Pemeriksaan Anti-Hcv Metoda Elisa [PDF]

Citation preview

Pemeriksaan Anti HCV dengan Teknik ELISA A. Tujuan Praktikum : Untuk mendeteksi adanya antibodi terhadap Hepatitis C pada serum dan plasma manusia. B. Metode Pemeriksaan : Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) C. Dasar Teori -



ELISA adalah suatu singkatan bahasa Inggris yang disebut dengan : (Enzymelinked immunosorbent assay) atau penetapan kadar immunosorben tautenzim yang merupakan suatu uji serologis. Menggunakan teknik ELISA dalam bidang imunologi untuk menganalisis interaksi antara antigen dan antibodi di dalam



suatu



menggunakan



sampel, suatu



dimana



enzim



interaksi



yang



tersebut



berfungsi



ditandai



sebagai



dengan



pelapor/signal.



Selanjutnya digunakan sebagai uji kualitatif untuk mengetahui keberadaan suatu antibodi/antigen dengan menggunakan antibodi/antigen spesifik. -



Teknik ELISA juga dapat diaplikasikan dalam uji kuantitatif untuk mengukur kadar antibodi/antigen yang diuji dengan menggunakan alat bantu berupa spektrofotometer dan dengan cara menentukan jumlah penambahan kadar antibodi/antigen, sehingga dapat dibuat suatu kurva standard antara kadar antibody atau antigen yang dapat dihitung berdasarkan absorbansinya. ELISA dianggap pemeriksaan yang memiliki spesifitas dan sensitifitas yang tinggi yang mampu menunjang diagnosa klinis HCV.



-



ELISA ( EIA ) dibagi menjadi dua macam yaitu homogenous EIA dan heterogenous EIA. Homogenous EIA berguna untuk pemeriksaan bahan obatobatan, hormon dan lain-lain. Sedangkan heterogenous EIA berguna untuk pemeriksaan bahan yang memiliki berat molekul besar misalnya antigen dan antibodi. Pemeriksaan parameter petanda serologis HCV termasuk dalam kelompok kedua yaitu heterogenous EIA.



-



Ada tiga tahapan penting dalam uji ELISA yaitu : 1. Pelapisan (coating) dengan antigen atau antibodi pada plate (fase padat). Pelapisan



dengan



dengan



antigen



untuk



penentuan



antibodi



untuk



penentuan antigen. 2. Penambahan bahan yang ditentukan (diperiksa), misalnya serum, plasma, saliva dan cairan tubuh yang lain. 3. Penambahan detektor yang berfungsi untuk mendeteksi ikatan Ag – Ab yang terjadi. Ada dua detektor yang digunakan yaitu : a. Penambahan konjugat yaitu antigen atau antibodi yang berlabel enzim, misalnya Horse Radish Peroxidase (HRPO). Alkaline Phosphatase, Urease, Glukose-Oxidase (GOP) dan lain-lain. b. Penambahan substrat yang berfungsi memberi perubahan warna pada reaksi. Misalnya TMB (Tetra Methyl Benzidine, O- Toluidine, OPD, ABTS dan lain-lain. ELISA sendiri terdiri dari beberapa macam metode diantaranya ELISA kompetitif, ELISA double sandwich antigen atau antibodi dan indirect ELISA yang ketiganya memiliki prinsip dasar reaksi yang sama yaitu reaksi Ag – Ab.



E. Alat dan Bahan : Alat :  Strip Mikrotiter  Mikropipet  Yellow tip  Inkubator  ELISA Reader  Wadah Subsrat  Wadah Larutan Pencuci



Bahan :  Kontrol positif dan negatif  Konjugat



 Subsrat A dan Subsrat B  Larutan Pencuci  Larutan Penghenti (STOP)  Aquadest  Serum



F. Prosedur : a.Siapkan conjugate, substrat dan wash solution. b.Pilihlah sumur yang sesuai dengan jumlah pemeriksaan yang akan dilakukan. c.Tambahkan 180 µL sample diluent kedalam seluruh sumur. d.Kemudian tambahkan 20 µL sample ke dalam seluruh sumur, kecuali sumur Al sampai dengan Cl. e.Pada sumur A l dan Bl ditambahkan dengan 20 µL control negative, f. sedangkan pada sumur Cl ditambahkan dengan 20 µL control positif. g. Setelah itu diinkubasi pada suhu 37°C selama 60 menit. h.Setelah dicuci sebanyak 5 kali dengan 500 µL wash fluid untuk setiap sumur i.kemudian tambahkan 100 µL conjugate ke dalam seluruh sumur dan diinkubasi kembali pada suhu 37°C selama 30 menit. j. Selanjutnya dicuci sebanyak 5 kali dengan menggunakan 500 µL wash fluid untuk setiap sumur. k.Kemudian tambahkan 100 µL substrate ke dalam seluruh sumur dan diinkubasi kembali pada suhu 37°C selama 30 menit. l.Untuk mengakhiri proses reaksi tambahkan 50 µL asam sulfat 0,5 - 2 M ke dalam seluruh sumur dan m.kemudian baca hasilnya pada 450 nm, ref 690 nm.



7. Pembacaan Absorbans a. Absorbansi diukur pada 450 nm sesegera mungkin atau dalam 30 menit setelah penghentian reaksi, dengan menggunakan panjang gelombang acuan 620-690 nm (jika ada). b. Hasil absorban dicatat dan dihitung untuk menentukan MNC, MPC dan COV.



Validasi Hasil : a. Nilai rata-rata kontrol negatif MNC < 0,100 Tidak termasuk apapun nilai [NC], jika melebihi 0.100 atau dua kali melebihi dari MNC. menghitung ulang MNC dari nilai [NC] yang tersisa. b. Nilai kontrol positif MPC > 0,600 Perhitungan : Ada atau tidak adanya Anti HCV ditentukan dengan membandingkan nilai absorbansi spesimen dengan nilai cut-off. Nilai cut-off dihitung dari kontrol negatif. Nilai value (COV) = MNC + 0,1 G. Interpretasi Hasil : HASIL



INTERPRETASI



A450 (spesimen) ≤ COV



Anti-HCV nonreaktif



A450 (spesimen) ≥ COV



Anti-HCV reaktif