Metode Preparat Parafin Testis Mencit [PDF]

Citation preview

A. Metode Preparat Parafin Testis Mencit (Mus musculus) Mencit yang telah diberi perlakuan dimatikan lalu dibedah dengan menggunakan alat bedah, kemudian testisnya diambil. Pengawetan jaringan terdiri dari proses trimming, dehidrasi, clearing, impregnasi (infiltrasi parafin), embedding (pengeblokan jaringan), cutting (pemotongan jaringan), penempelan, dan pewarnaan. Untuk lebih jelasnya sebagai berikut : 1. Memfiksasi organ testis, dengan merendamnya di dalam larutan formalin 10 % selama 24 jam. Testis yang sudah difiksasi kemudian dicuci dengan air mengalir sebanyak dua kali berturut-turut selama satu jam.



2. mendehidrasi organ testis, dengan cara merendam testis pada alkohol dengan konsentrasi 70 % selama dua jam, kemudian konsentrasi 80 % selama dua jam, lalu konsentrasi 95 % selama dua jam. Kemudian alkohol 95 % satu jam dan alkohol absolut selama satu jam sebanyak tiga kali berturut-turut.



3. Penjernihan testis, dengan cara merendam testis dengan xylol sampai transparan atau tenggelam dalam xylol sebanyak tiga kali, selama satu jam berturut-turut. 4. Impregnasi, dimulai dengan pemanasan parafin di oven dengan suhu 580 ᵒC dan ditempatkan pada tiga tempat. Potongan testis dimasukkan ke dalam tiga parafin tersebut setiap parafin dengan waktu dua jam.



5. Pemblokan, dilakukan dengan menuangkan parafin yang telah dicairkan ke kotak yang terbuat dari kertas atau teplon. Kemudian testis dimasukkan dan diatur letaknya dengan jarum yang telah dipanaskan selama waktu infiltrasi yaitu dua jam untuk setiap parafin.



6. Parafin dibiarkan pada suhu kamar sampai benar-benar padat, kemudian dimasukkan ke dalam air dingin sampai potongan testis terlihat dan disimpan atau didinginkan di mesin pendingin dengan suhu 4-6 ᵒC sampai proses pemotongan.



7. Pemotongan dilakukan dengan mengeluarkan parafin yang berisi potongan testis dari cetakannya. Parafin yang berisi potongan testis ditempelkan pada balok kayu dengan menggunakan balok kayu yang sudah dipanaskan.



8. kemudian di parafin objek dipasang mikrotom sliding. Pisau mikrotom dipasang dengan tepat, kemudian diatur ukuran ketebalan dan mikrotom diberi pelumas. Parafin berisi testis dipotong setebal lima mikron.



9. Penempelan dilakukan dengan memindahkan lembaran jaringan yang paling baik ke dalam air hangat (suhu 40-45 ᵒC) selama beberapa detik dengan menggunakan kertas karton sampai mengembang sempurna.



10. Dengan gerakan menyendok, lembaran jaringan diambil dengan objek glas dan ditempatkan di tengah pada sepertiga atas atau bawah.



11. Object glass yang berisi jaringan dimasukkan ke dalam inkubator (suhu 370C) selama 24 jam atau plat panas selama satu jam (suhu 50-600C) sampai jaringan melekat sempurna.



12. Melakukan Pewarnaan, dapat dilakukan dengan Hematoxylin Eosin (HE). Preparat direndam dengan xylol I-III sampai parafin yang menempel pada kaca objek larut atau hilang,



13. preparat kemudian dimasukkan ke dalam alkohol seri 100%, 96 %, selama dua sampai tiga menit, preparat dimasukkan ke dalam HE selama dua sampai lima menit. Preparat dicuci dengan menggunakan air mengalir sampai preparat berwarna biru.



14. Diferensiasi dilakukan dengan pengamatan menggunakan mikroskop. Apabila belum cukup terwarnai maka kembalikan lagi preparat ke dalam larutan HE dan apabila terlalu tua maka preparat dimasukkan ke dalam pewarna regresif, yaitu alkohol 70 % yang mengandung 0,5 % HNO3 sebanyak tiga sampai lima celupan.



15. Preparat dicuci kembali dengan air mengalir selama tiga smapai lima menit. kemudian Preparat dimasukkan ke dalam larutan scoot selama tiga menit. Lalu cuci kembali dengan air mengalir selama tiga sampai lima menit.



16. Preparat dimasukkan kembali ke dalam alkohol seri dengan konsentrasi 23 70 % dan 96 % untuk beberapa kali celupan, kemudian dimasukkan ke dalam alkohol 100 % selama tiga menit.



17. Dilanjutkan kembali pencelupan preparat ke dalam campuran alkohol 100 % dengan xylol selama dua sampai tiga menit. Sebelum xylol mengering, preparat ditutup dengan mengoles bahan mounting atau canada balsam untuk menutup object glass, kemudian ditutup dengan cover glass dan mencegah jangan sampai terbentuk gelembung-gelembung udara.



18. Jaringan siap dilihat di bawah mikroskop.



B. Metode Preparat Parafin Ovarium Mencit (Mus musculus) Sebelum dilakukan pembedahan mencit terlebih dahulu dibius dengan kloroform, kemudian setelah mencit tidak bergerak lagi mulailah dilakukan pembedahan pada bagian ventral tubuh mencit secara vertikal. Spesimen dibuka perutnya dan diambil ovariumnya. Ovarium yang telah diambil segera difiksasi dengan larutan formalin 10% atau 10% formolsaline (1 bagian formalin dalam 9 bagian NaCl – fisiologis) di dalam botol. Perbandingan volume spesimen dengan larutan formalin 1 : 10, guna mendapatkan hasil fiksasi yang sempurna. Adapun tahapannya sebagai berikut :



1. Trimming Spesimen berupa ovarium dicuci bersih dengan air mengalir untuk menghilangkan larutan fiksasi, yang sebelumnya spesimen difiksasi terlebih dahulu dengan larutan fiksatif formalin 10 % dengan perbandingan antara volume spesimen dengan larutan 1 : 10 untuk mendapatkan hasil yang baik. 2. Kemudian jaringan specimen dipotong setebal 2 – 4 mm menggunakan pisau skapel No. 2224. Potongan jaringan tersebut dimasukkan ke dalam embedding casette, tiap embedding cassette berisi 1 – 5 buah potongan jaringan yang disesuaikan dengan besar kecilnya potongan. Kemudian dicuci di bawah air mengalir selama 30 menit.



3. Dehidrasi Embedding cassette diletakkan di atas tisu untuk mengeringkan air. Kemudian diberi perlakuan sebagai berikut secara berurutan pada tabel berikut : Tahap



Waktu



Zat Kimia



Dehidration



2 jam



Alkohol 80%



2 jam



Alkohol 95%



2 jam



Alkohol 95%



1 jam



Alkohol absolut I



1 jam



Alkohol absolut II



1 jam



Alkohol absolut III



1 jam



Xylol I



1 jam



Xylol II



Clearing



Impregnasi



1 jam



Xylol III



2 jam



Paraffin I



2 jam



Paraffin II



2 jam



Paraffin III



4. Embedding, Setelah proses dehidrasi, maka jaringan yang berada dalam embedding casette dipindahkan ke dalam ”base mold”, kemudian diisi dengan paraffin cair (paraplast) dimasukkan ke dalam cangkir logam dan dimasukkan dalam oven dengan suhu di atas 580C.



5. Tuangkan paraplast cair ke dalam pans. Jaringan satu persatu dipindahkan dari embedding cassette ke dasar pans dengan mengatur jarak satu dengan yang lainnya. Pans dimasukkan atau diapungkan di dalam air.



6. Paraplast yang berisi jaringan dilepaskan dari pans, paraplast dipotong-potong sesuai dengan letak jaringan dengan menggunakan skalpet atau pisau hangat. Kemudian diletakkan pada balok kayu berukuran 3 x 3 cm.



7. Jaringan yang sudah diletakkan pada balok kayu atau casette disebut blok paraffin. Fungsi



dari balok kayu atau casette adalah untuk pemegang pada saat blok dipotong pada mikrotom.



8. Cutting, Proses cutting dilakukan di dalam ruangan dingin. Cutting adalah proses pemotongan jaringan dengan menggunakan mikrotom yang terlebih dahulu didehidrasi. Sebelum dipotong, blok terlebih dahulu didinginkan, pemotongan dilakukan secara kasar dan halus, selanjutnya blok dipotong dengan ketebalan 4 -5 µm.



9. Setelah blok dipotong, pilih lembaran yang baik, apungkan pada air dan kerutannya dihilangkan dengan cara salah satu sisi lembaran jaringan tersebut ditekan dengan ujung jarum, di sisi lain ditarik dengan kuas runcing.



10. Lembaran jaringan tersebut ke dalam waterbath selama beberapa detik sampai menggembung sempurna. Kemudian lembaran jaringan tersebut dipindahkan ke dalam waterbath selama beberapa detik sampai menggembung sempurna. Dengan gerakan disedot, jaringan tersebut diambil dengan slide bersih dan tempelkan di tengah atau sepertiga atas/bawah. Dicegah agar jangan sampai ada gelembung udara di bawah jaringan.



11. Setelah itu slide yang telah berisi jaringan ditempatkan pada inkubator (370C) selama 24 jam sampai jaringan melekat sempurna pada slide. Kualitas hasil cutting sangat tergantung pada keterampilan dan pengalaman serta pengetahuan yang mendalam tentang peralatan yang akan dipakai dan karakteristik jaringan yang akan dipotong.



12. Setelah pembuatan slide preparat selesai, dilakukan pengamatan dibawah mikroskop untuk melihat preparat yang terbaik sebelum dilakukan pewarnaan.



13. Proses selanjutnya adalah pewarnaan dengan menggunakan pewarna HE, proses pembuatan pewarnaan HE yaitu, Bahan pewarnaan : a. Hematoxylin kristal : 5 g b. Alkohol Absolut : 50 ml c. Ammonium (potassium alkena) : 100 g d. Aquadest : 1000ml e. Mercury oxide : 2,5 g Cara kerja : Larutan potassium alkena (ammonium) dimasukkan ke dalam air dan dipanaskan, kemudian ditambahkan Hematoxylin kristal yang telah dilarutkan pada alkohol absolut. Campuran larutan tersebut dididihkan selama 1 menit sambil diaduk, lalu secara perlahanlahan. Tambahkan mercury oxide sampai berwarna jingga gelap. Setelah itu, larutan dikeluarkan dari panas dan segera didinginkan. Untuk memperjelas pewarnaan inti ditambahkan 2-4 ml asam asetat glasial per 100 ml larutan. Larutan ini perlu disaring sebelum digunakan. Dalam proses pewarnaan secara berurutan slide dimasukkan ke 36 dalam zat kimia di bawah ini dengan waktu sebagai berikut, seperti pada tabel berikut :



Zat Kimia



Waktu



Xylol I



5 menit



Xylol II



5 menit



Xylol III



5 menit



Alkohol Absolut I



5 menit



Alkohol Absolut II



5 menit



Aquades



1 menit



Harris Hematoxylin



20 menit



Aquades



1 menit



Acid alkohol 2 – 3 celupan Aquades



1 menit



Aquades



15 menit



Eosin



2 menit



Alkohol 96% I



2 menit



Alkohol 96% II



3 menit



Alkohol Absolut III



3 menit



Alkohol Absolut IV



3 menit



Xylol IV



5 menit



Xylol V



5 menit



14. Mounting, Setelah jaringan pada slide diwarnai, dilakukan mounting dengan cara meneteskan bahan mounting (canada balsam) sesuai dengan kebutuhan dan ditutup dengan cover glass dengan cepat agar tidak ada gelembung udara yang terbentuk.



15. Pembacaan Slide Dengan Mikroskop Slide yang telah jadi diperiksa dibawah mikroskop sinar dengan pembesaran 40x, 100x, 200x atau 400x. Pada hasil slide yang baik, akan terlihat inti sel berwarna biru dan sitoplasma berwarna merah jambu. Hasil pengamatan yang didapatkan, dicatat dalam bentuk data tabel.