SPEKTROFOTOMETER [PDF]

Citation preview

SPEKTROFOTOMETER UV Vis



Disusun oleh : Meli Maulidia



Program Magister Biomedik Fakultas Kedokteran Universitas Islam Sultan Agung Semarang 2019



BAB 1 PENDAHULUAN



Spectrophotometry adalah metode ilmiah berdasarkan penyerapan cahaya oleh suatu zat, dan memanfaatkan dua hukum penyerapan cahaya. Yaitu merupakan alat untuk mengukur intensitas cahaya di bagian spektrum, sebagai ditransmisikan atau dipancarkan oleh zat tertentu.



Spektrofotometri merupakan bidang utama penelitian dalam analisis interaksi materi-optik. Makalah ini menunjukkan pengembangan spektrofotometer cahaya tampak yang terjangkau yang dapat mengukur absorbansi dan transmisi cairan solusi berbagai bahan dalam rentang yang terlihat spektrum elektromagnetik. Sistem ini memiliki bandwidth 72.5nm dalam rentang yang terlihat. Instrumen diverifikasi menggunakanKMnO4 solusi yang memiliki konsentrasi berbeda. Nilai absorbansi dari solusi dicatat dan dianalisis menggunakan Origin Pro 8.00 dan koefisien kepunahan KmnO4 dihitung menjadi 2,306 × 10-7 Lmol-1cm-1 pada 525nm. Validitas ini hasil diverifikasi dari penelitian sebelumnya yang dilakukan dengan spektrofotometer UV-Vis komersial. Spektrofotometer UV-Vis juga disebut spektrofotometer portable, berbasis mikrokontroler, sistem bertenaga baterai yang mampu menyerap data terhadap insiden panjang gelombang yang terlihat, terutama untuk cairan sampel. Karena sistem menjalankan baterai, perangkat ini dimungkinkan untuk digunakan di daerah rawan pemindahan beban. Sistem ini mampu membuat monokromatik terlihat ringan seperti sinar datang dan merekam energi yang ditransmisikan dalam bentuk sinyal listrik. Mikrokontroler Arduino telah digunakan untuk mengendalikan motor stepper untuk memilih monokromatik panjang gelombang melalui celah buatan tangan. Energi yang ditransmisikan melalui sampel ditampilkan dalam bentuk listrik dalam multimeter terpasang.



Pada



spektrofotometer



UV-Vis,



pemeriksaan



tersering



yaitu



pemeriksaan



kemurnian DNA dan RNA. Setiap kontaminasi protein akan memiliki penyerapan maksimum pada 280 nm. Pengukuran dilakukan pada 260 nm dan 280 nm dan dibandingkan untuk memberikan rasio. Untuk DNA hasil membagi penyerapan 260 nm oleh 280 nm harus lebih besar atau sama dengan 1,8 untuk menunjukkan tingkat kemurnian yang baik dalam sampel. Untuk sampel RNA, bacaan ini harus 2,0 atau di atas. Hasil lebih rendah dari ini bersifat indikatif kotor dalam sampel. Peningkatan absorbansi pada 230 nm juga dapat menunjukkan kontaminasi, yang pada gilirannya dapat mempengaruhi bacaan 260 nm untuk DNA dan RNA. Sejumlah zat menyerap pada 230 nm, seperti ini wilayah absorbansi ikatan peptida dan rantai samping aromatik. Beberapa penyangga komponen menunjukkan daya serap yang kuat pada 260 nm dan karenanya dapat mengubah hasil kuantifikasi fotometrik. Salah satu contoh komponen tersebut adalah konsentrasi EDTA di atas 10 mM. Kontaminan dalam sampel, seperti protein, fenol, atau urea, dapat menyebabkan penyerapan pada 230 nm. Kontaminasi fenol juga meningkatkan penyerapan sampel pada 280 nm dan karena itu dapat diidentifikasi melalui yang lebih rendah. Penyerapan pada 320 nm mungkin karena hamburan cahaya yang disebabkan oleh partikel, atau karena endapan di dalam Sampel. Cuvette yang kotor atau rusak dapat menyebabkan penyerapan pada 320 nm. Kontaminasi dengan garam chaotropic, seperti NaI, juga dapat menyebabkan meningkatnya penyebaran cahaya. Mengukur dan mengoreksi pembacaan pada 320 nm karena itu menghilangkan gangguan dari hamburan cahaya, dari kuvet, atau dalam kasus di mana pelat blanking digunakan untuk menargetkan berkas cahaya meskipun sampel. Koreksi sangat berguna saat menggunakan sel volume kecil atau spesialis kecil spektrofotometer volume. Spektofotometer UV-Vis menentukan komposisi suatu sampel didasarkan pada interaksi antara materi dan cahaya. Serapan cahaya oleh molekul dalam daerah spektrum ultraviolet dan visibel tergantung pada struktur elektronik dari molekul. Serapan ultraviolet dan visibel dari senyawa-senyawa organik berkaitan erat transisi-transisi diantara tingkatantingkatan tenaga elektronik. Oleh karena hal ini, maka serapan radiasi ultraviolet atau terlihat sering dikenal sebagai spektroskopi elektronik. Transisi-transisi tersebut biasanya antara orbital ikatan atau orbital pasangan bebas dan orbital non ikatan tak jenuh atau orbital anti ikatan. Panjang gelombang serapan merupakan ukuran dari pemisahan tingkatan-tingkatan tenaga dari orbital yang bersangkutan. Spektrum ultraviolet adalah gambar antara panjang gelombang atau frekuensi serapan lawan intensitas serapan (transmitasi atau absorbansi). Sering juga data ditunjukkan sebagai gambar grafik atau tabel yang menyatakan panjang gelombang lawan serapan molar atau log dari serapan molar, Emax atau log Emax



BAB II PEMBAHASAN



A. Pengertian Spektrofotometer Ultraviolet-Visibel (UV-Vis) merupakan salah satu teknik analisis spektroskopi yang memakai sumber radiasi eleltromagnetik ultraviolet dekat (190-380) dan sinar tampak (380-780) dengan memakai instrumen spektrofotometer. Spektrofotometer UVVis melibatkan energi elektronik yang cukup besar pada molekul yang dianalisis, sehingga spektrofotometri UV-Vis lebih banyak dipakai untuk analisis kuantitatif ketimbang kualitatif (Mukti, 2012).



Gambar 2. Spektrofotometer UV-Vis



Metode Spektrometer UV-Vis telah banyak diterapkan untuk penetapan senyawasenyawa organik yang umumnya dipergunakan untuk penentuan senyawa dalam jumlah yang sangat kecil. Spektrofotometer UV-Vis dapat melakukan penentuan terhadap sampel yang berupa larutan, gas, atau uap. Untuk sampel yang berupa larutan perlu diperhatikan pelarut yang dipakai antara lain: 1. Pelarut yang dipakai tidak mengandung sistem ikatan rangkap terkonjugasi pada struktur molekulnya dan tidak berwarna. 2. Tidak terjadi interaksi dengan molekul senyawa yang dianalisis. 3. Kemurniannya harus tinggi atau derajat untuk analisis.



B. Sistem Perlatan UV-Vis



Gambar 3. Instrumen pada spektrofotometri UV-Vis



1. Pengatur Intensitas Berfungsi untuk mengatur intensitas sinar yang dihasilkan oleh sumber cahaya agar sinar yang masuk tetap konstan. 2. Sumber cahaya Sebagai sumber cahaya pada spektrofotometer, haruslah memiliki pancaran radiasi yang stabil dan intensitasnya tinggi. Sumber cahaya pada spektrofotometer harus memiliki panacaran radiasi yang stabil dan intensitasnya tinggi. Sumber cahaya pada spektrofotometer UV-Vis ada dua macam : a. Lampu Tungsten (Wolfram) Lampu ini digunakan untuk mengukur sampel pada daerah tampak. Bentuk lampu ini mirip dengna bola lampu pijar biasa. Memiliki panjang gelombang antara 350-2200 nm. Spektrum radiasianya berupa garis lengkung. Umumnya memiliki waktu 1000jam pemakaian. Kebaikan lampu wolfarm adalah energi radiasi yang dibebaskan tidak bervariasi pada berbagai panjang gelombang. Sumber cahaya untuk spektrofotometer inframerah, sekitar 2 ke 15 m m menggunakan pemijar Nernst (Nernst glower) b. Lampu Deuterium Lampu ini dipakai pada panjang gelombang 190-380 nm. Spektrum energy radiasinya lurus, dan digunakan untuk mengukur sampel yang terletak pada daerah uv. Memiliki waktu 500 jam pemakaian. 3. Detektor Fungsinya untuk merubah sinar menjadi energi listrik yang sebanding dengan besaran yang dapat diukur. Syarat-syarat ideal sebuah detektor adalah :



a. Kepekaan yang tinggi. b. Perbandingan isyarat atau signal dengan bising tinggi. c. Respon konstan pada berbagai panjang gelombang. d. Waktu respon cepat dan signal minimum tanpa radiasi. e. Signal listrik yang dihasilkan harus sebanding dengan tenaga radiasi. 4. Monokromator Monokromator berfungsi sebagai penyeleksi panjang gelombang yaitu mengubah cahaya yang berasal dari sumber sinar polikromatis menjadi cahaya monokromatis. Jenis monokromator yang saat ini banyak digunakan adalah gratting atau lensa prisma dan filter optik. Monokromator adalah alat yang akan memecah cahaya polikromatis menjadi cahaya tunggal (monokromatis) dengan komponen panjang gelombang tertentu. Bagian-bagian monokromator, yaitu : a. Prisma Prisma akan mendispersikan radiasi elektromagnetik sebesar mungkin supaya di dapatkan resolusi yang baik dari radiasi polikromatis. b. Grating (kisi difraksi) Kisi difraksi memberi keuntungan lebih bagi proses spektroskopi. Dispersi sinar akan disebarkan merata, dengan pendispersi yang sama, hasil dispersi akan lebih baik. Selain itu kisi difraksi dapat digunakan dalam seluruh jangkauan spektrum. c. Celah optis Celah ini digunakan untuk mengarahkan sinar monokromatis yang diharapkan dari sumber radiasi. Apabila celah berada pada posisi yang tepat, maka radiasi akan dirotasikan melalui prisma, sehingga diperoleh panjang gelombang yang diharapkan. d. Filter Berfungsi untuk menyerap warna komplementer sehingga cahaya yang diteruskan merupakan cahaya berwarna yang sesuai dengan panjang gelombang yang dipilih. 5. Kuvet Kuvet merupakan wadah dari sampel berupa cairan yang telah diatur takarannya hingga dapat terbaca oleh spektrofotometer UV-Vis. Biasanya sampel yang digunakan adalah sampel yang berwarna yang mudah menyerap sinar yang dipancarkan oleh sumber cahaya. Pada pengukuran di daerah sinar tampak



digunakan kuvet kaca dan daerah UV digunakan kuvet kuarsa. Berikut beberapa contoh dari kuvet yang ada: 6. Read out a. Null balance, menggunakan prinsip null balance potentiometer, tidak nyaman, banyak diganti dengan pembacaan langsung dan pembacaan digital b. Direct readers, %T, A atau C dibaca langsung dari skala c. Pembacaan digital, mengubah sinyal analog ke digital dan menampilkan peraga angka Light emitting diode (LED) sebagai A, %T atau C. Dengan pembacaan meter seperti gambar, akan lebih mudah dibaca skala transmitannya, kemudian menentukan absorbansi dengan A = - log T.



C. Prinsip Kerja UV-Vis Adapun prinsip kerja alat spektrofotometer uv-vis yaitu sumber radiasi untuk spektroskopi UV-Vis adalah lampu tungsten. Cahaya yang dipancarkan sumber radiasi adalah cahaya polikromatik. Cahaya polikromatik UV akan melewati monokromator yaitu suatu alat yang paling umum dipakai untuk menghasilkan berkas radiasi dengan satu panjang gelombang (monokromator). Monokromator radiasi UV, sinar tampak dan infra merah adalah serupa yaitu mempunyai celah (slit), lensa, cermin dan perisai atau grating (Day R.A dan Underwood A.L., 1999).



Gambar 4. Proses cahaya polikromatik menjadi monokromatik



Wadah sampel umumnya disebut sel/kuvet. Kuvet yang terbuat dari kuarsa baik untuk spektrosokopi UV dan juga untuk spektroskopi sinar tampak. Kuvet plastik dapat digunakan untuk spektroskopi sinar tampak. Berkas-berkas cahaya dengan panjang tertentu kemudian akan dilewatkan pada sampel yang mengandung suatu zat dalam konsentrasi tertentu. Oleh karena itu, terdapat cahaya yang diserap (diabsorbsi) dan ada pula yang dilewatkan



Gambar 5. Proses penyerapan cahaya Cahaya yang diserap diukur sebagai absorbansi (A) sedangkan cahaya yang hamburkan diukur sebagai transmitansi (T), dinyatakan dengan hukum lambert-beer atau Hukum Beer, berbunyi: “Jumlah radiasi cahaya tampak (ultraviolet, inframerah dan sebagainya) yang diserap atau ditransmisikan oleh suatu larutan merupakan suatu fungsi eksponen dari konsentrasi zat dan tebal larutan”. Radiasi yang melewati sampel akan ditangkap oleh detektor yang berguna untuk mendeteksi cahaya yang melewati sampel tersebut. Cahaya yang melewati detektor diubah enjadi arus listrik yang dapat dibaca melalui recorder dalam bentuk transmitansi absorbansi atau konsentrasi.



D. Hukum Dasar UV-Vis 1.



Hukum Lambert-Beer Hukum Lambert-Beer (Beer`s law) adalah hubungan linearitas antara absorban dengan konsentrasi larutan sampel. Konsentrasi dari sampel di dalam larutan bisa ditentukan dengan mengukur absorban pada panjang gelombang tertentu dengan menggunakan hukum Lambert-Beer. Biasanya hukum Lambert-Beer ditulis dengan:



Menurut Dachriyanus (2004), Hukum Lambert-Beer terbatas karena sifat kimia dan faktor instrumen. Penyebab non linearitas ini adalah: a.



Deviasi koefisien ekstingsi pada konsentrasi tinggi (>0,01 M), yang disebabkan oleh interaksi elektrostatik antara molekul karena jaraknya yang terlalu dekat.



b.



Hamburan cahaya karena adanya partikel dalam sampel.



c.



Flouresensi atau fosforesensi sampel.



d.



Berubahnya indeks bias pada konsentrasi yang tinggi.



e.



Pergeseran kesetimbangan kimia sebagai fungsi dari konsentrasi.



f.



Radiasi non-monokromatik; deviasi bisa digunakan dengan menggunakan bagian datar pada absorban yaitu pada panjang gelombang maksimum.



g.



2.



Kehilangan cahaya.



Persamaan Planck Dalam Spetrofotometer UV-VIS menggunakan sinar elektromagnetik dan sinar tampak. Gelombang elektromagnetk memiliki sifat dualisme yaitu sifat sebagai gelombang dan sifat sebagai partikel. Karena sifat tersebut ada beberapa parameter yang perlu diketahui yaitu panjang gelombang, frekuensi, energy tiap foton. Hubungan ketiga parameter tersebut dirumuskan oleh planck yang dikenal dengan Persamaan Planck. Menurut Planck hubungan antara frekuensi dan panjang glombang adalah sebagai berikut : c =λ υ ..........(1) Sedangkan hubungan antara energy tiap foton dengan frekuensi dirumuskan : E=h υ ..........(2) E=(h c)/λ ..........(3)



Ket:



E = Energy tiap foton h = Tetapan Planck (6,626 x 10-34 J.s) υ = frekuensi c = kecepatan cahaya (3 x 108 m.s-1).



Dari rumus di atas dapat diketahui bahwa energi dan frekuensi suatu foton akan berbanding terbalik dengan panjang gelombang, sedangkan energi yang dimiliki suatu foton akan berbanding lurus dengan frekuensinya.



E. Treatment atau preparasi sampel dari UV-Vis Preparasi sampelnya harus dilakukan dengan prosedur yang teratur yaitu, sel sampel harus dibilas 3 – 5 kali dengan pelarut sebelum diisi dengan larutan bersih yang akan digunakan untuk pengukuran. Putar sel naik turun diatas tumpukan kertas pengisap akan menolong sisa pelarut. Perlakuan akan memperkecil kontaminasi dari eksperimen sebelumnya. Pembebasan koloid sampel terdiri dari debu atau partikel lain harus disaring, diputar atau dibiarkan tenang. Jika tidak, seluruh attenuasi – transmitansi spektrum ke penyebar cahaya dan refleksi akan menyembunyikan informasi spektrum dari analisis. Dibuat larutan induk sampel dengan konsentrasi relatif tinggi, larutan diukur absorbansinya pada berbagai panjang gelombang, dengan menggunakan larutan blanko. Dari data absorban yang diperoleh dilakukan pengenceran sedemikian sehingga pada panjang gelombang optimum akan diperoleh absorban dengan nilai berkisar antara 0,2 sampai dengan 0,8. Pada interval tersebut akan diperoleh dengan ketelitian yang baik.



F. Perawatan Spektrofotometer UV-Vis Hal-hal yang Harus Diperhatikan untuk Merawat Spektrofotometer UltravioletVisibel (UV-Vis) sebagai berikut. 1.



Membaca dan memahami seluruh intruksi dengan baik.



2.



Mematuhi semua larangan dan intruksi yang ditetapkan dalam prosedur kerja.



3.



Sebelum melakukan pengukuran, terlebih dahulu memanaskan instrument paling sedikit selama 20 menit.



4.



Tidak menutupi bagian unit yang sedang menyala.



5.



Mencabut Photomech 301-A dari dinding stopkontak terlebih dahulu ketika akan dibersihkan.



6.



Tidak boleh terkena air atau cairan.



7.



Menghindari agar instrument tidak terjatuh karena bila jatuh dapat merusak komponen elektronik yang ada didalamnya.



8.



Selalu menggunakan kuvet atau tabung persegi yang sesuai dengan spesifikasi alat tersebut.



9.



Jangan meletakkan di atas tempat yang mudah bergerak seperti kereta, meja, dan dalam lingkungan yang perubahan temperatur bervariasi dan signifikan.



10. Jika disimpan dalam ruangan yang tidak di setting, dapat dibolehkan unit ditempatkan pada temperatur ruang sebelum digunakan. Instrument diletakkan di tempat yang jauh dari debu, dihindarkan dari kelembaban yang berlebih atau bahan kimia yang bersifat korosif. Bila instrumen tidak digunakan sebaiknya diberi penutup untuk melindungi komponen elektriknya dari debu. 11. Pengoperasian instrumen berdasarkan tipe sumber arus yang ditunjukkan pada label dibagian unit belakang. 12. Jangan membongkar atau memodifikasi instrumen yang akan memberikan efek terhadap pengoperasian, keamanan, atau daya tahan instrumen. 13. Untuk mengurangi resiko kebakaran maka jangan membongkar unit-unit yang telah ada, tetapi hubungi pekerja service alat tersebut untuk memperbaikinya. 14. Ketika instrumen tidak digunakan, pastikan tombol power telah dimatikan dan mencabut kabel power dari dinding stopkontak. 15. Jangan memberikan muatan arus yang berlebihan pada kawat penyambung karena hal ini dapat menyebabkan kebakaran akibat hubungan arus pendek. 16. Jangan membiarkan meletakkan sesuatu di atas kabel power. 17. Mencabut photomech 301-A dari stopkontak dan menghubungi teknisi service alat tersebut dengan kondisi di bawah ini : a. Jika unit alat terkena air atau cairan. b. Jika unit alat tidak dapat berfungsi dengan normal sesuai dengan operasi intruksi yang semestinya. c. Pemakaian yang tidak layak dapat merusak alat dan akan selalu meminta pekerja service alat tersebut memperbaikinya seperti keadaan normal. d. Jika instrumen disalahgunakan atau habis terjatuh. 18. Hindari penggunaan instrumen saat hujan deras karena dapat menyebabkan resiko hubungan arus pendek. 19. Hanya digunakan sekering, lampu pijar, dan stopkontak yang berasal dari instrumen tersebut. 20. Akurasi instrumen sebaiknya diperiksa secara periodik dan setelah disimpan dalam jangka waktu yang lama, maka instrument sebaiknya dicek terlebih dahulu sebelum digunakan.



BAB III PENUTUP



A. Kesimpulan Adapun kesimpulan yang dapat duambil dari makalah ini, yaitu : 1. Spektrofotometer Uv-Vis adalah alat yang digunakan untuk mengukur transmitansi, reflektansi dan absorbsi dari cuplikan sebagai fungsi dari panjang gelombang serta untuk pengukuran didaerah ultra violet dan didaerah tampak. 2. Adapun prinsip kerja alat spektrofotometer uv-vis yaitu sumber radiasi untuk spektroskopi UV-Vis adalah lampu tungsten. Cahaya yang dipancarkan sumber radiasi adalah cahaya polikromatik. Cahaya polikromatik UV akan melewati monokromator yaitu suatu alat yang paling umum dipakai untuk menghasilkan berkas radiasi dengan satu panjang gelombang (monokromator). 3. UV/VIS spektrofotometer dapat digunakan untuk menentukan konsentrasi dalam larutan penyerap dan mengetahui seberapa cepat perubahan absorbansi dengan konsentrasi 4. Hukum-hukum yang berkaitan dengan spektrofotometri UV-Vis adalah Hukum Lambert-Beer dan Tetapan Plank 5. Instrumen spektrofotometri adalah pengatur Intensitas, sumber cahaya, detector, monokromator, kuvet, dan read out.



DAFTAR PUSTAKA



Adeeyinwo, C.E, Okorie, N, 2013, Basic Calibration of UV/ Visible Spectrophotometer, vol 2 : 3 dalam International Journal of Science and Technology. Bashar, L.Y. 2012. Spektrofotometer. Kendari: Akademi Analis Kesehatan Bina Husada. Dachrianus, 2004, Analisis Struktur Senyawa Organik Secara Spektroskopi, Universitas Andalas: Padang. Day, R.A., dan Underwood, A.L. 1999. Analisa Ilmu Kuantitatif Edisi Keempat. Erlangga: Jakarta Gandjar, dan Rohman. 2007. Kimia Farmasi Analisis. Pustaka Pelajar : Jakarta nd



Glasston, S. 1960. Textbook of physical chemistry. 2 ed. Macmillan and Co. Ltd., London. Huda, Nurul. 2001. Pemeriksaan Kinerja Spektrofotometer UV-Vis GBC 911A Menggunakan Pewarna Tatrazine CL19140. Jurnal Bidang Evaluasi dan Pengembangan Keselamatan Instalasi Khopkar, S. M.. 1990. Konsep Dasar Kimia Analitik. Universitas Indonesia: Jakarta. Md. Ashfaque et al, 2017, Development and validation of a low-cost visible light Spectrophotometer dalam International Conference on Advances in Electrical Engineering (ICAEE), 28-30 September, Dhaka, Bangladesh Mozaix. 2014. Spektrometroi UV-Vis. Diakses pada 7 Desember 2014.



Mukti, K. 2012. Analisis Spektroskopi UV-Vis Penentuan Konsentrasi Permanganat (KMnO4). Surakarta: Universitas Sebelas Maret. Rohman, Abdul. 2007. Kimia Farmasi Analisis. Yogyakarta : Pustaka Pelajar. Seran, E. 2011. Pengertian Dasar Spektrofotometer Vis, UV, UV-Vis. Diakses pada 7 Desember 2014. Seren, Emel. 2011. Spektrofotometri Sinar Tampak. (https://wanibesak .wordpress.com/2011/07/04/ spektrofotometri-sinar-tampak-visible, diunduh pada 14 september 2016).



Skoog, D.A. and D.M. West 1971. Principles of instrumental analysis. Holt, Rinehart and Winston, Inc., New York. Soewoto, Hafiz, dkk. 2001. Biokimia Eksperimen Laboratorium.Jakarta: Widya Spectrofotometry Handbook, 2013, Handbooks from GE healthcare life sciences Triyati, E. 1985. Spektrofotometer Ultra-Violet dan Sinar Tampak serta Aplikasinya dalam Oseanologi. Jakarta: LIPI. Jurnal Oseana X (1).