Metode Dilusi (Pengenceran) [PDF]

Citation preview

METODE DILUSI (PENGENCERAN) Paramita Koriston (J111 14 517) 1. Pengertian dan fungsi media Culture media atau media yang digunakan untuk pengkulturan yaitu formulasi zat kimia yang kaya akan nutrisi yang dipersiapkan untuk menumbuhkan mikroorganisme secara in vitro. Beberapa mikroorganisme dapat bertumbuh dengan baik secara in vitro dengan nutrisi dari segala media umum; ada beberapa mikroorganisme lain yang membutuhkan suatu media khusus, contohnya parasit yang bersifat obligat tidak dapat bertumbuh pada media yang tidak hidup. 1 Suatu media harus mengandung nutrisi, memiliki kelembaban dan pH yang sesuai, memiliki suplai oksigen yang memadai, dan memiliki temperatur yang sesuai untuk menumbuhkan mikroorganisme dengan baik. Media diformulasi dan dimodifikasi atau direvisi secara berkala dari makanan, air, tanah dan sampel klinis untuk digunakan dalam proses isolasi, pengkulturan dan identifikasi mikroorganisme. 1 2. Unsur yang terkandung dalam media Berikut adalah unsur dari culture media2: a. Pepton, yaitu campuran dari protein yang tercerna sebagian, mengandung asam amino, polipeptida, fosfat, dan mineral (seperti kalium dan magnesium). b. Meat extract, mengandung produk degradasi protein, garam anorganik, karbohidrat dan subtansi yang diperlukan untuk stimulasi pertumbuhan sel-sel hidup (seperti vitamin dan hormon). c. Elektrolit, berupa natrium klorida. d. Air, sebagai sumber hidrogen dan oksigen. e. Agar, yaitu produk alami yang berasal dari rumput laut. Agar mengandung karbohidrat, sebagian kecil material yang menyerupai protein, dan beberapa macam garam anorganik. Agar tidak mengandung nutrisi dan hanya digunakan sebagai bahan pemadat, digunakan dengan konsentrasi 2-3%. Bahan ini meleleh pada suhu 95°C dan memadat pada suhu 40°C. 3. Klasifikasi media Media terbagi menjadi beberapa jenis menurut beberapa kategori:



a. Klasifikasi menurut karakteristik fisiknya: 1) Media padat, digunakan untuk mengisolasi suatu bentukan murni dari mikroorganisme. 2) Media cair, digunakan untuk mengkulturkan bakteri dalam kuantitas yang besar untuk menyiapkan antigen atau vaksin.2 b. Klasifikasi menurut unsur yang terkandung dan kegunaanya: 1) Media sederhana, yaitu media yang paling sederhana dan secara rutin digunakan dalam laboratorium. Contohnya yaitu nutrient broth dan nutrient agar. 2) Media diperkaya, yaitu media yang mengandung protein alami, seperti darah, serum, telur dan glukosa. Contohnya yaitu glucose broth, blood agar, chocolate agar, dan Loeffler’s serum agar. 3) Media selektif, yaitu media yang hanya membantu pertumbuhan mikroorganisme tertentu saja dan mengandung zat inhibitor bagi mikroorganisme lain. Contohnya yaitu alkaline peptone water, blood tellurite medium, deoxycholate agar dan Aronson’s medium. 4) Media diferensial, yaitu media yang mengandung suatu subtansi yang dapat mendiferensiasikan dua tipe bakteri dengan karakter berbeda. Contohnya yaitu MacConkey agar. 5) Media indikator, yaitu media yang mengandung subtansi tertentu yang menghasilkan perubahan warna pada koloni sebagai hasil dari aktivitas metabolisme dari beberapa organisme. Contohnya yaitu sugar media, MacConkey agar, dan Wilson and Blair medium.2 c. Klasifikasi menurut kebutuhan oksigen 1) Anaerobic culture media, yaitu media yang disiapkan untuk isolasi organisme anaerob. Contohnya Robertson’s cooked meat medium dan thioglycollate broth. 2) Mycobacterial culture media, yaitu media yang khusus digunakan untuk mengisolasi mycobacteria. Mycobacteria membutuhkan media khusus karena merupakan organisme yang pertumbuhannya lambat dan kulturnya harus diinkubasikan sekitar 6 minggu dalam suhu 37°C. Jadi, media khusus untuk mycobacteria dikembangkan untuk bertahan selama masa inkubasi yang panjang. Contohnya Lowenstein-Jensen medium dan Middlebrook’s medium.2 4. Persiapan media Bahan medium biasanya dilarutkan, dan kemudian disterilkan. Ketika agar digunakan sebagai bahan pemadat, medium harus dipanaskan perlahan, biasanya



hingga mendidih, untuk melarutkan agar. Pada beberapa kasus dimana interaksi dengan komponen, misalnya metal, dapat mengakibatkan penggumpalan medium, larutan harus disiapkan dan disterilkan terpisah sebelum mencampurkan larutan dan mempersiapkan medium.3 Berikut adalah beberapa metode sterilisasi yang berbeda: a. Tyndallization Panas uap air 100°C selama 30 menit dapat membunuh sel bakteri vegetatif, tetapi tidak dengan endosporanya. Metode ini dapat dilakukan dengan menggunakan Arnold Sterilizer. Dengan mendinginkan medium dalam inkubator setelah dipanaskan, maka endospora yang tersisa nantinya akan berkecambah. Setelah itu, bakteri yang telah berkecambah dari endospore tersebut dimatikan lagi dengan mengulang proses pemanasan tadi. Apabila proses ini diulangi selama tiga hari, medium akan menjadi steril karena semua endospore telah berkecambah dan kemudian dibunuh dengan pemanasan uap air. Proses ini disebut Tyndallization, sesuai dengan nama penemunya, John Tyndall.3 b. Inpissation Inpissation adalah metode dimana medium dipaparkan dengan panas; ini dilakukan pada material dengan protein tinggi, seperti media yang mengandung telur, yang tidak dapat menahan panas pada proses autoclaving. Proses ini menyebabkan pembekuan protein tanpa mengubah susunan kimianya. Metode ini dapat dilakukan dengan beberapa prosedur berbeda: dengan Arnold sterilizer atau dengan specialized inpissator. Medium dipanaskan dalam suhu 75-80°C selama 2 jam secara berulang setiap harinya dalam 3 hari. Inpissation dengan menggunakan autoclave dilakukan pada suhu 85-90°C selama 10 menit, lalu temperatur dinaikkan menjadi 121°C dengan hanya menggunakan uap bertekanan, dan lalu perlahan suhu diturunkan hingga kurang dari 60°C. 3 c. Autoclaving Autoclaving menggunakan uap air bertekanan, untuk membunuh mikroorganisme. Pemanasan 15 menit pada tekanan 15 psi dan suhu 121°C adalah metode yang paling umum digunakan. Metode ini dpat membunuh sel bakteri sekaligus endosporanya. Bagaimana pun, beberapa subtansi media tidak dapat menoleransi panas tersebut, sehingga terkadang metode ini dilakukan dengan suhu yang lebih rendah. Media yang mengandung karbohidrat biasanya disterilisasi pada suhu 116-118°C untuk mencegah dekomposisi karbohidrat dan pembentukan zat toksik yang dapat menghambat perkembangan bakteri.3 d. Metode Filtrasi Filtrasi adalah metode yang umum digunakan untuk mensterilkan komponen yang tidak tahan panas (mengalami perubahan susunan kimia apabila terekspos panas berlebih). Media cair dialirkan melalui kaca sinter atau membran yang



terbuat dari selulosa asetat atau nitroselulosa, dengan ukuran pori yang kecil. Membran dengan ukuran pori 0.2 mm akan menjebak sel bakteri, sehingga sering disebut sebagai filter bakteriologis. Dengan mencegah lewatnya bakteri, filtrasi membuat cairan bebas dari bakteri dan mikroorganisme eukariotik, atau bebas dari organisme, sehingga disebut steril. Banyak larutan karbohidrat, larutan antibiotik dan larutan vitamin disterilkan dengan filter dan ditambahkan ke media yang sudah didinginkan pada temperatur di bawah 50°C.3 5. Metode isolasi dengan pengenceran bersambung Beberapa metode diketahui dapat mengisolasi dan memperbanyak jumlah mikroorganisme (bakteri, fungi, protozoa, alga, mycoplasma dan virus) dengan menggunakan tanah, makanan, susu, air, dan lain-lain. Metode pengenceran bersambung adalah salah satu prosedur yang paling umum digunakan untuk mengisolasi jamur, bakteri dan actinomycetes. Prinsip dasar dari metode ini yaitu ketika sampel cair yang mengandung mikroorganisme dikulturkan, masing-masing mikroorganisme yang bertahan hidup akan berkembang menjadi suatu koloni, sehingga jumlah dari koloni yang muncul di atas wadah (atau cawan petri) mewakili jumlah dari organisme yang ada di dalam sampel.1 Dalam metode ini, sejumlah material yang diketahui banyaknya (10 ml atau 10 gram) dicampurkan dengan sejumlah air suling steril (90 ml untuk mendapatkan larutan 100 ml) untuk mendapatkan suspensi mikroba. Pengenceran bersambung 10-2, 10-3, 107 , dan seterusnya dibuat dengan memindahkan (dengan pipet) sejumlah volume terukur (umumnya 1 atau 10 ml) ke dalam air suling steril (9 atau 90 ml). Terakhir, 1 ml dari tiap-tiap larutan yang telah diencerkan ditambahkan ke dalam cawan petri dimana kemudian dituangkan 25 ml agar steril yang masih cair (45°C). Media yang digunakan yaitu NA (nutrient agar) untuk bakteri, Saboraud’s agar atau Czapek’s Dox agar untuk fungi, Glycerol yeast agar untuk actinomycetes dan Wort agar untuk ragi. Umumnya, pengenceran 10-2 hingga 10-5 dipilih untuk memperbanyak jumlah fungi, 10-3 hingga 10-6 untuk actinomycetes dan 10-4 hingga 10-7 untuk bakteria tergantung proporsinya. Setelah agar mengeras, cawan petri kemudian diinkubasikan dalam posisi terbalik selama 3-7 hari pada suhu yang diinginkan (28-37°C). Jumlah koloni yang muncul pada cawan petri dihitung, dirata-ratakan dan dikalikan dengan faktor pengenceran untuk mendapatkan jumlah sel/spora atau cfu (colony per unit) per gram atau mililiter dari sampel.1



Daftar Pustaka 1. Kango N. Textbook of microbiology. New Delhi: I.K. International Publishing House; 2010. P.154,160. 2. Vasanthakumari R. Textbook of microbiology. New Delhi: BI Publications; 2007. P.32-35. 3. Atlas RM. Handbook of microbiological media. 4th Ed. Boca Raton: Taylor and Francis Group; 2010. P.8-9.