Mekanisme Kerja Western Blot [PDF]

Citation preview

Mekanisme Kerja Western Blot 1. Menyiapkan sampel yang akan diteliti, apakah itu limfosit T atau fibroblas ataupun sel darah tepi. Sampel harus dijaga tetap dingin. 2. Menyiapkan buffer agar pH dapat berada pada jangkauan yang stabil. 3. Menyiapkan antibodi yang akan digunakan sebagai pelacak Monoklonal antibodi maupun poliklonal antibodi dapat digunakan a. Antibodi monoklonal adalah yang lebih baik digunakan, karena : • Sinyal yang lebih baik • Spesifisitas yang lebih tinggi • Hasil yang lebih jernih pada proses pembuatan film western blot b. Antibodi Poliklonal - Mengenali lebih banyak epitop 4. Melisis Sel Kita perlu melisis sel untuk mengeluarkan protein yang diinginkan dari sel. Untuk melisis sel dapat digunakan detergen SDS dan RIPA. Bila yang diinginkan adalah sebuah protein yang terfosforilasi, maka perlu ditambahkan inhibitor fosfatase agar gugus fosfat pada protein tersebut tidak dibuang. Cara melisis : sentrifuge dan ambil pellet yang terbentuk. Jaga agar tetap dingin dengan menggunakan kotak es. Tambahkan buffer lisis, lalu kumpulkan dalam tabung eppendorf, jaga agar tetap dingin. 5. Gel Elektroforesis Gel yang biasa dipakai misalnya SDS-PAGE (sodium dodecyl sulfate- polyacrylamide gel electrophoresis) untuk memisahkan protein berdasarkan ukurannya dengan adanya arus listrik. Akrilamid 10% juga ditambahkan. Kerja SDS-PAGE ini adalah dengan mendenaturasi polipeptida setelah terlebih dahulu polipeptida tersebut dibuang struktur sekunder dan tersiernya. Sampel terlebih dahulu dimasukkan ke dalam sumur gel. Satu jalur biasanya untuk satumarker. Protein sampel akan memiliki muatan yang sama dengan SDS yang negatif sehingga bergerak menuju elektroda positif melalui jaring-jaring akrilamid. Protein yang lebih kecil akan bergerak lebih cepat melewati jaring-jaring akrilamid. Perbedaan kecepatan pergerakan ini akan terlihat pada pitapita yang tergambar pada tiap jalur. 6. Transfer Gel Agar protein tersebut dapat diakses oleh antibodi, maka protein tersebut harus dipindahkan dari gel ke sebuah kertas membran, biasanya nitroselulosa atau PVDF. Membran ini diletakkan di atas gel, dan tumpukan kertas penyerap diletakkan di atasnya. Larutan buffer kemudian akan merambat ke atas melalui reaksi kapiler dengan membawa protein-proteinnya. Cara lain untuk mentransfer protein adalah dengan menggunakan teknik elektroblotting. Teknik ini menggunakan arus listrik untuk menarik protein dari gel ke membran. Selain itu, diperlukan pula sebuah prosedur untuk mencegah terjadinya interaksi antara molekul-molekul yang tidak diinginkan agar hasil yang diperlukan lebih jernih (to reduce ‘noise’). Caranya adalah dengan menempatkan membran pada BSA (Bovine serum albumin) atau non-fat dry milk dengan sedikit detergen tween 20



sehingga serum tersebut akan menempel pada pada daerah yang tidak ditempeli protein sampel. Hal ini bertujuan untuk membuat antibodi hanya akan dapat menempel pada binding site protein target. Setelah itu, barulah membran dengan protein sampel tersebut diinkubasi dnegan antibodi. 7. Deteksi Deteksi dilakukan dengan antibodi yang telah dimodifikasi bersama dengan sebuah enzim yang disebut reporter enzyme. Proses deteksi biasanya berlangsung dalam dua tahap, yaitu : a. Antibodi Primer Antibodi yang digunakan di sini adalah antibodi yang pertama kali dihasilkan sistem imun ketika terpajan protein target. Antibodi terlarut kemudian diinkubasi bersama kertas membran paling sedikit selama 30 menit. b. Antibodi Sekunder Setelah diinkubasi bersama antibodi primer, kertas mebran dibilas terlebih dahulu barulah diinkubasi dengan antibodi sekunder. Antobodi sekunder adalah antobodi yang spesifik untuk suatu spesies pada antibodi primer. Misalnya, anti-tikus hanya akan berikatan pada antibodi primer yang berasal dari tikus. Antibodi sekunder biasanya berikatan dengan enzim reporter seperti alkaline fosfatase atau horseradish peroxidase. Antibodi sekunder ini kemudian akan menguatkan sinyal yang dihasilkan oleh antibodi primer. Sekarang, proses deteksi dapat dilakukan dengan satu langkah saja, yaitu dengan menggunakan antibodi yang dapat mengenali protein yang diinginkan sekaligus memiliki label yang mudah dideteksi 8. Analisis a. Colorimetric detection Metode ini digunakan bila substrat dapat bereaksi dengan reporter enzyme sehingga dapat mewarnai membran nitorselulosa b. Chemiluminescent Metode ini digunakan bila substrat merupakan molekul yang bila bereaksi dengan antibodi sekunder atu dengan reporter enzyme akan teriluminasi. Hasilnya kemudian diukur dengan densitometri untuk mengetahui jumlah protein yang terwarnai. Teknik terbarunya yang paking canggih disebut Enhanced Cheiluminescent (ECL). Teknik inilah yang paling banyak digunakan sekarang. c. Radioactive detection Metode ini menggunakan X-ray yang bila mengenai label akan menciptakan region gelap. Namun metode ini sangat maha dan beresiko tinggi terhadap kesehatan. d. Fluorescent detection Pelacak yang mmepunyai label yang dapat mengalami fluorosensi lalu kemudian dideteksi oleh fotosensor seperti kamera CCD yang menangkap image digital dari western blot. Hasil kemudian dapat dianalisi secara kuantitaif maupun kualitatif Metode ini juga merupakan salah satu metode yang paling sering digunakan karena sangat sensitif.



Sumber : Andrews AT. Electrophoresis Theory, Techniques, Biochemical and Clinical Application. Clarendon press : Oxford ; 1986. Langkah - langkah Kerja Western Blot 1. Alat dan Bahan 



Ponceau Solution







TBS Skim Milk 5% : TBS100 ml, Nonfat skim milk 5 g







TBS Tween 0.05%







Antibodi primer







Antibodi sekunder



: Biotin conjungate dan SAHRP







Substrat



: TMB



: Ponceau S2%, TCA30%,Aquades100 ml



: TBS100 ml, Tween 2050 μl : Shigella Ab 49 kDa



2. Procedures 



Gel SDS – PAGE direndam dalam transfer buffer selama 30 menit







Pita pada gel SDS – PAGE ditransfer pada membran NC pada arus 0,3 A dan tegangan 20 V selama 2 jam







Potong protein penanda, staining dengan ponceau 2% untuk memastikan pita protein telah tertransfer pada NC







Cuci dengan H2O sampai hanya tersisa warna pita







Block dengan TBS – skim milk 5% semalam dengan suhu 4oC







Cuci dengan TBS Tween 0.05% selama 2×10 menit dan goya pelan







Inkubasi dalam antibodi primer selama 1 jam







Cuci dengan TBS Tween 0.05% selama 2×10 menit dan goya pelan







Inkubasi pada antibodi sekunder (biotin conjungate) selam 2 jam, suhu ruangan, dan goyang pelan







Cuci dengan TBS Tween 0.05% selama 2×10 menit dan goya pelan







Inkubasi dalam SHARP selama 1 jam, suhu ruangan, dan goyang pelan







Cuci dengan TBS Tween 0.05% selama 2×10 menit dan goya pelan







Berikan substrat TMB selama 20 menit dalam ruangan gelap







Stop dengan aquadest dan keringkan



Metode pemberian warna dapat dikatagorikan menjadi dua, yaitu direct dan indirect. Direct berarti antibodi primer yang diberikan sudah ditempeli dengan substrat yang mengandung warna. Indirect berarti kita perlu menambahkan antibodi sekunder yang akan berikatan dengan antigen-antibodi komplek kemudian antibodi sekunder akan berikatan dengan substrat berwarna.



Result



Intepretasi hasil dari western blot mirip dengan SDS-PAGE elektroforesis. Kita menggunakan persamaan regresi linier dari marker yang digunakan sebagai standart. Pita sampel yang berwarna pada NC merupakan protein dengan berat molekul tertentu yang kita hitung dengan menggunakan persamaan regresi linier. Sumber : Kumar V, Abbas AK, Fausto N. Pathologic Basis of Disease. 7th Edition. Elsevier Saunders : China; 2005, p.314-315; 696-697.