PDF RFLP PDF [PDF]

Citation preview

c
 c   
    



I.



M
 Mel  lisis DNA de metode RFLP t  meem  DNA y sm de b ti DNA di CS smpel DNA beberp ter.



II.



Dsr Meori



2.1.



DNA, Iormsi Geeti d Polymorphism Iormsi eeti s t sel hid p tersimp di dlm mromole l biolois sm



 let, ter tm dlm bet  sm deosiribo let (DNA- Deoxyribo let Acid). Kode y meyimp iormsi eeti disimp dlm bet  se es bs itroe y bervrisi pd setip  leotid. DNA d RN dlh d 
eis sm  let y d pd setip mhl  hid p. [erbed tr DNA d RNA dlh pd  l itiy. DNA me   l deosiribos sebi iti  leotid semetr RNA me   l ribos. DNA ;ebih erper sebi peyimp iormsi eeti semetr RNA berper dlm peer
emh mteri eeti terseb t me
di s t sit eeti. 1,2 DNA dlh mromole l herediter pemb iormsi eeti. DNA mer p polimer sm  let y memilii moomer  leotid. N leotid terdiri dri  l de tom rbo 5, deosiribos, de ost teresteriisi pd tom rbo 5¶ d bs itroe pd pd tom rbo 1¶. D  tipe bs itroe y tersedi dlh p ri, bs itroe de d  cici, y terdiri dri Adei d G i, d pirimidi, bs itroe de cici t l, y oty dlh Mimi d



Sitosi. N leotid berit ovle de  leotid li membet  polimer liier berbet  ti y terh b  de it 3¶-5¶ osodiester tr   s ost pd C5¶ st  leotid de   s OH pd C3¶ mili  leotid liy. Mole l DNA terdiri dri d  ti t l y berit de it hydroe tr bs itroe membet  str t r do ble helix tiprlel dim orietsi tr ed  ti ber
l e rh y berbed. Uti y st ters s  de orietsi 5¶-3¶ sememtr y liy berorietsi 3¶-5¶. It hydroe y terbet  dri bs itroey ter
di secr esl si. Bs itroe Mimi sell berit de Adei de 2 it hydroe semetr G i sell berit de Citosi de 3 it hydroe.1,2 Vrisi s s  se es bs itroe  membet  ode iormsi eeti pd tip sel hid p. St



sit eeti diode di st



bi h s s pd DNA y



memilii se es  leotid y h s s de p
 tertet . Sit terseb t m c l dri protei y terode oleh setip e. seb h e terdiri dri odo-odo, yit triplet se es bs itroe. Dim tip odo meode s t sm mio. Vrisi tr odo  meyebb vrisi tr sm mio y mey s  setip protei sehi s s  sm mio terseb t  memberi rteristi i t  protei y dihsil. Se es sm  let stlh bervrisi tr mhl  hid p y berbed, bh di dlm st spesies. Vrisi tr idivid y berbed ii dim polimorisme eeti. Istilh polimorisme bisy di  t  vri eeti y dimilii oleh setidy st



perse dri pop lsi. Peyebb



tm dri



polimorisme eeti dlh  m lsi m tsi titi y seleti dim m t, idivid hsil m tsi, dpt berth hid p d meris mteri eeti m ty epd



et r y. Polimorisme pd m si dpt ber p vrisi tr idivid de perbed st  leotid (SNP-Sile N cleotid Polymorphisme) m p  vrisi pd se es  leotid y lebih by. Polimorisme tr idivid dlh s b
e lisis d pemeris DNA dim perbed se es DNA tr idivid bis di  t  berbi eperl , ditry pemeris oresic, idetiisi orb, diosis peyit d tes pterits. 1,2,3 2.2.



RFLP Slh st tei pertm y di  secr l s t  medetesi vrisi d



polimorisme pd se es DNA dlh tei Restrictio Frme Leth Polymorphism (RFLP). Mei RFLP didsr pd tivits s t eim restrisi y memoto DNA me
di rme-rme spesii. Perbed se es DNA tr idivid  memper hi titi poto restrisi edo lese sehi rme y terpoto  memilii p
 y bervrisi. Perbed p
 rme  terliht setelh dil  eletrooresis el, hibridissi d vis lissi. Hsil dri RFLP dlh proil pit-pit berdsr p
 rme. Idivid de DNA y berbed  mehsil pol y berbed.1,2,3,4 Aplisi terbi RFLP di  t  berbi mcm e , ter tm y berh b  de lisis DNA. Beberp cotoh plisi RFLP dlh



t 



medetesi diversits eeti, h b  eerbt, se
rh domestisi, sl d evol si s t spesies, eeti drit, eom mppi, isolsi e h s s d ostr si perp st DNA. Dlm proses RFLP y  dil , RFLP di  sebi metode t  mecoco b ti DNA CS de smpel DNA ters sehi dpt dieth i sip pel e
ht dri beberp or pel ters.1,4



2.3



Lh-lh RFLP Lh-lh t  mel  lisis RFLP di lbortori m dlh4 :



1. Isolsi DNA. 2. Pemoto de eim retrisi (diesti retrisi) d eletrooresis el. 3. Mrser DNA de so ther blotti. 4. Hibridissi DNA.



2.3.1. Isolsi DNA Lh pertm dlm mel  lisis vrisi idivid l dlm e (rme DNA) dlh isolsi e y med  r t se es  leotid y bervrisi t  memperoleh
mlh DNA y de t t  peeliti. 3 Isolsi DNA dil  de membil smpel sel beriti y memilii DNA dri orism. Sel smpel DNA em di diproses de diter
e t  mel  lisis membre sel d iti sel, ll pemish DNA dri ompoe sel li, terms  debris sel de setri si. Setelh etrsi DNA dil  presipitsi DNA de isopropol 100%. Seli DNA, bh li  lr t di dlm lohol terseb t sehi st dil  setri si, DNA  meedp d terpish dri sey li. 2,4 RFLP memerl  DNA y m ri d bebs dri otmi de bert mole l y tii. Hl y dpt me em ri DNA hsil isolsi dlh : 4 . DNA pth-pth selm proses isolsi. b. DNA terderdsi oleh eim  clese.



c. Mer
di otmisi oleh polisrid. d. Metbolit se der i t terisolsi.



2.3.2. Pemoto rme DNA de eim restrisi (diesti restrisi). DNA m ri hsil isolsi em di  dipoto de eim restrisi edo lese membet  poto DNA spesii. Eim restrisi terseb t memoto DNA dlm se es di dlm mole l (b  di




 mole l



seperti eim eso lese) de se es DNA y spesii. Eim ii hy memoto DNA pd se es y h s s tid seperti metode li y meoto DNA secr rdom. Ady m tsi tertet pd losi pemoto  meyebb DNA tid terpoto seperti bis d terbet  rme DNA y lebih p
. Vrisi p
 rme iilh y me
di dsr lisis RFLP. 1.5 Eim restrisi edo lese ii ditem  pd berbi
eis bcteri d bertid
sebi meisme perth bteri dri mole l DNA si. Eim terseb t dim berdsr m bteri y memiliiy, misly eim ecoRI bersl dri E.Coli. eim restrisi  meeli se es pede y spesii d h s s sep
 4-7 bs. Sit



tm eim ii dlh



spesiitsy dim eim y sm  sell mem t s DNA pd r t tertet . Hsil poto DNA dpt ber p ti t mp l/bl t (
 rme ti d) m p  leet/sticy (




 rme ti t l). Frme



sticy lebih ber  d m dh di  t  proses lise pd reombi DNA. 1,2,3



2.3.3 Gel eletrooresis Setelh dil  pemoto smpel DNA oleh eim restrisi,  terbet  poto rme DNA dlm berbi  r. Perbed ecil tr rme restrisi terseb t dpt didetesi d dipish de mel  eletrooresis el. Gel eltrooresis  memish mole l berdsr  r de me  med listri. Semi pede rme DNA, semi
 h rme terseb t ber
l meiiltrsi el. DNA memilii   s ost y berm t etive sehi mole l DNA  ber
l e rh eletrod positi pd eletrooresis. Gel y di  tert  dri t
 d plisiy. Gel polirilmid dpt memish mole l DNA de perbed p
 st  leotid s
, di  t  DNA seq eci. Gel ros di  t  memish rme DNA y memilii perbed  r lebih besr. 3,6 Hsil eletrooresis el  memberi pit-pit y membet  pol h s s t  setip idivid . Pol terseb t dpt diliht de berbi tei, misly de per etidi m bromide  mehsil l rosesi
i di bh sir UV. Frme restrisi bisy diidetiisi lebih l
t de hibridissi d vis lissi de probe. 2.3.4 Mrser DNA So ther Blotti Proses hibridissi d vis lissi dili de trser DNA dri sel ros e ilo berpori t membre itrosel los. Mrser DNA diseb t ³So ther Blotti , mec epd m peem tei terseb t yit E.M. So ther (1975).7



Prosed r metode ii meombisi lim tei lbortori m, d mem i pr peeliti t  dpt medetesi d melisis r t DNA tertet . Lim tei lbortori m y di  tr li7 : . Peyip rme restrisi Smpel DAN y  di
i dipersip dri s mber y tept, em di eim restrisi ditmbh t  mehsil rme restrisi. b. Eletrooresis Cmp r rme restrisi dri setip smpel dipish de eletrooresis. Setip smpel membet  s t pol pit y hs. c. Blotti Asi piler meri lr t lli e ts meleti el d meleti selembr erts itrosel los y dilet di tsy, memidh DNA e erts terseb t sert medet rsiy dlm proses terseb t. Uti t l DNA melet pd erts y ditempt dlm pit tept seperti pd el. d. Hibridissi de probe rdioti Blot erts dippr pd lr t y med  probe berlbel rdioti. Probe ii mer p DNA



ti t l y omplemeter



terhdp r t DNA y diii, d probe ii dilet e rme restrisi y med  r t omplemeter de cr berps bs. e. A todiori



Selembr ilm otori dilet di ts erts. Rdiotivits pd probe y terit mempr ilm t  membet  by y ses i de pit DNA y spesii-pit y med  DNA y berps bs de probe it .



2.3.5. Hibridissi d Vis lissi DNA y telh ditrser e lembr itrosel los  dihibridissi de probe. Probe dlh DNA ti t l y omplemeter terhdp DNA pd itrosel los. Proses hibridissi  meyt  embli (Reeli) probe de DNA



ti t l pd itrosel los. Bisy



probe memb lbel rdioti misly



35



P, probe dpt didetesi de



 todiori. Dib t  todiorm de memb  s bh y med  probe hybrid de erts sir-X. ilm sir-X terseb t  terp
 oleh electro hsil disitersi tom rdioti tept di ts probe sehi membet  pol ses i pit DNA y d.2,3,6 Probe pd m my bersl dri cDNA (dri hsil reverse trscriptse e RNA), rme DNA eom (dip t s dri eom oleh eim restrisi), olio leotid siteti t d RNA. Mid sem  probe berit de lbel rdioti. Probe dpt
 dilbeli de sey imi tmbh misly l orohores y dpt didetesi de l oroses.2,3 M tsi d perbed eotip  mehsil sisi peel eim y berbed pd s t se es DNA. Hsil dri tei RFLP dlh pol pit DNA y didetesi de d tidy rme DNA de p
 tertet .



Perbed tr eotip dri idivid berbed  divis lissi sebi pol rme restrisi y berbed.



2.4.



Kelebih d e r RFLP RFLP mer p metode y memp yi  rsi y tii d m dh ditrser



tr lbortori m, RFLP bersit odomi sehi dpt medetesi heteroiosits, tid diperl  iormsi se es DNA tret, d re tret berdsr homoloi se es sehi direomedsi



t  lisis iloei tr spesies








bererbt. RFLP coco di  t  pemb t pet lie, mer p mrer lo s y spesii, d memp yi emmp  pemish y tii bi pd tit pop lsi, spesies, t



idivid l. RFLP mer p tei y sederh



pbil probe tersedi. Ke r RFLP dlh dib t hy DNA de em ri tii dlm
mlh by, tid m i dil   tomtissi, s lit di  pd beberp spesies de tit polimorisme redh, medetesi lo s y sediit, memerl  perp st probe y ses i, sert memb t h t d te y by



3.



Metodoloi



À  c   3.1



Alt d Bh . Alt † Sistem eletrooresis sel ros (electrophoresis chmber, csti try, 8-ell comb) 1 b h. † Pipet tips, 2-200 ȝL seby 15 tip † Miro pipet, 2-20 ȝL seby 1 b h † Mb  tes miro y telh diri (hi
 , bir , ore, violet, red, yello msimsi 1 b h) † Permet mrer 1 b h † Mempt smph 1 b h † B s miro test t be holder 1 b h † Lbortory tpe † I btor t 37o terbth (optiol) † Mirosetri e



b. Bh



† ecoRI / PstI eyme mix 80 ȝL † DNA pel , DNA ters 1, DNA ters 2, DNA ters 3, DNA ters 4, d DNA ters 5. † Arose 1% y dicir dlm MAE 3.2



lh er
 1. Beri lbel pd tb  resi de etet  : Mb  hi




:pel (CS)



Mb  bir



:ters 1 (S1)



Mb  ore



:ters 2 (S2)



Mb  violet :ters 3 (S3) Mb  merh :ters 4 (S4) Mb   i



:ters 5 (S5)



Simp tb -tb  terseb t e b s peyimp tb  tes miro. 2. Beri lbel ³EN2 pd tb  tes miro y med  cmp r eim restrisi. 3. De me  tip y br , pidh 10 ȝL msi-msi DNA e tb  y ses i. 4. Kombisi d resi. G  pipet tip br



t  tip smpel, pipet 10 ȝL



cmp r eim ³EN2 e dlm setip tb  resi. 5. M t p sem  tb  de rpt. Cmp r ompoe-ompoe de me
eti tb  secr hti-hti de me 
ri. Ji di lbortori m terdpt setri e, etr tb  selm 2 deti t  mems cir e dsr tb  d memb t ret tercmp r d terombisi



(psti r s s  tb  dilet seimb di bli-bli). Ji tid terdpt setri e di lbortori m, tb  dioco seli de cept. Meet  tb  e me

 dpt membt



proses pecmp r d



ombisi isi tb . 6. Pei bsi smpel, melet tb -tb  pd b s microt be holder d mei bsiy pd s h 37oC selm 45 meit. Pilih lterti y dpt dil  dlh de mei bsi tb  pd ir y dips smpi s h 37Oc dlm
mlh by. Mb  d ir dii bsi semlm d s h ir  mecpi s h r  secr perlh. Setelh i bsi, DNA diest dpt disimp di lemri pedii smpi proses RFLP dil
t.



DAFMAR PUSMAKA



1) M rry, Robert K. et ll. 2006. Ñ

 
  
, 27th 



. Ne Yor: Mc Gr Hill. 2) Korp, Gerld. 2006. 3  
 3  
 5th 



. Hoboe: Willey t Sos. 3) Mrs, D B. et ll. 2000.    
 
. Jrt: EGC. 4) Ftchiyh d Estilrs Ar mitys. 2006.        !"   Ml: Lbortori m Bioloi Mole lr d Sel lr Uiversits Bri
y. 5) B diyto, Ari et ll. 1997.   

 . Jrt : Bi Kedoter Foresi F lts Kedoter Uiversits Idoesi. 6) Stryer, L bert. 2000.   . Jrt: EGC. 7) Cmpbell, N.A., Je B.R., d Lrece G.M. 2002.  #  $%&. Jrt : Erl.