Makalah Elisa [PDF]

Citation preview

MAKALAH TEKNIK IMMUNOASSAY Enzim-Linked Immunosorbent Assay (ELISA)



Disusun untuk memenuhi tugas mata kuliah Mikrobiologi Terapan yang dibina oleh Prof. Dr. Dra. Utami Sri Hastuti, M.Pd



Kelompok 4/Off B Haryatin Nurul Afifah



190341864411



Lidiya Praktika Rosa



190341864447



Mahathir Muhammad



190341864423



Zurienia Mimi Bibiyana 190341864402



PROGRAM STUDI MAGISTER PENDIDIKAN BIOLOGI PASCASARJANA UNIVERSITAS NEGERI MALANG NOVEMBER 2019



i



KATA PENGANTAR



Puji syukur penulis panjatkan ke hadirat Allah SWT, yang telah melimpahkan



rahmat,



taufik



dan



hidayah-Nya sehingga penulis



dapat



menyelesaikan makalah dengan judul “Teknik Immunoassay”. Makalah ini diselesaikan untuk memenuhi Tugas Mata Kuliah Ekologi dan Menejemen Lingkungan. Pada kesempatan ini penulis mengucapkan terima kasih kepada Prof. Dr. Dra. Utami Sri Hastuti, M.Pd selaku dosen pengampu mata kuliah Mikrobiologi Terapan yang banyak membantu dan membimbing penulis. Penyusunan makalah ini tentu masih terdapat kekurangan dan kesalahan. Untuk itu penulis berharap adanya masukan yang bersifat inovatif dan konstruktif agar makalah ini menjadi lebih sempurna. Di samping itu penulis berharap agar hasil tugas ini nantinya dapat berguna bagi semua pihak khususnya kalangan pendidikan.



Malang, November 2019 Penulis



ii



DAFTAR ISI



HALAMAN JUDUL ....................................................................................i KATA PENGANTAR ............................................................................... ii DAFTAR ISI ............................................................................................. iii BAB I PENDAHULUAN ........................................................................... 1 1.1 Latar Belakang ....................................................................................... 1 1.2 Rumusan Masalah .................................................................................. 2 1.3 Tujuan ................................................................................................... 2 BAB II KAJIAN PUSTAKA ...................................................................... 3 2.1 Pengertian Metode ELISA ...................................................................... 4 2.2 Jenis-Jenis Metode ELISA...................................................................... 5 2.3 Prinsip Kerja Metode ELISA ................................................................ 10 2.4 Alat dan Bahan dalam Metode ELISA.................................................. 11 2.5 Cara Kerja Metode ELISA ................................................................... 12 2.6 Kelebihan dan Kekurangan Metode ELISA .......................................... 13 BAB III PENUTUP .................................................................................. 16 3.1 Kesimpulan........................................................................................... 16 3.2 Saran..................................................................................................... 16 DAFTAR RUJUKAN ............................................................................... 17



iii



iv



BAB I PENDAHULUAN



1.1



Latar Belakang Reaksi antigen dan antibodi bersifat spesifik. Antigen akan breaksi hanya



dengan antibodi yang khas untuk antigen tersebut. Spesifitas yang tinggi ini, rekasi anatara antigen dan antibodi dapat digunakan untuk mengindentifikasi salah satu menggunakan satu lainya. Spesifitas ini merupakan dasar reaksi serologis. Reaksi silang yang mungkin terjadi antara antigen yang berhubungan dapat membatasi spesifitas tes. Immunoassays secara umum dapat dibagi menjadi yang tidak berlabel dan berlabel.



Kebanyakan teknik tanpa label didasarkan pada reaksi imun



sekunder, seperti, misalnya, presipitasi dan aglutinasi. Mereka diukur dengan metode hamburan cahaya atau partikel. Immunoassay berlabel didasarkan pada reaksi imun primer (Porstmann & Kiessig, 1992). Immunoassay adalah metode bioanalitik di mana kuantitasi analit tergantung pada reaksi antigen (analit) dan antibodi. Pada prinsipnya, metode ini didasarkan pada pengikatan kompetitif yang mengikat antara jumlah tetap bentuk berlabel dari analit dan jumlah variabel analit sampel tidak berlabel untuk jumlah terbatas dari situs pengikatan pada antibodi anti-analit yang sangat spesifik Ketika reagen immunoanalytical ini dicampur dan diinkubasi, analit terikat pada antibodi yang membentuk kompleks imun. Kompleks ini dipisahkan dari fraksi reagen tidak terikat dengan teknik pemisahan fisik atau kimia. Analisis dilakukan dengan mengukur aktivitas label (mis. Radiasi, fluoresensi, atau enzim) di salah satu fraksi terikat atau bebas. Kurva standar, yang merepresentasikan sinyal terukur sebagai fungsi konsentrasi analit tak berlabel dalam sampel dikonstruksi. Konsentrasi analit yang tidak diketahui ditentukan dari kurva kalibrasi ini (Darwish, 2006). Pada tahap awal penemuan dan pengembangan obat, terutama selama studi farmakokinetik klinis untuk kandidat obat baru, diperlukan skrining sejumlah besar sampel. Ini hanya dapat dicapai dengan menggunakan metode analitik throughput tinggi (20-22). Analisis matriks biologis kompleks (mis. Darah dan urine) dengan metode immunoassay, yang didasarkan pada reaksi pengikatan tertentu, dapat dicapai tanpa pretreatment untuk sampel (23-25).



Meskipun pengembangan



1



metode imunoassay baru untuk analit dapat memakan waktu berbulan-bulan (karena waktu yang dibutuhkan untuk menghasilkan antibodi yang diinginkan), namun, begitu reagen immuoanalitik yang sesuai tersedia, metode immunoassay dapat dibuat dalam kerangka waktu yang bersaing dengan metode kromatografi. Selanjutnya, teknik baru dikembangkan untuk memungkinkan produksi antibodi spesifik secara cepat. Imunoassay digunakan untuk menghitung secara kuantitatif malikula-kuman dari kepentingan biklogikal berdasarkan spesifisitas dan selektivitas reagen antibodi yang dihasilkan. Dalam proyek Hrrs dan timbal aptinmizatoe, pengujian dirancang untuk mendeteksi molekul yang diproduksi secara intraseluler atau disekresikan sebagai tanggapan terhadap penyaringan ciupoinds (Cox, 2011). Salah satu metode yang diguanakn dalam teknik Immunoassay adalah Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA). ELISA adalah salah satu dari beberapa metode yang digunakan di laboratorium untuk mendeteksi dan mengukur molekul tertentu. ELISA mengandalkan pada kemampuan yang melekat dari suatu antibodi untuk mengikat pada struktur spesifik suatu molekul. Untuk mengoptimalkan ELISA dan di dapatkan sensitivitas dan rentang dinamis yang diperlukan untuk pengujian khusus yang sedang dikembangkan, semuanya berbagai komponen pengujian harus dievaluasi. Komponen akan bervariasi tergantung pada immunoassay format yang dipilih. Berikut ini adalah deskripsi dari berbagai jenis format ELISA serta reagen yang perlu dioptimalkan untuk mendapatkan pengujian yang kuat (Cox, 2011). Makalah ini menjelaskan mengenai jenis, prinsip kerja, cara kerja dan kelebihan serta kekurangan metode ELISA.



1.2



Rumusan Masalah Berdasarkan latar belakang masalah di atas, maka rumusan masalah yang



dapat diajukan adalah sebagai berikut: 1. Apa itu metode ELISA? 2. Apa saja jenis-jenis ELISA? 3. Bagaimana prinsip kerja dari metode ELISA? 4. Apa alat dan bahan yang digunakan dalam metode ELISA?



2



5. Bagaimana cara kerja metode ELISA? 6. Apa kelebihan dan kekurangan dari metode ELISA?



1.3



Tujuan Berdasarkan rumusan masalah yang ada maka tujuan dari makalah ini adalah:



1. Mengetahui pengertian ELISA 2. Mengetahui jenis-jenis ELISA 3. Mengetahui prinsip kerja dari metode ELISA 4. Mengetahui alat dan bahan yang digunakan dalam metode ELISA 5. Mengetahui cara kerja dari ELISA 6. Mengetahui kelebihan dan kekurangan dari ELISA



3



BAB II KAJIAN PUSTAKA



2.1



Pengertian Metode ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay) Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA) adalah suatu teknik biokimia



yang terutama digunakan dalam bidang imunologi untuk mendeteksi kehadiran antibodi atau antigen dalam suatu sampel. ELISA telah digunakan sebagai alat diagnostik dalam bidang medis, patologi tumbuhan, dan juga berbagai bidang industri. Dalam pengertian sederhana, sejumlah antigen yang tidak dikenal ditempelkan pada suatu permukaan, kemudian antibodi spesifik dicucikan pada permukaan tersebut, sehingga akan berikatan dengan antigennya. Antibodi ini terikat dengan suatu enzim, dan pada tahap terakhir, ditambahkan substansi yang dapat diubah oleh enzim menjadi sinyal yang dapat dideteksi. Dalam ELISA fluoresensi, saat cahaya dengan panjang gelombang tertentu disinarkan pada suatu sampel, kompleks antigen/antibodi akan berfluoresensi sehingga jumlah antigen pada sampel dapat disimpulkan berdasarkan besarnya fluoresensi. Penggunaan ELISA melibatkan setidaknya satu antibodi dengan spesifitas untuk antigen tertentu. Sampel dengan jumlah antigen yang tidak diketahui diimobilisasi pada suatu permukaan solid (biasanya berupa lempeng mikrotiter polistirene), baik yang non-spesifik (melalui penyerapan pada permukaan) atau spesifik (melalui penangkapan oleh antibodi lain yang spesifik untuk antigen yang sama, disebut ‘sandwich’ ELISA). Setelah antigen diimobilisasi, antibodi pendeteksi ditambahkan, membentuk kompleks dengan antigen. Antibodi pendeteksi dapat berikatan juga dengan enzim, atau dapat dideteksi secara langsung oleh antibodi sekunder yang berikatan dengan enzim melalui biokonjugasi. Di antara tiap tahap, plate harus dicuci dengan larutan deterjen lembut untuk membuang kelebihan protein atau antibodi yang tidak terikat. Setelah tahap pencucian terakhir, dalam plate ditambahkan substrat enzimatik untuk memproduksi sinyal yang visibel, yang menunjukkan kuantitas antigen dalam sampel. Teknik ELISA yang lama menggunakan substrat kromogenik, meskipun metode-metode terbaru mengembangkan substrat fluorogenik yang jauh lebih sensitif .



4



2.2



Jenis-Jenis Metode ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay) Secara umum, teknik ELISA dibedakan menjadi dua jenis, yaitu teknik



ELISA kompetitif yang menggunakan konjugat antigen-enzim atau konjugat antibodi-enzim, dan teknik ELISA nonkompetitif yang menggunakan dua antibodi (primer dan sekunder). Pada teknik ELISA nonkompetitif, antibody kedua (sekunder) akan dikonjugasikan dengan enzim yang berfungsi sebagai signal. Teknik ELISA nonkompetitif ini seringkali disebut sebagai teknik ELISA sandwich. Teknik ELISA telah berkembang menjadi berbagia macam jenis teknik. Perkembangan ini didasari pada tujuan dari dilakukannya uji dengan teknik ELISA tersebut sehingga dapat diperoleh hasil yang optimal. Berikut ini adalah beberapa macam teknik ELISA yang relatif sering digunakan, antara lain: ELISA Direct, ELISA Indirect, ELISA Sandwich (Salazar, 2017).



Gambar 1. ELISA assays 2.2.1 ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay) Direct Teknik ELISA ini merupakan teknik ELISA yang paling sederhana. Teknik ini seringkali digunakan untuk mendeteksi dan mengukur konsentrasi antigen pada sampel ELISA direct menggunakan suatu antibody spesifik (monoklonal) untuk mendetaksi keberadaan antigen yang diinginkan pada sampel yang diuji. Pada ELISA direct, pertama microtiter diisi dengan sampel yang mengandung antigen yang diinginkan, sehingga antigen tersebut dapat menempel pada bagian dindingdinding lubang microtiter, kemudian microtiter dibilas untuk membuang antigen yang tidak menempel pda dinding lubang microtiter. Lalu antibodi yang telah



5



ditautkan dengan enzim signal dimasukkan ke dalam lubang lubang microtiter sehingga dapat berinteraksi dengan antigen yang diinginkan, yang dilanjutkan dengan membilas microtiter untuk membuang antibody tertaut enzim signl yang tidak berinteraksi dengan antigen. Lalu, ke dalam lubang-lubang microtiter tersebut ditambahkan substrat yang dapat bereaksi dengan enzim signal, sehingga enzim yang tertaut dengan antibodi yang telah berinteraksi dengan antigen yang diinginkan akan berinteraksi dengan substrat dan menimbulkan signal dapat dideteksi. Pendeteksian interaksi antara antibodi dengan antigen tersebut selanjutnya dapat dihitung dengan menggunakan kolorimetri, chemiluminescent, atau fluorescent end-point. 2.2.2 ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay) Indirect ELISA Indirect ini pada dasarnya juga merupakan teknik ELISA yang paling sederhana, hanya saja dalam teknik ELISA indirect yang dideteksi dan diukur konsentrasinya merupakan antibody. ELISA indirect menggunakan suatu antigen spesifik (monoklonal) serta antibody sekunder spesifik tertaut enzim signal untuk mendeteksi keberadaan antibody yang diinginkan pada sampel yang diuji. Tahap umum yang digunakan dalam ELISA indirect untuk mendeterminasi konsentrasi antibodi dalam serum adalah: a. Suatu antigen yang sudah dikenal dan diketahui konsentrasinya ditempelkan pada permukaan lubang plate mikrotiter. Antigen tersebut akan menempel pada permukaan plastik dengan cara adsorpsi. Sampel dari konsentrasi antigen yang diketahui ini akan menetapkan kurva standar



yang digunakan untuk



mengkalkulasi konsentrasi antigen dari suatu sampel yang akan diuji. b. Suatu larutan pekat dari protein non-interacting, seperti bovine serum albumin (BSA) atau kasein, ditambahkan dalam semua lubang plate mikrotiter. Tahap ini dikenal sebagai blocking, karena protein serum memblok adsorpsi nonspesifik dari protein lain ke plate. c. Lubang plate mikrotiter atau permukaan lain kemudian dilapisi dengan sampel serum dari antigen yang tidak diketahui, dilarutkan dalam buffer yang sama dengan yang digunakan untuk antigen standar. Karena imobilisasi antigen dalam tahap ini terjadi karena adsorpsi non-spesifik, maka konsentrasi protein total harus sama dengan antigen standar.



6



d. Plate dicuci, dan antibodi pendeteksi yang spesifik untuk antigen yang diuji dimasukkan dalam lubang. Antibodi ini hanya akan mengikat antigen terimobilisasi pada permukaan lubang, bukan pada protein serum yang lain atau protein yang terbloking. e. Antibodi sekunder, yang akan mengikat sembarang antibodi pendeteksi, ditambahkan dalam lubang. Antibodi sekunder ini akan berkonjugasi menjadi enzim dengan substrat spesifik. Tahap ini bisa dilewati jika antibodi pendeteksi berkonjugasi dengan enzim. f. Plate dicuci untuk membuang kelebihan konjugat enzim-antibodi yang tidak terikat. g. Dimasukkan substrat yang akan diubah oleh enzim untuk mendapatkan sinyal kromogenik/ fluorogenik/ elektrokimia. h. Hasil dikuantifikasi dengan spektrofotometer, spektrofluorometer atau alat optik/ elektrokimia lainnya. Enzim bertindak sebagai amplifier, bahkan jika hanya sedikit antibodi terikat enzim yang tetap terikat, molekul enzim akan memproduksi berbagai molekul sinyal. Kerugian utama dari metode indirect ELISA adalah metode imobilisasi antigennya non-spesifik, sehingga setiap protein pada sampel akan menempel pada lubang plate mikrotiter, sehingga konsentrasi analit yang kecil dalam sampel harus berkompetisi dengan protein serum lain saat pengikatan pada permukaan lubang. ELISA indirect dapat dilihat pada gambar berikut:



Gambar 2. Indirect ELISA (Sumber: Lakna, 2018)



7



2.2.3 ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay) Sandwwich Teknik ELISA jenis ini menggunakan antibody primer spesifik untuk menangkap antigen yang diinginkan dan antibody sekunder tertaut enzim signal untuk mendeteksi keberadaan antigen yang diinginkan. Pada dasarnya, prinsip kerja dari ELISA sandwich mirip dengan ELISA direct, hanya saja pada ELISA sandwich, larutan antigen yang diinginkan tidak perlu dipurifikasi. Namun, karena antigen yang diinginkan tersebut harus dapat berinteraksi dengan antibody primer spesifik dan antibody sekunder spesifik tertaut enzim signal, maka teknik ELISA sandwich ini cenderung dikhususkan pada antigen memiliki minimal 2 sisi antigenic (sisi interaksi dengan antibodi) atau antigen yang bersifat multivalent seperti polisakarida atau protein. Pada ELISA sandwich,antibody primer seringkali disebut sebagai antibody penangkap, sedangkan antibody sekunder seringkali disebut sebagai antibody penangkap, sedangkan antibody sekunder seringkali disebut sebagai antibody deteksi. ELISA sandwich lebih banyak dimanfaatkan untuk mendeteksi keberadaan antigen multivalent yang kadarnya sangat rendah pada suatu larutan dengan tingkat kontaminasi tinggi. Hal ini disebabkan ELISA sandwich memiliki tingkat sensitivitas tinggi terhadap antigen yang diinginkan akibat keharusan dari antigen tersebut untuk berinteraksi dengan kedua antibody. Tahapan dalam Sandwich ELISA adalah sebagai berikut: a. Disiapkan permukaan untuk mengikatkan antibodi ‘penangkap’ b. Semua non spesifik binding sites pada permukaan diblokir c. Sampel berisi antigen dimasukkan dalam plate d. Plate dicuci untuk membuang kelebihan antigen yang tidak terikat e. Antibodi primer ditambahkan, supaya berikatan secara spesifik dengan antigen f. Antibodi sekunder yang berikatan dengan enzim dimasukkan, yang akan berikatan dengan antibodi primer. g. Plate dicuci, sehingga konjugat antibodi-enzim yang tidak terikat dapat dibuang. h. Ditambahkan reagen yang dapat diubah oleh enzim menjadi sinyal berwarna/ berfluoresensi/ elektrokimia. i. Diukur absorbansinya untuk menetukan kehadiran dan kuantitas dari antigen



8



Faktor yang mempengaruhi tingkat sensitivitas dari hasil pengujian dengan teknik ELISA sandwich, antara lain : a. Banyak molekul antibody penangkap yang berhasil menempel pada dindingdinding microtiter. b. Avinitas dari antibody penangkap dan antibody detector terhadap antigen sebenarnya, teknik ELISA sandwich ini merupakan pengembangan dari teknik ELISA terdahulu, yaitu ELISA direct. Prinsip kerja sandwich ELISA dapat dilihat pada skema berikut ini:



Gambar 3. Prinsip kerja Sandwich ELISA Keterangan: 1. Plate dilapisi dengan antibodi penangkap yang cocok. Buffer blocking ditambahkan ke situs pengikatan protein yang tersisa di piring 2. Sampel ditambahkan ke wadah dan setiap antigen yang ada terikat oleh antibodi penangkap 3. Antibodi pendeteksi berlabel biotin yang cocok ditambahkan ke plate dan juga mengikat antigen yang ada di sumur 4. Ultra Aidin HRPO ditambahkan dan mengikat antibodi deteksi berlabel biotin 5. Media TMB ditambahkan dan dikonversi oleh HRPO ke bentuk yang dapat dideteksi.



9



2.3



Prinsip kerja Metode ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay) Berbagai kombinasi antigen-antibodi yang digunakan dalam ELISA selalu



termasuk antigen atau antibodi berlabel enzim, dan aktivitas enzim diukur secara kolorimetri. Aktivitas enzim diukur dengan menggunakan substrat yang berubah warna ketika dimodifikasi oleh enzim (Medical and Biological Laboratory, 2017). Penyerapan cahaya produk yang terbentuk setelah penambahan substrat diukur dan dikonversi ke nilai numerik. Prinsip dasar dari teknik ELISA ini secara simple dapat dijabarkan sebagai berikut:



Gambar 4. Prinsip sederhana ELISA



Apabila menggunakan kit dengan pelat yang sudah dilapisi antibodi, ELISA dimulai dengan langkah pelapisan, di mana lapisan pertama terdiri dari antigen target atau antibodi, diadsorpsi ke dalam pelat polistiren 96-well. Hal ini diikuti oleh langkah pemblokiran di mana semua site yang tidak terikat dilapisi dengan agen pemblokiran. Setelah serangkaian pencucian, pelat diinkubasi dengan antibodi yang terkonjugasi enzim. Serangkaian pencucian lainnya menghilangkan semua antibodi yang tidak terikat. Substrat kemudian ditambahkan, menghasilkan sinyal kalorimetri dan akhirnya pelat dapat dibaca (ELISA Handbook, -). Pengujian menggunakan pengikatan permukaan untuk pemisahan, beberapa pencucian diulang dalam setiap langkah ELISA untuk menghilangkan bahan yang tidak terikat. Selama proses ini, sangat penting bahwa kelebihan cairan dihilangkan untuk mencegah pengenceran larutan yang ditambahkan pada langkah pengujian



10



berikutnya. Untuk memastikan keseragaman, mesin pencuci pelat khusus sering digunakan. ELISA bisa sangat kompleks dan mencakup beberapa langkah intervensi, terutama ketika mengukur konsentrasi protein dalam sampel heterogen seperti darah. Langkah paling kompleks dan bervariasi dalam proses keseluruhan adalah deteksi, di mana beberapa lapisan antibodi dapat digunakan untuk memperkuat sinyal (ELISA Handbook, -).



2.4



Alat dan Bahan Metode ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay)



Alat dan bahan yang digunakan dalam metode ELISA antara lain: 2.4.1 Bahan Metode ELISA Kit ELISA yang terdiri dari: a. Plate ELISA yang telah dilapisi (coated) dengan antibodi atau antigen b. Antigen yang dimurnikan (jika sampel yang hendak dideteksi atau dikuantifikasi berupa antibodi). c. Antibodi yang dimurnikan (jika sampel yang hendak dideteksi atau dikuantifikasi berupa antigen). d. Larutan standard (kontrol positif dan negatif). e. Sampel yang ingin diuji. f. Standar antibiotik g. Konjugate atau enzim penanda h. Substrat yang bersifat spesifik terhadap enzim signal i. Larutan pencuci ( Buffer ) j. Larutan penghenti reaksi (stop solution) 2.4.2 Alat Metode ELISA a. Timbangan b. Gelas ukur c. Single mikro pipet 5-50 µl, 50-1000 µl d. Multi channel mikro pipet 5-50 µl, 50-300 µl e. Bak reservoar f. Homogenizer/stomacher/mortar, g. Sentrifuger atau filter h. Penangas air



11



i. Inkubator j. ELISA Plate washer atau labu semprot k. ELISA Plate Reader dengan filter panjang gelombang 400-600 nm untuk pengukuran kuantitatif l. Komputer



2.5



Cara Kerja Metode ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay) Berikut ini adalah contoh langkah kerja beberapa macam teknik ELISA,



yaitu: a. Pendeteksian antibodi dengan ELISA indirect: 1. Melapisi mikrotiter plate dengan antigen yang sudah dimurnikan dengan membiarkan larutan berisi antigen menempel pada dinding/permukaan selama 30-60 menit. 2. Membilas antigen yang tidak terikat dengan buffer. 3. Melapisi sisi-sisi tertentu yang mungkin tidak spesifik dilekati oleh antigen dengan protein yang tidak berhubungan/tidak spesifik (seperti larutan susu bubuk). 4. Membilas protein yang tidak melekat. 5. Menambahkan sampel serum yang akan



dideteksi



antibodinya



dan



membiarkan antibody spesifik untuk berikatan dengan antigen. 6. Membilas antibody yang tidak terikat. 7. Menambahkan anti-Ig yang akan berikatan pada daerah Fc pada antibody yang spesifik (sebagai contoh, anti-rantai gamma manusia yang berikatan dengan IgG manusia). Daerah Fc pada anti-Ig akan berikatan secara kovalen dengan enzim. 8. Membilas kompleks antibody-enzim yang tidak terikat. 9. Menambahkan substrat chromogenic: substrat yang tidak berwarna yang terikat ke enzim akan dikonversi menjadi produk. 10. Inkubasi sampai muncul warna. 11. Ukur dengan spectrometer. Jika semakin pekat warna yang dideteksi, maka makin besar kadar antibody spesifik dalam sampel.



12



b. Pendeteksian antigen dengan ELISA sandwich: 1. Melapisi mikrotiter plate dengan antibodi yang sudah dimurnikan dengan membiarkan larutan berisi antigen menempel pada dinding/permukaan selama 30-60 menit. 2. Membilas antibodi yang tidak terikat dengan buffer. 3. Melapisi sisi-sisi tertentu yang mungkin tidak spesifik dilekati oleh antigen dengan protein yang tidak berhubungan tidak spesifik (seperti larutan susu bubuk). 4. Membilas protein yang tidak melekat. 5. Menambahkan sampel yang akan dideteksi antigennya dan membiarkan antibodi untuk berikatan dengan antigen spesifik dari sampel. 6. Membilas antigen yang tidak terikat. 7. Menambahkan antibody yang telah terlabeli dengan enzim dan bersifat spesifik untuk epitope yang berbeda pada antigen sampel, sehingga terbentuk sandwich. 8. Membilas antibody-enzim yang tidak terikat. 9. Menambahkan substrat chromogenic: substrat yang tidak berwarna yang terikat. 10. Inkubasi sampai muncul warna. 11. Ukur dengan spektrofotometer. Jika semakin pekat warna yang terdeteki, maka makin besar kadar antigen spesifik dalam sampel.



2.6



Kelebihan dan Kekurangan ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay) Berikut merupakan penjelasan mengenai kelebihan dan kekurangan dari



masing-masing jenis metode ELISA. 2.6.1 ELISA Direct ELISA direct memiliki beberapa kelemahan, antara lain: a. Immunoreaktifitas antibodi kemungkinan akan berkurang akibat bertaut dengan enzim. b. Penautan enzim signal ke setiap antibodi menghabiskan waktu dan mahal.



13



c. Tidak memiliki fleksibilitas dalam pemilihan tautan enzim (label) dari antibodi pada percobaan yang berbeda. d. Amplifikasi signal hanya sedikit. e. Larutan yang mengandung antigen yang diinginkan harus dimurnikan sebelum digunakan untuk uji ELISA direct. Sedangkan kelebihan dari ELISA direct antara lain: a. Metodologi yang cepat karena hanya menggunakan 1 jenis antibody. b. Kemungkinan terjadinya kegagalan dalam uji ELISA akibat reaksi silang dengan antibody lain (antibody sekunder) dapat diminimalisasi. 2.6.2 ELISA Indirect ELISA indirect memiliki kelemahan, antara lain: membutuhkan waktu pengujian yang relative lebih lama daripada ELISA direct karena ELISA indirect membutuhkan 2 kali waktu inkubasi yaitu pada saat terjadi interaksi antara antigen spesifik dengan antibody yang dinginkan dan antara antibody yang diinginkan dengan antibody sekunder tertaut enzim signal, sedangkan pada ELISA direct hanya membutuhkan 1 kali waktu inkubasi yaitu pada saat terjadi interaksi antara antigen yang diinginkan dengan antibody spesifik tertaut enzim signal. Sedangkan kelebihan dari ELISA indirect antara lain: a. Terdapat berbagai macam variasi antibody sekunder yang terjual secar komersial di pasar. b. Immunoreaktifitas dari antibody yang diinginkan (target) tidak terpengaruh oleh penautan enzim signal ke antibody sekunder karena penautan dilakuka pada wadah berbeda. c. Tingkat sensitivitas meningkat karena setiap antibody yag diinginkan memiliki beberapa epitop yang bisa berinteraksi dengan antibody sekunder. 2.6.3 ELISA Sendwich Kelebihan teknik ELISA sandwich ini pada dasarnya berada pada tingkat sensitivitasnya yang relatif lebih tinggi karena antigen yang diinginkan harus dapat berinteraksi dengan dua jenis antibody, yaitu antibody penangkap dan antibody detector, kemampuannya menguji sampel yang tidak murni, dan mampu mengikat secara selektif antigen yang dikehendaki. Tanpa lapisan pertama



14



antibodi penangkap, semua jenis protein pada sampel (termasuk protein serum) dapat diserap secara kompetitif oleh permukaan lempeng, menurunkan kuantitas antigen yang terimobilisasi. Namun demikian, teknik ELISA sandwich ini juga memiliki kelemahan, yaitu teknik ini hanya dapat diaplikasikan untuk medeteksi antigen yang bersifat multivalent serta sulitnya mencari dua jenis antibody yang dapat berinteraksi antigen yang sama pada sisi antigenic yang berbeda (epitopnya harus berbeda).



15



BAB III PENUTUP 3.1



Kesimpulan



1. Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA) adalah suatu teknik biokimia yang terutama digunakan dalam bidang imunologi untuk mendeteksi kehadiran antibodi atau antigen dalam suatu sampel. 2. Metode ELISA yang relatif sering digunakan, antara lain: ELISA Direct, ELISA Indirect, ELISA Sandwich. 3. Prinsip kerja ELISA: Pertama antigen atau antibodi yang hendak diuji ditempelkan pada suatu permukaan yang berupa microtiter. Penempelan tersebut dapat dilakukan melalui dua cara, yaitu penempelan secara non spesifik dengan adsorbs ke permukaan microtiter, dan penempelan secara spesifik dengan menggunakan antibody atau antigen lain yang bersifat spesifik dengan antigen atau antibodi yang diuji. 4. Metode



ELISA



memiliki



kelebihan



dan



kekurangan



dalam



proses



pemeriksaannya.



3.2



Saran Sebaiknya dilakukan kajian referensi yang lebih mendalam lagi agar



mencapai penjelasan dan hasil analisis yang lebih runtut, terstruktur, dan komperhensif. Selain itu juga sebaiknya dilakukan peningkatan dalam hal pemilihan bahasa agar makalah lebih mudah dipahami oleh pembaca



16



DAFTAR RUJUKAN Cox, K. L. 2011. Immunoassay Development, Optimization and Validation Flow Chart. ImmunoAssay Methods, (Md), 1–38. Darwish, I. A. 2006. Immunoassay Methods and their Applications in Pharmaceutical Analysis: Basic Methodology and Recent Advances. International Journal of Biomedical Science: IJBS, 2 (3), 217–235. Retrieved from http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/23674985%0Ahttp://www.pubmedc entral.nih.gov/articlerender.fcgi?artid=PMC3614608. ELISA Handbook. -. Principle, Troubleshooting, Sample Preparation and Assay Protocols. Boster. Online. https://www.bosterbio.com/media/pdf/ELISA_Handbook.pdf Diakses pada 15 November 2019. Lakna. 2018. What is the Difference Between Direct and Indirect ELISA. https://pediaa.com/what-is-the-difference-between-direct-and-indirect-elisa/ (Diakses pada tanggal 14 November 2019). Medical and Biological Laboratory. 2017. The principle and method of ELISA. Online. https://ruo.mbl.co.jp/bio/e/support/method/elisa.html diakses pada 15 November 2019. Porstmann, T., & Kiessig, S. T. 1992. Enzyme immunoassay techniques an overview. Journal of Immunological Methods, 150(1–2), 5–21. https://doi.org/10.1016/0022-1759(92)90061-W. Salazar, A., Henry, V., Julio A, & Maria C. J. 2017. Allergen-Based Diagnostic: Novel and Old Methodologies with New Approaches. Intech. http://dx.doi.org/10.5772/intechopen.69276.



17