![Penuntun Praktikum Teknik Laboratorium Mikrobiologi Medik Veteriner 1 [PDF]](https://pdfs.asia/img/200x200/penuntun-praktikum-teknik-laboratorium-mikrobiologi-medik-veteriner-1.jpg)
3 0 1 MB
PENUNTUN PRAKTIKUM TEKNIK LABORATORIUM MIKROBIOLOGI MEDIK VETERINER
Disusun Oleh: Drh. Debby Fadhilah Pazra, M.Si Ni Kadek Karisma Dewi, SST
PROGRAM STUDI KESEHATAN HEWAN JURUSAN PETERNAKAN POLITEKNIK PEMBANGUNAN PERTANIAN BOGOR 2019
1
DAFTAR ISI
TATA TERTIB LABORATORIUM
3
BAB I MEDIA PERTUMBUHAN MIKROBA Media Pertumbuhan Mikroba Berdasarkan Komposisi
5
Media Pertumbuhan Mikroba Berdasarkan Bentuknya
6
Media Pertumbuhan Mikroba Berdasarkan Kegunaannya
6
BAB II TEKNIS ASEPTIS DAN STERILISASI Teknik Aseptis
12
Teknik Sterilisasi
13
BAB III TEKNIK ISOLASI, PENANAMAN (KULTIVASI),
15
PEMURNIAN (PURIFIKASI) DAN PENGHITUNGAN JUMLAH (ENUMERASI) MIKROBA Preparasi sampel
18
Isolasi dan Penanaman Mikroba
20
Perhitungan Jumlah Mikroba
30
BAB IV MIKROSKOP MEDAN TERANG DAN PERAWATANNYA 45 BAB V PENGAMATAN MIKROORGANISME HIDUP
48
Preparat Basah
48
Preparat Tetes Bergantung
51
BAB VI PEWARNAAN BAKTERI, ENDOSPORA, KAPANG
52
Preparat Ulas & Fiksasi
53
Pewarnaan Sederhana
56
Pewarnaan Negatif
57
Pewarnaan Gram
58
Pewarnaan Ziehl Neelsen
60
Pewarnaan Endospora
62
BAB VII DETERMINASI BAKTERI DENGAN UJI BIOKIMIAWI
66
Test Oksidase
68
Test Katalase
69
Test O-F (Oksidasi Fermentasi)
69
2
Test pengunaan sitrat
69
Test dekarboksilase lisin
70
Test H2S dan fermentasi gula-gula
70
Test hidrolisis gelatin
70
Test indol
70
Test MR (Methy Red)
71
Test VP (Voges Proskauer)
71
Test urease
71
DAFTAR PUSTAKA
72
3
TATA TERTIB LABORATORIUM Guna melindungi diri dan mencegah tercemarnya bahan yang anda kerjakan, patuhilah peraturan-peraturan laboratorium berikut ini: 1. Letakkan tas dan benda-benda lain milik Anda yang tidak diperlukan pada tempat yang disediakan; janganlah sekali-sekali meletakkannya di meja lab1oratorium. 2. Kenakan jas laboratorium selama Anda bekerja di laboratorium. Jas laboratorium tidak hanya melindungi diri Anda dari kontaminasi yang tidak disengaja, tetapi juga akan melindungi Anda dan pakaian Anda dari zat warna atau zat kimia lainnya yang digunakan sehari-hari dilaboratorium. 3. Sekalah baik-baik meja laboratorium Anda dengan desinfektan sebelum dan sesudah kegiatan laboratorium. 4. Cucilah tangan Anda baik-baik dengan air dan sabun sebelum dan sesudah kegiatan laboratorium. Lakukan hal yang sama bila anda meninggalkan laboratoriumuntuk pergi ke kamar kecil. 5. Jangan merokok, makan, atau minum di laboratorium. 6. Jauhkan tangan Anda dari mulut, hidung dan telinga selama Anda bekerja di laboratorium. 7. Perlakukan semua organisme yang anda tangani sebagai patogen (mampu menimbulkan penyakit). Kebanyakan biakan yang disediakan di laboratorium tidak berbahaya, tetapi beberapa di antaranya berbahaya. 8. Anda tidak diperkenankan membawa keluar biakan mikroorganisme apapun dari ruangan laboratorium. 9. Usahakanlah supaya mikroorganisme yang Anda tangani tidak tercecer dan tidak tercampur dengan organisme lain. 10. Bila biakan yang sedang Anda pindahkan tercecer di lantai, tuangkan disinfektan ke atasnya, seka dengan kertas merang dan buang di tempat yang disediakan untuk bahan-bahan bukan kaca yang terkontaminasi. 11. Bila Anda memecahkan tabung berisi mikroorganisme, tuangkan disinfektan ke atasannya, sapukan, dan buang di tempat yang telah disediakan untuk pecahan kaca. 12. Bila anda terkontaminasi atau terluka, hubungi petugas laboratorium. 13. Buanglah smpah-sampah yang tidak terkontaminasi di tempat yang telah disediakan. 14. Lup inokulasi dan jarum inokulasi dengan cara memijarkan seluruh panjang kawatan sebelum dan sesudah setiap penggunaan. Percikan biakan dapat dihindarkan dengan cara memulai pemanasan di dalam kerucut api sebelah dalam yang berwarna lebih biru.
4
15. Bila pipet yang sama perlu digunakan lebih dari satu kali, janganlah meletakkannya langsung di atas meja di antara penggunaan, tetapi letakkanlah pada penyangga pipet yang tersedia. 16. Api pada pembakar Bunsen harus dikecilkan atau dimatikan pada waktu tidak digunakan. 17. Biakan yang tidak diperlukan lagi serta bahan-bahan bekas pakai yang mempunyai potensi bahaya harus diletakkan dalam tempatnya masing-masing yang disediakan sebagai berikut: • Cawan petri, labu, dan tabung reaksi harap diletakkan pada tempat-tempat khusus yang telah diberikan disinfektan. Bakteri yang ada pada kaca objek belum tentu semuanya mati sekalipun sudah di fiksasi dengan panas. Jadi berhati-hatilah menanganinya. Kaca-kaca obyek akan disterilkan pada setiap akhir minggu dan dikembalikan ke laboratorium pada awal minggu berikutnya. • Jangan sekali-sekali membuang biakan di tempat cuci. 18. Sebelum anda meninggalkan laboratorium, cucilah meja laboratorium dan tangan anda seperti yang telah disebutkan pada tata tertib nomor 3 dan 4. Periksalah kembali bahwa gas, kran air, dan lampu-lampu mikroskop telah anda matikan. Tatalah semua reagen dan alat-alat ke tempatnya semula sebagaimana anda temukan ketika anda mulai. 19. Cucilah jas laboratorium sehingga selalu bersih pada waktu anda datang kembali ke laboratorium pada periode berikutnya.
5
BAB I MEDIA PERTUMBUHAN MIKROBA
A. Tujuan Praktikum 1. Mempelajari cara pembuatan media
B. Dasar Teori Kelangsungan hidup dan pertumbuhan mikroorganisme dipengaruhi oleh adanya nutrisi dan faktor lingkungan. Bahan nutrisi yang tersedia dapat berupa bahan alami dan dapat pula berupa bahan sintetis. Bahan nutrisi yang digunakan mikroorganisme biasanya berupa senyawa sederhana yang tersedia secara langsung atau berasal dari senyawa yang kompleks yang kemudian dipecah oleh mikroorganisme menjadi senyawa yang sederhana melalui proses enzimatik. Bahan nutrisi ini dapat berupa cairan atau padatan setengah padat (semi solid) yang disebut sebagai media.
1. Media Pertumbuhan Mikroba Berdasarkan Komposisi atau susunan bahannya a. Media alami Komposisi media ini tidak diketahui secara pasti baik jenisnya maupun ukurannya. Media ini sudah tersedia secara alami misalnya air, nasi, buah, biji, daging, susu dan lain-lain b. Media sintetis Sering juga disebut media buatan. Komposisi senyawa berikut takarannya diketahui secara pasti, tidak tersedia secara alami tapi dibuat. Media sintetik sering digunakan untuk mempelajari sifat genetika mikroorganisme. Senyawa organik dan anorganik ditambahkan dalam media sintetik harus murni sehingga harganya mahal, misalnya: sabouroud agara,czapek’s dox agar, cairan hanks dan lain-lain.
6
c. Media semi sintetis Komposisinya sebagian diketahui secara pasti, sebagian lagi tidak disebut juga media setengah buatan misalnya potato dextrose agar, nutrient agar dan lainlain.
2. Media Pertumbuhan Mikroba Berdasarkan Bentuknya a. Media cair Komposisi dapat sintetis dapat pula alami. Keadaan cair karena tidak ditambahkan bahan pemadat. b. Media padat Sama halnya dengan media cair hanya bedanya disini ditambahkan bahan pemadat (agar-agar, amilum atau gelatin). c. Media semi padat Sebenarnya media ini termasuk media padat tapi karena keadaanya lembek disebut semisolid. Bahan pemadat yang ditambahkan kurang dari setengah medium padat sedangkan komposisinya sama dengan yang lainnya. Media semi dapat digunakan untuk mengetahui pertumbuhan mikroba atau mengetahui motilitas bakteri.
3. Media Pertumbuhan Mikroba Berdasarkan Kegunaannya a. Media umum Media ini digunakan secara umum artinya media ini dapat ditumbuhi oleh berbagai jenis mikroorganisme baik bakteri maupun jamur misalnya NA (nutrient agar), PDA (potato dextrose agar) dan lain-lain. b. Media selektif Media ini dipakai untuk menyeleksi mikroorganisme sesuai dengan yang diinginkan, jadi hanya satu jenis mikroorganisme saja yang dapat tumbuh dalam media ini atau hanya satu kelompok tertentu saja, misalnya media salmonella sigella agar yaitu media khusus untuk mengamati atau menyelidiki Salmonella atau Shigella dari makanan atau bahan lain. Berikut ini beberapa contoh media selektif:
7
•
Untuk Jumlah Koliform : violet red bile agar (VRB agar). Bentuk koloni kolifirm pada media VRB agar: merah keunguan yang dikelilingi zona merah
•
Untuk jumlah Staphylococcus aureus : Vogel johnsol agar (VJA) + potassium tellurite 3% Baird parker agar + ditambahkan 5 ml egg yolk tellurite ke dalam 95 ml agar steril. Koloni bewarna abu-abu sampai hitam pekat dikelilingi zona opak.
•
Untuk bakteri negarif (family Enterobacteriaceae) kecuali Pasteurella dan Haemophilus: Mac Conkey agar plate (MCA) ✓ Bakteri yang memfermentasi laktosa warna koloni pink ✓ Bakteri yang tidak memfermentasi laktosa tidak berwarna/colorles
•
Salmonella-Shigella agar (SSA) ✓ Bakteri yang memfermentasi laktosa warna koloni pink ✓ Bakteri yang tidak memfermentasi laktosa tidak berwarna/colorles ✓ Media selektif yang ideal untuk mengisolasi Salmonella sp dan Shigella sp ✓ Koloni bakteri yang memproduksi hidrogen sulfida (H2S) membentuk black spot
•
Brilliant green agar (BGA) ✓ Bakteri yang memfermentasi laktosa warna koloni kuning ✓ Bakteri yang tidak memfermentasi laktosa bewarna merah ✓ Media selektif yang ideal untuk mengisolasi Salmonella sp
•
Bismuth sulphite agar (BSA) ✓ Media selektif yang ideal untuk mengisolasi Salmonella sp ✓ Koloni bakteri yang memproduksi hidrogen sulfida (H2S) membentuk black spot
•
Eosin methylen blue agar (EMBA) ✓ Koloni Escherichia coli berwarna hijau metalik ✓ Koloni coliform yang lain berwarna coklat gelap dan coklat kemerahan, ✓ Bakteri yang tidak memfermentasi laktosa tidak berwarna
8
c. Media diferensial Media ini digunakan untuk menyeleksi mikroorganisme. Medium ini dapat ditumbuhi berbagai jenis mikroorganisme tapi salah satu diantaranya dapat memberikan salah satu ciri yang khas sehingga dapat dibedakan dari yang lain dan dapat dipisahkan. d. Medium pengaya Medium ini digunakan untuk menumbuhkan mikroorganisme untuk keperluan tertentu. Dibiakkan dalam medium ini supaya sel-sel mikroorganisme tertentu dapat berkembang dengan cepat sehingga diperoleh populasi yang tinggi. Komposisi medium sangat diperluka dan sangat menguntungkan bagi pertumbuhan sel mikoorganisme yang bersangkutan.
C. Prosedur Kerja Pembuatan Media Alat dan bahan a. Timbangan b. Kompor pemanas c. Gelas ukur 500 ml d. Labu erlenmeyer 500 ml dan 1000 ml e. Tabung reaksi f. Kaca pengaduk g. Autoklaf h. Beaker glass 500 ml dan 1000 ml i. Aquades j. Kapas k. Kain kasa l. Benang atau tali m. Alkohol 70%
9
Prosedur Kerja ❖ Membuat medium umum untuk bakteri (Nutrient Agar/NA dan Nutrien Broth/NB): •
NB manual Daging sapi tanpa lemak........................................... 500 gram Peptone ...................................................................... 5 gram Aquades ..................................................................... 1000 ml
•
NB instan NB ............................................................................. 20 gram Aquades ................................................................... 1000 ml
•
NA manual Daging sapi tanpa lemak .......................................... 500 gram Peptone ...................................................................... 5 gram Agar-agar .................................................................. 15 gram Aquades .................................................................... 1000 ml
•
NA instan NA ............................................................................. 20 gram Aquades ................................................................... 1000 ml
Cara Kerja: a. Media NA dan NB Manual 1. Cuci bersih daging sapi, buang bagian lemak jika masih ada 2. Iris daging dengan ukuran 1x1 cm2 , dimasukkan dalam beaker glass atau wadah dan ditambah akuades sebanyak 500 mL 3. Rebus atau masak daging selama 25 menit atau sampai daging lunak (jaga agar volume air tetap, jika berkurang tambahkan akuades) 4. Saring rebusan daging sehingga diperoleh air kaldu, campurkan dengan pepton, agar dan akuades hingga volume akhir 1000 mL (pada pembuatan NB, tidak perlu ditambahkan agar) 5. Panaskan kembali campuran kaldu, pepton dan agar, aduk hingga homogen dan tunggu sampai mendidih, dinginkan pada suhu ruang 6. Cek pH medium menggunakan pH meter dan atur pada pH 7
10
b. Media NA dan NB Instan 1. Timbang media sesuai kebutuhan (penghitungan jumlah mengacu pada takaran yang tertera pada kemasan) 2. Larutkan 20 gram bubuk atau serbuk NA/NB instan ke dalam 1000 ml akuades 3. Aduk hingga serbuk larut, panaskan diatas penangas ditunggu hingga mendidih (larutan terlihat jernih) 4. Dinginkan dan dituang pada cawan petri maupun tabung reaksi serta disterilisasi dengan autoklaf ❖ Membuat medium untuk jamur (Potato Dextrose Agar): •
Manual Kentang .................................................................... 200 gram Dextrose .................................................................... 10 gram Agar-agar .................................................................. 15 gram Aquades .................................................................... 1000 ml
•
Instan (disesuaikan dengan kemasan PDA instan) PDA ........................................................................... 39 gram Aquades ................................................................... 1000 ml
Cara Kerja: a. Media PDA Manual 1. Kupaslah kentang lalu bersihkan, potong bentuk dadu berukuran 1x1 cm2 kemudian timbang hingga diperoleh 200 g kentang 2. Potongan kentang dimasak dalam 500 ml akuades dan biarkan mendidih, jaga agar volume tetap (tambahkan akuades jika menyusut) 3. Saring ekstrak kentang dan ambil filtratnya 4. Tambahkan dekstrose dan agar-agar serta akuades hingga volume akhir 1000 mL aduk hingga homogen 5. Panaskan pada api sedang sambil diaduk hingga homogen atau mendidih 6. Masukkan pada tabung reaksi masing-masing 10 ml untuk media tegak dan 5-7 ml untuk media miring
11
7. Tutuplah tabung berisi medium dengan kapas yang telah dibungkus kain kasa 8. Sterilkan dengan autoklaf 9. Setelah disterilkan untuk media tegak biarkan tabung dalam keadaan berdiri dan untuk media miring tabung miringkan dengan catatan media tidak sampai menyentuh tutup tabung
b. Media PDA Instan 1. Timbang media sesuai kebutuhan (penghitungan jumlah mengacu pada ukuran yang tertera di kemasan 39 g / L) 2. Larutkan serbuk PDA instan ke dalam 1000 ml akuades 3. Aduk hingga serbuk larut, panaskan diatas penangas ditunggu hingga mendidih (larutan terlihat jernih) 4. Dinginkan dan tuang pada cawan petri maupun tabung reaksi serta disterilisasi dengan autoklaf
12
BAB II TEKNIS ASEPTIS DAN STERILISASI
A. Tujuan Praktikum 1. Mempelajari macam-macam teknik sterilisasi 2. Mengetahui prinsip kerja autoklaf sebagai alat untuk sterilisasi
B. Dasar Teori Sterilisasi Suatu alat dan bahan disebut steril apabila bahan tersebut bebas dari mikroorganisme. Sterilisasi dapat dilakukan dengan berbagai cara yaitu: cara kimia, mekanik atau fisik. a. Sterilisasi cara kimia Bahan atau senyawa kimia yang memiliki sifat membunuh mikroorganisme dapat digunakan untuk sterilisasi atau desinfektan, misalnya dibidang kedokteran. Contohnya alkohol 70%, detergen, karbol, lisol, merkurokhrom dan lain-lain.
b. Sterilisasi cara mekanik Sterilisasi ini dilakukan dengan menggunakan alat penyaring yang sangat halus atau disebut metode filtrasi.
c. Sterilisasi cara fisik Umumnya dilakukan dengan cara pemanasan pada suhu tinggi. Salah satu contohnya adalah menggunakan alat autoklaf, disterilkan pada suhu 121 °C dengan tekanan 1,5 kg/cm2 (15 lbs) dalam jangka waktu tertentu bergantung pada apa yang disterilkan.
C. Prosedur Kerja Pembuatan Media ❖ Teknik Aseptis Meja Kerja dan Tangan (Sterilisasi secara kimia) Alat dan bahan a. Alkohol 70 % b. Botol semprot
13
c. Kertas Tissue/kain lap bersih
Cara Kerja: 1. Sebelum mulai bekerja cucilah tangan dengan menggunakan air dan keringkan 2. Semprotkan alkohol 70% pada bagian telapak dan punggung tangan, keringkan. 3. Bersihkan meja yang akan digunakan dari barang atau alat yang tidak dipergunakan 4. Semprotkan alkohol 70% pada permukaan meja kerja 5. Bersihkan sisa semprotan alkohol menggunakan kertas tissue bersih dengan arah yang sama atau searah ❖ Sterilisasi menggunakan autoklaf (Sterilisasi secara fisika) Alat dan bahan a. Cawan Petri dan alat gelas lain serta media yang akan disterilisasi b. Kertas HVS c. Plastik tahan panas d. Autoklaf e. Karet gelang f. Alumunium foil
Cara Kerja: 1. Bungkus cawan petri dengan kertas HVS kemudian masukkan ke dalam plastik tahan panas. Alat gelas yang lain dibungkus menggunakan alumunium foil dan atau plastik tahan panas. 2. Isilah autoklaf dengan aquades setinggi batas sarangan, masukkan alat dan bahan (media) yang akan disterilisasi. 3. Aturlah suhu sebesar 121 oC, dengan tekanan 1 atm dan aturlah waktu yang akan digunakan sampai pada angka 15-20 menit. 4. Tutup autoklaf dan pastikan dalam kondisi terpasang rapat. 5. Pastikan lubang uap dalam keadaan tertutup (EXHAUST CLOSE)
14
6. Tarik tuas power ke arah ON, lalu tekan tombol ON (push) untuk memulai sterilisasi, apabila lampu hijau menyala maka dapat dipastikan autoklaf dalam keadaan bekerja. 7. Setelah alarm berbunyi maka tarik tuas power hingga ke titik OFF kemudian bukalah lubang uap dengan cara memutarnya kearah OPEN. 8. Diamkan autoklaf selama 15 menit untuk mematikan bahwa uap telah keluar dan autoklaf dalam keadaan tidak panas. 9. Bukalah tutup autoklaf dan keluarkan alat-alat yang telah steril.
15
BAB III TEKNIK ISOLASI, PENANAMAN (KULTIVASI), PEMURNIAN (PURIFIKASI) DAN PENGHITUNGAN JUMLAH (ENUMERASI) MIKROBA
A. Tujuan Praktikum 1. Mempelajari langkah-langkah pengambilan sampel 2. Mempelajari cara-cara pemindahan mikroba secara aseptis 3. Mempelajari teknik-teknik isolasi dan penanaman mikroba 4. Mempelajari morfologi koloni mikroba pada media 5. Mengetahui metode penghitungan jumlah mikroba Total Plate Count
B. Dasar Teori Mikroorganisme terdapat dimana-mana, baik didalam tanah, air, udara maupun pada makhluk hidup termasuk pada jaringan tubuh kita sendiri (kulit dan selaput lendir). Mikroba sangat beragam jumlahnya, yang umumnya berada dalam suatu populasi campuran. Dalam keadaan sebenarnya (di alam bebas) tidak ada bakteri yang hidup tersendiri terlepas dari spesies lainnya. Kerapkali bakteri patogen terdapat bersama-sama bakteri yang tidak berbahaya sehingga beberapa teknik isolasi dan pemurnian mikroba sangat diperlukan untuk memisahkan tiap jenis mikroba tersebut sehingga dapat dilakukan penelitian lebih lanjut (Waluyo, 2004). Teknik pengambilan sampel untuk mendapatkan mikroba yang diinginkan merupakan suatu aspek penting yang harus diperhatikan ketika melakukan penelitian mikrobiologi. Sampel yang diambil haruslah merupakan representasi dari seluruh bagian yang diteliti. Untuk itu diperlukan teknik yang benar agar terhindar dari kesalahan yang mengakibatkan sampel menjadi bias. Beberapa prinsip pengambilan sampel antara lain adalah; sampel yang diambil merupakan perwakilan dari keseluruhan bagian yang diteliti; sampel yang diambil benar-benar dari sumbernya dan sampel tetap terjaga kondisinya seperti saat pengambilan sampai dilakukan tahap pembiakan dan analisa sampel.
16
Morfologi mikroba serta jumlahnya dapat diobservasi dengan cara mengisolasi dan membiakkannya pada media agar nutrisi terlebih dahulu. Koloni bakteri dapat diamati pertumbuhannya setelah diinkubasi selama 1 x 24 atau 2 x 24 jam pada suhu yang sesuai, sedangkan jamur dapat diamati setelah 5-7 hari inkubasi. Karakteristik morfologi tiap koloni perlu dicatat sesuai dengan ciri-ciri yang ditunjukkan sebagai bagian dari proses identifikasi bakteri. Identifikasi biakan mikroorganisme seringkali merupakan pemindahan ke biakan segar tanpa terjadi pencemaran. Pemindahan mikroorganisme ini dilakukan dengan teknik aseptik untuk mempertahankan kemurnian biakan selama pemindahan berulang kali. Mikroorganisme dapat ditumbuhkan dalam biakan cair, mikroorganisme menunjukkan ciri pertumbuhan mikroorganisme menunjukkan ciri pertumbuhan seperti pada Gambar 13. Kekeruhan dalam kaldu terjadi akibat pertumbuhan mikroorganisme. Jumlah mikroorganisme yang diperlukan cukup banyak agar kaldu terlihat keruh (lazimnya sekitar 106 sel/ml). Bila pertumbuhan mikroorganisme menumpuk di bagian dasar tabung akan terlihat sedimen. Sebaliknya, bila mikroorganisme tumbuh di bagian permukaan kaldu, maka pertumbuhan ini terlihat seperti pelikel berupa lapisan tipis pada permukaan pada permukaan. Kandungan pertumbuhan dalam kaldu merupakan gabungan dari kekeruhan, sedimen, atau pelikel. Pertumbuhan mikroorganisme dalam kaldu seringkali menggambarkan aktivitas metabolismenya. Sebagai contoh, mikroorganisme aerob obligat berkembangbiak pada lapisan permukaan karena pada bagian ini kandungan oksigen tinggi. Kelompok ini sering membentuk pelikel sewaktu pertumbuhan dalam kaldu. Mikroorganisme yang membentuk filamen, kapsel atau pili dapat juga membentuk lapisan tipis pada permukaan niakan kaldu. Bakteri yang motil dapat bergerak dalam media kaldu, sehingga pertumbuhannya terlihat sebagai kekeruhan. Sebaiknya mikroorganisme yang tidak bergerak menumpuk di bagian dasar dan membentuk sedimen. Selain
dalam
media
cair,
mikroorganisme
juga
memperlihatkan
pertumbuhan dengan ciri tertentu dalam biakan padat seperti agar miring atau lempengan agar. Beberapa pola pertumbuhan pada biakan padat terlihat pada
17
Gambar 10. Agar miring lazimnya digunakan untuk menyimpan biakan murni sedangkan
agar
lempengan
lazimnya
digunakan
untuk
memurnikan
mikroorganisme. ❖ Pemindahan secara aseptik dengan pipet Cara kerja: Hari pertama 1. Pindahkan 0.1 ml aquadest steril ke dalam tabung kaldu dengan menggunakan pipet 1 ml. Perhatikan cara penggunaan pipet. Cairan masuk ke dalam pipet dengan cara menempatkan bagian mulut pipet di antara bibir, kemudian hisap perlahan. 2. Pastikan cairan yang masuk tidak melewati batas yang diinginkan. Lepaskan pipet dari bibir dan segera tutup dengan jari telunjuk sehingga cairan tidak keluar. 3. Perhatikan cara memegang pipet. Bagian batang pipet dipegang oleh jempol, jari tengah dan jari manis, sedangkan telunjuk digunakan untuk menutup mulut pipet, jangan menggunakan jempol untuk menutup bagian mulut pipet! 4. Untuk mengatur aliran cairan, tekanan telunjuk dikeraskan atau dilonggarkan. Perhatikan bahwa bahan beracun tidak boleh dihisap dengan mulut! Gunakan penyedot karet untuk menghisap bahan beracun 5. Pemindahan cairan berikut menggunaan penyedot karet (propipet). Pindahkan 1,0 ml aquadestillata steril ke dalam 3 tabung kaldu nutrien dengan menggunakan pipet 10 ml. 6. Lingkaran diatas (A) digunakan untuk mengeluarkan udara dari propipet. Pijat dengan jempol dan jari telunjuk pada A, sedangkan ketiga jari lainnya dan telapak tangan memencet bagian bola karet. Pemencetan bola karet ini menyebabkan keadaan vakum untuk menghisap cairan melalui pipet. 7. Bulatan kedua (S) terletak di bawah bola karet dan dibawahnya terdapat lubang
18
❖ Isolasi dan Penanaman Mikroba Mengisolasi suatu mikroba didefinisikan sebagai proses memisahkan mikroba dari lingkungannya di alam dan menumbuhkannya sebagai biakan murni dalam medium buatan (Jutono dkk, 1980). Macam-macam cara mengisolasi dan menanam mikrobia adalah : 1. Spread plate method (cara tebar/sebar) 2. Streak plate method (cara gores), 3. Pour plate method (cara tabur). Namun demikian, untuk mengurangi kepadatan mikroba yang diperoleh dari suatu sampel diperlukan adanya proses pengenceran bertingkat atau serial dilution.
a. Teknik Preparasi Sampel Sampel yang telah diambil perlu dipreparasi sehingga memudahkan untuk proses isolasi mikroba. Tujuan dari teknik ini pada prinsipnya adalah melarutkan atau melepaskan mikroba dari substratnya ke dalam air sehingga lebih mudah penanganannya. Macam-macam preparasi bergantung pada bentuk sampel : •
Pencucian. Ditujukan untuk melarutkan sel-sel mikroba yang menempel pada
permukaan substrat yang luas tapi relatif berukuran kecil, misalnya daun bunga dll. Pencucian merupakan prosedur kerja dengan mencelupkan sampel ke dalam aquades dengan perbandingan 1 : 9 (w/v). Contohnya sampel daun diambil dan ditimbang 5 g kemudian dibilas dengan aquades 45 ml. Selanjutnya air cucian diinokulasikan ada media yang telah disiapkan. Amati pertumbuhan mikrobia yang terjadi pada media setelah diinokulasikan selama 3 sampai 7 hari di ruang dengan suhu kamar. •
Teknik Pengulasan (Swab) Teknik ini bertujuan untuk memindahkan mikroba yang berada di
permukaan sampel yang memiliki permukaan luas dan pada umumnya sulit dipindahkan dengan menggunakan cotton swab/cotton bud. Contohnya adalah meja, batu, batang kayu, kulit dll. Teknik ini dilakukan dengan mengusapkan cotton bud memutar sehingga seluruh permukaan kapas dari cotton bud kontak dengan
19
permukaan sampel. Hasil ulasan akan lebih baik jika cotton bud dicelupkan terlebih dahulu ke dalam larutan pengencer (contoh pepton water). •
Penghancuran (Maserasi) Sampel yang berbentuk padat dapat ditumbuk dengan mortar dan pestle,
stomacher atau blander sehingga mikroba yang ada dipermukaan atau di dalam dapat terlepas kemudian dilarutkan ke dalam air. Contoh sampelnya antar lain biji, buah, keju, daging dll. Perbandingan antar berat sampel dengan pengenceran pertama adalah 1 : 9 (w/v). Untuk sampel dari tanah tidak perlu dimaserasi. Hasil maserasi selanjutnya di inokulasikan pada media yang telah disiapkan. Selanjutnya inkubasikan cawan petri yang telah diinokulasikan tersebut pada suhu ruang. Setelah 3 sampai 7 hari masa inkubasi, amati mikrobia yang tumbuh pada media tersebut.
b. Teknik Serial Dilution (Pengenceran bertingkat/berseri) Tujuan dari pengenceran bertingkat yaitu memperkecil atau mengurangi jumlah mikroba yang tersuspensi dalam cairan. Penentuan besarnya atau banyaknya tingkat pengenceran tergantung kepada perkiraan jumlah mikroba dalam sampel. Digunakan perbandingan 1 : 9 untuk sampel dan pengenceran pertama dan selanjutnya,
sehingga
pengenceran
berikutnya
mengandung
1/10
sel
mikroorganisme dari pengenceran sebelumnya.
Alat dan Bahan •
Enlemeyer
•
Tabung reaksi dan penutup
•
Kantong plastik steril
•
Pipet steril
•
Cawan petri
•
Gunting steril (jika sampel padat)
•
Pinset steril (jika sampel padat)
•
Api Bunsen
•
Stromacher (jika sampel padat)
•
Inkubator
20
•
Sampel
•
Buffered pepton water (BPW) 0,1%
•
Plate count agar (PCA)/Nutrien Agar
•
Alkohol 70%
Cara Kerja: 1. Sampel yang mengandung bakteri dimasukan ke dalam tabung pengenceran pertama (1/10 atau 10-1) secara aseptis (dari preparasi suspensi). Perbandingan berat sampel dengan volume tabung pertama adalah 1 : 9 (jika memakai teknik pencucian dan pengolesan maka akuades/larutannya sudah termasuk pengencer 10-1. Setelah sampel masuk lalu dilarutkan dengan mengocoknya sampai homogeny atau menggunakan vortex. 2. Ambil 1 ml dari tabung 10-1 dengan pipet ukur kemudian dipindahkan ke tabung 10-2 secara aseptis kemudian dihomogenkan menggunakan vortex mixer. Pemindahan dilanjutkan hingga tabung pengenceran terakhir dengan cara yang sama, hal yang perlu diingat bahwa pipet ukur yang digunakan harus selalu diganti, artinya setiap tingkat pengenceran digunakan pipet ukur steril yang berbeda/baru. Prinsipnya bahwa pipet tidak perlu diganti jika memindahkan cairan dari sumber yang sama (Gambar 1).
c. Teknik Isolasi dan Penanaman Mikroba Penanaman dari Suspensi Teknik penanaman ini merupakan lanjutan dari pengenceran bertingkat. Pengambilan suspensi dapat diambil dari pengenceran mana saja tapi biasanya untuk tujuan isolasi (mendapatkan koloni tunggal) diambil suspensi dari beberapa tabung pengenceran terakhir. Teknik Isolasi dan penanaman mikroba dibagi menjadi 3 metode diantaranya: ❖ Spread Plate Method (Metode cawan tebar/sebar) Teknik spread plate merupakan teknik isolasi mikroba dengan cara menginokulasi kultur mikroba secara pulasan/sebaran di permukaan media agar yang telah memadat. Alat dan Bahan
21
•
Cawan petri
•
Spreader/batang bengkok
•
Bunsen
•
Tabung reaksi
•
Pipet ukur
• •
Ose Suspensi bakteri
•
Media agar: Plate count agar (PCA)/Nutrien Agar
Cara kerja : 1. Pindahkan 0,1 mL suspensi berisi bakteri secara aseptis dengan pipet ukur ke permukaan media yang telah memadat dalam cawan petri menggunakan pipet. 2. Sterilisasi spreader/batang bengkok/batang Drigalsky dengan cara dicelupkan dalam alkohol 70% kemudian dibakar dengan dilewatkan diatas api, biarkan spreader dingin. 3. Tebarkan/sebarkan kultur bakteri dengan spreader secara merata dan biarkan sampai permukaan agar mengering (lihat Gambar 2). 4. Setelah permukaan agar mengering, selanjutnya inkubasikan secara terbalik selama 24 jam pada suhu kamar ataupun inkubator dan amati pertumbuhannya.
22
Sampel (25 g) : Volume Pengencer (Buffer Pepton Water/BPW 0,1%) (225 ml)
Gambar 1 Metode pengenceran decimal pada metode hitung cawan
Gambar 2 Spread Plate Method (Metode cawan tebar/sebar) 23
❖ Pour Plate Method (Metode cawan tuang) Tujuan dari teknik ini adalah untuk menyebarkan sel-sel bakteri tidak hanya pada permukaan medium agar saja melainkan sel terendam dalam medium (di dalam agar) sehingga terdapat sel yang tumbuh dipermukaan agar yang kaya O 2 dan ada yang tumbuh di dalam agar dengan kandungan oksigen sedikit. Teknik ini memerlukan agar yang belum padat (>45 oC) untuk dituang bersama suspensi bakteri ke dalam cawan petri lalu kemudian dihomogenkan dan dibiarkan memadat.
Cara kerja : 1. Teteskan 1 ml suspensi sel kedalam cawan petri kosong yang telah steril secara aseptis 2. Tuangkan media agar yang hangat (suhu 45 – 50 oC) ke cawan yang telah berisi suspensi bakteri tersebut dan tutup (Gambar 3) 3. Homogenkan campuran media dan suspensi dengan cara goyangkan atau putar cawan petri secara perlahan membentuk angka delapan (8) di atas meja yang rata dalam kondisi aseptis (Gambar 3). 4. Setelah agar memadat cawan petri diinkubasi dengan posisi terbalik pada suhu kamar ataupun inkubator selama 24 jam. Amati pertumbuhannya.
Gambar 3 Pour Plate Method (Metode cawan tuang)
24
❖ Streak Plate Method (Metode cawan gores) Teknik penanaman mikroba dengan goresan bertujuan untuk mengisolasi mikroorganisme dari campurannya atau meremajakan kultur ke dalam medium baru. Cara gores umumnya digunakan untuk mengisolasi koloni mikroba pada medium-agar sehingga didapatkan koloni terpisah dan merupakan biakan murni. Cara ini dasarnya ialah menggoreskan suspensi bahan yang mengandung mikroba pada permukaan medium-agar yang sesuai pada cawan petri. Setelah inkubasi maka pada bekas goresan akan tumbuh koloni-koloni terpisah yang mungkin berasal dari 1 sel mikroba, sehingga dapat dikultur lebih lanjut (Jutono dkk, 1980). Penggoresan yang sempurna akan menghasilkan koloni yang terpisah. Bakteri yang memiliki flagella seringkali membentuk koloni yang menyebar terutama bila digunakan medium yang basah. Pencegahan terjadinya penhyebaran koloni harus digunakan lempengan agar yang benar-benar kering permukaannya (Lay, 1994).
Cara Kerja : 1. Perhatikan teknik transfer aseptis/memindahkan biakan mikroba secara aseptis (Gambar 4). Panaskan jarum ose hingga memijar di atas bunsen, kemudian beri jarak dari bunsen dan diamkan hingga dingin. 2. Gunakan ose yang telah dingin untuk mengambil kultur murni bakteri (ambil sebanyak 1 ose). 3. Goreskan pada permukaan medium-agar dimulai dari satu ujung (Perhatikan teknik/tipe penggoresan). Hati-hati saat menggores, jangan sampai medium rusak! Ose yang disentuhkan pada permukaan medium sebaiknya tidak ditekan terlalu dalam.
25
4
5
6
7
Gambar 4 Teknik transfer aseptis kultur mikroba dari tabung reaksi ke cawan petri Bakteri yang memiliki flagela seringkali membentuk koloni yang yang membayar terutama bila digunakan lempengan agar yang basah. Untuk mencegah hal ini harus digunakan lempengan agar yang bener-bener kering. Untuk mendapatkan koloni yang terpisah sewaktu melakukan goresan perlu diperhatikan butir-butir berikut: 1. Dinginkan ose setelah dipijarkan. Gunakan ose yang telah dingin untuk menggores pada permukaan lempengan agar. Ose yang panas mematikan mikroorganisme, sehingga tidak terjadi pertumbuhan pada bekas goresan. (Gambar 4)
26
2. Ose disentuhkan pada lempengan agar; sewaktu menggores ose dibiarkan meluncur di atas permukaan lempengan. Agar yang luka mengganggu pertumbuhan mikroorganisme sehingga sulit diperoleh koloni terpisah. 3. Pijaran ose setelah menggores satu daerah; pemijaran ose mematikan mikroorganisme yang melekat pada mata ose dan mencegah pencemaran pada penggoresan daerah berikutnya. 4. Gunakan tutup cawan petri untuk melindungi permukaan agar dari pencemaran. 5. Balikkan lempengan agar untuk mencegah air kondensasi jatuh keatas permukaan agar sehingga dapat terjadi penyebaran koloni.
Metode cawan gores dibagi menjadi beberapa tipe, diantaranya : •
Goresan Sinambung Goresan sinambung umumnya digunakan bukan untuk mendapatkan koloni
tunggal, melainkan untuk peremajaan ke cawan atau medium baru. Cara kerja : Sentuhkan ujung ose pada koloni dan gores secara kontinyu sampai setengah permukaan agar. Putar cawan 180o lanjutkan goresan sampai habis (Gambar 5a). Tipe goresan sinambung/kontinyu juga dilakukan pada media agar miring dalam tabung reaksi (Gambar 5b).
Gambar 5 Tipe goresan sinambung 27
Gambar 5b Teknik goresan sinambung pada agar miring •
Goresan T Tipe goresan T diguankan untuk mendapatkan koloni tunggal dengan
membagi wilayah goresan menjadi 3. Cara kerja : Tandai bagian luar-bawah cawan petri dengan membagi cawan menjadi 3 bagian menggunakan spidol marker, inokulasi daerah 1 dengan streak zig-zag. Panaskan jarum ose dan tunggu dingin, kemudian lanjutkan streak zig-zag pada daerah 2. Cawan diputar untuk memperoleh goresan yang sempurna. Lakukan hal yang sama pada daerah 3 (Gambar 6). •
Goresan kuadran Tipe goresan kuadran hampir sama dengan goresan T namun pola goresan
dibagi ke dalam 4 bagian/wilayah. Pembagian 4 wilayah diharapkan akan memisahkan koloni bakteri dengan lebih baik sehingga diperoleh koloni tunggal bakteri. Tipe goresan kuadran dapat dilakukan dengan menggores secara zig-zag maupun secara terputus.
Cara kerja : Tandai bagian luar-bawah cawan petri dengan membagi cawan menjadi 4 bagian menggunakan spidol marker, inokulasi daerah 1 dengan streak zigzag/terputus. Panaskan jarum ose dan tunggu dingin, kemudian lanjutkan streak pada daerah 2. Cawan diputar untuk memperoleh goresan yang sempurna. Lakukan hal yang sama pada daerah 3 dan 4 (Gambar 7a). 28
Gambar 6 Tipe goresan T
Gambar 7a Tipe goresan kuadran d. Penanaman kapang dengan metode slide culture (metode riddle) Alat dan bahan •
Cawan petri
•
Scapel
•
Gelas objek
29
•
Cover gelas
•
Pinset
•
Batang gelas bentuk “V” atau “U”
•
Needle
•
Kertas saring
•
Aquades
•
Media Potato Dextrose Agar (PDA)/Sabroud agar (SDA)
•
Biakan kapang
Cara kerja: 1. Letakkan kertas saring pada dasar cawan petri 2. Letakkan batang gelas steril berbentuk U atau V di atas kertas saring 3. Kertas saring dibasahi dengan air, sehingga suasana dalam cawan petri menjadi lembab 4. Letakkan kaca objek di atas batang gelas berbentuk U 5. Potong agar PDA atau SDA berbentuk bujur sangkar dan letakkan di atas kaca objek 6. Sisi dari agar ini diinokulasi dengan kapang 7. Letakkan kaca penutup di atas potongan agar, kemudian tutup dengan cawan petri 8. Inkubasi pada suhu ruang selama 48 jam
2
1
3
4
5
Gambar 7b Penanaman kapang metode slide culture (riddel) 30
e. Perhitungan Jumlah Mikroba Penghitungan jumlah sel mikroba dapat dilakukan dengan berbagai macam cara, antara lain secara langsung dengan hitung mikroskopik (direct microscopic count) menggunakan haemocytometer dan secara tidak langsung dengan hitung cawan (plate count), selain itu juga terdapat penghitungan menggunakan metode MPN
(Most
Probable
Number)
dan
turbidimetri
menggunakan
alat
spektrofotometer. ❖ Penghitungan langsung menggunakan haemocytometer Hitung mikroskopik merupakan metode yang cepat dan murah tetapi mempunyai beberapa kelemahan antara lain: sel-sel yang mati tidak dapat dibedakan dari sel hidup, sel-sel yang berukuran sngat kecil sulit dilihat sehingga kadang-kadang tidak terhitung. Pada haemocytometer ruang hitung terdiri dari 9 kotak besar dengan luas 1 mm². Satu kotak besar di tengah, dibagi menjadi 25 kotak sedang dengan panjang 0,2 mm. Satu kotak sedang dibagi lagi menjadi 16 kotak kecil. Dengan demikian satu kotak besar tersebut berisi 400 kotak kecil. Tebal dari ruang hitung ini adalah 0,1 mm. Sel bakteri yang tersuspensi akan memenuhi volume ruang hitung tersebut sehingga jumlah bakteri per satuan volume dapat diketahui (Gambar 9). Perhitungan Jumlah sel menggunakan haemocytometer dapat dilihat pada Gambar 8.
Gambar 8 Perhitungan jumlah sel (cfu/ml atau gram)
31
Ruang hitung haemocytometer
Gambar 9 Kotak hitung haemocytometer Cara kerja : 1. Bersihkan haemocytometer dan gelas penutupnya (coverslip) dengan menggunakan larutan deterjen, bilas dengan akuades lalu bersihkan lagi dengan alkohol, kering anginkan atau tempelkan lap atau pengering berbahan lembut (jangan menggunakan tissue dengan serat yang kasar karena akan menggores kotak-kotak haemocytometer). 2. Letakkan haemocytometer beserta gelas penutupnya pada mikroskop, cari kotak-kotak (ruang pengamatan) yang ada di haemocutometer dengan menggunakan perbesaran lemah terlebih dahulu, jika sudah berhasil menemukan, dilanjutkan perbesaran yang lebih kuat. Tentukan 5 kotak pengamatan yang akan dihitung (umumnya dipilih kotak ukuran sedang pada pojok kanan atas, kanan bawah, kiri atas, kiri bawah dan tengah) 3. Homogenkan suspensi mikroba (bakteri/kamir) yang akan dihitung jumlah selnya dengan cara digojog menggunakan vortex. 4. Ambil sampel mikroba pipet steril dari media cair secukupnya (0,1 - 0,5 ml) lalu masukkan ke dalam parit-parit pada haemocytometer (jangan sampai berlebihan). Perhatikan / cari kembali kotak-kotak pengamatan. 5. Hitunglah jumlah sel mikroba dengan rumus pada Gambar 8. 32
❖ Penghitungan tidak langsung ✓ Hitung cawan/Angka Lempeng Total/Total Plate Count untuk bakteri/ Angka Kapang Khamir (AKK) untuk jamur Prinsip metode hitung cawan adalah jika sel mikroba yang masih hidup ditumbuhkan pada media agar, maka sel mikroba itu akan berbiak membentuk koloni yang dapat dilihat dan dihitung dengan mata telanjang, dan disebut dengan “colony forming unit” = cfu. Metode hitungan cawan dapat dilakukan dengan menggunakan metode tuang (pour plate) dan metode permukaan (surface/spread plate). Penghitungan jumlah mikroba dianggap valid jika dalam satu cawan tumbuh koloni sebanyak 25 - 250, sehingga jika pertumbuhan mikroba terlalu padat, maka harus dilakukan pengenceran terlebih dahulu. Rumus Perhitungan jumlah sel mikroba metode TPC (cfu/ml atau gram): Jumlah Koloni x Faktor Pengencer Faktor Pengencer (FP):
1 Tingkat pengenceran
Cara menghitung jumlah koloni pada cawan harus memenuhi kaidah sebagai berikut : •
Cawan yang dipilih dan dihitung adalah yang mengandung jumlah koloni antara 25 – 250
•
Beberapa koloni yang bergabung menjadi satu merupakan suatu kumpulan koloni yang besar dimana jumlah koloni diragukan, dapat dihitung sebagai satu koloni.
•
Suatu deretan (rantai) yang terlihat sebagai suatu garis tebal dihitung sebagai satu koloni.
•
Data yang dilaporkan harus mengikuti peraturan yaitu hanya terdiri dari dua angka, yaitu angka pertama di depan koma dan angka ke dua dibelakang koma.
•
Jika semua pengenceran menghasilkan angka kurang dari 25 koloni, hanya jumlah koloni yang terendah yang dihitung. Jika semua pengenceran menghasilkan lebih dari 250 koloni pada cawan petri, hanya jumlah koloni pada pengenceran yang tertinggi yang dihitung. 33
•
Jika terdapat lebih dari satu cawan yang mempunyai jumlah koloni yang memenuhi syarat, maka dihitung nilai rata-ratanya.
•
Jika ada 2 yang jumlah koloni 25 - 250, maka kita lihat rasio perbandingan antara jumlah pengenceran tertinggi dan jumlah pengenceran yang lebih rendah. Jika perbandingan tersebut < 2,0 maka dihitung rata-ratanya.
•
Jika perbandingan antara jumlah pengencer tertinggi dengan terendah ≥ 2, maka ambil jumlah koloni dari pengenceran terendah.
Contoh soal: 1. Jika setelah perhitungan koloni pada media agar di dapatkan : Jumlah koloni pengenceran 10-3 = 789 Jumlah koloni pengenceran 10-4 = 82 Jumlah koloni pengenceran 10-5 = 10 Maka jumlah koloninya adalah ? 2. Jika setelah perhitungan koloni pada media agar di dapatkan : Jumlah koloni pengenceran 10-3 = 200 Jumlah koloni pengenceran 10-4 = 30 Jumlah koloni pengenceran 10-5 = 2 Maka jumlah koloninya adalah ? Jawaban: 1. Diketahui: Jumlah koloni pengenceran 10-3 = 789 Jumlah koloni pengenceran 10-4 = 82 Jumlah koloni pengenceran 10-5 = 10 Cara perhitungan koloninya: Ambil cawan petri dengan jumlah koloni 25 – 250 yaitu pengenceran
10-4
= 82 = 82 x 𝟏 10-4
cfu/ml = 82 x 104 cfu/ml
2. Diketahui: Jumlah koloni pengenceran 10-3 = 200 = 200 x 103 Jumlah koloni pengenceran 10-4 = 30 = 30 x 104
34
Jumlah koloni pengenceran 10-5 = 2 Cara perhitungan koloninya: Ambil cawan petri dengan jumlah koloni 25 – 250 yaitu pengenceran
10-3 &
10-4 .Jika ada 2 yang jumlah koloni 25 -250, maka kita lihat rasio perbandingan antara jumlah pengenceran tertinggi dan jumlah pengenceran yang lebih rendah
Jika perbandingan tersebut < 2,0 maka di rata-ratakan: Perbandingan pengencer tertinggi dgn yg rendah: 300.000 200.000
= 1,5 berarti < 2, maka:
200.000 + 300.000
500.000
= 2 = 250.000 = 2,5 x 105 cfu/ml 3. Jika perbandingan antara jumlah pengencer tertinggi dgn terendah ≥ 2, 2
maka ambil jumlah koloni dari pengenceran terendah, contoh: Jumlah koloni pengenceran 10-3 = 200 = 200 x 103 Jumlah koloni pengenceran 10-4 = 40 = 30 x 104 Jumlah koloni pengenceran 10-5 = 2 Perbandingan:
400.000 200.000
= 2 , maka :
Jumlah koloninya : 2,0 x 105 cfu/ml
Satu koloni bakteri yang terpisah dengan koloni lainnya dapat diamati tipe pertumbuhan pada masing-masing media, diantaranya dilakukan terhadap konsistensi, bentuk koloni, warna koloni dan permukaan koloni (Gambar 10, 11, 12, 13) (Lim, 2000) Angka kapang/khamir adalah jumlah koloni kapang dan khamir yang ditumbuhkan dalam media yang sesuai selama 5 hari pada suhu 20 - 25 oC dan dinyatakan dalam satuan koloni/mL (Soekarto, 2008). Prinsip uji AKK (Angka Kapang Khamir) yaitu pertumbuhan kapang dan khamir yang telah diisolasi menggunakan metode pour plate ataupun spread plate pada media yang sesuai dan diinkubasikan pada suhu 20 - 25 oC. Setelah inkubasi, dipilih cawan petri dari satu pengenceran yang menunjukkan jumlah koloni antara 10 - 150 koloni. Jumlah koloni rata-rata dari dihitung lalu dikalikan dengan faktor pengencerannya.
35
Gambar 10 Karakteristik pertumbuhan bakteri pada media plate agar
Gambar 11 Karakteristik pertumbuhan bakteri pada media agar miring
Gambar 12 Karakteristik pertumbuhan bakteri pada media agar miring (atas) dan media semi solid (bawah) 36
Gambar 13 Karakteristik pertumbuhan bakteri pada media cair Aspergillus sp.
Gambar 14 Jenis kapang secara makroskopis dan mikroskopis
37
Fusarium sp.
Mucor sp. Rizophus sp Gambar 15 Jenis kapang (Rizophus sp., Fusarium sp., Mucor sp.) secara makroskopis dan mikroskopis
Microsporum canis
Gambar 16 Jenis kapang penyebab ringworm pada hewan dan menular ke manusia
38
Gambar 17 Bentuk sel kamir Candida albican secara makroskopis (kiri) & mikroskopis (kanan)
Gambar 18 Bentuk sel kamir Saccharomyces cerevisiae secara makroskopis (kiri) & mikroskopis (kanan)
Gambar 19 Bentuk sel kamir Rhodotorula sp secara makroskopis (kiri) & mikroskopis (kanan) ❖ Isolasi bakteri/kapang dari keju Alat dan Bahan •
Enlemeyer
•
Tabung reaksi dan penutup
•
Kantong plastik steril
•
Pipet steril 39
•
Cawan petri
•
Gunting steril (jika sampel padat)
•
Pinset steril (jika sampel padat)
•
Api Bunsen
•
Stromacher (jika sampel padat)
•
Inkubator
•
Sampel keju
•
Buffered pepton water (BPW) 0,1% atau NaCl fisiologis 0,9%
•
Plate count agar (PCA)/Nutrien Agar (bakteri)
•
Potato Dextrose Agar (kapang)
•
Alkohol 70%
Cara Kerja: ❖ Timbang 25 ml atau gram contoh dan masukkan ke dalam kantong plastik steril ❖ Tambahkan larutan BPW 0,1% (dari 225 ml) secukupnya (± 100 ml) ke dalam kantong plastik yang berisi sampel keju ❖ Masukkan ke dalam stomacher (selama 1 menit) ❖ Masukkan campuran yang telah di stomacher ke dalam sisa larutan BPW 0,1% (jadi pengenceran 10-1) ❖ Siapkan tabung reaksi sebanyak 4 tabung (tergantung perkiraan banyaknya kuman pada sampel, semakin banyak kuman pengenceran diperbanyak) berisi media BPW 0,1% steril untuk proses dilusi (sipakan tabung berlabel 10-2 – 10-5), tiap tabung berisi 9 mL BPW 0,1% steril. ❖ Lakukan pengenceran bertingkat/desimal dengan mengambil 1 ml sampel yang sudah diencerkan dengan BPW 0,1% ke dalam tabung rekasi yang berisi 9 ml larutan BPW 0,1% (menjadi pengenceran 10-2). Homogenkan tabung pada pengenceran pertama (10-2) menggunakan vortex. Lakukan pengenceran desimal selanjutnya dengan cara yang sama (10-3, 10-4 dan seterusnya) seperti pada Gambar 1.
40
❖ Pupuklah dari masing-masing pengenceran dengan memasukkan 1 ml ke dalam petri steril yang sudah diberi label sesuai dengan angka pengenceran (Gambar 1). ❖ Tuanglah media PCA atau Nutrien agar (bakteri) atau Potato Dextrose Agar (kapang) yang masih cair (suhu 40 – 50 oC) ke masing-masing cawan petri, lalu homogenkan isinya secara berlahan dengan membentuk seperti angka delapan. Biarkan agar memadat. ❖ Setelah padat diinkubasi pada suhu 37 oC selama 24 - 48 jam (untuk bakteri). Inkubasi pada suhu 20 - 25 oC selama 5 - 7 hari (untuk kapang). ❖ Hitung koloni yang tumbuh dengan metode hitung cawan (Lihat prosedur hitung cawan) dan amati karakter morfologinya (Lihat Gambar 10). ❖ Koloni yang tumbuh terpisah atau yang berbeda karakternya dipilih untuk kemudian dipurifikasi menggunakan metode streak plate (Lihat prosedur streak plate). ❖ Isolasi bakteri/jamur dari kulit (teknik swab) Alat dan bahan : •
Tabung reaksi dan penutup
•
Pipet steril
•
Swab steril
•
Cawan petri
•
Api Bunsen
•
Inkubator
•
Sampel keju
•
Buffered pepton water (BPW) 0,1% atau NaCl fisiologis 0,9%
•
Plate count agar (PCA)/Nutrien Agar (bakteri)
•
Potato Dextrose Agar (kapang)
•
Alkohol 70%
Cara kerja: 1. Celupkan swab steril ke dalam larutan NaCl 0,9 % atau BPW 0,1% 2. Oles permukaan kulit dengan swab
41
3. Oles swab ke media agar (NA dan PDA) 4. Inkubasi selama 24 jam 5. Lakukan pengamatan terhadap koloni mikroba (Gambar 10) ✓ Perhitungan Jumlah Mikroba dengan Metode Most Probable Number (MPN) Metode MPN adalah memupuk/menumbuhkan mikroba suatu tingkat pengenceran ke dalam 3 atau 5 tabung berisi media cair. Pengujian kuantitatif menggunakan metode hitung cawan akan mengalami kesulitan pada pengujian suatu sampel yang mengandung mikroorganisme kurang dari 10 cfu per ml/gram, namun dengan metode MPN masalah tersebut dapat diatasi. Biasanya metode MPN sangat bagus untuk contoh dari sampel berbentuk cair. Nilai MPN ditentukan oleh jumlah tabung yang memberikan reaksi positif setelah diinkubasi. Reaksi positif dapat ditentukan berdasarkan seperti Gambar 20.
Alat dan bahan •
Botol (150 ml)
•
Tabung reaksi (20 – 50 ml)
•
Tabung durham
•
Tube shaker
•
Stomacer/blender (jika sampel padat)
•
Pipet ukur
•
Inkubator
•
Pelarut: buffer pepton water 0,1%
•
Media cair: Tergantung jenis bakteri yang diuji: ✓ Koliform: lauryl sulfate tryptose broth ✓ Staphylococcus aureus: Trypticase/tryptic soy broth + 10% NaCl
Cara kerja pada metode MPN dapat dilihat pada Gambar 21. Menghitung jumlah sel dengan MPN dapat dilihat pada Gambar 22.
42
Gambar 20 Reaksi positif pada metode MPN
43
Gambar 21 Teknik metode MPN dengan 3 tabung (atas) dan 5 tabung (bawah)
44
Gambar 22 Menghitung jumlah sel dengan MPN dengan 3 tabung (atas) & 5 tabung (bawah)
45
BAB IV MIKROSKOP MEDAN TERANG DAN PERAWATANNYA
Mikroskop medan terang adalah suatu bentuk mikroskop dengan medan yang mengelilingi spesimen kelihatan terang (berwarna cerah), sedangkan spesimennya memperlihatkan warna lebih gelap. Penanganan Dan Pemeliharaan Mikroskop 1. Bawalah mikroskop dalam posisi tegak dengan memegang tangkinya dengan satu tangan dan menyangga dasarnya dengan tenaga yang lain (Gambar 23) . 2. Jagalah supaya dasar dan tubuh mikroskop tersebut bebas dari debu dengan cara menutupinya bila sedang tidak digunakan. 3. Hindarkan mikroskop dari benturan. 4. Dengan secarik kertas yang halus, bersihkan minyak celup (bila ada) dari pentas dan penjepit kaca objek. 5. Jangan menyentuh lensa obyektif dengan tangan anda. Bersihkan lensa obyektif (celup minyak) dan kondensor setelah digunakan. 6. Jangan melepaskan lensa obyektif dari tempatnya untuk membersihkannya. Untuk pembersihan rutin lensa objektif celup minyak, cukup menyekanya dengan kertas lensa kering. Pembersihan lensa dengan xylene (xylol) hanya dilakukan oleh asisten untuk mencegah larutnya perekat lensa. 7. Jangan memiringkan mikroskop bila bekerja dengan obyektif celup minyak, karena besar kemungkinan lensa tersebut mengalir pada tempat-tempat yang sukar dibersihkan dan mengering disitu. 8. Jangan melakukan penyetelan mikroskop dengan paksa (penyetelan diafragma iris, kondensor, tombol-tombol penyetel obyektif kasar dan halus). Bila anda menemui kesulitan dalam penyetelan, mintalah bantuan petugas. 9. Jangan menukarkan obyektif atau okular mikroskop anda dengan kepunyaan mikroskop lain. 10. Kecuali sedang menyetel penyinaran, biarkan okular pada tempatnya supaya debu tidak mengendap pada lensa obyektif bagian belakang.
46
11. Lensa okular sangat peka terpengetsaan (etching) oleh asam-asam yang ada pada keringat sehingga harus dibersihkan setiap setelah penggunaan. Caranya yaitu secara hati-hati menyeka okular dengan secarik kertas lensa yang dibasahi dengan setetes air suling, lalu keringkan dengan kertas lensa kering. 12. Pasangkanlah lensa obyektif kekuatan rendah pada posisi kerja bila mikroskop tidak digunakan. 13. Simpanlah mikroskop tersebut di dalam lemari dan/atau di bawah tutup plastik.
Gambar 23 Cara membawa mikroskop yang benar (A), yang salah (B)
Gambar 24 Bagian-Bagian Mikroskop
47
Gambar 25 Cara Menggunakan mikroskop yang benar
48
BAB V PENGAMATAN MIKROORGANISME HIDUP
Pengamatan mikroorganisme yang hidup memberikan ciri-ciri yang membantu dalam klasifikasi. Cara mikroorganisme memperoleh dan mencerna bahan makanan, serta pergerakannya hanya dapat dilihat sewaktu mikroorganisme hidup. Dalam praktikum diamati pergerakan mikroorganisme yang merupakan salah satu ciri yang digunakan dalam identifikasi. Bakteri dipilihkan menjadi kelompok yang tidak bergerak (non-motil) dan bergerak (motil). Kelompok bakteri yang tidak bergerak ini dalam cairan terlihat bergerak setempat; gerakan ini disebut gerakan Brown. Gerakan brown disebabkan ole benturan bakteri dengan molekul air. Makin kecil ukuran bakteri, makin besar gerakan brown. Bakteri yang berukuran besar jarang menunjukkan gerakan Brown. Pergerakan aktif bakteri disebabkan oleh flagela. Bakteri yang bergerak ini seakan-akan meluncur dengan gerakan melenggak-lenggok atau meloncat-loncat dalam cairan. Gerakan yang aktif ini menunjukkan bahwa bakteri mempunyai flagela.
A. Preparat Basah Cara membuat preparat basah: 1. Kaca obyek dibersihkan dengan kapas yang diberi alkohol. 2. Pindahkan 2 mata ose suspensi biakan ke atas kaca obyek (Gambar 26). Pada preparat basah digunakan kaca obyek biasa. 3. Tutuplah dengan kaca penutup. 4. Periksa dengan pembesar 10x atau 45x ❖ Biakan Mikroorganisme dalam Medium Cair 1. Letakkan setetes suspensi bakteri di tengah-tengah kaca obyek. 2. Usapkan sedikit vaselin pada tepi telapak tangan kiri anda sehingga membentuk lapisan tipis. Sentuhkan secara bergantian keempat sisi kaca penutup dengan lapisan tipis vaselin sehingga seluruh tepi kaca dilapisi vaselin.
49
3. Letakkan perlahan-lahan kaca penutup bertepi vaselin tadi (muka yang bervaselin menghadap ke kaca obyek) pada suspensi bakteri dan tekan perlahan-lahan sehingga terbentuk segel. ❖ Biakan Mikroorganisme dalam Medium Padat 1. Taruh setetes air suling/aquades di atas kaca obyek disusul dengan pemindahan sedikit biakan mikroorganisme dengan lup (ose) atau jarum inokulasi ke atas air suling tersebut lalu diaduk sampai rata. 2. Usapkan sedikit vaselin pada tepi telapak tangan kiri anda sehingga membentuk lapisan tipis. Sentuhkan secara bergantian keempat sisi kaca penutup sehingga seluruh tepi kaca tutup dilapisi vaselin. 3. Letakkan perlahan-lahan kaca penutup bertepi vaselin tadi (muka yang bervaselin menghadap ke kaca obyek) pada suspensi bakteri dan tekan perlahan-lahan sehingga terbentuk segel. ❖ Biakan Mikroorganisme dalam Medium Padat khusus Kapang 1. Pada sebuah kaca obyek yang bersih taruhlah setetes larutan zat warna lactophenol catton blue. Zat warna ini akan menambah kontras sehingga kapang lebih mudah diamati. 2. Ambillah cawan Sabouraud’s dextrose agar yang terdapat kapang di dalamnya pilihlah 2 macam koloni kapang yang tampak berbeda. 3. Dengan menggunakan pisau bedah, pindahkan sedikit biakan kapang (dari salah satu koloni) ke atas tetesan zat warna pada kaca objek tadi. Perhatian: pilihlah bagian tepi koloni namun yang telah menampakkan warna. Bagian koloni yang putih belum membentuk spora akan sukar diidentifikasi. 4. Tutuplah dengan kaca penutup yang telah dilapisi vaselin dipinggirnya. 5. Amati di bawah mikroskop pembesaran 10x dan 40x 6. Ulangi seluruh prosedur di atas untuk koloni kapang yang kedua.
50
1. Goyangkan tabung sehingga bakteri tercampur merata dalam suspensi
2. Pijarkan ose sampai merah
3. Buka tutup tabung dan panaskan mulut tabung di atas api
4. Setelah ose dingin kembali, ambil satu mata ose suspensi bakteri. Jangan menyentuh sisi tabung
5. Panaskan mulut tabung sebelum menutup tabung
6. Tutup kembali tabung dan letakkan kembali pada tempatnya semula.
7. Letakkan ose yang berisi suspensi biakan di atas kaca objek dan tutup dengan kaca penutup
8. Pijarkan ose setiap kali mengambil suspense biakan & sewaktu meletakkan kembali
Gambar 26 Cara membuat preparat basah
51
B. Preparat Tetes Bergantung Dalam mempelajari morfologi mikroba dapat digunakan preparat tetes bergantung, preparat basah atau preparat yang diwarnai. Pada preparat tetes bergantung atau preparat basah diamati mikroba yang hidup, sedangkan pada preparat yang diwarnai mikroba tersebut mati. Preparat tetes bergantung dan preparat basah digunakan untuk mengamati pergerakan mikroba. Preparat tetes bergantung lebih menguntungkan dibandingkan preparat basah oleh karena tidak cepat kering. Cara membuat preparat tetes bergantung sebagai berikut (Gambar 27): 1. Beri vaselin pada sudut-sudut kaca penutup dengan tusuk gigi 2. Taruh 2 mata ose suspense biakan di bagian tengah kaca penutup 3. Kaca objek diletakkan di atas kaca penutup, kemudian balikkan dengan cepat 4. Preparat tetes bergantung diperiksa dengan pembesaran 10x dan 45x
Gambar 27 Cara membuat preparat tetes bergantung
52
BAB VI PEWARNAAN BAKTERI, ENDOSPORA, KAPANG A. Tujuan Praktikum 1. Mengetahui teknik pembuatan apusan bakteri 2. Mengetahui teknik pewarnaan mikroba 3. Melihat bentuk sel, letak endospora dan sifat Gram bakteri 4. Mengamati morfologi kapang B. Dasar Teori
Mikroorganisme sulit dilihat dengan mikroskop cahaya, karena tidak mengadsorbsi ataupun membiaskan cahaya. Alasan inilah yang menyebabkan zat warna digunakan untuk mewarnai mikroorganisme dengan sekelilingnya ditingkatkan. Penggunaan zat warna memungkinkan pengamatan struktur sel seperti spora, flagela dan badan inklusi yang mengandung zat pati dan granula fosfat. Pewarnaan yang digunakan untuk memilahkan mikroorganisme disebut pewarnaan diferensial. Pewarnaan Gram merupakan contoh pewarnan diferensial yang memilahkan bakteri menjadi kelompok Gram positif dan Gram negatif. Pewarnaan diferensial lainnya ialah perawatan Ziehl-neelsen yang memilahkan bakteri menjadi kelompok tahan asam dan tidak tahan asam. Zat warna yang digunakan dalam pewarnaan bersifat basa atau asam. Pada zat warna basa, bagian yang berperan dalam memberikan warna disebut kromofor dan mempunyai muatan positif. Sebaiknya, pada zat warna asam bagian yang berperan memberikan zat warna mempunyai muatan negatif. Zat warna basa lebih banyak digunakan karena muatan negatif banyak ditemukan pada dinding sel, membran sel dan sitoplasma sewaktu proses pewarnaan. Muatan positif pada zat warna basa akan berikatan dengan muatan negatif dalam sel, sehingga mikroorganime lebih jelas terlihat. Zat warna asam yang bermuatan negatif lazimnya tidak digunakan untuk mewarnai mikroorganisme, namun biasanya dimanfaatkan untuk mewarnai latar belakang sediaan pewarnaan. Zat warna asam yang bermuatan negatif ini tidak dapat berkaitan dengan muatan negatif yang terdapat pada struktur sel. Kadangkala zat warna negatif ini digunakan untuk mewarnai bagian sel yang yang bermuatan 53
positif. Perlu diperhatikan bahwa muatan dan daya ikat zat warna terhadapa struktur sel dapat berubah tergantung pada pH sekitarnya sewaktu proses pewarnaan. Prosedur pewarnaan yang menghasilkan pewarnaan mikroorganisme disebut pewarnaan positif. Dalam prosedur pewarnaan ini dapat digunakan zat warna basa yang bermuatan positif maupun zat warna asam yang bermuatan negatif. Sebaliknya pada pewarnaan negatif latar belakang di sekeliling mikroorganisme diwarnai untuk meningkatkan kontras dengan mikroorganisme yang tidak bewarna. Pewarnaan secara umum digunakan untuk mengetahui morfologi sel bakteri, namun terdapat pula teknik pewarnaan untuk mengetahui beberapa bagian dari sel bakteri seperti endospora, kapsul dan flagella. Beberapa teknik pewarnaan yang sering digunakan diantaranya: a. Pewarnaan sederhana b. Pewarnaan negatif (negative staining) c. Pewarnaan Gram (Gram staining) d. Pewarnaan asam (acid fast staining – Ziehl-Neelsen and Kinyoun) e. Pewarnaan endospora (Endospore staining – Schaeffer-Fulton or WirtzConklin) Konfirmasi jenis Gram bakteri dapat dilakukan menggunakan KOH 10%. Pewarnaan untuk jamur diantaranya menggunakan teknik : Lactophenol blue stain, PAS and methenamine silver staining dan Gomori methenamine silver (GMS) stain.
C. Cara Kerja ❖ Preparat Ulas Sebelum dilakukan pewarnaan dibuat ulasan bakteri di atas kaca obyek. Ulasan ini kemudian difiksasi. Jumlah bakteri yang terdapat dalam ulasan haruslah cukup banyak sehingga dapat terlihan bentuk dan penataannya sewaktu diamati. Kesalahan yang seringkali dibuat adalah menggunakan suspensi bakteri yang terlalu padat terutama bila suspensi berasal dari biakan media padat. Sebaliknya bila suspensi bakteri terlalu encer, maka akan diperoleh kesulitan sewaktu mencari bakteri pada preparat.
54
Fiksasi Preparat Untuk pengamatan morfologi sel milkroorganisme, maka seringkali setelah pembuatan preparat ulas dilaksanakan fiksasi diikuti oleh pewarnaan. Fiksasi dapat dilakukan dengan cara melewatkan preparat di atas api atau meredamnya dalam metanol. Fiksasi digunakan untuk: •
Mengamati bakteri oleh karena sel bakteri lebih jelas terlihat setelah diwarnai.
•
Melekatkan bakteri pada gelas obyek.
•
Mematikan bakteri.
Alat dan bahan •
Objek glass/kaca objek
•
Jarum ose
•
Bunsen dan spirtus
•
Kertas label/marker pen
•
Aquadest steril/NaCl
•
Kultur murni bakteri
•
Penjepit gelas benda
Cara pembuatan preparat ulas: I. Biakan Cair 1. Bersihkan kaca obyek dengan sepotong kapas yang dibasahi dengan alkohol. 2. Tuliskan kode organisme pada sudut kaca obyek dengan spidol. 3. Kocok tabung yang berisi suspensi bakteri, kemudian pindahkan 2 mata ose suspensi ke bagian tengah kaca obyek. 4. Ulaskan suspensi di atas kaca obyek. 5. Biarkan preparat mengering di udara sebentar. 6. Fiksasi di atas api untuk membunuh dan melekatkan bakteri pada kaca obyek.
55
II. Biakan Padat (Gambar 28) 1. Bersihkan kaca obyek dengan sepotong kapas yang dibasahi dengan alkohol. 2. Tuliskan kode organisme pada sudut kaca obyek dengan spidol. 3. Teteskan 2 mata ose NaCl fisiologis atau aquades steril di bagian tengah kaca obyek. 4. Sentuhkan ose pada biakan bakteri, kemudian campur dengan NaCl fisiologis sehingga merata. Ulaskan campuran ini di atas kaca obyek. 5. Biarkan preparat mengering di udara sebentar. 6. Fiksasi di atas api.
Gambar 28 Pembuatan preparat ulas dan fiksasi 56
1. Pewarnaan Sederhana Pada pewarnaan sederhana hanya digunakan 1 macam zat warna untuk meningkatkan kontras antara mikroorganisme dan sekelilingnya. Lazimnya, prosedur pewarnaan ini menggunakan zat warna basa seperti kristal violet, biru metilen, karbol fuksin basa, safaranin atau hijau malakit. Kadangkala digunakan zat warna negatif untuk pewarnaan sederhana. Zat warna asam yang sering digunakan adalah nigrosin dan merah kongo. Prosedur pewarnaan sederhana mudah dan cepat, sehingga pewarnaan ini sering digunakan untuk melihat bentuk, ukuran dan penataan mikroorganisme. Pada bakteri dikenal berbagai bentuk,yaitu bulat (kokus), batang (basilus), dan spiral. Dengan pewarnaan sederhana dapat juga terlihat penataan bakteri. Pada kokus dapat terlihat penataan/susunan sel seperti rantai (streptokokus), buah anggur (stafilokokus), pasangan (diplokokus), bentuk kubus yang terdiri dari 4 atau 8 kokus (sarcinae). Cara kerja: 1. Buat preparat ulas (Gambar 28) 2. Berikan larutan zat warna yaitu larutan biru metilen atau larutan karbol fuksin basa 3. Berikan zat warna selama 30 detik 4. Cuci dan keringkan hati-hati dengan kertas saring 5. Periksa dengan mikroskop 100x 6. Apabila preparat ulas dan teknik pewarnaan dilakukan dengan benar, maka mikroorganisme bewarna biru dengan larutan biru metilen dan bewarna merah dengan larutan karbol fuksin-basa 7. Laporkan hasil pengamatan dan isi table di bawah ini! Mikroorganisme
Morfologi
Bacillus subtilis Staphylococcus epidermidis Streptococcus spp Escherichia coli
57
2. Pewarnaan negatif Beberapa mikroba sulit diwarnai dengan zat warna yang bersifat basa, tetapi mudah dilihat dengan pewarnaan negatif. Pada metode ini mikroba dicampur dengan tinta cina atau nigrosin, kemudian digesekkan di atas kaca objek (Gambar 26). Zat warna tidak akan mewarnai bakteri akan tetapi mewarnai lingkungan sekitar bakteri. Dengan mikroskop, mikroba akan terlihat tidak bewarna dengan latar belakang hitam. Pada metode ini, preparat tidak dipanaskan di atas api, melainkan dikeringkan di udara.
Cara kerja: 1. Ambil 2 kaca objek. Beri 1 tetes tinta cina pada bagian ujung kanan salah satu kaca objek (Gambar 29-1) 2. Ambil kotoran gigi dengan tusuk gigi, kemudian campur dengan tinta cina di atas objek (Gambar 29-1) 3. Tempatkan salah satu sisi kaca objek yang lain pada campuran ini, kemudian gesekkan ke samping kiri (Gambar 29-2,3,4) 4. Biarkan preparat mongering di udara. Preparat tidak boleh dipanaskan di atas api. 5. Periksa dengan mikroskop 100x 6. Laporkan hasil pengamatan!
Gambar 29 Cara pewarnaan negatif
58
3. Pewarnaan Gram Pengecatan atau pewarnaan Gram dikembangkan pertama kali oleh Hans Christian Joachim Gram (1884) dan termasuk pengecatan diferensial karena dapat membedakan bakteri yang bersifat Gram positif dan Gram negatif. Bakteri Gram positif mengikat zat warna utama (crystal violet) yang berwarna ungu dengan kuat sehingga tidak dapat dilunturkan oleh larutan pemuncat (aceton alkohol), dan tidak diwarnai lagi oleh zat warna lawan (safranin), hal ini disebabkan karena sifat dinding sel dan sitoplasmanya yang mempunyai afinitas kuat terhadap kompleks crystal violet dan iodine (iodium). Bakteri Gram negatif tidak mengikat zat warna utama secara kuat, sehingga dapat dilunturkan oleh larutan pemucat dan dapat diwarnai oleh zat warna lawan sehingga tampak berwarna merah. Perbedaan sifat bakteri Gram positif dan gram negatif tidak mutlak tegas dan spesifik, tetapi masih tergantung pada beberapa faktor yang dapat menyebabkan variasi dalam pengecatan Gram. Pewarnaan Gram memberikan hasil yang baik, bila digunakan biakan segar yang berumur 24 – 48 jam. Apabila menggunaan biakan mikroba yang tua, terdapat kemungkinan penyimpangan hasil pewarnaan Gram. Pada biakan tua, banyak sel mengalami kerusakan pada dinding sel. Kerusakan pada dinding sel ini menyebabkan zat warna dapat keluar sewaktu dicuci dengan larutan pemucat. Hal ini berarti bakteri Gram positif dengan dinding yang rusak tidak lagi dapat mempertahankan komplek warna kristal violet-yodium sehingga terlihat sehingga terlihat sebagai bakteri Gram negatif. Alat dan Bahan •
Mikroskop
•
Jarum ose
•
Bunsen dan spirtus
•
Kertas label/marker pen
•
Objek glass
•
Rak wadah pewarna
•
Penjepit gelas benda
•
Botol semprot berisi air
•
Kultur murni bakteri
59
•
Crystal violet
•
Larutan iodine
•
Alkohol 96% (larutan pemucat)
•
Safranin
•
Minyak immersi
Cara kerja: 1. Bersihkan objek gelas menggunakan alkohol 70% dan tissue untuk menghilangkan noda dan lemak yang menempel. 2. Buatlah pulasan bakteri di atas gelas objek, keringkan dan fiksasi dengan api (Gambar 28) 3. Teteskan zat warna crystal violet dan diamkan 60 detik. 4. Buanglah sisa zat warna dan cuci sisanya dengan air mengalir. 5. Teteskan larutan iodine dan diamkan selama 60 detik. 6. Buang sisa zat warna dan cuci sisanya dengan air mengalir 7. Teteskan larutan peluntur yaitu alkohol 96% diamkan kira-kira 10 - 30 detik. (hati-hati jangan sampai berlebihan yang mengakibatkan kesalahan hasil). 8. Buang sisa zat warna dan cuci sisanya dengan air mengalir 9. Teteskan safranin dan diamkan selama 30 - 45 detik. 10. Cuci kembali dengan air mengalir, keringkan dengan cara menganginanginkan di udara dan keringkan sisa air menggunkana kertas tisu. 11. Amati menggunakan mikroskop perbesaran lemah sampai perbesaran kuat (100x) dan diteteskan minyak immersi. 12. Catat bentuk sel dan sifat Gramnya sesuai dengan table dibawah ini. Mikroorganisme
Morfologi
Sifat Gram
Warna
Bacillus subtilis Staphylococcus epidermidis Staphylococcus aureus Streptococcus spp Escherichia coli
60
Gambar 30 Prosedur pewarnaan Gram
4. Pewarnaan Ziehl-Neelsen Pewarnaan Ziehl-Neelsen atau pewarnaan tahan asam memilahkan kelompok Mycobacterium dan Nocardia dari bakteri lainnya. Pada 2 kelompok tersebut terdapat bakteri yang bersifat pathogen yaitu Mycobacterium tuberculosis, M. leprae dan Nocardia asteroides. Kelompok bakteri ini disebut tahan asam karena dapat mempertahankan zat warna pertama (karbol fuksin) sewaktu dicuci dengan larutan pemucat. Bakteri tahan asam terlihat bewarna merah. Sebaliknya pada bakteri yang tidak tahan asam, larutan pemucat akan melarutkan fuksin-karbol dengan cepat sehingga sel bakteri tidak bewarna. Setelah penambahan zat warna kedua bakteri tidak tahan asam berwarna biru. Mycobacterium dan Nocardia memiliki keistimewaan karena dinding selnya mengandung lipid yang terlihat sebagai lapisan lilin. Kandungan lipida yang tinggi ini menyebabkan sel bakteri sulit diwarnai, karena zat warna tidak dapat
61
menembus lapisan lilin ini. Jika bakteri tahan asam diwarnai dengan larutan karbolfuksin, maka zat warna ini tidak mudah luntur oleh larutan pemucat. Sifat tahan asam berkaitan dengan kandungan lipid dinding sel, oleh karena itu digunakan pemanasan sehingga zat warna dapat merasuk ke dalam sel bakteri yang diliputi oleh lipida. Zat warna
Tahan asam
Tidak tahan asam
Fuksin karbol
merah
merah
Larutan pemucat
merah
Tidak bewarna/pucat
Biru metilen
merah
biru
Cara kerja (Gambar 31): 1. Buatlah pulasan bakteri atau sputum di atas gelas objek, keringkan dan fiksasi dengan api (Gambar 28) 2. Tutup preparat ulas dengan sepotong kertas saring, kemudian tambahkan larutan karbol fuksin, lalu dipanaskan preparat selama 5 menit sehingga terlihat uap. Hati-hati jangan sampe biakan preparat mongering 3. Setelah preparat dingin, buang kertas saring kemudian cuci dengan air 4. Cuci dengan asam alkohol selama 20 detik 5. Cuci dengan air untuk menghentikan pemucatan 6. Warnai dengan biru metilen selama 1 menit 7. Lalu cuci dengan air 8. Keringkan dengan kertas saring 9. Laporkan hasil pengamatan da nisi table di bawah!
Gambar 31 Cara Pewarnaan Ziehl-Neelsen
62
Mikroorganisme
Morfologi
Sifat Gram
Warna
Bacillus subtilis Staphylococcus epidermidis Staphylococcus aureus Streptococcus spp Escherichia coli
5. Pewarnaan endospora/spora (Scaeffer-fulton) Spora pada bakteri merupakan struktur yang tahan panas dan bahan kimia. Spora dibentuk oleh bakteri tertentu untuk mengatasi lingkungan yang tidak menguntungan bagi bakteri. Contoh bakteri pembentuk spora yaitu Bacillus, Clostridium, Thermoactinomyces dan Sporosarcina. Spora terbentuk dalam sel sehingga seringkali disebut sebagai endospora; dalam sel bakteri hanya terdapat 1 spora. Spora ini tidak berfungsi untuk reproduksi. Dalam lingkungan yang menguntungkan spora bergeminasi kembali menjadi sel vegetative. Bila lingkungan tidak menguntungkan disebabkan langkanya sumber karbon, energi atau fosfat. Spora tahan terhadap suhu dan bahan kimia yang mematikan sel vegetatif. Sebagai contoh, spora Clostridium botulinum tahan terhadap suhu mendidih selama beberapa jam. Kekeringan dan kekurangan zat hara tidak menyebabkan kematian spora, spora dapat bertahan dalam tanah selama puluhan tahun. Lapisan luar spora merupakan penahan yang baik terhadap bahan kimia, sehingga spora sukar diwarnai. Spora bakteri dapat diwarnai dengan dipanaskan. Pemanasan dapat menyebabkan lapisan luar spora mengembang sehingga zat warna sapat masuk.
Cara kerja: 1. Siapkan preparat ulas dari biakan bakteri berspora (72 jam) 2. Tempatkan preparat ulas pada rak pewarna 3. Panaskan preparat ulas yang diberi warna hijau malakit seperti pada pewarnaan Ziehl-Neelsen dengan menggunakan tangkai gelas berujung
63
kapas. Celupkan ujung kapas ini dalam alkohol. Pemanasan dilakukan dengan menempatkan kertas saring di atas preparat ulas, sebelum diberi zat warna hijau malakit. Kertas saring menghindari menguap yang tidak merata dan menjaga agar sediaan tidak kering. Panas mengembangkan lapisan luar spora sehingga zat warna hijau malakit dapat masuk ke dalam spora. Setelah dingin warna hijau ini terperangkap di dalam spora. 4. Dinginkan preparat selama 1 menit sebelum meneruskan pewarnaan. 5. Buang kertas saring dalam bak pewarnaan, kemudian cuci dengan air. Air akan mencuci zat warna hijau malakit dari sel vegetatif, namun tidak dapat mencuci hijau malakit dalam spora. Pada tahap ini spora bewarna hijau sedangkan sel vegetatif tidak bewarna, sehingga sulit dilihat dengan mikroskop. 6. Beri zat warna safranin selama 60 detik. Sewaktu pewarnaan safranin, preparat ulas tidak perlu dipanaskan. Zat warna ini termasuk zat warna basah, sehingga akan mengikat muatan negatif yang terdapat pada permukaan sel. Safranin tidak akan masuk dalam spora dan sel vegetatif terlihat merah, sedangkan spora bewarna hijau. 7. Cuci preparat dengan air. Keringkan preparat dengan hati-hati karena safranin adalah zat warna lemah sehingga mudah lepas dari sel vegetatif. Pencucian yang terlalu lama dapat melunturkan warna merah dari sel vegetatif 8. Pemeriksaan preparat dengan menggunakan pembesaran 100x 9. Laporkan hasil pengamatan!
Konfirmasi sifat Gram menggunakan KOH 10%. Langkah kerja yaitu teteskan KOH 10% pada objek gelas bersih, campurkan dengan satu ose kultur bakteri. Tunggu 30 detik kemudian tarik ose secara perlahan dari objek gelas yang berisi suspensi bakteri tersebut. Bakteri Gram negatif akan membentuk lendir (saat ditarik ada lender) sedangkan bakteri Gram positif akan encer atau tetap.
64
Gambar 32 Berbagai bentuk sel bakteri f. Pewarnaan jamur/fungi Alat dan bahan : •
Mikroskop dan stereomikroskop
•
Jarum enten, jarum pentul 65
•
Bunsen dan spirtus
•
Kertas label/marker pen
•
Objek glass dan cover glass
•
Penjepit gelas benda
•
Kultur murni kapang/jamur
•
Larutan Lactophenol cotton blue (LCB)
Cara kerja : 1. Bersihkan objek glass dan cover glass menggunakan alkohol 70% dan tissue untuk menghilangkan noda dan lemak yang menempel. 2. Teteskan sedikit larutan LCB di tengah permukaan objek glass. 3. Ambil sedikit hifa kapang yang berada di bagian tepi, taruh di permukaan objek glass yang telah ditetesi LCB. 4. Uraikan hifa secara hati-hati menggunakan dua jarum pentul steril sambal diamati menggunakan stereomikroskop. 5. Tutup sediaan kapang menggunakan cover glass secara hati-hati dan usahakan tidak ada gelembung udara dalam preparat. 6. Bersihkan kelebihan LCB dengan kertas hisap 7. Amati menggunakan mikroskop pada perbesaran lemah hingga kuat. 8. Amati morfologi kapang yang terlihat serta bagian-bagiannya.
66
BAB VII DETERMINASI BAKTERI DENGAN UJI BIOKIMIAWI
A. Tujuan 1. Mengetahui teknik identifikasi bakteri melalui uji biokimia 2. Mengetahui cara karakterisasi bakteri melalui uji biokimia
B. Dasar Teori Bakteri adalah kelompok organisme yang tidak memiliki membran inti sel. Organisme ini termasuk ke dalam domain prokariota dan berukuran sangat kecil (mikroskopik), serta memiliki peran besar dalam kehidupan di bumi. Beberapa kelompok bakteri dikenal sebagai agen penyebab infeksi dan penyakit, sedangkan kelompok lainnya dapat memberikan manfaat dibidang pangan, pengobatan, dan industri. Struktur sel bakteri relatif sederhana: tanpa nukleus/inti sel, kerangka sel, dan organel-organel lain seperti mitokondria dan kloroplas. Hal inilah yang menjadi dasar perbedaan antara sel prokariot dengan sel eukariot yang lebih kompleks (Colome, 2001). Uji biokimia merupakan salah uji yang digunakan untuk menentukan spesies mikroba yang tidak diketahui sebelumnya. Setiap mikroba memiliki sifat biokimia yang berbeda sehingga tahapan uji biokimia ini sangat membantu proses identifikasi. Setelah sampel diinokulasikan pada media differensial atau selektif, kemudian koloni mikroba diinokulasikan pada media uji biokimia. Ada 12 jenis uji yang sering digunakan dalam uji biokimia walaupun sebenarnya masih banyak lagi media yang dapat digunakan (Adam, 2001). Pentingnya dilakukan praktikum ini adalah untuk melakukan teknik identifikasi dan karakterisasi jenis bakteri melalui uji biokimia.
C. Prosedur Kerja Alat dan Bahan •
Isolat murni bakteri
•
Nutrien Agar (NA)
•
Reagen untuk test oksidase: tetramethyl-paraphenyldiamine
67
•
Regen untuk test katalase: 10% atau 30% H2O2
•
Reagen untuk test O-F: media OF-yang mengandung 0.5-1% karbohidrat dan parafin cair
•
Reagen untuk test sitrat: Simmons Citrate Agar yang mengandung indikator Brom Thymol Blue- BTB
•
Reagen untuk test dekarboksilase lisin : media Lysin Iron Agar (LIA) yang mengandung Lisin dan indikator Brom Cresol Purple-BCP, media tanpa Lisin
•
Gelatin
•
Media TSIA (Triple Sugar Iron Agar)
•
Reagen untuk test pembentukan indol : media Tryptone Water, reagen Kovacsk.Reagen untuk test MR-VP : media MR-VP, larutan 40% KOH, larutan5% alphanaphtoll
•
Reagen untuk test Urease : media Urea Broth, idikator Phenol Red l. Buku panduan determinasi bakteri : Bergey’s Manual of Determinative Bacteriology (Holt et al.., 2000)
•
Jarum ose
•
Jarum needle
•
Pipet steril
Prosedur Kerja a. Test Oksidase 1. Letakkan 2-3 tetes larutan tetramethyl-paraphenyldiamine pada kertas saring. 2. Ambillah suspensi isolat murni bakteri dalam nutrien cair daninokulasikan pada kertas saring yng telah ditetesi reagen. 3. Amati dan laporkan hasil pengujian, reaksi positif terjadi jika timbulwarna ungu tua atau hitam setelah didiamkan selama beberapa menit. 4. Kadangkala perubahan warna memakan waktu lebih lama sampai 10-30 menit. 5. Bandingkan dengan kontrol (tanpa inokulasi bakteri).
68
b. Test Katalase 1. Letakkan 1-2 tetes 10 % atau 30% H2O2 pada gelas benda dantambahkan 1 ose atau 2-3 tetes suspensi isolat murni bakteri. 2. Amati, katalase positif ditandai oleh pembentukan buih seketika. 3. Bandingkan dengan kontrol (tanpa inokulasi bakteri)
c. Test O-F (Oksidasi Fermentasi) 1. Inokulasikan secara hati-hati isolat murni bakteri ke dalam 4 tabung berisi media O-F yang mengandung 0,5-1% karbohidrat (glukosa,laktosa, manitol, maltosa atau sukrosa) secara tusukan. 2. Tabung I ditutup dengan parafin lunak, tabung II tidak ditutup parafin, tabung III dan IV sebagai kontrol (ditutup paraffin dan tidak ditutup paraffin tanpa inokulasi bakteri). 3. Amati setelah 24 jam pada suhu kamar. 4. Bandingkan perlakuan dengan kontrol. Oksidasi (terbentuk warna kuning pada media O-F yang tidak ditutup paraffin) terjadi pada mikroba aerobik dan fermentasi (terbentuk warna kuning pada media O-F yang ditutup paraffin) terjadi pada mikroba anaerob. 5. Bandingkan dengan kontrol. Perhatikan perubahan warna media yang terjadi dan indikator yang terkandung dalam media O-F
d. Test pengunaan sitrat 1. Isolat murni bakteri diinokulasikan secara goresan zig zag menggunakan ose dan secara tusukan menggunakan jarum inokulasi pada media Simmons Citrat Agar miring, kemudian diinkubasi pada suhu kamar selama 24 jam. 2. Perhatikan perubahan warna dengan melihat perubahan warna dari hijaumenjadi biru. 3. Bandingkan dengan kontrol
69
e. Test dekarboksilase lisin 1. Pada medium yang mengandung lisin dan kontrol (media tanpa lisin)diinokulasi secara tusukan dengan isolat murni bakteri, inkubasikan pada suhu kamar selama 24 jam. 2. Positif jika terjadi perubahan warna dari ungu menjadi kuning dankembali ke ungu, sementara pada kontrol (media tanpa lisin) terjadi perubahan warna dari ungu menjadi kuning
f. Test hidrolisis gelatin 1. Dengan cara tusukan, inokulasikan isolat murni bakteri pada media yangmengandung gelatin sedalam ¾ bagian dari lapisan permukaan. 2. Inkubasikan selama 24 jam pada suhu kamar. 3. Pada saat pengamatan, masukkan tabung perlakuan dan kontrol (media tanpa inokulasi bakteri) dalam almari es selama 30 menit. Positif berartiterjadi pencairan
g. Test H2S dan fermentasi gula-gula 1. Dengan menggunakan media TSIA, inokulasikan isolat murni bakteri secara goresan menggunakan jarum ose dan secara tusukan menggunakan jarum inokulasi. 2. Inkubasikan selama 24 jam 3. Pembentukan H2S ditunjukkan dengan terbentuknya endapan warnahitam. Perubahan warna media TSIA dari merah menjadi kuning menunjukkan adanya fermentasi gula (glukosa, sukrosa, laktosa). Amati juga apakah terbentuk gas yang ditandai dengan pecahnya media atau terangkatnya media ke atas. 4. Bandingkan dengan kontrol (media tanpa inokulasi bakteri)
h. Test indol 1. Inokulasikan 1 tabung media Tryptone Water dengan 2 tetes isolate murni bakteri dan 1 tabung media untuk kontrol (tanpa inokulasi bakteri).
70
2. Inkubasikan pada suhu kamar selama 24 jam. 3. Setelah inkubasi, tiap-tiap tabung ditambah 5 ml larutan reagen Kovacs. 4. Terbentuknya
warna
merah/merah
muda
pada
lapisan
larutan
reagenmenunjukkan terbentuknya indol. 5. Bandingkan dengan kontrol
i. Test MR (Methy Red) 1. Inokulasikan isolat murni bakteri pada media MR-VP (media Methyl RedVoges Proskauer) dan inkubasikan selama 24 jam pada suhu kamar. 2. Tambahkan 5 tetes reagen Methyl Red ke dalam tabung berisi media MRVP 3. Kocoklah hati-hati, Hasil tes positif jika terjadi warna merah dalam waktu 30 menit setelah penambahan reagen. 4. Bandingkan dengan kontrol (tanpa inokulasi bakteri)
j. Test VP (Voges Proskauer) 1. Inokulasikan isolat murni bakteri pada media MR-VP dan inkubasikan selama 24 jam pada suhu kamar. 2. Tambahkan 0,6 ml larutan alpha-naphtol 5% dilanjutkan 0,2 ml KOH 40%. 3. Kocoklah hati-hati, longgarkan tutupnya, kocok kembali, ulangi setiap 5 menit, bacalah perubahan warnanya setelah 30 menit. Hasil tes positif jika terjadi warna merah dalam waktu 30 menit setelah penambahan reagen. 4. Bandingkan dengan kontrol (tanpa inokulasi bakteri)
k. Test urease 1. Inokulasikan media Urea Broth yang mengandung indikator fenol merah dengan 1 tetes kultur murni bakteri. 2.
Amatilah perubahan warna menjadi merah (phenol red) setelah 24 jam pada suhu kamar.
3. Bandingkan dengan kontrol
71
DAFTAR PUSTAKA
Benson HJ. 2001. Microbiological Aplication A Laboratory Manual in General Microbiology. McGraw Hill: USA. Cappuccino JG, Welsh C. 2020. Microbiology A Laboratory Manual. Pearson: USA. Lay BW. 1994. Analisis Mikroba Di Laboratorium. Rajawali Pers : Jakarta.
72
