan dilakukan dengan memakai mikropipet dan harus dilakukan secara hati-hati agar campuran DNA dengan loading buffer tidak melebihi batas ke bagian well yang lain. DNA memiliki muatan negatif (DNA mengandung gugus PO4) sehingga diharapkan akan bergerak menuju kutub positif. Marker adalah segmen DNA yang spesifik dan telah diketahui ukurannya. Marker berfungsi sebagai acuan untuk mengetahui ukuran DNA hasil ampifikasi. Marker DNA yang terdapat di dalam ruang elektroforesis berfungsi sebagai penanda posisi pasangan basa dari molekul DNA yang bermigrasi. Marker-marker DNA tersebut merupakan marker yang telah dibuat oleh pabrik sehingga tanda pasangan basanya jelas. Salah satu contoh marker DNA adalah lambda HindIII. Marker tersebut memiliki delapan fragmen DNA dengan kisaran 125 pb hingga 23.130 pb (Martin, 1996). Berdasarkan dari hasil uji kualitas DNA terlihat bahwa semua sampel yang di uji memiliki pita DNA pada Marker (M). Hasil pada sampel DNA murni yaitu MW 1, IR6, IR2, MW3 terlihat bahwa sampel-sampel tersebut memiliki pita DNA namun ukuran dab posisi pita DNA nya belum dapat terlihat, hal ini dikarenakan pita DNA tersebut



berbentuk bulat, tebal dan bergerombol sehingga sulit untuk terbaca. Kemudian hasil pada sampel DNA + PCR yaitu sampel 1-5 memiliki pita DNA yang sudah berbentuk elips atau fibril, namun pita DNAyang terlihat masih bergerombol sehingga masih terlihat tebal, jadi masih agak sulit terbaca ukuran dan posisi DNA nya. Sedangkan pada DNA yang diencerkan 10x + PCR yaitu sampel 6-10 memiliki bentuk pita DNA elips atau fibril dan bentuknya sangat tipis sehingga DNA nya dapat terbaca ukuran dan posisisnya. Cara membaca pita DNA tersebut yaitu berdasarkan DNA ladder nya, pita DNA akan terbaca apabila pita DNA tersebut berbentuk elips atau fibril serta tidak bergerombol dengan DNA yang lain (terlihat tipis) sehingga dapat terlihat posisi DNA yang sejajar dengan DNA laddernya. Pada praktikum ini pita DNA yang terbaca yaitu pada sampel DNA yang diencerkan 10x + PCR, DNA tersebut sejajar dengan DNA leadernya yaitu memiliki posisi yang agak naik ke atas sehingga memiliki ukuran sekitar 500 bp. Diberitahukan oleh asisten praktikum bahwa pada praktikum ini DNA ladder yang digunakan kurang bagus, karena kurang terbaca hasilnya di PCR. Hal ini dikarenakan DNA ladder yang digunakan sudah cukup lama. Menurut Sunarno et al (2014) dalam proses elektoforesis terdapat beberapa faktor yang mempengaruhi laju pergerakan dari molekul DNA, yaitu: 1. Ukuran Molekul DNA, molekul yang berukuran lebih kecil akan cepat bergerak melewati gel karena hambatan yang akan dihadapi tidak lebih banyak dibandingkan molekul berukuran besar. 2. Konsentrasi gel, semakin tinggi konsentrasi agarosa, semakin kaku gel yang dibuat sehingga sukar untuk dilewati molekul-molekul DNA. Konsentrasi agarosa yang lebih tinggi memudahkan pemisahan DNA yang berukuran kecil, konsentasi agarosa yang lebih rendah memudahkan pemisahan DNA dengan ukuran yang lebih besar. 3. Bentuk molekul, molekul yang memiliki bentuk elips atau fibril akan lebih cepat bergerak dibandingkan dengan yang berbentuk bulat. 4. Densitas muatan, densitas muatan yaitu muatan per unit volume molekul. Molekul dengan densitas muatan tinggi akan bergerak lebih cepat dibandingkan molekul dengan densitas muatan yang rendah. 5. Pori-pori gel, semakin kecil pori-pori gel yang digunakan, semakin lambat pergerakan molekul DNA. 6. Voltase, semakin tinggi tegangan listrik yang diberikan, semakin cepat pergerakan molekul DNA. 7. Larutan buffer elektroforesis, buffer dengan kadar ion tinggi akan menaikkan konduktansi listrik sehingga mempercepat migrasi DNA BAB IV PENUTUP 4.1 Simpulan Berdasarkan praktikum yang telah dilakukan, maka dapat disimpulkan bahwa pada uji kuantitas DNA, nilai kemurnian DNA berkisar 1,526 hingga 2,15. Sehingga DNA dapat dikatakan memiliki tingkat kemurnian DNA yang rendah. Hal ini menunjukkan bahwa masih banyak terdapat pengotor fenol dan protein. DNA yang murni memiliki rasio 1,8. Apabila nilai rasio lebih dari 1,8 menunjukkan adanya RNA, hal ini karena RNA juga diserap pada panjang gelombang yang sama yaitu λ260 - λ280 nm. Kemudian paja uji kualitas DNA, ini pita DNA yang terbaca yaitu pada sampel DNA yang diencerkan 10x + PCR, DNA tersebut sejajar dengan DNA leadernya yaitu memiliki posisi yang agak naik ke atas sehingga memiliki ukuran sekitar 500 bp. Diberitahukan oleh asisten praktikum bahwa pada praktikum ini DNA ladder yang



digunakan kurang bagus, karena kurang terbaca hasilnya di PCR. Hal ini dikarenakan DNA ladder yang digunakan sudah cukup lama. 4.2 Saran Saran untuk praktikum ini yaitu sebelum dimulainya praktikum para praktikan harus sudah menguasai materi yang akan menjadi dasar dari praktikum. Hal ini diwajibkan karena agar praktikum dapat berjalan dengan baik dan benar. DAFTAR PUSTAKA Fatchiyah, Estri, L. A, Sri, W., dan Sri, R. 2011. Biologi Molekular Prinsip Dasar Analisis. Erlangga. Jakarta. Gardner, E.J., M.J. Simmons, & D.P Snustad. 1991. Principles of genetics 8th ed. John Wiley & Sons Inc., New York. Handoyo, D. & R. Ari. 2001. Prinsip umum dan pelaksanaan Polymerase Chain Reaction (PCR). PCR 9: 17-28. Jean, Francois Giot. 2010. Agarose Gel Electrophoresis – Aplications in Clinical Chemistry. Journal of Medical Biochemistry 2010; 29 (1). Magdeldin, Sameh. 2012. Gel Electrophoresis - Principles and Basics. InTech Publisher : Rijeka, Croatia. Martin, R. 1996. Gel electrophoresis: Nucleid acids. Bros Scientific Publishers Ltd., Oxford. Mulyani, Y., A. Purwanto dan I. Nurruhwati. 2011. Perbandingan Beberapa Metode Isolasi DNA untuk deteksi didi Koi Herpes Virus (KHV) pada Ikan Mas (Cyprinus caprio L.). J. Akuatika Vol. 2 (1). Purwantara. 2001. Genetika, Biokimia, dan Biologi Molekuler. PT Rineka Cipta. Bandung. Sambrook, J and Russell. 2001. Fragment DNA in Bacterial System. pp 29-37 in Maniatis T, Fritsch EF (eds). Molecular Cloning A Laboratory Manual. USA: Cold Spring Harbor Laboratory. Sari, Yuni Nurisva Maya., Syukur, Sumaryati dan Jamsari. 2013. Isolasi, Karakteristik, dan Identifikasi DNA Bakteri Asam Laktat (BAL) yang Berfungsi Sebagai Aantimikroba dari Fermentasi Markisa Kuning (Passiflora edulis var. flavicarpa). Jurusan Kimi FMIPA Universitas Andalas. Sunarno et al. 2014. Metode Cepat Ekstraksi DNA Corynebacterium diphtheria untuk Pemeriksaan PCR. Departemen Mikrobiologi Klinik. Fakultas Kedokteran Universitas Indonesia. Tarigan, Simson. 2011. Penggunaan Polymerase Chain Reaction Enzyme Linked Oligonucelotide Sorbent Assay (PCR-ELOSA) untuk Deteksi Agen Penyakit. WARTAZOA Vol. 21, No.1. Teare, J.M. et al. 2009. Measurement of Nucleic Acid Concentration Using the DyNa QuantTM and the GenequantTM. BioTechniques. 1997;22(6):1170-1171. Thermo Scientific. 2009. Thermo Scientific Pierce Cell Lysis Technical Handbook : Featuring Cell Lysis Reagent and Detergents Vol. 11, No.8



LAMPIRAN



Lampiran 1. Stavolt



Lampiran 5.



Lampiran 2. Proses PCR



Lampiran 3. Tangki elektroforesis dan gel agarose 1%



Lampiran 6. Bahanbahan PCR



Lampiran 7. Proses penambahan mix PCR pada DNA sampel



Lampiran 4. Proses spektrofotometer



Lampiran 8. Hasil uji kualitas DNA



LAMPIRAN HITUNG Pengenceran DNA 10x DNA = 5 μL Nucleid Water = 45μL Total = 50 μL Pembuatan TAE 0,5x TAE 1x = TAE 10x = 25 mL = Aquades = 225mL Total = 250 mL Untuk menjadi TAE 0,5x maka ditambah aquades kembali sebanyak 250 mL Pembuatan Gel Agarose 1% sebanyak 40 mL Agarose = 1 x 40 mL = 0,4 gram bubuk agarose 100