Pengantar Praktikum Semester 4 [PDF]

Citation preview

Pengantar Praktikum Semester 4 (Chemiluminescence Immunno Assay)



PENDAHULUAN ❑



EIA (Enzyme Immuno Assay) ❖ Elisa (Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay) ❖ CHLIA (Chemiluminescence Immunno Assay)



❑



CHLIA menggunakan substrat berupa luminol, isoluminol/derivatnya atau derivat acridium ester → mengeluarkan cahaya ketika ditambahkan reagen triger



❑



CHLIA menetapkan konsentrasi analit pada sampel berdasarkan intensitas dari luminescen yang dikeluarkan akibat reaksi kimia



❑



Umumnya menggunakan teknologi assay sandwich → jumlah signal yg diukur secara proporsional langsung menunjukkan jumlah analit yang ada pada sampel



KEUNTUNGAN Metode CHLIA 1.



Menggunakan “magnetic microparticle” berbentuk bola sbg pembawa Ag dan atau Ab → permukaan lebih luas, shg jumlah Ab/Ag yg dibawa lebih banyak



2.



Keutamaan CLIA adalah dalam penggunaan substrat yang memiliki aktifitas tinggi, lebih stabil dan memiliki emisi cahaya lebih tinggi → jumlah cahaya yg lebih banyak lebih mudah terukur → lebih sensitif Proses kimia lebih stabil terhadap perubahan suhu & Ph Sistem deteksi tidak menggunakan cahaya dari luar Pengukuran photon dari reaksi chemiluminescence menghindari masalah yg berkaitan dg filter dan pemilihan panjang gelombang Umumnya menggunakan peralatan otomatik mengurangi kemungkinan kontaminasi dan human error



3. 4. 5.



6.



Masih ingat Prinsip Elisa ???



Prinsip Clia Architect



LIAISON XL murex HCV Ab – Test Format Indirect 2 steps



STEP 1



p22



NS4



150µL diluent



NS4 p22



Incubation (23’ 66 cycles)



+ MP coated with HCV core and NS4 rec Ag and streptavidin-coated MP



C33 C33



Wash with Wash/System liquid.



25µL Sample



25µL Antigen



STEP 2 150µL Tracer



+



Wash with Wash/Systemliquid



Incubation (12’36 cycles)



Add the Starter Reagents and measure the light emitted



Assay Principles



6



Liaison XL – HBsAg test format



Sandwich 2 steps 30µL Assay Buffer



STEP 1



150µL sample



+ Magnetic particlescoated with antibodies to HBsAg (mouse monoclonal)



Incubation (21’ 66 cycles)



Wash with Wash/System liquid.



HBsAg in samples, and controls



HBsAg binds to the solid phase



Antibody conjugate reacts with HBsAg already bound to the solid phase



STEP 2



Incubation (31’ 99 cycles)



Wash with Wash/System liquid.



180µL Tracer 20µL Assay Buffer



Mouse monoclonal IgG to HBsAg having balanced reactivity for ad and ay subtypes, conjugated toan isoluminol derivative



Add the Starter Reagents and measure the light emitted



7



LIAISON XL murex HIV Ab/Ag – Test Ab Sandwich 2 steps



STEP 1



Spec. antibodies to HIV 1 (group M and group O) and/or to HIV-2 in human serum or plasma samples 100uL



+



Incubation (12’ 36” - 36 cycles)



Wash with Wash/System liquid.



specimen diluent



Magnetic particles coated with rec HIV-1 gp41 (group M and group O) as well as HIV-2 gp35 recombinant antigens (both obtained in E. coli)



STEP 2 Recombinant HIV-1 gp41 (group M and group O) as well as HIV-2 gp35 recombinant antigens conjugated to an isoluminol derivative



+



conjugate diluent



Incubation (33’ 36” - 96 cycles)



Wash with Wash/Systemliquid



Add the Starter Reagents and measure the light emitted



8



Perbedaan EIA dengan CLIA No Konfigurasi tes



EIA



CLIA



1



Pembawa Ag dan atau Ab* (fase padat)



Sumur mikro (microplate)



Microparticle



2



Konjugat



Ag dan atau Ab berlabel enzyme



Ag dan atau Ab berlabel senyawa acridinium



3



Substrat



Kromogen / zat warna



Senyawa chemiluminescence



4



Pembacaan



Serapan cahaya dgn spektrofotometer



Emisi cahaya dgn luminometer



* Ag = antigen ; Ab = antibodi



KALIBRATOR DAN KONTROL •



Kalibrator – Larutan yang diketahui nilainya yang digunakan untuk menghasilkan hubungan antara jumlah signal yang diproduksi dalam suatu assay dengan konsentrasi analit –



•



Biasanya berupa satu set kalibrator



Kontrol – Sampel yang mengandung analit yang diketahui konsentrasinya – Digunakan untuk memonitor performans akurasi dan presisi dari suatu assay



FAKTOR PENENTU HASIL UJI SARING IMLTD 



 



Input:  Sampel: volume, kondisi dan identitas  Alat: validasi dan pemeliharaan  Reagensia: metoda, sensitifitas, spesifisitas, masa kadaluarsa, kualitas, volume  Tenaga: kompetensi Proses:  Prosedur kerja, Instruksi Kerja, Lembar Kerja Output:  Hasil uji saring: Pembacaan, interpretasi hasil, laporan 21