Penetuan Protein Dengan HPLC [PDF]

Citation preview

Penentuan Protein dengan HPLC



UMUM • Prinsip dasarnya kromatografi… • HPLC singkatan dari High performance liquid chromatography, merupakan salah satu teknik kromatografi untuk zat cair yang biasanya disertai dengan tekanan tinggi. Jg dikenal Kromatografi cair kinerja tinggi • Seperti teknik kromatografi pada umumnya, HPLC berupaya untuk memisahkan molekul berdasarkan perbedaan afinitasnya • Afinitas kecenderungan suatu unsur atau senyawa untuk membentuk ikatan kimia dengan unsur atau senyawa lain • Teknik ini sangat berguna untuk memisahkan beberapa senyawa sekaligus karana setiap senyawa mempunyai afinitas selektif antara fase diam tertentu dan fase gerak tertentu. • Dengan bantuan detektor serta integrator kita akan mendapatkan kromatogram. Kromatorgram memuat waktu tambat (waktu retensi)serta tinggi puncak suatu senyawa.



• Kromatografi merupakan sebuah teknik atau metode pemisahan molekul yang didasarkan pada perbedaan pola pergerakan antara fase gerak dan fase diam. Kromatografi digunakan untuk memisahkan komponen (berupa molekul) yang berada pada suatu larutan. • HPLC adalah alat laboratorium yang bekerja dengan metode fisikokimia, didasarkan pada teknik kromatografi dimana fase geraknya berupa cairan dan fase diamnya bisa berupa memiliki bentuk padat atau cair. • Penggunaan alat HPLC sangat erat kaitannya dengan dunia industri obat dan makanan. Fungsi HPLC adalah untuk menentukan atau mengukur atau menganalisa kadar bahan aktif (kuali and kuanti) pada suatu sample(obat, makanan atau herbal). Pada beberapa kasus yang berhubungan dengan obat herbal, alat ini digunakan untuk menentukan marker (tanda) pada suatu obat herbal.



Istilah yang perlu Tahu • • • • • •



1. Fase gerak dan fase diam , 2. Polar dan non polar 3. Fase normal dan terbalik, 4. Waktu Retensi.. Rf 5. Kromatogram dan luasan 6. Penentuan konsentrasi



Fase Gerak •



•



. Fasa gerak berupa cairan yang polar maupun non polar dg syarat : -pelarut yang baik untuk cuplikan yang akan di analisis. -Zat cair harus murni sekali untuk menghindarkan masuknya kotoran -Zat cair harus jernih sekali untuk menghindarkan penyumbatan pada kolom. -Zat cair harus mudah diperoleh, murah, tidak mudah terbakar, dan tidak beracun. -Zat cair tidak kental. Fase gerak campuran pelarut-pelarut hidrokarbon dengan pelarut yang terklorisasi atau menggunakan pelarut-pelarut jenis alkohol.(Fase Normal) …Fase



•



gerak Non Polar Pemisahan dengan fase normal ini kurang umum dibanding dengan fase terbalik.



•



Fase gerak yang paling sering digunakan untuk pemisahan dengan fase terbalik adalah campuran larutan bufer dengan metanol atau campuran air dengan



asetonitril. …….Bersifat



polar



Fase Diam (



yang normal polar



)



• Fase diam yang digunakan biasanya berisikan silika murni atau gugus senyawa organik seperti amino atau siano yang terikat pada basis silika. Sedangkan fase geraknya biasanya merupakan senyawa non polar seperti heksana atau heptana yang sedikit dicampur dengan senyawa polar seperti metanol, etanol, ataupun isopropanol. • Fase diam ada pada kolom diameter kecil terbuat dari plastik atau stainess steel uk diameter 2- 4 mm……tuku dadi



• Kolom adea tiga jenis 1. Konvensional 10 – 20 cm 2. Microbore 10 cm 3. Hight speed 6 cm



Polar non Polar • Dikatakan polar jika memiliki momen dipole…punya momen dipole jika senyawa punya gugus elektronegatif dan tidak simetris. • Ciri khas senyawa polar… • Sinau …



Fase Normal dan terbalik • Fase Normal fase diamnya adalah Polar (mis Silikagel) nah fase geraknya non polar. Analit yang dipisahkan juga non polar. • Jika kolom polar,maka senyawa yang polar akan tertahan lama di kolom ( Like disolve like)…nah senyawa non polar keluar duluan… • Fase Terbalik itu fase diamnya Non Polar dan fase geraknya Polar ( ini yang umum digunakan)



Gambar HPLC



DIAGRAM HPLC/KCKT



Luaran HPLC