Makalah Uji Bioautografi Mahmudah [PDF]

Citation preview

BAB 1 PENDAHULUAN a. Latar Belakang M i k r o o rg a n i s m e y a n g i n g i n k i t a t u m b u h k a n , y a n g p e r t a m a h a r u s d i l a k u k a n adalah memahami kebutuhan dasarnya kemudian memformulasikan suatu medium atau bahan yang akan digunakan. Air sangat penting bagi organisme bersel tunggal sebagaikomponen utama protoplasmanya serta untuk masuknya nutrien ke dalam sel .



Kebanyakan cuplikan, senyawa



analisis



pemisahan



yang



meliputi



pengambilan



s e n y a w a pengganggu,



dimaksudkan,



pemekatan



terlebih



isolasi dahulu



sebelumidentifikasi dan pengukuran serta teknik pemisahan yang digunakan, namun kromatografi m e r u p a k a n banyak



digunakan.



Pemisahan



teknik



paling



menggunakan



t e k n i k kromatografi relatif murah dengan peralatan yang relatif sederhana. .



Dalam mendeteksi campuran bakteri yang berupa bercak pada KLT ada 2 metodeyang



dipakai



untuk



mendeteksi



bercak



atau



komponen yang aktif sebagai anti bakteri. Kedua metode tersebut adalah: 1.Deteksi mikrobiologi (bioautografi) 2. Deteksi senyawa kimia dengan reaksi warna spesifik. Bioautografi merupakan metode yang spesifik untuk mendeteksi bercak pada kromatogram hasil kromatografi lapis tipis atau kromatografi kertas yang mempunyai aktivitas sebagai antibakteri, antibiotic, anti fungi dan anti viral. Bioautografi juga dapat juga digunakan untuk mendeteksi senyawa antibitik yang belum diketahui yang manadengan pereaksi warna spesifik



1



digunakan



sebagai



pembanding



bioautografi



sehingga kedua



metode tersebut saling melengkapi. Biautografi digunakan bertujuan untuk mendeteksi bercak atau komponen zat aktif sebagai antibakteri. Ada 3 metode bioautografi yaitu: 1.



Bioautografi langsung/direct adalah Mikroorganisme tumbuh secara



langsung di atas lempeng KLT. 2.



Bioautografi kontak/contact adalah Senyawa dipindahkan dari



lempeng KLT ke medium. 3.



Bioautografi pencelupan/overlay



b. Rumusan masalah 1. Apa defenisi dari biautografi 2. Jenis- jenis biautografi 3. Keuntungan dan kelemahan metode biautografi 4. Skema kerja dalam biautografi c. Tujuan 1. Untuk mengetahui defenisi dari biautografi 2. Untuk mengetahui jenis-jenis biautografi 3. Untuk mengetahui keuntungan dan kelemahan dari metode biautografi 4. Untuk mengetahui skema atau cara kerja dalam biautografi



BAB II PEMBAHASAN A. Pengertian Bioautografi Menurut Betina (1972) bioautografi adalah suatu metode pendeteksian untuk menemukan suatu senyawa antimikroba yang belum teridentifikasi



2



dengan cara melokalisir aktivitas antimikroba tersebut pada suatu kromatogram. Metode ini memanfaatkan pengerjaan Kromatografi Lapis Tipis (KLT). Pada bioautogafi ini didasarkan atas efek biologi berupa antibakteri, antiprotozoa, antitumor dan lain-lain dari substansi yang diteliti. Ciri khas dari prosedur bioautografi adalah didasarkan atas teknik difusi agar, dimana senyawa antimikrobanya dipindahkan dari lapisan KLT ke medium agar yang telah diinokulasikan dengan merata bakteri uji yang peka. Dari hasil inkubasi pada suhu dan waktu tertentu akan terlihat zona hambatan di sekeliling spot dari KLT yang telah ditempelkan pada media nagar. Zona hambatan ditampakkan oleh aktivitas senyawa aktif yang terdapat di dalam bahan yang diperiksa terhadap pertumbuhan mikroorganisme uji. Biautografi dapat dipertimbangkan karena paling efisien untuk mendetekski komponen antimikroba, sebab dapat melokalisir aktivitas meskipun dalam senyawa aktif tersebut terdapat dalam bentuk senyawa kompleks dan dapat pula diisolasi langsung dari komponen yang aktif. Metode yang spesifik untuk mendeteksi bercak pada kromatogram hasil kromatografi lapis tipis (KLT) dan kromatografi kertas yang mempunyai aktivitas sebagai antibakteri, antifungi, antibiotik dan antiviral disebut bioautografi. Kromatografi lapis tipis merupakan salah satu kromatografi yang berdasarkan proses adsorpsi. Fase diam dapat menggunakan silika atau alumina yang dilapiskan pada lempeng kaca atau aluminium. Fasa bergerak (fase mobil) atau larutan pengembang biasanya digunakan pelarut campuran organik atau bisa juga campuran pelarut organik-anorganik 5. Kebanyakan analisis meliputi pengambilan cuplikan, pemisahan senyawa pengganggu, isolasi senyawa yang dimaksudkan, pemekatan terlebih dahulu sebelum identifikasi dan pengukuran serta teknik pemisahan yang digunakan, namun kromatografi merupakan teknik paling banyak digunakan. Pemisahan menggunakan teknik kromatografi relatif murah dengan peralatan yang relatif sederhana 5. Kromatografi lapis tipis merupakan kromatografi adsorpsi dan adsorben (silika gel (asam silikat), alumina (aluminium oxide), kieselguhr



3



(diatomeous earth), dan selulosa) bertindak sebagai fase stasioner. Dalam kromatografi lapis tipis, bahan penyalut yang digunakan beraneka macam. Silika gel yang paling banyak dipakai B. Macam-macam Metode KLT Bioautografi 1. Bioautografi Langsung Bioautografi langsung, yaitu dimana mikroorganismenya tumbuh secara langsung di atas lempeng Kromatografi Lapis Tipis (KLT). Prinsip kerja dari metode ini adalah suspensi mikroorganisme uji yang peka dalam medium cair disemprotkan pada permukaan Kromatografi Lapis Tipis (KLT) yang telah dihilangkan sisa-sisa eluen yang menempel pada lempeng kromatogram. Setelah itu dilakukan inkubasi pada suhu dan waktu tertentu. Pengeringan Kromatogram dilakukan secara hati-hati dengan menggunakan hair dryer untuk menghiangkan sisa eluen. Senyawa alam lempeng kromatogram dideteksi dengan menggunakan sinar UV pada panjang gelombang 254 nm dan 366 nm. Setelah diketahui letak dan jumlah senyawa aktif yang terpisah atau terisolasi, dengan timbulnya noda (spot) pada lempeng KLT, selanjutnya disemprotkan suspense bakteri uji sebanyak 5-6 ml di atas permukaan lempeng KLT tadi secara merata. Besarnya lempeng KLT yang sering digunakan adalah 20x20 cm dan untuk meratakan suspensi bakteri yang telah disemprotkan dapat menggunakan alat putar atau roller yang dilapisi dengan kertas kromatogram (Whatman, Clipton). Lempeng KLT diinkubasi semalam (1x24 jam) dalam box plastik dan dilapisi dengan kertas, kemudian disemprot dengan 5 ml larutan TTC (20 mg/ml) atau INT (5 mg/ml), INTB (5 mg/ml) serta MTT (2,5 mg/ml) dan selanjutnya diinkubasi kembali selama 4 jam pada suhu 370C. 2. Bioautografi Kontak Bioautografi kontak, dimana senyawa antimikroba dipindahkan dari lempeng KLT ke medium agar yang telah diinokulasikan bakteri uji



4



yang peka secara merata dan melakukan kontak langsung. Metode ini didasarkan atas difusi dari senyawa yang telah dipisahkan dengan Kromatogafi Lapis Tipis (KLT) atau kromatografi kertas. Lempeng kromatografi tersebut ditempatkan di atas permukaan Nutrien Agar yang telah diinokulasikan dengan mikroorganisme yang sensitif terhadap senyawa antimikroba yang dianalisis. Setelah 15-30 menit, lempeng kromatografi tersebut dipindahkan dari permukaan medium. Senyawa antimikroba yang telah berdifusi dari lempeng kromatogram ke dalam media agar akan menghambat pertumbuhan bakteri setelah diinkubasi pada waktu dan suhu yang tepat sampai noda yang menghambat pertumbuhan mikroorganisme uji tampak pada permukaan membentuk zona yang jernih. Untuk memperjelas digunakan indicator aktivitas dehidrogenase. 3. Bioautografi pencelupan Bioautografi



pencelupan,



dimana



medium



agar



telah



diinokulasikan dengan suspensi bakteri dituang di atas lempeng Kromatografi Lapis Tipis (KLT). Pada prakteknya metode ini dilakukan sebagai berikut yaitu bahwa lempeng kromatografi yang telah dielusi diletakkan dalam cawan petri, sehingga permukaan tertutup oleh medium agar yang berfungsi sebagai base layer. Setelah base layernya memadat, dituangkan medium yang telah disuspensikan mikroba uji yang berfungsi sebagai seed layer. Kemudian diinkubasi pada suhu dan waktu yang sesuai. C. Keuntungan dan Kerugian Metode KLT Bioautografi Metode bioautografi dalam mendeteksi komponen yang aktif sebagai antibakteri memiliki beberapa keuntungan dan kerugian : Keuntungan :  Dapat mendeteksi bercak pada kromatogram hasil KLT yang mempunyai aktivitas sebaga antibakteri, antifungi, antibiotik, dan antiviral.



5



 Dapat digunakan untuk mendeteksi antibiotik yang belum diketahui mekanismenya.  Merupakan metode yang sederhana dan mudah dilakukan.  Cepat dalam pengerjaannya 4. Kerugian:  Tidak bisa digunakan untuk senyawa yang tidak mempunyai aktivitas membunuh ataupun menghambat mikroorganisme.  Hasil tidak valid karena kemungkinan adanya kontaminan dari luar atau karena zat yang diidentifikasikan tidak mengandung khasiat bakteri antibakteri.  Mempunyai faktor kesalahan yang besar 4. Metode kromatografi lapis tipis mempunyai beberapa keuntungan yaitu diperoleh waktu yang lebih cepat dan hasil pemisahan yang baik. Waktu rata-rata untuk kromatografi lapisan tipis dengan panjang silica sekitar 10 cm adalah sekitar 20-30 menit (tergantung sifat dari fase gerak). Dalam kromatografi lapisan tipis hanya membutuhkan penyerap dan cuplikan dalam jumlah yang sedikit dan noda-noda yang dipisahkan dilokalisir pada plat seperti pada lembarab kertas. Setelah pemisahan mudah diperoleh senyawasenyawa yang terpisah secara individu yaitu dengan cara mengeruknya dan mengumpulkan tiap-tiap lapisan di mana lapisan itu diserap. Identifikasi dari senyawa-senyawa yang diserap pada lapisn tipis lebih baik digunakan atau dikerjakan dengan pereaksi kimia dan reaksi-reaksi warna, tetapi lazimnya untuk identifikasi menggunakan harga Rf yang didefinisikan sebagai berikut: Harga Rf



=



Jarak yang ditempuh senyawa Jarak yang ditempuh pelarut



Harga Rf dari senyawa murni dapat dibandingkan dengan harga Rf standard. Perlu diperhatikan bahwa harga Rf yang diperoleh hanya berlaku untuk campuran tertentu dari pelarut dan penyarap yang digunakan, meskipun demikian daftar dari harga Rf untuk berbagai pelarut dan penyerap dapat diperoleh 7.



D. Skema Kerja Metode KLT Bioautografi 6



Medium (NA) sebanyak 10 ml Inokulasi dengan bakteri sebanyak 0,5 ml Masukan



lempeng KLT yang telah dielusi diletakkan diatas permukaan medium agar Setelah 30 menit, lempeng tersebut dipindahkan Diinkubasi pada suhu 37C selama 24 jam Amati zona hambat



BAB III PENUTUP A. Kesimpulan Beberapa prosedur yang dikemukakan di atas masing-masing memiliki kelebihan dan kekurangan. Menurut Horman dan Fuchs, bioautografi kontak merupakan tipe yang paling sering digunakan. Masalah



7



perbedaan difusi dari senyawa-senyawa dari kromatogram ke plat agar dipermudah dengan deteksi bioautografi secara langsung, tetapi metode ini membutuhkan peralatan mikrobiologi yang cukup rumit. Sedangkan Land dan Lyon, menyatakan bioautografi secara langsung, untuk aktivitas antibakteri sangat sensitif dan melokalisir senyawa-senyawa yang aktif, tetapi mempunyai kekurangan karena keterbatasan mikroorganisme yang dapat tumbuh secara langsung diatas lapisan kromatografi. Ketersebaran bakteri pada lempeng dan memungkinkan terjadi kontaminasi. Sedang metode bioautografi pencelupan merupakan metode yang paling tepat sebab tidak dipengaruhi



oleh kemungkinan



adanya kontaminasi. Tetapi



metode



bioautografi kontak adalah yang paling umum digunakan karena mudah dan sederhana dalam pengerjaannya.



DAFTAR PUSTAKA Djide, M. N. 2003. Mikrobiologi Farmasi. Jurusan Farmasi UNHAS, Makassar. Djide, Natsir dan Sartini.\2008. Analisis Mikrobiologi Farmasi. Jurusan Farmasi UNHAS, Makassar



8



Mulyaningsih, S., 2004, Analisis Mikrobiologi, Farmasi FMIPA UII, Yogyakarta Sastrohamidjojo, 2002, Kromatografi, UGM-press, Yogyakarta



9