Makalah PCR [PDF]

Citation preview

BAB I PENDAHULUAN 1.1 Latar Belakang Perkembangan ilmu pengetahuan dan teknologi dewasa ini berkembang semakin pesat.Salah satu perkembangan ilmu pengetahuan dan teknologi yang sering diterapkan adalah bioteknologi. Bioteknologi merupakan pemanfaatan berbagai prinsip ilmiah dan rekayasa terhadap organisme, sistem, atau proses biologis untuk menghasilkan atau meningkatkan potensi organisme maupun menghasilkan produk dan jasa bagi kepentingan hidup manusia. Secara umum bioteknologi dikelompokkan menjadi dua, yaitu bioteknologi tradisional dan bioteknologi modern. Bioteknologi tradisional merupakan bioteknologi yang memanfaatkan mikroba, proses biokimia, dan proses genetik yang terjadi secara alami. Bioteknologi tradisional ini terus mengalami perkembangan hingga ditemukannya struktur DNA yang diikuti dengan penemuan lainnya.Dengan ditemukannya struktur DNA dan berkembangnya ilmu pengetahuan tentang DNA, muncullah istilah bioteknologi modern. Bioteknologi modern merupakan bioteknologi yang didasarkan pada manipulasi atau rekayasa DNA. Bioteknologi yang didasarkan pada manipulasi DNA ini dilakukan dengan memodifikasi gen spesifik dan memindahkannya pada organisme yang berbeda, seperti bakteri, hewan, dan tumbuhan. Produk dari bioteknologi



modern,



misalnya



insulin,



kloning



domba



Dolly,



antibodi



monoklonal.Dalam aplikasinya, bioteknologi menerapkan berbagai macam disiplin ilmu. Disiplin ilmu tersebut antara lain: mikrobiologi (tentang mikroba), biologi sel (tentang sel), genetika (tentang pewarisan sifat makhluk hidup), dan biokimia (tentang makhluk hidup dilihat dari aspek kimianya). Salah satu pokok bahasan yang penting untuk di pahami yaitu mengenai Polymerase Chain Reaction atau yang lebih dikenal dengan istilah PCR.PCR adalah suatu metode in vitro untuk menghasilkan sejumlah fragmen DNA spesifik dengan panjang dan jumlah skuens 1



yang



telah



ditentukandari



jumlah



kecil



template



kompleks.



PCR merupakan suatu teknik sangat kuat dan sangat sensitif dan dapat diaplikasikan dalam berbagai bidang seperti biologi molekuler, genetika populasi, dan analisis forensik. Mengingat peningnya peranan teknik PCR ini terhadap perkembangan ilmu pengetahuan kedepan, maka dalam makalah ini akan dibahas tentang teknik PCR, prinsip-prinsip PCR, pertimbangan penggunaan PCR, dan manfaat PCR. 1.2 Rumusan Masalah 1. Apa yang dimaksud dengan Polymerase Chain Reaction (PCR) dan H. pylori? 2. Apasaja tahapan-tahapan Polymerase Chain Reaction (PCR)? 3. Alat dan bahan apa saja yang dibutuhkan dalam Polymerase Chain Reaction (PCR)? 4. Apakah komponen-komponen yang dibutuhkan dalam proses Polymerase Chain Reaction (PCR)? 5. Apa saja variasi dari Polymerase Chain Reaction (PCR)? 6. Apa saja manfaat dari Polymerase Chain Reaction (PCR)? 7. Bagaimana mendeteksi H. Pylori dengan menggunakan metode (PCR). 8. Apa saja peralatan,bahan dan prosedur yang digunakan dalam proses (PCR)?



1.3 Tujuan 1. Untuk mengetahui apa yang dimaksud dengan Polymerase Chain Reaction (PCR) dan H. pylori. 2. Untuk mengetahui apa saja tahapan-tahapan Polymerase Chain Reaction (PCR). 3. Untuk mengetahui alat dan bahan apa saja yang dibutuhkan dalam Polymerase Chain Reaction (PCR). 4. Untuk mengetahui apakah komponen-komponen yang dibutuhkan dalam proses Polymerase Chain Reaction (PCR). 5. Untuk mengetahui apa saja variasi dari Polymerase Chain Reaction (PCR). 6. Untuk mengetahui apa saja manfaat dari Polymerase Chain Reaction (PCR). 7. Untuk mengetahui cara mendeteksi H.pylori menggunakan metode (PCR). 2



8. Untuk mengetahui peralatan,bahan dan prosedur yang digunakan dalam proses (PCR).



3



BAB II PEMBAHASAN



2.1 Definisi Polymerase Chain Reaction (PCR) dan H. pylori Reaksi berantai polimerase atau lebih umum dikenal sebagai PCR (Polymerase Chain Reaction) merupakan suatu teknik atau metode perbanyakan (replikasi) DNA secara enzimatik tanpa menggunakan organisme. Dengan teknik ini, DNA dapat dihasilkan dalam jumlah besar dengan waktu relatif singkat sehingga memudahkan berbagai teknik lain yang menggunakan DNA. Teknik ini dirintis oleh Kary Mullis pada tahun 1983 dan ia memperoleh hadiah Nobel pada tahun 1994 berkat temuannya tersebut. Penerapan PCR banyak dilakukan di bidang biokimia dan biologi molekular karena relatif murah dan hanya memerlukan jumlah sampel yang kecil. Polymerase Chain Reaction (PCR), merupakan suatu proses sintesis enzimatik untuk mengamplifikasi nukleotida secara in vitro. Metode PCR dapat meningkatkan jumlah urutan DNA ribuan bahkan jutaan kali dari jumlah semula. Setiap urutan basa nukleotida yang diamplifikasi akan menjadi dua kali jumlahnya. Kunci utama pengembangan PCR adalah menemukan bagaimana cara amplifikasi hanya pada urutan DNA target dan meminimalkan amplifikasi urutan non-target. Pada dasarnya reaksi PCR adalah tiruan dari proses replikasi DNA in vivo, yaitu dengan adanya pembukaan rantai DNA (denaturasi) utas ganda, penempelan primer (annealing) dan perpanjangan rantai DNA baru (extension) oleh DNA polimerase dari arah terminal 5’ ke 3’. Hanya saja pada teknik PCR tidak menggunakan enzim ligase dan primer RNA. Secara singkat, teknik PCR dilakukan dengan cara mencampurkan sampel DNA dengan primer oligonukleotida, deoksiribonukleotida trifosfat (dNTP), enzim termostabil Taq DNA polimerase dalam larutan DNA yang sesuai, kemudian menaikkan dan menurunkan suhu 4



campuran secara berulang beberapa puluh siklus sampai diperoleh jumlah sekuens DNA yang diinginkan. Menurut Erlich (1989) PCR adalah suatu metode in vitro yang digunakan untuk mensintesis sekuens tertentu DNA dengan menggunakan dua primer oligonukleotida yang menghibridisasi pita yang berlawanan dan mengapit dua target DNA. Kesederhanaan dan tingginya tingkat kesuksesan amplifikasi sekuens DNA yang diperoleh menyebabkan teknik ini semakin luas penggunaannya. PCR didasarkan pada amplifikasi enzimatik fragmen DNA dengan menggunakan dua oligonukleotida primer yaitu komplementer dengan ujung 5’dari dua untaian skuen target.Oligonukleotida ini digunakan sebagai primer (primer PCR) untuk memungkikan DNA template dikopi oleh DNA polimerase.Untuk mendukung terjadinya annealing primer ini pada template pertama kali diperlukan untuk



memisahkan



untaian



DNA



substrat



melalui



pemanasan.



Hampir semua aplikasi PCR mempekerjakan DNA polimerase yang stabil terhadap panas, seperti polimerase Taq. Awalnya enzim diisolasi dari bakteri Aquaticus Thermus. DNA polimerase enzimatis ini merakit sebuah untai DNA baru dari pembangunan blok DNA, nukleotida , dengan menggunakan DNA beruntai tunggal sebagai template dan oligonukleotida DNA (juga disebut primer DNA ), yang dibutuhkan untuk inisiasi sintesis DNA. Sebagian besar metode PCR menggunakan siklus termal , yaitu, bergantian pemanasan dan pendinginan sampel PCR untuk serangkaian langkah pasti suhu. Langkah-langkah siklus termal yang diperlukan pertama yang secara fisik memisahkan dua helai dalam heliks ganda DNA pada suhu tinggi dalam proses yang disebut DNA leleh .Pada suhu yang lebih rendah, masing-masing untai kemudian digunakan sebagai template dalam sintesis DNA oleh polimerase DNA untuk selektif memperkuat DNA target.Selektivitas hasil PCR dari penggunaan primer yang komplementer ke wilayah yang ditargetkan untuk amplifikasi DNA di bawah kondisi spesifik siklus termal. 5



Helicobacter pylori (H. pylori) adalah suatu bakteri yang menyebabkan peradangan lapisan lambung yang kronis (gastritis) pada manusia. Bakteri ini juga adalah penyebab yang paling umum dari borok-borok (ulcers) diseluruh dunia. H. pylori adalah bakteri Gram negatif, berbentuk spiral dengan panjang 2,55,O pm dan lebar 0,5-1,O pm, mempunyai 4-6 flagela pada ujung selnya dan pada setiap ujung flagela terdapat bulb, bergerak aktif seperti pembuka tutup botol, dan tidak membentuk spora. Bakteri ini mengalami adaptasi untuk dapat hidup dalam mukus lambung yang bersuasana asam kuat (pH asam lambung berhsar antara 1,72,O) dengan cara menghasilkan enzim urease yang sangat kuat dan akan memecahkan urea yang ada dalam mukus lambung menjadi amonia dan bikarbonat yang bersifat busa2. Sel bakteri H. pylori akan diliputi awan amonia yang terbentuk sehingga dapat bertahan hidup dalam suasana asam.Bakteri ini juga menghasilkan protease yang mempengaruhi mukosa lambung yang mengakibatkan menurunnya kemampuan asam lambung berdifusi melewati lendir. H. pylori berbentuk pleomorfik, yaitu dapat ditemui dalam beberapa bentuk. Dalam lambung keadaan normal akan berbentuk spiral atau batang bengkok. 2.2 Tahapan-Tahapan Polymerase Chain Reaction (PCR) Proses PCR terdiri dari tiga tahapan, yaitu denaturasi DNA templat, penempelan (annealing) primer, dan polimerisasi (extension) rantai DNA. Denaturasi merupakan proses pemisahan utas ganda DNA menjadi dua utas tunggal DNA yang menjadi cetakan (templat) sebagai tempat penempelan primer dan tempat kerja DNA polimerase, dengan pemanasan singkat pada suhu 90-95°C selama beberapa menit. Penjelasan ringkas tentang setiap siklus reaksi PCR adalah sebagai berikut:  Denaturasi. Selama proses denaturasi, DNA untai ganda akan membuka menjadi dua untai tunggal. Hal ini disebabkan karena suhu denaturasi yang tinggi 6



menyebabkan



putusnya



ikatan



hidrogen



diantara



basa-basa



yang



komplemen.Pada tahap ini, seluruh reaksi enzim tidak berjalan, misalnya reaksi polimerisasi pada siklus yang sebelumnya.Denaturasi biasanya dilakukan antara suhu 90 C – 95̊ C.  Penempelan Primer. Pada tahap penempelan primer (annealing), primer akan menuju daerah yang spesifik yang komplemen dengan urutan primer. Pada proses annealing ini, ikatan hidrogen akan terbentuk antara primer dengan urutan komplemen pada templat. Proses ini biasanya dilakukan pada suhu 50oC – 60oC. Selanjutnya, DNA polymerase akan berikatan sehingga ikatan hidrogen tersebut akan menjadi sangat kuat dan tidak akan putus kembali apabila dilakukan reaksi polimerisasi selanjutnya, misalnya pada 72oC.  Reaksi Polimerisasi (extension). Umumnya, reaksi polimerisasi atau perpanjangan rantai ini, terjadi pada suhu 72oC. Primer yang telah menempel tadi akan mengalami perpanjangan pada sisi 3’nya dengan penambahan dNTP yang komplemen dengan templat oleh DNA polimerase. Jika siklus dilakukan berulang-ulang maka daerah yang dibatasi oleh dua primer akan di amplifikasi secara eksponensial (disebut amplikon yang berupa untai ganda), sehingga mencapai jumlah copy yang dapat dirumuskan dengan (2n)x. Dimana n adalah jumlah siklus dan x adalah jumlah awal molekul DNA. Jadi, seandainya ada 1 copy DNA sebelum siklus berlangsung, setelah satu siklus, akan menjadi 2 copy, sesudah 2 siklus akan menjadi 4, sesudah 3 siklus akan menjadi 8 kopi dan seterusnya. Sehingga perubahan ini akan berlangsung secara eksponensial. PCR dengan menggunakan enzim Taq DNA polimerase pada akhir dari setiap siklus akan menyebabkan penambahan satu nukleotida A pada ujung 3’ dari potongan DNA yang dihasilkan. Sehingga nantinya produk PCR ini dapat di kloning dengan menggunakan vektor yang 7



ditambahkan nukleotida T pada ujung-ujung 5’-nya.Proses PCR dilakukan menggunakan suatu alat yang disebut thermocycler.



Gambar 01.Proses Amplikasi Secara Eksponensial. Selain ketiga proses tersebut, secara umum PCR didahului dan diakhiri oleh tahapan berikut:  Pra-Denaturasi Dilakukan selama 1-9 menit di awal reaksi untuk memastikan kesempurnaan denaturasi dan mengaktifasi DNA Polymerase (jenis hot-start alias baru aktif kalau dipanaskan terlebih dahulu).  Final Elongasi Biasanya dilakukan pada suhu optimum enzim (70-72oC) selama 5-15 menit untuk memastikan bahwa setiap utas tunggal yang tersisa sudah diperpanjang secara sempurna. Proses ini dilakukan setelah siklus PCR terakhir.



8



Gambar 02. Siklus Polymerase Chain Reactions (PCR)



2.3 Alat dan Bahan yang Dibutuhkan dalam Polymerase Chain Reaction (PCR) Reagen khusus yang dibutuhkan dalam pelaksanaan proses PCR secara in vitro antara lain : 1. Pasangan primer oligonukleotida sintetik mengapit urutan yang akan diamplifikasi 2. Buffer PCR 5X (250 mM KCl, 50 mM Tris-HCl pH 8,3, 7,5 mM MgCl2) 3. Campuran dari empat dNTP (dGTP, dATP, dTTP, dCTP) masing-masing sebesar 2,5 mM (ultra murni DNTP set, Pharmacia # 27-2035-01). DNTP campuran dibuat dengan volume 10 mM larutan dari masing-masing empat dNTP terpisah yang digabung. 4. Taq DNA Polymerase (AmpliTaqTM, Perkin-Elmer/Cetus) 5. Minyak mineral ringan 9



6. Akrilamida (grade elektroforesis) 7. N, N’-Methylenebisacrylamide (grade elektroforesis, Ultra-Pure/BRL, # 5516UB) 8. Amonium persulfat (Ultra-Pure/BRL, # 5523UA) 9. TEMED (N, N, N’N ‘Tetramethylethylenediamine, Ultra-Murni / BRL, # 5524UB) Peralatan khusus yang yang dibutuhkan dalam pelaksanaan PCR antara lain: 1. Mighty-small II SE-250 vertical gel electrophoresis unit (Hoefer) 2. Perkin-Elmer/Cetus Thermal Cycler 3. Sterile Thin-wall 0.5 ml Thermocycler microfuge tubes: (TC-5, Midwest Scientific) 2.4 Komponen-Komponen Polymerase Chain Reaction (PCR) beberapa komponen-komponen PCR antara lain: 1. Enzim DNA Polymerase Dalam sejarahnya, PCR dilakukan dengan menggunakan Klenow fragment DNA Polimerase I selama reaksi polimerisasinya. Enzime ini ternyata tidak aktif secara termal selama proses denaturasi, sehingga peneliti harus menambahkan enzim di setiap siklusnya. Selain itu, enzim ini hanya bisa dipakai untuk perpanjangan 200 bp dan hasilnya menjadi kurang spesifik.Untuk mengatasi kekurangan tersebut, dalam perkembangannya kemudian dipakai enzim Taq DNA polymerase yang memiliki keaktifan pada suhu tinggi. Oleh karenanya, penambahan enzim tidak perlu dilakukan di setiap siklusnya, dan proses PCR dapat dilakukan dalam satu mesin 2. Primer Primer merupakan oligonukleotida pendek rantai tunggal yang mempunyai urutan komplemen dengan DNA templat yang akan diperbanyak. Panjang primer 10



berkisar antara 20-30 basa.Untuk merancang urutan primer, perlu diketahui urutannukleotida pada awal dan akhir DNA target.Primer oligonukleotida di sintesis menggunakan suatu alat yang disebut DNA synthesizer. 3. Reagen lainnya Selain enzim dan primer, terdapat juga komponen lain yang ikut menentukan keberhasilan reaksi PCR. Komponen tersebut adalah dNTP untuk reaksi polimerisasi, dan buffer yang mengandung MgCl2. Konsentrasi ion Mg2+dalam campuran reaksi merupakan hal yang sangat kritis. Konsentrasi ion Mg2+ ini sangat mempengaruhi proses primer annealing, denaturasi, spesifisitas produk, aktivitas enzim dan fidelitas reaksi. 2.5 Variasi dari Polymerase Chain Reaction (PCR) Ada banyak variasi dari PCR yang umum di kenal, antara lain:  Alel-spesifik PCR : atau kloning teknik diagnostik yang didasarkan pada nukleotida polimorfisme tunggal (SNP) Hal ini membutuhkan pengetahuan sebelumnya dari urutan DNA, termasuk perbedaan antara alel , dan menggunakan primer yang 3 'berakhir meliputi SNP. amplifikasi PCR dalam kondisi ketat jauh kurang efisien dalam adanya ketidaksesuaian antara template dan primer, amplifikasi sukses jadi dengan kehadiran sinyal primer spesifik-SNP dari SNP spesifik secara berurutan.  Polymerase Cycling Assembly (PCA): sintesis buatan urutan DNA yang panjang dengan melakukan PCR di kolam oligonukleotida panjang dengan segmen tumpang tindih pendek. The oligonukleotida bergantian antara rasa dan arah antisense, dan segmen tumpang tindih menentukan urutan fragmen PCR, sehingga selektif menghasilkan produk DNA panjang akhir.  Asymmetric PCR : Menguatkan satu untai DNA dalam template DNA beruntai ganda. Hal ini digunakan dalam sequencing dan hibridisasi probing amplifikasi hanya satu dari dua untai komplementer diperlukan. PCR dilakukan seperti 11



biasa, tetapi dengan kelebihan besar primer untuk untai yang ditargetkan untuk amplifikasi. Karena (lambat aritmatika amplifikasi) kemudian dalam reaksi setelah membatasi primer telah digunakan Facebook, siklus PCR tambahan yang diperlukan.  Amplifikasi tergantung helikase : mirip dengan PCR tradisional, tetapi menggunakan suhu konstan daripada bersepeda melalui denaturasi dan annealing / siklus ekstensi. DNA helikase , sebuah enzim yang unwinds DNA, digunakan di tempat denaturasi termal.  Hot Start PCR : teknik yang mengurangi amplifikasi non-spesifik selama proses set up awal tahapan PCR. Ini dapat dilakukan secara manual dengan memanaskan komponen reaksi terhadap temperatur leleh (misalnya, 95°C) sebelum menambahkan polimerase. Khusus sistem enzim telah dikembangkan yang menghambat polimerase, aktivitas pada suhu sekitar, baik oleh mengikat dari antibodi atau oleh kehadiran inhibitor yang terikat kovalen yang terdisosiasi hanya setelah suhu aktivasi langkah-tinggi. Hot-start/cold-finish PCR dicapai dengan polimerase hibrida baru yang tidak aktif pada suhu kamar dan akan segera diaktifkan pada suhu perpanjangan.  PCR spesifik Intersequence (ISSR): metode PCR untuk sidik jari DNA yang memperkuat daerah antara mengulangi urutan sederhana untuk menghasilkan sidik jari yang unik dengan panjang fragmen diperkuat.  Inverse PCR : umumnya digunakan untuk mengidentifikasi urutan mengapit sekitar genom sisipan. Ini melibatkan serangkaian digestions DNA dan ligasi diri, sehingga diketahui pada urutan kedua ujung urutan tidak diketahui.  Mediated PCR Ligasi : menggunakan linker DNA kecil diligasikan dengan DNA kepentingan dan beberapa primer anil ke linker DNA, tetapi telah digunakan untuk sekuensing DNA , berjalan genom , dan DNA footprinting.  PCR spesifik Metilasi (MSP): dikembangkan oleh Stephen Baylin dan Jim Herman di Johns Hopkins School of Medicine dan digunakan untuk mendeteksi metilasi dari CpG pulau dalam DNA genom. DNA pertama diobati dengan natrium bisulfit, yang mengubah unmethylated basa sitosin ke urasil, yang 12



diakui oleh primer PCR sebagai timin. Dua PCR kemudian dilakukan pada DNA dimodifikasi, menggunakan primer set identik kecuali pada setiap pulau CpG dalam urutan primer. Pada titik-titik ini, satu set primer mengakui DNA dengan sitosin untuk mengamplifikasi DNA alkohol, dan satu set mengakui DNA dengan urasil atau timin untuk mengamplifikasi DNA unmethylated. MSP menggunakan qPCR juga dapat dilakukan untuk mendapatkan informasi kuantitatif daripada kualitatif tentang metilasi.  Miniprimer PCR : menggunakan polimerase termostabil (S-TBR) yang dapat memperpanjang dari primer pendek ("smalligos") sesingkat 9 atau 10 nukleotida. Metode ini memungkinkan menargetkan untuk mengikat PCR primer daerah yang lebih kecil, dan digunakan untuk memperkuat sekuens DNA, seperti atau eukariotik 18S rRNA).  Multiplex Ligasi-dependent Probe Amplifikasi (MLPA): izin beberapa sasaran diperkuat dengan hanya sepasang primer tunggal, sehingga menghindari keterbatasan resolusi PCR multipleks.  Multiplex-PCR : terdiri dari beberapa set primer dalam campuran PCR tunggal untuk menghasilkan amplikon dari berbagai ukuran yang spesifik untuk sekuens DNA yang berbeda. Dengan penargetan gen sekaligus, informasi tambahan dapat diperoleh dari lari-tes tunggal yang tidak akan membutuhkan beberapa kali reagen dan lebih banyak waktu untuk melakukan. temperatur Annealing untuk masing-masing set primer harus dioptimalkan untuk bekerja dengan benar dalam reaksi tunggal, dan ukuran amplikon. Artinya, panjangnya pasangan basa harus berbeda cukup untuk membentuk band yang berbeda ketika divisualisasikan dengan elektroforesis gel .  Nested PCR : meningkatkan kekhususan amplifikasi DNA, dengan mengurangi latar belakang karena khusus non amplifikasi DNA. Dua set primer yang digunakan dalam dua PCR berturut-turut. Dalam reaksi pertama, sepasang primer digunakan untuk menghasilkan produk DNA, yang selain target yang dimaksud, masih dapat terdiri dari fragmen DNA non-khusus diperkuat. Produk (s) yang kemudian digunakan dalam PCR kedua dengan satu set primer yang 13



mengikat situs sebagian atau seluruhnya berbeda dari dan terletak 3 'dari masing-masing primer yang digunakan dalam reaksi pertama. Nested PCR sering lebih berhasil dalam memperkuat fragmen spesifik DNA yang panjang dari PCR konvensional, tapi membutuhkan pengetahuan lebih rinci tentang urutan target.  Tumpang tindih-ekstensi PCR atau Penyambungan tumpang tindih ekstensi (BUMN): sebuah rekayasa genetika teknik yang digunakan untuk splice bersama lebih fragmen DNA atau dua yang berisi urutan komplementer. Hal ini digunakan untuk bergabung dengan potongan DNA yang mengandung gen, urutan peraturan, atau mutasi, teknik tersebut memungkinkan penciptaan DNA spesifik dan panjang konstruksi.  Kuantitatif PCR (Q-PCR): digunakan untuk mengukur jumlah produk PCR (umum secara real-time). Ini secara kuantitatif jumlah ukuran mulai DNA, cDNA, atau RNA. Q-PCR biasanya digunakan untuk menentukan apakah urutan DNA hadir dalam sampel dan jumlah salinan dalam sampel. Kuantitatif realtime PCR memiliki tinggi tingkat yang sangat presisi. QRT-PCR metode menggunakan pewarna fluorescent, seperti Sybr Green, EvaGreen atau fluorophore DNA probe yang mengandung seperti TaqMan, untuk mengukur jumlah produk yang diperkuat secara real time. Hal ini juga kadang-kadang disingkat RT-PCR (R T ime Bit PCR) atau RQ-PCR. QRT-PCR atau RTQ-PCR sesuai kontraksi lebih, karena RT-PCR umumnya mengacu pada reverse transkripsi PCR (lihat di bawah), sering digunakan dalam hubungannya dengan Q-PCR.  RT reverse transcription PCR (RT-PCR): untuk memperkuat DNA dari RNA. Reverse transcriptase mentranskripsi RNA menjadi cDNA , yang kemudian diamplifikasi dengan PCR. RT-PCR secara luas digunakan dalam profiling ekspresi , untuk menentukan ekspresi gen atau untuk mengidentifikasi urutan dari transkrip RNA, termasuk start transkripsi dan situs penghentian. Jika urutan DNA genom gen diketahui, RT-PCR dapat digunakan untuk memetakan lokasi 14



ekson dan intron dalam gen. 5 'akhir dari gen (sesuai dengan awal transkripsi) biasanya diidentifikasi oleh RACE-PCR (Rapid Amplifikasi cDNA End).  PCR Thermal asimetris interlaced ( TAIL-PCR ): untuk isolasi dari suatu urutan yang tidak diketahui mengapit urutan yang dikenal. Dalam urutan diketahui, TAIL-PCR menggunakan sepasang nested primer dengan suhu yang berbeda anil; degenerate primer digunakan untuk memperkuat yang lain dari arah yang tidak diketahui.  Touchdown PCR (Langkah-mundur PCR): sebuah varian dari PCR yang bertujuan untuk mengurangi latar belakang spesifik secara bertahap menurunkan suhu anil sebagai bersepeda PCR berlangsung. Suhu anil pada awal siklus biasanya beberapa derajat (3-5 ° C) di atas m T primer yang digunakan, sedangkan pada siklus kemudian, ini adalah beberapa derajat (3-5°C) di bawah T primer m. Suhu tinggi memberikan spesifisitas yang lebih besar untuk primer mengikat, dan suhu yang lebih rendah izin lebih amplifikasi efisien dari produk tertentu terbentuk selama siklus awal.



2.6 Manfaat Polymerase Chain Reaction (PCR) 



Polymerase



Chain



Reaction



(PCR)



dapat



digunakan



untuk:



Amplifikasi urutan nukleotida. 



Menentukan kondisi urutan nukleotida suatu DNA yang mengalami mutasi.







Bidang kedokteran forensik.







Melacak



asal-usul



sesorang



dengan



membandingkan



“finger



print”.



Saat ini PCR sudah digunakan secara luas untuk berbagai macam kebutuhan, diantaranya: 



Isolasi Gen.



15



Kita tahu bahwa DNA makhluk hidup memiliki ukuran yang sangat besar, DNA manusia saja panjangnya sekitar 3 miliar basa, dan di dalamnya mengandung ribuan gen. Fungsi utama DNA adalah sebagai sandi genetik, yaitu sebagai



panduan



sel



dalam



memproduksi



protein,



DNA



ditranskrip



menghasilkan RNA, RNA kemudian diterjemahkan untuk menghasilkan rantai asam amino alias protein. Dari sekian panjang DNA genome, bagian yang menyandikan protein inilah yang disebut gen, sisanya tidak menyandikan protein atau disebut ‘junk DNA’, DNA ‘sampah’ yang fungsinya belum diketahui dengan baik. Para ahli seringkali membutuhkan gen tertentu untuk diisolasi. Sebagai contoh, dulu kita harus mengekstrak insulin langsung dari pancreas sapi atau babi, kemudian menjadikannya obat diabetes, proses yang rumit dan tentu saja mahal serta memiliki efek samping karena insulin dari sapi atau babi tidak benar-benar sama dengan insulin manusia. Berkat teknologi rekayasa genetik, kini mereka dapat mengisolasi gen penghasil insulin dari DNA genome manusia, lalu menyisipkannya ke sel bakteri (dalam hal ini E. coli) agar bakteri dapat memproduksi insulin. Hasilnya insulin yang sama persis dengan yang dihasilkan dalam tubuh manusia, dan sekarang insulin tinggal diekstrak dari bakteri, lebih cepat, mudah, dan tentunya lebih murah ketimbang cara konvensional yang harus ‘mengorbankan’ sapi atau babi. Untuk mengisolasi gen, diperlukan DNA pencari atau dikenal dengan nama ‘probe’ yang memiliki urutan basa nukleotida sama dengan gen yang kita inginkan. Probe ini bisa dibuat dengan teknik PCR menggunakan primer yang sesuai dengan gen tersebut. 



DNA Sequencing. Urutan basa suatu DNA dapat ditentukan dengan teknik DNA Sequencing, metode yang umum digunakan saat ini adalah metode Sanger (chain termination method) yang sudah dimodifikasi menggunakan dye-dideoxy 16



terminator, dimana proses awalnya adalah reaksi PCR dengan pereaksi yang agak berbeda, yaitu hanya menggunakan satu primer (PCR biasa menggunakan 2 primer) dan adanya tambahan dideoxynucleotide yang dilabel fluorescent. Karena warna fluorescent untuk setiap basa berbeda, maka urutan basa suatu DNA yang tidak diketahui bisa ditentukan. 



Identifikasi Forensik. Seseorang yang terlibat kejahatan (baik pelaku maupun korban), atau korban kecelakaan/bencana kadang sulit dilakukan.Jika identifikasi secara fisik sulit atau tidak mungkin lagi dilakukan, maka pengujian DNA adalah pilihan yang tepat. DNA dapat diambil dari bagian tubuh manapun, kemudian dilakukan analisa PCR untuk mengamplifikasi bagian-bagian tertentu DNA yang disebut fingerprints alias DNA sidik jari, yaitu bagian yang unik bagi setiap orang. Hasilnya dibandingkan dengan DNA sidik jari keluarganya yang memiliki pertalian darah, misalnya ibu atau bapak kandung.Jika memiliki kecocokan yang sangat tinggi maka bisa dipastikan identitas orang yang dimaksud. Banyak orang yang juga yang memanfaatkan pengujian ini untuk menelusuri orang tua ‘sesungguhnya’ dari seorang anak jika sang orang tua merasa ragu.







Diagnosa Penyakit. Penyakit Influenza A (H1N1) yang sebelumnya disebut flu babi sedang mewabah saat ini, bahkan satu fase lagi dari fase pandemi. Penyakit berbahaya seperti ini memerlukan diagnosa yang cepat dan akurat.PCR merupakan teknik yang sering digunakan. Teknologi saat ini memungkinkan diagnosa dalam hitungan jam dengan hasil akurat. Disebut akurat karena PCR mengamplifikasi daerah tertentu DNA yang merupakan ciri khas virus Influenza A (H1N1) yang tidak dimiliki oleh virus atau makhluk lainnya.



17



2.7 Cara mendeteksi H. Pylori Sebanyak 73 buah biopsi lambung (antrum dan corpus) pasien yang menjalani pemeriksaan endoskopi di Subbagian Gastroenterologi, Bagian Ilmu Penyakit Dalam FKUI/RSCM Jakarta dimana 53 sampel diperoleh selama bulan Juli-Desember 2004, sedangkan 20 sampel lainnya diperoleh selama bulan JuliOktober 2006. Spesimen biopsi tersebut diambil dari antrum dan corpus lambung pasien dyspepsia yakni gangguan pencernaan akibat tingginya asam lambung.  Ekstraksi DNA H pylori Prosedur ekstraksi DNA H. pylori dilakukan sesuai dengan petunjuk Kit Easy-DNA for genomic DNA isolation (No. katalog K-1800-01) Invitrogene. Secara garis besar, biopsi dimasukkan ke dalam mikrotube steril berisi 350 µl larutan pelisis (Solution A), divorteks dan diinkubasi pada 65oC selama 10 menit. Selanjutnya ditambahkan 150 µl larutan pemurnian (Solution B), kemudian divorteks hingga diperoleh larutan bening. Ditambahkan 500 µl kloroform dan divorteks hingga campuran homogen. Larutan disentrifus pada 12.000 rpm selama 10-20 menit pada mesin sentrifus yang ditempatkan di dalam lemari pendingin (4oC) dan kemudian fasa bagian atas dipindahkan ke dalam tabung mikrosentrifus steril baru untuk ekstraksi DNA. Pemurnian DNA dilakukan dengan menambahkan 1 ml etanol 100% dingin (-20oC), divorteks dan kemudian diinkubasi pada es selama 30 menit. Disentrifus pada kecepatan maksimum selama 10-15 menit pada 4oC. Setelah etanol disingkirkan dari pellet, ditambahkan 500 µl etanol 80% (-20oC) dan kemudian dicampur dengan membolak- balikkan tabung 3-5 kali. Selanjutnya disentrifus pada kecepatan maksimum selama 3-5 menit pada 4oC. Etanol disingkirkan dengan pipet. Disentrifus kembali pada kecepatan maksimum selama 2-3 menit pada 4oC dan residu etanol disingkirkan dan dibiarkan mengering di udara. Pelet dilarutkan ke dalam 75-100 µl buffer TE serta ditambahkan 1,5 µl RNase 2 mg/ml hingga konsentrasinya 40 µg/ml. Diinkubasi pada 37oC selama 30 menit dan DNA yang diperoleh siap untuk digunakan sebagai DNA template. 18



 Amplifikasi DNA denganPCR. Amplifikasi DNA dilakukan dengan PCR menggunakan lima primer oligonukleotida untuk gen-gen cagA, ureA dan ureC (glmM) serta 16S RNA ribosom (Tabel1). Tabel 1.Urutan basa primer oligonukleotida untuk gen-gen yang diuji beserta ukuran produk PCR yang diharapkan, suhu annealing PCR. Gen



Oligonukleotida



Ukuran produk (pb*) 349



Suhu anneali ng (oC) 55



Monteiro dkk. [20]



Pustaka



cagA



5’-GATAACAGGCAAGCTTTTGAGG-3’ 5’-CTGCAAAAGATTGTTTGCGAGA-3’



ureA



5’-GCCAATGGTAAATTAGTT-3’ 5’-CTCCTTAATTGTTTTTAC-3’



491



45



Peek dkk. [21]



ureC (glmM)



5’-AAGCTTTTAGGGGTGTTAGGGGTTT-3’ 5’-AAGCTTACTTTCTAACACTAA CGC-3”



294



60



Lage dkk. [22]



16S-RNA ribosom



5’-CTGGAGAGACTAAGCCCTCC-3’ 5’-ATTACTGACGCTGATTGTGC-3’



110



60



Mapstone dkk.[10]



*) pb : pasang basa (basepair)



Proses PCR dilakukan dengan mencampur Buffer 1X, MgCl2 2,5 mM, gelatin 0,001%, dNTP 100 µM, primer forward dan reverse masing-masing 0,1 µM dan ampliTaq polymerase 0,5 U serta DNA template. Proses PCR dilakukan pada mesin Master cycler gradient Eppendorf untuk maing-masing primer dengan kondisi sebagai berikut: denaturasi awal pada 94oC selama 10 menit diikuti oleh 40 siklus terdiri dari denaturasi pada 94oC selama 30 detik, annealing pada 45-64oC selama 1 menit (tergantung primer) dan elongasi pada 72oC selama 45 detik. Setelah selesai 40 siklus, kemudian dilanjutkan elongasi akhir pada 72oC selama 7 menit. Hasil amplifikasi PCR dielektroforesis pada 2% gel agarose dan kemudian diwarnai dengan etidium bromida 0,5 µg/ml selama 15 menit serta dipotret dengan kamera instant Polaroid.



19



 HASIL DETEKSI H. Pylori Dalam penelitian ini, telah terkumpul 73 sampel biopsi dari pasien dispepsia berumur antara 22 hingga 85 tahun yang sebagian besar menderita gastritis antrum berdasarkan hasil uji patologi anatomi. Dalam penelitian ini telah dilakukan pendeteksian H pylori dalam biopsi lambung pasien dengan teknik PCR menggunakan primer gen antara lain cagA, ureA, ureC dan 16S RNA ribosom yang berhubungan erat dengan kolonisasi dan aktivitas patogenisasi bakteri dalam saluran cerna. Dari 73 sampel biopsi yang diuji, empat atau 5,47% sampel menunjukkan hasil positif untuk tiga gen yakni cagA, ureC dan 16S RNA, tetapi tidak menghasilkan produk PCR positif untuk gen ureA. Dari empat sampel tersebut, dua diantaranya menunjukkan pita DNA non spesifik dengan berat molekul tinggi.Primer ureA yang digunakan tampaknya kurang sensitif disebabkan karena jumlah ureA RNA yang lebih rendah dalam masing-masing sel bakteri.



Gambar 2.Hasil analisis PCR untuk gen ureC (produk berukuran 294 bp) pada sampel nomor 10 dan 15 (MIU positif). Kontrol positif (K+) adalah DNA strain H. pylori NCTC 11638 dan kontrol negatif (K-) adalah akuabidest steril.



2.8 Peralatan,bahan dan prosedur yang digunakan dalam proses (PCR) Sebelum melakukan prosedur amplifikasi DNA dengan teknik PCR, diperlukan pengenalan peralatan dan bahan terlebih dahulu sesuai dengan metode pengembangan PCR masing-masing. Berikut ini akan disajikan persiapan alat, bahan dan prosedur dalam teknik PCR yang rutin digunakan yaitu teknik PCR standar atau konvensional.



20



1.Peralatan Peralatan dasar di laboratorium biologi molekuler sudah dibahas pada topik sebelumnya pada Bab 6 tentang Teknik dasar Analisis Biologi Molekuler. Pada sub topik ini hanya akan dibahas peralatan yang diperlukan terutama untuk teknik PCR konvensional diperlukan peralatan sebagai berikut: a.Biosafety Cabinet Komponen utama biosafety cabinet HEPA (High Efficiency Particulate Air) dan ULFA (Ultra Low Penetration Air), merupakan jantung dari Biosafety Cabinet terbuat dari filter tipe kering berbentuk mikrofiber borosilikat lembaran tipis seperti kertas. Fungsinya menyaring debu, asap, bakteri, jelaga, serbuk sari dan partikel radioaktif). b.Mesin PCR (PCR Thermal cycler) Mesin PCR merupakan suatu alat yang dipergunakan untuk mengamplifikasi atau menggandakan untaian basa-basa DNA yang dibatasi oleh pasangan primer pengapitnya melalui pengaturan suhu dan penggunaan enzim tahan panas tinggi. Dalam proses amplifikasi tersebut, mesin PCR akan bekerja secara otomatis sesuai permintaan pengaturan suhu untuk tahap denaturasi, annealing maupun ektensi/ elongasi serta berapa siklus yang diperlukan sampai dengan proses PCR selesai. c.Pipet Mikro Pipet dimaksudkan alat untuk mengambil larutan dari suatu tempat ke tempat lain dalam jumlah tertentu secara akurat. Alat ini diperlukan dalam teknik PCR untuk mengambil larutan atau suspensi dengan ketepatan yang sangat tinggi dan volume yang relatif kecil ( dalam µL). Dalam pemakaian pipet mikro perlu diperhatikan kisaran volume yang sesuai untuk pipet yang bersangkutan. Angka yang tercantum di dalam pipet menunjukkan volume maksimum yang dapat diambil pemilihan ukuran pipet dan tips pipet mikro tergantung pada volume yang akan diambil. Misalnya untuk mengambil volume 80 µL, kita gunakan pipet mikro dengan kisaran 1021



100 µL. Pengambilan bisa dengan pipet mikro yang 1000 µL, tetapi kurang akurat. Demikian pula dapat dilakukan dengan pipet ukuran 0-10 µL, tetapi harus diulang beberapa kali. Hal tersebut dapat menyebabkan kesalahan yang cukup besar karena dengan pengambilan berulang kali terdapat kesalahan setiap kali pemipetan walaupun dengan kesalahan yang sangat kecil. d.Tabung (tubes) Tabung mikro (micro tubes) dipergunakan dalam berbagai proses di laboratorium molekuler termasuk proses PCR dalam berbagai volume. Dikenal berbagai macam ukuran tabung, mulai ukuran kecil sampai besar, di antaranya ukuran 0,5 mL; 1,5 mL; 2,0 mL. (Maftuchah, 2014). e.Perangkat elektroforesis Perangkat elektroforesis digunakan untuk mendeteksi secara visual hasil produk PCR (Amplikon).



2.Bahan (Reagensia) yang diperlukan dalam proses PCR Sebelum melakukan PCR, komponen-komponen yang akan digunakan dipersiapkan terlebih dahulu, yaitu: a.Larutan buffer stock 100 mM Tris-HCl pH 8,3 (pada suhu 25oC); 500 mM KCl; 1,5 mM MgCl2; 0,1% (b/v) gelatin. Untuk mempersiapkan arutan buffer harus digunakan komponen-komponen yang steril. b.Larutan dNTP Larutan dATP, dTTP, dCTP, dCTP dan dGTP masing-masing disiapkan dengan konsentrasi 10 mM sebagai larutan stock. Kemudian buatlah larutan dNTP yang merupakan campuran keempat deoksiribonukleotida trifosfat sehingga masing-masing deoksinukleotida trifosfat mempunyai konsentrasi 0,2 mM. Sterilkan larutan dNTP dengan menggunakan filter. 22



Larutan deoksinukleotida trifosfat tersebut harus disimpan di dalam freezer bersuhu -20oC. c.Larutan oligonukleotida primer Sebelum digunakan untuk membuat larutan stok primer, oligonukleotida yang diperoleh dari hasil sintesis dengan DNA synthesizer sebaiknya dimurnikan terlebih dahulu dengan cara tertentu. Pada saat ini sudah tersedia kit komersial yang dapat digunakan untuk memurnikan DNA. Bahkan jika primer dipesan dari perusahaan yang bagus, biasanya dikirim sudah dalam keadaan siap digunakan. d.Larutan enzim Taq DNA polymerase Enzim Taq DNA polymerasesebaiknya disiapkan menjelang digunakan. Encerkan stok enzim dengan menggunakan larutan 1X buffer PCR steril sehingga diperoleh konsentrasi 2,5 unit/µL. Sebelum digunakan, enzim yang telah diencerkan tadi harus selalu diletakkan pada es. Oleh karena enzim ini merupakan salah satu komponen yang termasuk mahal, enzimTaq DNA polymerasedisiapkan seperlunya saja dan sisanya disimpan kembali dalam freezer bersuhu - 20oC.



3.Prosedur Pada reaksi PCR diperlukan DNA template, primer spesifik, enzim DNA polimerase yangthermostabil, buffer PCR, ion Mg 2+, danthermal cycler. Cara Kerja: PCR mix solution, untuk keperluan 10 μL pereaksi, maka campurkan: Aquadest steril = 2 μL ; PCR mix = 5 μL ; Primer 1(10pmole) = 1 μL ; Primer 2 (10pmole) = 1 μL dan Sampel DNA = 1 μL. Contoh PCR Program: 23



1.Hot start (denaturasi awal) 94 oC selama 2 menit 2.Siklus amplifikasi diulang 31 kali terdiri dari a) Denaturasi 94 oC selama 60 detik b) Annealing 58 oC selama 45 detik c) Ekstensi 72 oC selama 60 detik 3.Periode ekstensi pada suhu 72 oC selama 5 menit Catatan: bila primer diganti program PCR menyesuaikan susunan primer dan panjang DNA produk amplifikasi yang diinginkan.(Fatchiyah dkk., 2012).



24



BAB III PENUTUP 3.1 Kesimpulan Polymerase Chain Reaction (PCR) adalah metode in vitro yang digunakan untuk mensintesis sekuens tertentu DNA dengan menggunakan dua primer oligonukleotida yang menghibridisasi pita yang berlawanan dan mengapit dua target DNA. Tahapan-Tahapan Polymerase Chain Reaction (PCR), denaturasi DNA templat, penempelan (annealing) primer, dan polimerisasi (extension) rantai DNA. Komponen-Komponen Polymerase Chain Reaction (PCR), Enzim DNA Polymerase: enzim Taq DNA polymerase yang memiliki keaktifan pada suhu tinggi; Primer merupakan oligonukleotida pendek rantai tunggal yang mempunyai urutan komplemen dengan DNA templat yang akan diperbanyak. Panjang primer berkisar antara 20-30 basa; Reagen lainnya berupa dNTP untuk reaksi polimerisasi, dan buffer yang mengandung MgCl2. Manfaat Polymerase Chain Reaction (pcr), yaitu: amplifikasi urutan nukleotida, menentukan kondisi urutan nukleotida suatu DNA yang mengalami mutasi,



bidang kedokteran



forensik,



melacak



asal-usul



sesorang



dengan



membandingkan DNA “finger print”. Kesimpulan yang dapat diambil dari penelitian ini adalah bahwa hanya empat (5,47%) dari 73 sampel yang diuji menunjukkan hasil positif untuk seluruh gen kecuali gen ureA. Dari ke empat sampel tersebut, dua diantaranya menunjukkan pita DNA non spesifik.



25



DAFTAR PUSTAKA Anonim,



2011.PCR



(Polimerase



Chain



Reaction).



Diperoleh



dari:



www.



http://www.medicinenet.com. Diakses pada 5 April 2011. Campbell dan Farrell. 2008. Biochemistry Sixt Edition. Brooks/cole.Kanada. Elrod,S., dan William S. 2011. Genetika edisi 4. Penerbit Erlangga. Jakarta. Mahmuddin, 2010.Polimerase Chain Reaction (PCR). Diperoleh dari : www. http://mahmuddin.wordpress.com/. Diakses pada 5 April 2011. Nasir, M. 2002. Bioteknologi Molekuler. Citra Aditya Bakti. Bandung. Sandra,



R.N.,



2011.



Polimerase



Chain



Reaction.



Diperoleh



dari:



www.



http://restunidia.blogspot.com/. Diakses pada 5 April 2011. Stanfield, W., dkk.2009. Biologi Molekuler dan Sel. Erlangga. Jakarta Wikipedia,



2011.Polimerase



Chain



Reaction.



Diperoleh



dari:



www.



http://en.wikipedia.org/wiki/ Polymerase_chain_reaction. diakses pada 5 April 2011. BLASER, M.J. and PARSONNET, J., Parasitism by “slow” bacterium Helicobacter pylori leads to altered gastric homeostasis and neoplasia, Journal of Clinical Investigation, 94, 4-8, 1994. KIKUCHI, S. and DORE, M.P., Epidemiology of Helicobacter pylori infection, Helicobacter 10 (Supplement), 1-4, 2005. IARC Working Group on the Evaluation of Carcinogenic Risks to Humans, Infection with Helicobacter Pylori.In : International Agency for Research on Cancer (IARC) (ed.) IARC Monograph on the Evaluation of Carcinogenic Risks to Humans. IARC Scientific Publications, No. 61, IARC, Lyon, 1994, pp. 177–241.



26



SYAIFUDIN, M., MARIALINA, R., ABDULLAH, M., and SYAM, A.F., Deteksi Helicobacter pylori dengan teknik polimerase chain reaction, Risalah Seminar Ilmiah Penelitian dan Pengembangan Aplikasi Isotop dan Radiasi, P3TIR BATAN, Jakarta 12 April 2005, 41-47. RUZSOVICS,



A.,



MOLNAR,



B.,



and



TULASSAY,



Z.,



Review



article:



deoxyribonucleic acid-based diagnostic techniques to detect Helicobacter pylori, Aliment Pharmacol Ther, 19, 1137-1146, 2004. AZUMA, T., YAMAKAWA, A., YAMAZAKI, S., OHTANI, M., ITO, Y., MURAMATSU, A., SUTO, H., YAMAZAKI, Y., KEIDA, Y., HIGASHI, H., and HATAKEYAMA, M. Distinct diversity of the cag pathogenicity island among Helicobacter pylori strains in Japan, J. Clin. Microbiol. 42: 2508-2517, 2004.



27